Desenli Photostimulation Şube Noktaları Arasında Dendritik Entegrasyon Araştırma Digital Micromirror Cihazlar

Bu prosedürün genel amacı, nöronları uyarmak için kullanılabilecek şekilde, ışığın zaman ve mekan içindeki karmaşık modellerini kontrol etmektir. Bu, öncelikle optik yol üzerindeki uygun bir konjugat görüntü düzlemine bir DMD çipi yerleştirilerek gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, DMD'nin lazer gibi yoğun bir ışık kaynağı ile uygun şekilde aydınlatılmasıdır.

Prosedürün üçüncü adımı, koherent aydınlatmanın beneklenme etkisini ortadan kaldırmaktır. Prosedürün son adımı ise DMD çipini kontrol etmek için bir grafik kullanıcı arayüzü entegre etmektir. Sonuç olarak, daha önce gerçekleştirilmesi zor olan deneylerin, DMD sistemi kullanılarak kafesli nörotransmitterlerin çok bölgeli lizizi aracılığıyla artık nispeten kolay bir şekilde tamamlanabildiğini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Merhaba, ben Michael Mohammed; University of Maryland Nöroloji Bölümü'ndeki Dr. Chaman Tang'in laboratuvarındayım. Bugün size, bir optik mikroskobunda karmaşık eliminasyon paternleri oluşturma prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü dendritik entegrasyonu incelemek için kullanıyoruz.

Hadi başlayalım. Bu protokol, deneysel nörobilim için dijital mikro ayna aygıtı veya DMD aydınlatma sisteminin çalışmasını gösterecektir. DMD, yüzeyinde dikdörtgen bir dizi şeklinde düzenlenmiş birkaç yüz bin mikroskobik hareketli aynaya sahip optik bir yarı iletken çiptir; her bir aynanın konumu bir görüntünün pikseline karşılık gelir.

Her bir ayna, iki yönelim arasında eğilecek şekilde ayrı ayrı kontrol edilebilir. Kapalı yönelimde, ışık numune aydınlatma optik ekseninden uzağa yönlendirilir. Açık yönelimde ise ışık, optik eksen boyunca yönlendirilir.

DMD, çok yoğun UV ışığına tolerans göstermesi, açık ve kapalı pikseller arasında yüksek kontrast oranları üretmesi ve iki durum arasında on mikrosaniyelik sürelerde geçiş yapabilmesi nedeniyle lizis için oldukça uygundur. DMD'lerin biyomedikal araştırmalarda kullanımı, görüntü işleme yazılım ve donanımlarının yaygınlığına ve görüntüleme alanıyla ilgilenen ticari girişimlere dayanmaktadır. Modüler bileşenler, Texas Instruments tarafından DMD'yi bir mikroskobik sisteme uyarlamak için gerekli destekleyici elektronik sürücüleri sağlayan DLP keşif kitleri olarak pazarlanmaktadır.

Mikroskopi optiğine ilişkin temel kavramların anlaşılması gerekir. Temel modern floresan mikroskobu, bir görüntüleme yolu ve bir aydınlatma yolundan oluşur. Bu sistem; bir objektif, bir filtre küpü ile görüntüleme ve aydınlatma yolları için iki ayrı tüp lensten meydana gelir.

Mikroskop, numune görüntü düzlemine konjuge konumlar olacak şekilde tasarlanmıştır; böylece numune düzleminde odaklanmış olan nesneler, bu konjuge görüntü düzlemlerinde de odaklanmış olarak görünecektir. Bu kavramın bir sonucu olarak, konjuge görüntü düzleminde oluşturulan herhangi bir parlak görüntü, numune görüntü düzlemine de net bir şekilde yansıtılacaktır. Bu strateji, bilgisayar tarafından oluşturulan bir aydınlatma desenini numune üzerine yansıtmak için kullanılır.

Lazer ışını, konjuge bir görüntü düzleminde konumlandırılmış DMD çiplerindeki mikro aynalar tarafından uygulanan deseni aydınlatacak çok parlak bir ışık kaynağı görevi görür. Bir DMD aydınlatma sisteminin tasarımı, optogenetik deneyler için kullanılan ve görünür dalga boyunda ışık kullanan eksitasyon ışıklarına bağlıdır. Aydınlatılmış desen, kamera yolu üzerinden getirilebilir.

Bu nedenle, DMD çipi basitçe çift kamera portlu bir modülün iki kamera portundan birine monte edilebilir. Aksine, kafesli bileşiklerin lizisi gibi UV aralığında ışık kullanan deneyler için, ışık epi aydınlatma yolu üzerinden getirilmeli ve daha erişilebilir bir konjugat görüntü düzlemi oluşturulmalıdır. Bunun nedeni, görüntüleme tüp lensinin UV geçirgenliği için tasarlanmamış olmasıdır.

Bunun yerine, aydınlatma tüp lensi UV iletimi için kullanılır ve görüntü oluşturma konusunda yeterli bir işlev görür. DMD üzerindeki her bir mikro ayna, çip düzlemine göre +12 ve -12 derecelik eğimler arasında geçiş yapabilir. Bilgisayardan aldığı dijital girişe bağlı olarak, dönme ekseni her bir aynanın diyagonal köşeleri boyunca, çipin dikdörtgen kenarlarına 45 derece açıyla yerleşiktir.

Ayna eğiminin yönü, çipin ön yüzeyinin bir köşesindeki altın renkli bir üçgen ile belirtilmiştir. Mikro aynanın eğimi, gelen aydınlatma ışınının pitch ve azimuth hizalamasını belirler. DMD'yi aydınlatmak için öncelikle aydınlatma ışınının pitch değerini DMD çipinin dik ekseninden 24 derece olacak şekilde ve azimuth değerini ayna dönme eksenine dik olacak şekilde yapılandırın.

