Name: Biyoparlaklık Görüntüleme kullanarak Tümör Büyüme ve Terapi yanıt sonraki Analizi ile İntrakranial Beyin Tümörü Xenografts kurulması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-13T17:55:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Öğrenin, biyoparlaklık görüntüleme ile farelerde intrakranial beyin tümörü ksenogreftleri kurma ve tedavi yanıtını izleme yöntemini. Bu teknik nöro-onkoloji araştırmalarında deneysel terapilerin etkinliğini değerlendirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NINDS hibe NS49720 ve NS65819 ve NCI hibe CA97257

1. Tümör Hücre hazırlanması. Tümörler atimik farelerde subkütan büyümeleri olarak, ya da hücre kültürü yayılır gelen, insan beyin tümörü xenografts için hücreleri ya kaynaklı olabilir. Her iki hücre kaynaklarından yararlanma hücre implantasyonu için bir yöntem gösteri ile birlikte, aşağıda tartışılmıştır. Intrakranial bölmesi transferi için subkutan tümörler hücreleri hazırlamak için, doku, başlangıçta, bir hücre toplam süspansiyon 1 oluşturmak için tekrarlayan pipetleme bir neşter ve sonra mekanik kesintiye kıyılmış nerede eksize kanadını tümörler, kültür yemekler konur. Hücre agrega süspansiyon sonra intrakraniyal enjeksiyon için uygun tek bir hücre süspansiyonu üretmek için filtre 70 mcM naylon örgü geçirilir. Hücre süspansiyonu, 10 dakika boyunca 1000 4 dak ° C, ve nihai bir çalışma konsantrasyonu (aşağıya bakın) elde etmek için uygun bir serum ücretsiz medya hacmi hücre pelletini resuspending önce aspire süpernatant santrifüj edilir. Intrakranial implantasyonu için kurulan hücre hatları hazırlamak için, hücreler, sonra 2 Yukarıda belirtildiği gibi hücreler santrifüj ve resuspending neurosphere süspansiyon kültürleri toplayarak trypsinizing mono tabakaları tarafından hasat, veya. Enjekte edilen hücrelerin sayısı nöroanatomik yere enjeksiyon değişken bağımlı. Beyin sapı enjeksiyonları 3, 5 x 10 4 hücreler olarak en az 0.5 mcL enjekte ise supratentoryal enjeksiyonları için rutin serum ücretsiz medya (DMEM) 3 mcL 3-5 x 10 5 hücre enjekte. Önerilenden daha geniş hacimli enjekte çıkan ekzofitik (Şekil 1) ziyade, intrakranial tümör büyümesini, iğne yolu ile tümör hücresi reflü neden olabilir. Intrakranial enjeksiyon için örnek çekmek sonra, kalan hücre süspansiyonu bir enjeksiyon serisinin üyeleri arasında intrakranial tümör kurulması tamamlarken uygun konsantrasyonu elde etmek için sık sık karıştırılır içeriği ile buz yerleştirilir olmalıdır. 2. Tümör Hücre İmplantasyonu Not aşağıda açıklanan tüm prosedürleri California San Francisco Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır var. <ol><li> Cerrahi alanda,% 2 klorheksidin çözüm olarak, bir dezenfektan ile tüm yüzeylerde püskürtme tarafından hazırlanmış olmalıdır. Dezenfektan kullandıktan sonra, aşağıdaki malzemeleri, cerrahi alanda yer almalıdır: <ul><li> Fare vücut ısısını korumak için ısıtma yastığı </li><li> % 2 klorheksidin içeren% 3 hidrojen peroksit içeren tek ve bir, iki küçük Petri kutularına </li><li> Steril gazlı bez ve pamuklu </li><li> Steril tek kullanımlık neşter </li><li> Otoklavlı cerrahi zımba </li></ul></li><li> Enjekte anestezi için anestezi kullanılmalıdır; tipik bir ketamin ksilizin karışımı. </li><li> Bir fare uyuşturulduktan sonra, kafa derisi, klorheksidin çözüm batırılmış bir parça steril gazlı bez ile birkaç kez sürüntü hazırlanır. Göz merhemi işlem sırasında yeterli nemi korumak için uygulanmalıdır. Steril bir neşter kullanarak, uzun, yaklaşık 1cm parieto-oksipital kemik üzerinde sagital kesi tamamlamak. Maruz kafatası yüzeyi daha sonra% 3 hidrojen peroksit çözeltisi ile ıslatılmış pamuklu bir bez kullanılarak temizlenebilir. Bregma (video) Bu noktada anlaşılması gerekir. </li><li> Tümör hücrelerinin enjeksiyon için koordinatları tümör kurulması için istenen siteye göre değişir. Aşağıda, biz, birçok beyin tümörlü hastalarda tümör geliştirme deneyimi nöroanatomik yerde intraserebral tümör kurulması için 2 kullanın prosedür temsil eder. Beyin tümörü araştırma ilgi diğer yerlerde pons, beyin sapı tümörleri 3 anatomik modelleme için, meningeal tümörlerin yerini 4 modelleme için subdural enjeksiyonları içerir . Tümör hücresi enjeksiyonu önce, böylece tümör hücrelerinin (video) enjeksiyon için bir açılış yaratarak bregma ve koronal sütür 1 mm ön sağ 2 mm kafatası ponksiyon steril 25 gauge keskin iğne kullanın. Bu prosedür, fare ve sıçan (22 sıçanlar için iğne) her ikisi için de iyi çalışır. </li><li> Önce şırıngaya hücreleri çizim, parmağınızla dokunarak hücre süspansiyonu içeriğini karıştırın. Hava kabarcıklarını önlemek için dikkatli olmak, istenilen miktarda hücre süspansiyonu ile şırınga yükleyin. Şırınga dış ekstrakraniyal tümör kurulması ve büyüme (Şekil 1A) önlemeye yardımcı olacak herhangi bir yandaşı bir hücre, serbest dışını silmek için bir alkollü bez ile temizlenmesi gerekir. Uygun enjeksiyon derinliği elde olduğundan emin olmak için, P20 pipetteman ucu sivri ucundan 3mm