Desenli Photostimulation Şube Noktaları Arasında Dendritik Entegrasyon Araştırma Digital Micromirror Cihazlar
March 2nd, 2011
Dijital micromirror cihazları (DMD) nöronal eksitabilite kontrol etmek için zaman ve mekan karmaşık desenleri oluşturabilirsiniz. Tasarım, inşaat, ve DMD sistemlerinin işletilmesi ile ilgili konular görüşülüyor. Böyle bir sistem, distal dendritik dallanma noktaları arasında doğrusal olmayan entegrasyon gösteri sağladı.
Bu prosedürün genel amacı, nöronları uyarmak için kullanılabilmesi için zaman ve uzaydaki karmaşık ışık modellerini kontrol etmektir. Bu, önce bir DMD çipinin mikroskobun optik yolundaki uygun bir eşlenik görüntü düzlemine yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. İşlemin ikinci adımı, DMD'yi lazer gibi yoğun bir ışık kaynağı ile düzgün bir şekilde aydınlatmaktır.
Prosedürün üçüncü adımı, tutarlı aydınlatmanın beneklenme etkisini ortadan kaldırmaktır. Prosedürün son adımı, DMD çipini manipüle etmek için bir grafik kullanıcı arayüzü entegre etmektir. Sonuç olarak, daha önce başarılması zor olan deneylerin, DMD sistemini kullanan kafes nörotransmiterinin çok bölgeli lizisi yoluyla artık nispeten kolay bir şekilde tamamlanabileceğini gösteren sonuçlar elde edilebilir.
Merhaba, ben Michael Mohammed ve Maryland Üniversitesi Nöroloji Bölümü'nde Dr.Chaman Tang'ın laboratuvarıyım. Bugün size optik mikroskopta karmaşık eliminasyon desenleri oluşturmak için bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda dendritik entegrasyonu incelemek için kullanıyoruz.
Öyleyse başlayalım. Bu protokol, deneysel sinirbilim için bir dijital mikro ayna cihazının veya DMD aydınlatma sisteminin çalışmasını gösterecektir. Bir DMD, dikdörtgen bir dizi halinde düzenlenmiş birkaç yüz bin mikroskobik hareketli aynaya sahip bir optik yarı iletken çiptir Yüzeyinde, her aynanın konumu bir görüntünün pikseline karşılık gelir.
Her ayna, iki yön arasında eğilmek için ayrı ayrı kontrol edilebilir. Kapalı oryantasyonda, ışık, numune aydınlatmasının optik ekseninden uzağa yönlendirilir. Açık oryantasyonda, ışık optik eksen boyunca yönlendirilir.
DMD, çok yoğun UV ışığını tolere ettiği, açık ve kapalı pikseller arasında yüksek kontrast oranları oluşturduğu ve iki durum arasında onlarca mikrosaniye içinde geçiş yapabildiği için lizis için çok uygundur. DMD'lerin biyomedikal araştırmalar için uygulanması, görüntü işleme yazılımı ve donanımının geniş kullanımı ve görüntü görüntüleme alanındaki ticari ilgi ile desteklenmektedir. Modüler bileşenler, Texas Instruments tarafından DMD'yi mikroskobik bir sisteme uyarlamak için destekleyici elektronik sürücüler sağlayan DLP keşif kitleri olarak pazarlanmaktadır.
Mikroskopi optiği ile ilgili temel kavramların anlaşılması gerekir. Temel modern floresan mikroskobu, bir görüntüleme yolu ve bir aydınlatma yolundan oluşur. Görüntüleme ve aydınlatma yolu için bir objektif, bir filtre küpü ve iki farklı tüp mercekten oluşur.
Mikroskop, numune görüntü düzlemine eşlenik konumlara sahip olacak şekilde tasarlanmıştır, burada numune düzleminde odakta olan nesneler de bu eşlenik görüntü düzlemlerinde odakta görünecektir. Bu kavramın bir sonucu, eşlenik görüntü düzleminde oluşturulan herhangi bir parlak görüntünün aynı zamanda örnek görüntü düzlemine keskin bir şekilde yansıtılmasıdır. Bu strateji, bilgisayar tarafından oluşturulan bir aydınlatma modelini numuneye yansıtmak için kullanılır.