Verimli çalışma için hassas ışın hizalaması kritik öneme sahiptir. Lizis deneyleri için, hızlı kafes dışına çıkarma (uncaging) işlemi için gerekli olan yüksek yoğunluklu odaklanabilir ışını oluşturmak amacıyla bir lazer kaynağı kullanın.

Burada, lazer çıktısının yalnızca küçük bir kısmının numuneye iletildiği nedeniyle, nispeten yüksek güçlü bir lazer olan yarı sürekli diyot pompalı katı hal frekans üçlemeli Nd:YAG lazer kullanılmıştır. Bir DMD sistemi kullanılırken, lazer çıktısını çok modlu bir fiber içine yönlendirin; böylece lazer, DMD'yi aydınlatmak için doğru eksen boyunca kolayca konumlandırılabilir ve yönlendirilebilir, böylece koherent aydınlatmadan kaynaklanan beneklenme (speckle) sorununa bir çözüm sağlanmış olur; ışığı optik fiber aracılığıyla iletin.

Fiber, yaklaşık 40 kilohertz frekansta salınım yapacak şekilde sürülen bir piezo elektrikli fiber gericiye sarılmıştır. Fiberin mikroskobik düzeyde gerilmesi, her bir foto stimülasyon darbesinin milisaniyelik süresi boyunca benekli paternini birçok kez hareket ettirmek için yeterlidir ve böylece beneklenmeyi etkili bir şekilde ortadan kaldırır. Son olarak, optik fiberin çıkışı, DMD'leri aydınlatmak için bir UV mikroskop objektifi ile kolime edilmiş; CCD piksellerini, bireysel DMD aynalarını görüntüleme CCD kamerasının belirli pikselleriyle ilişkilendiren DMD görüntü yazılımı ile birlikte eş zamanlı olarak kaydetmek için kullanılmıştır.

Yazılım içindeki grafik kullanıcı arayüzü, kullanıcının bilgisayar faresiyle grafik kullanıcı arayüzünü kullanarak DMD ayna yönlendirmesini CCD görüntüsü üzerindeki ilgili bölgeye atamasını sağlar. Bilgisayar ekranında görüntülenen resim üzerinde imleci hareket ettirerek foto-stimülasyon konumunu işaretleyin ve ışık iletim kalıpları deposunu programlamak için işaretlenen ilgi bölgesine tıklayın. Bilgisayar ekranında bir dizi ayrı görüntü olarak işaretlenen kalıplar, her bir uzamsal kalıp için lazer darbelerinin zamanlamasını yazılıma programlar.

Bu sistem, P clamp veri toplama programı ile entegre edilecektir. Son olarak, DMD elektroniklerinin zamanlamasını, lazer kaplamasını ve hedef nöronla yapılan patch clamp işleminden elde edilen elektriksel sinyalin toplamasını koordine etmek için veri toplama programını kullanın. Burada, optik sistem çözünürlüğünün kalibrasyonu gösterilmektedir.

Minimum nokta boyutu, floresan bir hedeften ölçüldüğü şekilde gösterilmiştir. Etkili fizyolojik çözünürlük, foto-stimülasyonun bir fonksiyonu olarak akım akışının genliği ile ölçülür. Nokta konumunda, kafeslenmiş glutamat, iki mikrometre çapındaki bir dendritik dala komşu olarak foto-uyarılmıştır.

Leke hareket ettirildikçe, farklı yoğunluklardaki foto-stimülasyona karşı elektrik yanıtlar diklemesine olarak gösterilmiştir. Voltaj klempli yanıtlar, lizis yoğunluğunun bir fonksiyonu olarak sunulmuştur.

Dağıtılmış dendritik stimülasyon, DMD tabanlı bir sistem kullanılarak kolayca uygulanabilir. Burada, giriş yoğunluğu, iki dendritik dal üzerindeki dairelerle işaretlenmiş foto-stimülasyon noktalarının sayısı artırılarak değiştirilmiştir. Uzamsal toplam, dallanma noktaları boyunca doğrusal olmayabilir.

İki kapı branşına ulaşan giriş genlikleri arttıkça, süreç giderek süper doğrusal hale gelir. Bu sonuçlar, dendritik branş noktaları boyunca gerçekleşen toplamanın doğrusal olmayan doğasını açıkça ortaya koymaktadır. Süper doğrusallık, büyük ölçüde voltaj bağımlı kanallar tarafından değil, NMDA reseptörleri tarafından aracılanmaktadır.

Bu durum, iki NMDA antagonisti olan APV ve MK 801'in uygulanmasıyla gösterilebilir; bu maddeler doğrusal olmayan davranışı büyük ölçüde ortadan kaldırır. Sinir dokusunun desenli foto-stimülasyonu için DMD tabanlı bir sistemin temel tasarımını ve çalışmasını göstermiş olduk. Sistem, optogenetik deneylerde kullanılan görünür ışıkla stimülasyon için uyarlanabilir.

Ayrıca tek foton lizisinde kullanıldığı gibi yakın UV ışıklar için de uyarlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, 400 nanometreden düşük dalga boyunda bir ışık kullanılacaksa ve çoğu kişinin yaptığı gibi epi aydınlatma yolu tercih edilecekse, aydınlatma ışınının birkaç derecelik hassasiyetle hizalanmasının kritik olduğunu ve eğer koherent bir ışık kullanılıyorsa, beneklenmenin (speckling) etkili bir şekilde ortadan kaldırılması gerektiğini unutmamak önemlidir. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.