kesmek için bir neşter kullanın. Şırınga ucu Bu bölümde üzerinde monte edilebilir ve enjeksiyon derinliğini sınırlamak için hareket edecek ve ayrıca sağlayacaktır tişırınga iğnesi p kafatasının alt 3mm. Kafatası dik şırınga yerleştirin ve önceden oluşturulmuş bir delik ve yavaş yavaş hücre süspansiyonu (3μL süspansiyon 1 dakikalık süre içinde enjekte edilmelidir) enjekte. Şırınga yerleştirilmesi uygun olmayan bir açı hücreleri ve sonraki spinal yayılması (Şekil 1B: Sağ) intraventriküler enjeksiyon sonucu enjeksiyon tamamladıktan sonra, bir dakika için iğne bırakın, sonra yavaş yavaş çekilmeye (video): Bu adımları azaltmaya yardımcı olacaktır tümör hücre reflü. </li><li> Intrakranial tümör hücre implantasyonu 5 yardımsız ya da serbest bir yaklaşım bir alternatif olarak, genellikle, daha tutarlı bir enjeksiyon konuma teşvik küçük bir hayvan stereotaktik çerçeve (şematik bakış panel F) kullanımı, ancak önemli miktarda pahasına işlem süresi. Serbest el yaklaşım kullanarak, deneyimlerimiz, küçük bir hayvan stereotaktik çerçeve ile maksimum enjeksiyon hızı yaklaşık 15 fareler / saat iken, iki cerrahi personel, fare / saat kadar 60 enjekte edebilir. Usul elverişsizlik farelerin büyük seri enjekte önemli bir husus olup, tümör hücreleri enjekte edilecek, buz üzerinde olduğu zaman azaltmaya yardımcı olur. </li><li> Kuru steril bir pamuklu çubukla kullanarak% 3 hidrojen peroksit ve kuru kafatası temizleyin. Deliğine steril kemik mum uygulayın. Forseps kullanarak, yakın kafatası ve elyaf üzerinde birlikte kafa derisi çizin. Optimum iyileşme için, kafa derisi kafa derisi birbirine karşı her iki tarafında alt karşı dermis (alt) ile zımbalanmış olmalıdır. Klorheksidin çözüm, daha sonra post-operatif ağrı subkutan enjeksiyon yoluyla uygulanan ve buprenorfin zımbalanmış kafa derisi kullanılarak temizlenebilir olmalıdır. </li><li> Onlar ayakta olur ve normal aktiviteye korumak kadar ameliyat sonrası tüm fareler izleyin. Genelde, iyileşme süresi yaklaşık 30 dakika. </li></ol> 3. Tümör Büyüme Biyoparlaklık İzleme <ol><li> Arka plan. Biyoparlaklık görüntüleme (BLI) luciferase oksidasyon bazlı [(-) -2 - d-(60-hidroksi-20-benzothiazolyl) thiazone-4-karboksilik asit oksijen ve adenozin trifosfat (ATP) varlığı. Bu reaksiyon çıkan emisyonu ile ışık fotonları kimyasal enerjiye dönüştüren bir enzim lucifeares, tarafından katalize edilmektedir. İnsan hücreleri luciferase substrat varlığında yayan ışık yeteneğine sadece lusiferaz ifade hücreleri ile (aşağıya bakın) lusiferaz ifade değiştirilebilir. Tümör büyümesi ve in vivo tedaviye yanıt çok hassas izlenmesine olanak lusiferaz modifiye tümör hücrelerinin lüminesans emisyonları tespit etmek için çok olumlu bir sinyal-gürültü oranı olduğu gibi luciferase ile tedavi barındıran hayvanlardan elde edilen minimal arka plan lüminesans, yoktur. Ayrıca, lusiferaz ve substrat, luciferase memeli hücreleri için toksik olmayan, ve ilgili değiştirilmemiş hücrelere lusiferaz akrabası ifade hücreleri arasındaki işlevsel farklılıklar gözlemledik. Luciferase kolayca böylece lusiferaz değiştirilmiş hücreler içeren her bölmesi görüntüleme sağlayan, hücre zarları ve sonra kan-beyin bariyerini intraperitoneal (ip) ya da intravenöz (iv) enjeksiyonu farelerde geçer. Lusiferaz değiştirilmiş hücreler yayılan ışık ve spektrum foton emisyon seviyesi, küçük bir araştırma, fare ve sıçan gibi hayvanlar, dokulara nüfuz için yeterli ve düşük ışık harici görüntüleme kameraları ile tespit edilebilir. Biyoparlaklık görüntüleme noninvaziv doğa, tümör büyümesi ve bireysel hayvan konularda tedaviye yanıt tekrarlanan izlenmesine olanak sağlar. </li><li> İmplante hücre kaynakları stably ateşböceği lusiferaz ifade için modifiye edilmelidir. Bu tür hücre kaynakları satın, ya da luciferase kurucu ifade etmek için inşa edilmiştir lentivirüs kullanarak bireysel laboratuvarlarda üretilebilir. Önemle art arda bireysel hayvan denekler için, tümör yükü değişikliklerin doğru göstergesi sağlamak için kantitatif lüminesans görüntüleme için gerekli olan in vivo, lusiferaz istikrarlı hücresel ifade sağlamak için, yerine plazmid daha lusiferaz kodlama lentivirüs, değiştirilmiş hücreler kullanmanızı öneririz Bir denemenin ders sırasında görüntülenmiş. </li><li> BLI izleme. Biz tümör hücresi enjeksiyonu takiben bir hafta başlayan, kantitatif biyoparlaklık görüntüleme (qBLI) 1x-2x haftalık yapmanızı öneririz. Bizim qBLI IVIS Lumina görüntüleme istasyonu (Kaliper Yaşam Bilimleri) kullanılarak yapılan ve sonuçları benzer veri IVIS Lumina, 150 IVIS, veya IVIS 200 görüntüleme istasyonu kullanılarak elde edilir. Görüntüleme için hazırlık, fareler, enjeksiyondan sonra 12 dakika görüntülü farelerde intraperitoneal enjeksiyon yoluyla Ketamin / Xylazine ve yönetilen luciferase (D-luciferase potasyum tuzu, 150 mg / kg, kaliper Yaşam Bilimleri) ile eş zamanlı anestezi. Luciferase, farmakokinetiği göstermektedir ki idari arasındaki süreluciferase belirlenmesi ve hücre lüminesans tration maksimum lüminesans emisyon ve algılama büyük hassasiyet elde etmek için, luciferase 10-15 dakika enjeksiyon arasında olmalıdır. 