Lazer ışını, eşlenik bir görüntü düzleminde konumlandırılmış DMD çipleri üzerindeki mikro aynalar tarafından uygulanan deseni aydınlatacak çok parlak bir ışık kaynağı görevi görür. Bir DMD aydınlatma sisteminin tasarımı, görünür dalga boyunda ışığı kullanan optogenetik deneyler için kullanılan uyarma ışıklarına bağlıdır. Işıklı desen kamera yolundan geçirilebilir.
Bu nedenle, DMD çipi, bir çift kamera bağlantı noktası modülünün iki kamera bağlantı noktasından birine kolayca monte edilebilir. Tersine, kafesli bileşiklerin parçalanması gibi UV aralığında ışık kullanan deneyler için, ışığın epi aydınlatma yolundan geçirilmesi ve daha erişilebilir bir eşlenik görüntü düzlemi oluşturulması gerekir. Bunun nedeni, görüntüleme tüpü lensinin UV iletimi için tasarlanmamasıdır.
Bunun yerine, aydınlatma tüpü lensi UV iletimi için kullanılır ve görüntü oluşumunda yeterli bir iş çıkarır. DMD üzerindeki her bir mikro ayna, çip düzlemine göre pozitif ve negatif 12 derecelik eğim arasında geçiş yapabilir. Bilgisayardan aldığı dijital girişe bağlı olarak, dönme ekseni her aynanın çapraz köşeleri boyunca, çipin dikdörtgen kenarlarına 45 derecedir.
Ayna eğiminin yönü, çipin ön yüzeyinin bir köşesinde altın renkli bir üçgen ile belirlenir. Mikro aynanın eğimi, gelen aydınlatma huzmesinin eğiminin ve azimutunun hizalanmasını belirler. DMD'yi aydınlatmak için, önce aydınlatma huzmesinin eğimini DMD çipinin dik ekseninden 24 derece olacak şekilde yapılandırın ve azimutu ayna dönüş eksenine dik olacak şekilde yapılandırın.
Hassas ışın hizalaması, verimli çalışma için kritik öneme sahiptir. Lizis deneyleri için. Hızlı açma için gerekli olan yüksek yoğunluklu odaklanabilir ışını oluşturmak için bir lazer kaynağı kullanın.
Burada, yarı sürekli diyot pompalanan katı hal frekansı üçlü ND ateli bir lazer kullanılır, nispeten yüksek güçlü bir lazer kullanılır, çünkü lazer çıktısının yalnızca küçük bir kısmı numuneye gerçekten iletilir. Bir DMD sistemi kullanırken, lazerin çıkışını çok modlu bir fibere fırlatın, böylece beneğe bir çözüm sağlamak için DMD'yi aydınlatmak için doğru eksen boyunca kolayca konumlandırılabilir ve yönlendirilebilir. Tutarlı aydınlatmadan kaynaklanan problem, ışığı optik fiber üzerinden iletir.
Fiber, yaklaşık 40 kilohertz salınımı için sürülen bir pazo elektrikli fiber sedyenin etrafına sarılır. Elyafın mikroskobik gerilmesi, her bir foto stimülasyon darbesinin milisaniye süresi boyunca benek desenini birçok kez hareket ettirmek için yeterlidir, böylece beneklenmeyi etkili bir şekilde ortadan kaldırır. Son olarak, optik fiberin çıktısı, CCD pikselini, tek tek DMD aynalarını görüntüleme CCD kamerasının belirli pikselleriyle ilişkilendiren DMD görüntü yazılımı ile birlikte kaydetmek için DMD'leri aydınlatmak için bir UV mikroskobu objektifi ile harmanlanmıştır.
Yazılım içindeki grafiksel kullanıcı arayüzü, kullanıcının grafik kullanıcı arayüzünü kullanarak bilgisayar faresi ile CCD görüntüsündeki bölgeye karşılık gelen DMD ayna yönünü atamasına olanak tanır. İmleci bilgisayar ekranında görüntülenen görüntünün üzerine getirerek fotoğraf stimülasyonu için konumu etiketleyin ve ışık dağıtım desenleri deposunu programlamak için ilgili etiketli bölgeyi tıklayın. Bilgisayar ekranında bir dizi ayrı görüntü olarak işaretlenen desen, her bir uzamsal desen için lazer darbelerinin zamanlamasını yazılıma programlar.