10-15 dakikalık bir zaman aralığı içinde, seçilen zaman uzunluğu görüntülü olan hayvanlar arasında sabit olarak muhafaza edilmelidir. BLI okuma luciferase ve elde enjeksiyonu arasındaki zaman uzunluğu tutarlılığı korumak için son derece önemlidir. Sinyal intrakranial alanı kapsayan ilgi Bölgeler Yaşam Görüntü yazılım (Şekil 2) kullanılarak tanımlanan ve toplam photons/s/sr/cm2 (cm kare başına steradian ortalama saniyede fotonlar) (video) kaydedilir. </li><li> Veri analizi. Bireysel hayvanlarda tümör büyümesi ve tedaviye yanıt izlenir Oysa, biz çok tümör yanıtı ile ilgili sonuçların istatistiksel kesinlik artırmak için en az 8 tedavi grupları tavsiye ya da tedaviye, bunların eksikliği. Lüminesans okumaları 6,7 okuma karşılık gelen maksimum tedavi öncesi lüminesans, terapötik rejiminin tamamlanmasından sonra sunulması qBLI sonuçları ile ilgili olarak, her bir fare s lüminesans bölünmesiyle normalize değerleri dönüştürülür sırasında elde edilen ve . Sağkalım analizi için Kaplan-Meier tahmincisi 8 kullanılır ve sağkalım eğrileri oluşturulur ve medyan sağkalım değerleri belirlendi. Sağkalım eğrileri arasındaki farklar log-rank testi 9 kullanılarak karşılaştırıldı. </li><li> Işlenmiş ve işlenmemiş tümör sonraki analiz için beyin Alma. Hayvan ötenazi üzerine farenin beyin hızlı (video) eksize ve ya tümör morfolojisi ve immünohistokimya sonraki analiz için formalin yerleştirilir ya da örnek dondurma OCT monte edilmelidir olmalıdır. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 3A gösterilen örnekte, ardışık ortalama luminescence değerleri ilerleyen tümör büyümesini kadar intrakranial tümör hücresi enjeksiyonu alan fareler, intrakranial lüminesans monitörize edildi ve hangi zaman tedavisi 34 gün (gri ok başında başlatılan erlotinib 150 mg günlük uygulanan gerekli ötenazi kadar / kg). Her fare için Lüminesans değerleri, her bir fare için son tedavi öncesi görüntüleme değerine normalize sonraki lüminesans okumaları ile tedaviye başlanmadan anda 1 normalleştirilmiş bir değer olarak ayarlanır. Bir örnek olarak, lüminesans 6.0 'artmıştı 34 günde 2.0 x 10 7 fotonlar / sn, son bir tedavi öncesi lüminesans okuma ile bir fare gün 38 x 10 7 fotonlar / sn, bir günde 38 normalize lüminesans değeri olurdu 3.0. Normalize biyoparlaklık ve kontrol ve tedavi grupları için ilgili standart hata ortalaması her görüntüleme zaman noktası için çizilir. Bu örnekte, ortalama normalize lüminesans önemli bir fark (gün 38) tedavi başlandıktan sonraki ilk görüntüleme zaman noktada, daha sonraki zaman noktalarında daha fazla artış göstererek ortalama grup lüminesans farkı ile açıktır. Çoğu durumda, tedavisi, qBLI tarafından belirtildiği gibi, anti-tümör aktivitesi örneğinde olduğu gibi burada (Şekil 3B) karşılık gelen bir hayatta kalma anlamlı bir fark (yani, p &lt;0.05) ile birlikte. Paneller 3C ve 3D gösterisi bitişik hematoksilen &amp; eozin ve fare beyin anti-EGFR boyanan kesitler kesit için formalin ve sonraki parafine gömme rezeke beyin yerleştirilmesini takiben, ötenazi zamanı elde etti. <img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 intrakranial enjeksiyon hataları işaretleri. A) ekzofitik (ekstrakraniyal) tümör büyümesi (kırmızı daire), çok büyük bir enjeksiyon hacmi, şırıngaya takılı kalan hücre süspansiyonu neden olabilir, ya da tümör hücreleri enjekte sonra çok hızlı bir şekilde şırınga çekilmesi. B) ventriküller içine tümör hücreleri enjekte, tümör hücrelerinin düzgün enjekte aksine, enjeksiyon yerinde (sol fare) lokalize kalır sinyal spinal tümör yayılması (sağ fare) neden olabilir. <img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Tedaviye yanıt deneyi Şekil 2. Isı harita görüntüsü temsili kontrol fareler için biyoparlaklık yoğunluğu temsilleri (solda) ve tedavi grupları (sağda). The Living Image yazılımı, ilgi alanları tanımlamak için (kırmızı daireler), ya da araç operatörleri ilgi bölgelerde elle tanımlayabilirsiniz. Görüntüleri için bu rakam inşaat gibi kullanmak için, biz de cihazı kullanan operatör, hayvan konular arasındaki biyoparlaklık farkı ölçüde görsel temsilini sağlamak için, aynı biyoparlaklık ısı haritası aralığı (rakam üst kısmı) kullanılarak ısı haritası görüntüleri gösterir öneririz. <img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 Biyoparlaklık, yaşam kalitesi ve terapötik yanıt belirgin olduğu bir deney tümör dokusu analizi. A) standart hata ile kontrol ve tedavi grubundaki fareler için ortalama biyoparlaklık okumaları, Arsa, her görüntü noktası için belirtilen. B) aynı fareler için Survival arsa; p-değeri, log-rank testi 7 kullanımı yoluyla belirlenir . C) fare beyin tümörü olan H &amp; E lekeli bölümü. D) EGFR lekeli bölümü. Tümör baskılayıcı protein PTEN için negatif boyanma gösteren panel E sırasıyla paneller C ve D, E ve F) belirtilen alanların büyütmelerde.

<ol><li>Giannini, C., Sarkaria, J. N., Saito, A., Uhm, J. H., Galanis, E., Carlson, B. L., Schroeder, M. A., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient+Tumor+EGFR+and+PDGFRA+Gene+Amplifications+Retained+in+an+Invasive+Intracranial+Xenograft+Model+of+GBM%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncol%22%5BJournal%5D)">Patient Tumor EGFR and PDGFRA Gene Amplifications Retained in an Invasive Intracranial Xenograft Model of GBM.</a> Neuro-Oncol. 7, 164-176 (2005).</li>
<li>Ozawa, T., Wang, J., Hu, L. J., Bollen, A. W., Lamborn, K. R., Deen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+human+glioblastomas+as+xenografts+in+the+brains+of+athymic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Growth of human glioblastomas as xenografts in the brains of athymic rats.</a> In Vivo. 1, 55-60 (2002).</li>
<li>Hashizume, R., Ozawa, T., Dinca, E. B., Banerjee, A., Prados, M. D., James, C. D., Gupta, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+brainstem+glioma+xenograft+model+enabled+for+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">A human brainstem glioma xenograft model enabled for bioluminescence imaging.</a> J Neurooncol. , Forthcoming (2009).</li>
<li>Baia, G. S., Dinca, E. B., Ozawa, T., Kimura, E. T., McDermott, M. W., James, C. D., VandenBerg, S. R., Lal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+skull+base+model+of+malignant+meningioma%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">An orthotopic skull base model of malignant meningioma.</a> Brain Pathol. 2, 172-179 (2007).</li>
<li>Ozawa, T., James, C. D. Human Brain Tumor Cell and Tumor Tissue Transplantation Models. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOzawa%2C+T+%22CNS+Cancer%3A+Models%2C+Markers%2C+Prognostic+Factors%2C+Targets%2C+and+Therapeutic+Approaches%22">CNS Cancer: Models, Markers, Prognostic Factors, Targets, and Therapeutic Approaches</a>. Van Meir, E. , Humana Press-Springer. New York, NY. 147-162 (2009).</li>
<li>Sarkaria, J. N., Yang, L., Grogan, P. T., Kitange, G. J., Carlson, B. L., Schroeder, M. A., Galanis, E., Giannini, C., Wu, W., Dinca, E. B., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Molecular+Characteristics+Correlated+with+Glioblastoma+Sensitivity+to+EGFR+Kinase+Inhibition+Through+Use+of+an+Intracranial+Xenograft+Test+Panel%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Identification of Molecular Characteristics Correlated with Glioblastoma Sensitivity to EGFR Kinase Inhibition Through Use of an Intracranial Xenograft Test Panel.</a> Mol. Cancer Ther. 6, 1167-1174 (2007).</li>
<li>Dinca, E. B., Sarkaria, J. N., Schroeder, M. A., Carlson, B. L., Voicu, R., Gupta, N., Berger, M. S., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+Monitoring+of+Intracranial+Glioblastoma+Xenograft+Response+to+Primary+and+Salvage+Temozolomide+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence Monitoring of Intracranial Glioblastoma Xenograft Response to Primary and Salvage Temozolomide Therapy.</a> J. Neurosurg. 107, 610-616 (2007).</li>
<li>Kaplan, E. L., Meier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-parametric+estimation+from+incomplete+observations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Stat.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Non-parametric estimation from incomplete observations.</a> J. Am. Stat. Assoc. 53, 457-481 (1958).</li>
<li>Peto, R., Peto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymptotically+efficient+rank+invariant+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Stat.+Soc.+Ser.+A.+Stat.+Soc%22%5BJournal%5D)">Asymptotically efficient rank invariant procedures.</a> J. R. Stat. Soc. Ser. A. Stat. Soc. 135, 185-207 (1972).</li>
<li>Camphausen, K., Purow, B., Sproull, M., Scott, T., Ozawa, T., Deen, D. F., Tofilon, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+in+vivo+growth+on+human+glioma+cell+line+gene+expression%3A+convergent+profiles+under+orthotopic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A.%22%5BJournal%5D)">Influence of in vivo growth on human glioma cell line gene expression: convergent profiles under orthotopic conditions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.. 102, 8287-8292 (2005).</li>
</ol>