Bu, veri toplama programı P kelepçesi ile entegre olacaktır. Son olarak, DMD elektroniğinin zamanlamasını, lazerin kapısını ve hedef nörondan yama kenetlenmiş elektrik sinyalinin alınmasını koordine etmek için veri toplama programını kullanın. Burada, optik sistem çözünürlüğünün bir kalibrasyonu gösterilmektedir.
Minimum spot boyutu, bir floresan hedeften ölçüldüğü gibi gösterilir. Etkili fizyolojik çözünürlük, foto stimülasyonun bir fonksiyonu olarak akım akışının genliği ile ölçülür. Buradaki spot pozisyon, kafesli glutamat, iki mikrometre çapında bir dendritik dalın bitişiğinde fotoğraflandı.
Nokta taşınırken. Dite boyunca ortogonal olarak, farklı yoğunluklarda foto stimülasyona elektriksel tepkiler gösterilmiştir. Lizis yoğunluğunun bir fonksiyonu olarak gerilim kenetlenmiş yanıtlar gösterilir.
Dağıtılmış dendritik stimülasyon, DMD tabanlı bir sistem kullanılarak kolayca uygulanabilir. Burada, giriş yoğunluğu, iki dendritik dal üzerinde daireler olarak işaretlenmiş fotoğraf stimülasyon noktalarının sayısı artırılarak değiştirildi. Uzamsal toplama, dal noktaları arasında doğrusal olmayabilir.
Dallara giden iki kapıya gelen artan giriş genlikleri ile giderek daha süper doğrusal hale gelir. Bu sonuçlar, dendritik dal noktaları boyunca doğrusal olmayan toplama şeklini açıkça göstermektedir. Süper doğrusallığa, voltaj kapılı kanallar değil, büyük ölçüde NMDA reseptörleri aracılık eder.
Bu, iki NMDA antagonisti olan A PV ve MK 8 0 1'in uygulanmasının doğrusal olmayan davranışı büyük ölçüde ortadan kaldırması olarak gösterilebilir. Az önce size nöral dokunun desen foto stimülasyonu için DMD tabanlı bir sistemin temel tasarımını ve işleyişini gösterdik. Sistem, optogenetik deneyler için kullanılanlar gibi görünür ışıkla stimülasyon için uyarlanabilir.
Tek foton lizizi için kullanıldığı gibi yakın UV ışıkları için de uyarlanabilir. Bu prosedürü yaparken, 400 nanometreden daha düşük dalga boyunda bir ışık kullanılacaksa ve çoğu insan epi aydınlatma yolundan çıkacaksa, aydınlatıcı ışının birkaç derece içinde hassas bir şekilde hizalanmasının kritik olduğunu ve tutarlı bir ışık kullanılıyorsa, beneklenmenin etkili bir şekilde ortadan kaldırılması gerektiğini hatırlamak önemlidir. İşte bu kadar.
İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, nöron stimülasyonu için karmaşık ışık desenleri oluşturmak amacıyla dijital mikro ayna cihazlarının (DMD) kullanımını ele almaktadır. Prosedür, nöronal uyarılabilirliğin kontrolünü sağlar ve uzak dendritik dallanma noktaları arasında doğrusal olmayan entegrasyonu gösterir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Optogenetik
- Nöron stimülasyonu
Arka Plan
- Dijital mikro ayna cihazları (DMD) ışık desenlerini manipüle edebilir.
- Nörobilim araştırmaları için nöronal uyarılabilirliğin kontrolü kritik öneme sahiptir.
- Nöron stimülasyonu için önceki yöntemler sınırlamalar ile karşı karşıya kalmıştır.
- DMD sistemleri karmaşık deneysel tasarımları kolaylaştırabilir.
Çalışmanın Amacı
- Nöron stimülasyonu için zaman ve uzayda ışık desenlerini kontrol etmek.
- Nörobilimde DMD sistemlerinin etkinliğini göstermek.
- Daha önce yapılması zor olan deneyleri mümkün kılmak.
Kullanılan Yöntemler
- Bir mikroskopun eşlenik görüntü düzlemine bir DMD çipinin yerleştirilmesi.