Ortotopik (intrakranial) beyin tümörü xenograft kurulmasını, terapötik yanıt için test modelleme CNS kanseri için 10 uygun bir mikroçevresinin sağlar . Modelleme Bu tür ek deneysel bir ajan, hastalarda klinik deneme değerlendirme için gelişmiş gerekip gerekmediğini belirlemek için kritik öneme sahip olan beyin ve beyin tümörü, tedavi ile ilgili bilgi sağlar. Kaliperler tarafından gibi, intrakranial xenograft tümör miktarını doğrudan ölçülebilir değil çünkü, intrakranial tümör büyümesi ve tedaviye yanıt boyuna izleme deneyimi gösteren biyoparlaklık görüntüleme ile birincil hedefi deneyler için en pratik yaklaşım olarak, non-invaziv görüntüleme gerektirir tedaviye tümör yanıtı ölçüde değerlendirmektedir. Biyoparlaklık görüntüleme sonuçları hayvan konu sağkalım analizi ile birlikte, iki veri setleri, deneysel tedavi etkinliğini değerlendiren için güçlü ve güvenilir bir yaklaşım sağlamak. Son olarak, intrakranyal beyin tümörü xenografts morfolojik ve moleküler tedavi etkilerini değerlendirmek için ötenazi hayvan konular hasat derece önemli olduğunu ve bunun için bir sonraki analiz için rezeke beyin korunması, ötenazi anda tüm beyin rezeksiyonu tercih. Yukarıdaki beyin tümörü araştırma özel sunum yapılmıştır Oysa, kavramları kesinlikle kemirgenlerde ortotopik modelleme için uygun olan diğer insan kanserlerin generalizeable vardır.

<table><tbody><tr><td>Tek Kullanımlık Bistüriler</td><td>Feather Safety Razor Co, Ltd.</td><td>2975</td><td>No.21</td></tr><tr><td>Isıtıcı Ped</td><td>Dunlap</td><td>HP950</td><td></td></tr><tr><td>Gazlı bez</td><td>Fisher Scientific</td><td>22028563</td><td></td></tr><tr><td>Pamuklu Çubuklar</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-100</td><td></td></tr><tr><td>%2 Klorheksidin</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9756995</td><td></td></tr><tr><td>%3 Hidrojen Peroksit</td><td>Fisher Scientific</td><td>H312P-4</td><td></td></tr><tr><td>25G İğne</td><td>BD Biosciences</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>10ul Hamilton Keskin Mikroşırınga</td><td>Hamilton Co</td><td>20734</td><td></td></tr><tr><td>Cilt Zımbalama Cihazı ve Zımbalar</td><td>Stoelting Co.</td><td>59020</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaksik Cihaz</td><td>Stoelting Co.</td><td>51725</td><td></td></tr><tr><td>Living Image Yazılımı</td><td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Category/ID/Living%20Image%20Software" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Caliper Life Sciences</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-lusiferin</td><td>Altın Biyoteknolojisi</td><td>LUCK-1G</td><td>Potasyum Tuzu</td></tr><tr><td>Xenogen Lumina</td><td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Category/ID/IVIS%20Series" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Caliper Life Sciences</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

biyoparlaklık görüntüleme kullanarak tümör büyüme ve terapi yanıt sonraki analizi ile İntrakranial beyin tümörü xenografts kurulması

Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging

Nöro-onkoloji araştırma, insan beyin tümörü hücreleri kullanarak Nakli modelleri, uzun yıllar boyunca önemli bir işlevi hizmet etmiş. Geçmişte, insan tümör xenograft kurulması için en sık kullanılan prosedür kültür şişeler hücreleri toplanması, toplanan hücreler, immün sistemi baskılanmış farelerde subkütan enjeksiyon yoluyla takip oluşuyordu. Bu yaklaşım hala birçok laboratuvarlarında sık kullanılması görüyor, oysa, beyin tümörleri örneği, tümör hücresi enjeksiyonu uygun nöroanatomik yapılar gerektirir, kadavradan xenograft kurulması yönünde vurgu son on yılda önemli bir kayma, olmuştur. Intrakranial xenograft kurulması kaliperler kullanımı, ortotopik beyin tümörü xenograft modellere doğru vurgu kayması ile doğrudan ölçüm ile tümör büyümesi gibi izlemenize olanak attığından ana hayvanlarda tümör yükü değerlendirmek için non-invaziv görüntüleme kullanımı ihtiyacını doğurmuştur. Mevcut görüntüleme yöntemleri, biyoparlaklık izleme, genellikle en iyi kombinasyonu duyarlılık, yararlılık ve maliyet teklif olarak kabul edilir. Burada, ortotopik beyin tümörü kurulması için, deneysel tedaviler test ederken, tümör büyümesi ve tedaviye yanıtın izlenmesi için prosedürler gösterecektir.

Lusiferaz modifiye insan beyin tümörü xenografts atimik farelerde tümör büyümesi ve biyoparlaklık görüntüleme kullanarak tedaviye yanıt daha sonraki izleme ile intrakranyal kurulmuş olabilir. Sağkalım analizi ile birlikte, biyoparlaklık izleme, beyin tümörlerinin tedavisi için düşünülen tedavilerin klinik öncesi test için önemli bir araştırma aracı.

Biyoparlaklık Görüntüleme kullanarak Tümör Büyüme ve Terapi yanıt sonraki Analizi ile İntrakranial Beyin Tümörü Xenografts kurulması

İnsan beyin tümörü hücreleri kullanılarak oluşturulan transplantasyon modelleri, uzun yıllardır nöro-onkoloji araştırmalarında temel bir işlev görmüştür. Geçmişte, en ...