- DMD'yi bir lazer gibi yoğun bir ışık kaynağı ile aydınlatmak.
- Uyumlu aydınlatmanın lekelenme etkisini ortadan kaldırmak.
- DMD manipülasyonu için bir grafik kullanıcı arayüzü entegrasyonu.
Ana Sonuçlar
- Nöron stimülasyonu için karmaşık ışık desenlerinin başarılı kontrolü.
- Dendritik dallanma noktaları arasında doğrusal olmayan entegrasyonun gösterimi.
- Kafes nörotransmitterinin çok yerli lizisinin kolaylaştırılması.
- Sonuçlar, karmaşık deneylerin yürütülmesinde kolaylığın arttığını gösterir.
Sonuçlar
- DMD sistemleri, nöronal uyarılabilirliği kontrol etmek için etkili araçlardır.
- Nörobilimde yeni deneysel olanakları mümkün kılar.
- Gelecekteki araştırmalar bu teknolojiyi ileri çalışmalar için kullanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Patterned photostimulation using digital micromirror devices (DMD) enables precise spatiotemporal control of neuronal activity, addressing a key challenge in neuroscience for studying complex dendritic integration. This approach supports target validation by allowing researchers to interrogate how distributed synaptic inputs are processed across dendritic branches, a critical factor in understanding neuronal computation and disease mechanisms. The ability to eliminate speckling and integrate with electrophysiology enhances reproducibility and quantitative rigor, which are essential for de-risking mechanistic hypotheses in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of dendritic integration mechanisms across branch points, supporting hypothesis testing for synaptic function and plasticity targets.
- Operational Value: Provides a reproducible platform for multi-site uncaging experiments, reducing variability in assessing neuronal responses to patterned stimuli.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates standardized light pattern delivery for quantifying neuronal excitation, enabling assay development for compounds affecting dendritic signaling.
- Operational Value: Supports high-contrast, rapid-switching stimulation compatible with automated imaging and electrophysiology readouts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links NMDA receptor-mediated supralinear integration to disease-relevant pathways, offering a mechanistic readout for neurotherapeutic screening.
- Operational Value: Adaptable to visible light for optogenetics, allowing translation from acute slice studies to chronic in vivo models.
Pipeline & Workflow Integration
The DMD photostimulation system fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, particularly for neuroscience targets involving synaptic signaling and dendritic computation.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by testing how spatial input patterns influence postsynaptic responses, informing target engagement strategies.
- Screening: Enables quantitative, patterned stimulation as a functional readout for compound effects on dendritic integration.
- Analytics: Generates measurable electrophysiological outputs (e.g., current amplitude, voltage response) that correlate with stimulation intensity and pattern.
- Translational Research: Connects NMDA-dependent nonlinearity to pathophysiological processes, supporting biomarker-aligned preclinical validation.
- Enterprise Reuse: The core DMD illumination strategy can be reused across multiple neuroscience projects requiring patterned photostimulation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in neuronal mechanism models through controlled, repeatable dendritic stimulation paradigms.
- Operational Value: Standardized light delivery and speckle reduction improve inter-experiment consistency and cross-team collaboration.
- Strategic Value: Reduces biological risk in target selection by clarifying nonlinear integration properties early in discovery.
- Portfolio Impact: Informs go/no-go decisions by providing mechanistic insight into how therapeutic compounds may affect dendritic signal processing.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical alignment, particularly for UV wavelengths where precise beam pitch and azimuth are critical.
- Depends on high-intensity laser sources and multi-mode fiber delivery with piezoelectric stretching to mitigate speckle from coherent illumination.
- Necessitates integration with electrophysiology systems (e.g., patch clamp) and software for synchronizing DMD patterning, laser gating, and data acquisition.
- Adaptation to visible light for optogenetics simplifies UV-specific constraints but retains need for conjugate plane alignment and GUI-based pattern control.
- Practical limitations include the need for conjugate image plane accessibility, which may require optical path modifications on upright microscopes.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:58
Introduction
1:19
Introduction to DMD Chips and General Design Considerations
4:12
Illumination of the DMD
6:14
Operation of the System
7:16
Representative Results Demonstrating Patterned Photostimulation with DMDs to Investigate Dendritic Integration across Branch Points
8:43
Conclusion