Uzun yıllar boyunca, insan beyin tümörü hücreleri kullanılarak oluşturulan transplantasyon modelleri temel olarak immün yetmezliği olan farelere deri altına yapılan enjeksiyonları kapsamaktaydı. Son zamanlarda, uygun anatomik yapıya, yani beyne enjeksiyon yapma yönünde bir eğilim oluşmuştur.Bu video makalesinde, kafatasında bir delik açıldığı ve biyolüminesans görüntüleme için modifiye edilmiş tümör hücrelerinin enjekte edilmesi amacıyla bir iğnenin kullanıldığı bir enjeksiyon yöntemi ile farelerde intrakraniyal tümörler oluşturulmaktadır. Cerrahi müdahalenin ardından, tümör büyüme hızı ve tedaviye verilen yanıt izlenmektedir. Biyolüminesans görüntüleme istasyonu, sağkalım analizi ile histopatolojik ve protein ekspresyon analizleri kullanılarak elde edilen veriler, daha sonra deneysel beyin tümörü tedavilerinin etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilmektedir.Bu yöntem, antitümör ajanın beyne ulaşıp ulaşamadığı gibi nöro-onkoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Hayvan konakçıda büyütülen insan beyin tümörlerini tedavi ettiğimiz için, bu tekniğin doğurguları hastalardaki beyin tümörlerinin tedavisine kadar uzanmaktadır. Bir doku kültürü kabininde çalışarak, deri altı tümör hücrelerini intrakraniyal bölmeye transfer etmek için hazırlayın.Eksize edilmiş flank tümörlerini doku kültürü kaplarına yerleştirerek başlayın. Bir bistüri kullanarak dokuyu ince parçalara ayırın. Ardından, hücre agregatı süspansiyonu oluşturmak için bir pipetleyici kullanarak dokuyu mekanik olarak parçalayın.Ardından, hücre agregatı süspansiyonunu 70 µm naylon ağ filtreli bir süzgeçten geçirin ve yuvarlak tabanlı bir tüpe toplayın. İntrakraniyal enjeksiyona uygun tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için bu işlemi toplam üç kez tekrarlayın. Süspansiyonu 4 °C'de 10 dakika boyunca 1000 RPM hızda santrifüjleyin. Santrifüj işleminin ardından süpernatanı aspire edin, ardından deri altı tümörlerin disagregasyonuna alternatif olarak, nihai çalışma konsantrasyonunu elde etmek için hücre peletlerini uygun hacimde serumsuz ortamda yeniden süspande edin.Tümör hücreleri, yerleşmiş beyin tümörü hücre hatlarını içeren hücre kültürlerinden toplanabilir. Hücreleri tripsinleme ve santrifüjleme yoluyla hasat edin.Santrifüj sonrası resüspansiyon işlemini takiben, hücreleri serbest el ile yapılacak supratentoryal enjeksiyonlar için uygun hacimdeki serumsuz DMEM içerisinde süspanse edin. Üç mikrolitrede 3 ila 5 x 10⁵ hücre hazırlayın. Tüm yüzeylere %2 klorheksidin püskürterek cerrahi alanı dezenfekte edin.Ardından, aşağıdaki malzemeleri cerrahi alana yerleştirin. Fare vücut sıcaklığını korumak için bir ısıtma pedi. Biri %3 hidrojen peroksit, diğeri %2 Klorheksidin içeren iki küçük petri kabı, steril gazlı bezler ve pamuklu çubuklar, steril tek kullanımlık bistüriler ve bir otoklav cerrahi zımbalama cihazı.Fare, ketamin ksilazin karışımı ile anestezi altına alındıktan sonra, klorheksidine batırılmış steril gazlı bezler kullanarak cerrahi alanı birkaç kez silin. İşlem boyunca yeterli nemi korumak için ment uygulayın. Steril bir bistüri kullanarak, paroksipital kemik üzerinde yaklaşık bir santimetre uzunluğunda sagital bir insizyon gerçekleştirin.%3'lük hidrojen peroksit çözeltisine batırılmış bir pamuklu çubuk kullanarak, açığa çıkan kafatası yüzeyini temizleyin. Tümör hücrelerinin enjeksiyonu için bir açıklık oluşturmak amacıyla, bu aşamada bgma belirgin olmalıdır. Kafatasını delmek için steril 25 gauge keskin bir iğne kullanın.bgma'nın 2 mm sağına ve koronal sütürün 1 mm anteriörüne. Hücre süspansiyonunun içeriğini hafifçe vurarak karıştırın. Şırıngaya istenilen miktarda hücre süspansiyonu yükleyin.Hava kabarcığı oluşumundan kaçının. Yapışmış hücreleri temizlemek için şırınganın dış kısmını alkollü bir pamukla silin. Bu işlem, burada gösterildiği gibi, uygun enjeksiyon derinliğinin sağlandığından emin olarak ekstra kranial tümör oluşumunu ve büyümesini önlemeye yardımcı olacaktır.Küçük hayvan stereotaktik aparatı kullanılmadığında, bir bistüri yardımıyla P 20 pipet ucunun sivri ucundan üç milimetre kesin. Enjeksiyon derinliğini sınırlamak ve şırınga iğnesinin ucunun kafatası tabanından üç milimetre uzaklıkta olmasını sağlamak için uç kısmını şırınganın üzerine yerleştirin. Dolayısıyla, prosedürdeki bir sonraki adım, aşağıdaki enjeksiyon gerçekleştirilirken tüm yöntemin muhtemelen en zor kısmıdır; tümörün beynin doğru konumunda yerleşmesini ve büyümesini sağlamak için uygun derinliğe ulaşılması ve iletimin gerçekleştirilmesi büyük önem taşımaktadır.Ardından, bir şırıngayı kafatastaki deliğe dik olarak yerleştirin ve hücre süspansiyonunu yavaşça enjekte edin. Önerilenden daha büyük hacimlerin enjekte edilmesi, iğne yolu boyunca tümör hücresi reflüsüne yol açarak intrakraniyal tümör büyümesi yerine fitiği büyüme ile sonuçlanabilir. Burada gösterildiği gibi, şırınganın yanlış açıyla yerleştirilmesi, hücrelerin intraventriküler enjeksiyonuna ve enjeksiyon tamamlandığında burada gösterildiği üzere ardından gelen spinal yayılıma neden olabilir.İğneyi bir dakika daha yerinde bırakın, ardından yavaşça geri çekin. Bu adımlar tümör refluksünü önlemeye yardımcı olacaktır. Kafatasını %3 hidrojen peroksit ile temizleyin ve kurulayın.Steril bir pamuklu çubuk kullanın. Pens yardımıyla deliğe steril kemik mumu uygulayın. Kafa derisini, her iki tarafın dermis tabakaları alt kısımları birbirine gelecek şekilde bastırılarak kafa tası üzerinde birleştirin ve zımbalayın.Ardından klorheksidin kullanarak kafa derisini temizleyin. Ameliyat sonrası ağrıyı hafifletmek için cilt altına buprenorfin enjekte edin. Burada gösterilmemiş olsa da, buprenorfin hızla emilir.Diğer farelere enjeksiyon yapmaya geçin. Bir enjeksiyon serisindeki üyeler arasında uygun konsantrasyonu korumak için enjeksiyonlar arasında hücreleri karıştırdığınızdan emin olun. İstatistiksel olarak anlamlı sonuçlar elde etmeyi sağlamak için en az sekiz üyeli tedavi grupları önerilir.Tüm fareleri, hareketli hale gelene ve normal aktivitelerini geri kazanana kadar ameliyat sonrası izleyin. İyileşme süresi genellikle, tümör hücresi enjeksiyonundan bir hafta sonra başlayarak yaklaşık 30 dakikadır. Kantitatif biyolüminesans görüntüleme veya QBLI, haftada bir veya iki kez gerçekleştirilmelidir.Burada.QBLI, IVIS Lumina Görüntüleme istasyonu ve living image yazılımı versiyon 3.2 kullanılarak gerçekleştirilir. Windows başlat menüsünden living image yazılım programını seçin. Program açıldığında, kamera kontrol panelindeki initialized IVIS system butonuna tıklayın.Başlatma işleminden sonra, sıcaklık durum kutusu yeşil olmalı ve bu durum CCD kameranın uygun olduğunu belirtmelidir; ardından anestezi uygulanmış ve lüsiferaz enjekte edilmiş fareyi görüntüleme odasının sahnesine yerleştirin. Görüntüleme oturumunuzdan kaydedilmiş dosyalardan birini açın ve görüntü verisi gösterimini sayımlardan (counts) fotonlara değiştirin. Hedef sinyalin saniyedeki foton sayısını belirlemek için ROI açılır menüsünden daire simgesini seçin.Hedef sinyalin etrafında ROI olarak etiketlenmiş bir ilgi alanı belirlenmelidir. Sinyal, hayvan numarasının ve görüntüleme gününün belirtildiği bir Excel dosyasına girilmelidir. Bu diziyi, görüntüleme oturumunuz sırasında analiz edilen tüm hayvanlar için tekrarlayın.Görüntülenen her bir fare için foton sayıları belirlendikten ve foton değerleri bir Excel dosyasına aktarıldıktan sonra, her farenin terapötik rejim sırasında ve tamamlanmasının ardından elde edilen lüminesans değerlerini, ilgili tedavi öncesi maksimum lüminesans değerine bölerek lüminesans okumalarını normalize değerlere dönüştürün. Prism yazılımını kullanarak sağkalım analizi gerçekleştirmek için, sağkalım grafikleri oluşturmak ve medyan sağkalım değerlerini tahmin etmek amacıyla KAPLAN-Meier tahmin edicisini kullanın.Sağkalım eğrileri arasındaki farklar log rank testi kullanılarak karşılaştırılır. Hayvanda sağlık durumunda belirgin bir kötüleşme, özellikle de maksimum ağırlığın %20'sinden fazla ağırlık kaybı görülürse hayvan ötanize edilmelidir. Ötanize edilen fareden beyin hızlıca çıkarılmalı ve ardından tümör morfolojisi ile immünohistokimya analizleri için beyin formalin içine yerleştirilmelidir.Bu örnek, gün 34'te erlotinib tedavisine başlanan ve intrakraniyal tümör hücresi enjeksiyonu uygulanan fareler için ortalama normalize lüminesans değerlerini göstermektedir. Hata çubukları standart hatayı belirtmektedir; tedavinin başlamasını takip eden ilk görüntüleme zaman noktasında, ortalama normalize lüminesans değerlerinde belirgin bir fark görülmektedir. Grup ortalaması lüminesansındaki fark, çoğu durumda sonraki zaman noktalarında daha da artış göstermektedir.QBLI ile belirtilen tedavi kaynaklı anti-tümör aktivitesine, sağkalımda karşılık gelen anlamlı bir fark eşlik etmektedir. Buradaki durumda olduğu gibi, parafinle gömülmüş fare beyni kesimlerinin hematoksilin ve EOSİN boyaması, tümör hücresi dağılım modelini göstermektedir. P 10, EGFR inhibisyonuna karşı tümör yanıtı ile sıklıkla ilişkilendirilen bir markördür. Burada.İşlem görmüş tümör hücrelerinin, kahverengi boyamanın yokluğuyla belirtildiği üzere P 10 ekspresyonundan yoksun olduğu görülmektedir. Burada, parafinle gömülmüş fare beyninin bir kesiti gösterilmiştir. EGFR inhibitörüne duyarlı beyin tümörü hücreleri, kahverengi EGFR boyaması ile tanımlanabilir.Gördüğünüz üzere, bu prosedürün en zorlayıcı yönü tümör hücrelerinin doğru şekilde enjekte edilmesidir. Tümör hücrelerine yönelik genetik modifikasyonların büyüme etkilerini araştırmak gibi, bu yaklaşım kullanılarak gerçekleştirilebilecek en ileri düzey deney hangisidir? İşte hepsi bu kadar.Umarım bu sunumu faydalı bulmuşsunuzdur. Deneylerinizde başarılar dilerim.

establishing-intracranial-brain-tumor-xenografts-with-subsequent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Lusiferaz etiketli insan malign periferik sinir kılıfı tümör hücreleri, bağışık yetmezliği olan farelere siyatik sinir grefti için güvenilir bir yöntem açıklanmıştır. Biyoparlaklık görüntüleme, çalışma grupları içine hayvanların rastgele ayrımı için tümör greft ve kriterlere uygun kurulmasını göstermek için kullanımı da tartışılmıştır.

İnsan Takip edilen-Lusiferaz Malign Periferik Sinir Kılıf Tümör Hücreleri Ortotopik Xenografting In vivo</emAday Terapötik Ajanlar> Test

Hipoksi indüklenebilir faktör-1α aktivite Biyoparlaklık görüntüleme, bir meme kanseri beyin metastazı fare modeli intrakranial tümör hipoksi gelişimini izlemek için uygulanır.

Meme Kanseri Beyin metastaz tümör Hipoksi Dynamics in vivo Biyoparlaklık Görüntüleme Fare Modeli

İntrakraniyal GL261 hücrelerin içine C57BL / 6 farelerin implantasyon birçok insan glioblastoma multiforme işaretlerinden özetlemek malign gliomlar üretir. Biz bizi kullanmasına izin stably lusiferaz ifade GL261 hücreleri...

Müteakip 3D ile İntrakranial İmplantasyonu In Vivo Murin Gliomlar Bioluminescent Görüntüleme

Biz çıplak farelerin ve sonraki seri beyinlerine insan glioblastoma multiforme hücrelerinin hassas, stereotaktik implantasyon için tümleşik bir yöntem...

Stereotaktik intrakranial implantasyon ve<em&gt; In vivo</emGlioblastoma Multiforme bir Mouse Model Sistemde Tümör Xenografts arasında&gt; Bioluminescent Görüntüleme

Kaynak: Ciraku, L., et. al. Meme kanseri beyin metastatik tümör büyümesini incelemek ve hedeflemek için bir ex vivo beyin dilimi modeli. J. Vis. Uzm. (2021). Bu video, organotipik bir fare beyin diliminde lusiferaz eksprese eden tümör hücrelerinin görüntülenmesini göstermektedir. Luciferin ortama eklenir ve plaka, in vivo görüntüleme sisteminin haznesinin içine yerleştirilir. Görüntü yakalama parametreleri ayarlanır ve tümörün şekli ve boyutu tanımlanır. Tümör hücreleri tarafından yayılan...

Organotipik Bir Fare Beyin Diliminde Tümör Büyümesini Değerlendirmek için Biyolüminesans Görüntüleme

Kaynak: Clark, A.J., et al. Glioblastoma için İmmün Yetmezliği Olan Bir Hayvan Modelinin Biyolüminesans Görüntülemesi. J. Vis. Uzm. (2016)Bu video, tümör büyümesini non-invaziv olarak ölçmek için lusiferaz eksprese eden tümör hücreleri ve lusiferin kullanarak, immün yetmezliği olan bir fare modelinde glioblastoma ilerlemesini izlemek için biyolüminesans görüntülemeyi göstermektedir.

Glioblastoma için İmmünkompetan Bir Fare Modelinin Biyolüminesans Görüntülemesi

Beyin de in vitro veya ektopik analizler tarafından temsil edilmeyen nitelikleri ile benzersiz bir sitedir. Tekrarlanabilir bulunduğu yere ve büyüme özelliklerine sahip Ortotopik fare modelleri güvenilir bir stereotaksik tespit aracı ve bir düşük basınç şırınga pompası kullanılarak kafatası içine uygulanan enjeksiyonları ile oluşturulabilir.

Oluşturma Anatomik Doğru ve İnsan Beyin Tümörleri Reproducible İntrakraniyal Ksenograftlar

GL261 glioma hücreleri, glioblastomun yararlı bir immünokompetan hayvan modelini sağlar. Bu protokolün amaçları, in vivo biyolüminesans görüntüleme kullanarak intrakraniyal tümör büyümesini izlemek için uygun teknikleri göstermek ve glioblastom tedavisi için tümör immünolojisi ve immünoterapötik yaklaşımları incelemek için lusiferaz ile modifiye edilmiş GL261 hücrelerinin faydasını doğrulamaktır.

Glioblastoma&#39;nın için bir Immünkompetan Hayvan Modeli Biyoparlaklık Görüntüleme

Orthotopic kafa içi enjeksiyon tümör hücrelerinin Beyin tümör biyolojisi, ilerleme, evrim ve terapötik yanıt çalışmaya kanser araştırmalarında kullanılmıştır. Burada gerçek zamanlı intravital görüntüleme ve miktar tümör preklinik glioblastoma modellerinde kitle sağlayan Floresans moleküler tomografi, tümör xenografts, mevcut.

Floresans moleküler tomografi Glioblastoma Xenografts in Vivo içinde görüntüleme için

Ortotopik pediatrik beyin tümörü modellerinin geliştirilmesi, kanser hücrelerini hassas bir şekilde implante etmek için stereotaksik bir cihaz kullanarak titiz bir hassasiyet gerektirir. Burada sunulan metodoloji, beyin tümörü hücrelerinin hazırlanması, intrakraniyal enjeksiyonların gerçekleştirilmesi ve beyin tümörü aşılanmasını değerlendirmek için ameliyat sonrası bir izleme sisteminin uygulanmasında yer alan adımları özetlemektedir.

Stereotaksik Cihaz Kullanılarak Beyin Tümörleri İçin Ortotopik Hasta Kaynaklı Ksenogreft Modellerinin Oluşturulması

Bu protokolün amacı, araştırmacılara intrakraniyal implantasyonlar için son derece tekrarlanabilir bir teknik sunmaktır.

Farelerde glioblastoma hasta kaynaklı ksenograft hücre hatlarının stereotaktik intrakranial implantasyonu

Öğrenin, biyoparlaklık görüntüleme ile farelerde intrakranial beyin tümörü ksenogreftleri kurma ve tedavi yanıtını izleme yöntemini. Bu teknik nöro-onkoloji araştırmalarında deneysel terapilerin etkinliğini değerlendirmeye yardımcı olur.

Biyoparlaklık Görüntüleme kullanarak Tümör Büyüme ve Terapi yanıt sonraki Analizi ile İntrakranial Beyin Tümörü Xenografts kurulması (Video) | JoVE Journal

Biyoparlaklık Görüntüleme kullanarak Tümör Büyüme ve Terapi yanıt sonraki Analizi ile İntrakranial Beyin Tümörü Xenografts kurulması

Daha fazla video keşfet