Name: Kinesin Powered Moleküler minibüsleri üzerine Kargo Yükleniyor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Öğrenin, kinesin motor proteinleri üzerinde kayan mikrotübüllere nanokürelerin yüklenmesi yöntemini. Bu sistem, nanobotanik ve biyofizik alanlarında hücre içi taşıma mekanizmalarını incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz yoğun olan grup, daha sonra bize adapte oldu bir kayma motilite tayini için temel protokolü geliştirildi Jonathon Howard, borçlu. NSF hibe DMR0645023 mali destek minnetle kabul edilmektedir.

1) Tamponlar ve Reaktifler Bu çözümler, önceden hazırlanmış ve uygun büyüklükteki alikotları saklanmalıdır. Bir kısım tipik bir deney ve taze bir kısım her motilite tayini için kullanılması gereken yeterli bir çözüm bulunmalıdır. Saklama koşulları ve tipik kısım boyutları da aşağıdaki protokollerden söz edilmektedir. 1. BRB80 tampon, (80 mM BORU, 1 mM MgCl 2, 1 mM EGTA deiyonize distile (dd) su, KOH ile 6.9 pH değeri ayarlanmış) <ul><li> Gg su EGTA 0.5 M 100 mL stok çözelti olun. 2 M NaOH çözeltisi ile 7.0 pH ayarlayın. </li><li> 1 M MgCl 2 gg su 100 mL stok çözelti olun. Çözüm Otoklav. </li><li> 24,2 g BORU ve gg su yaklaşık 800 ml, 3,1 g KOH pelet ekleyin ve erimesi için karıştırın. 1 M KOH çözeltisi kullanılarak 6.9 pH ayarlayın. 0.5 M EGTA stok solüsyonu ve 1 mL 1 M MgCl 2 stok solüsyonu 2 ml ekleyin. Gg su ile hacmi 1000 ml 'ye kadar getirin. </li><li> Ileride kullanmak üzere -20 ° C'de 50 ml şahin tüpleri ve dondurma haline kısım. BRB80 tüp şu anda kullanılmakta olan 4 ° C ya da oda sıcaklığında saklanabilir. </li></ul> 2. Magnezyum Klorür, MgCl 2 (100 mM gg su) <ul><li> 100 mM son bir konsantrasyon elde etmek için gg su sulandırınız. </li><li> Ileride kullanmak üzere -20 ° C'de 0.5 mL mikrosantrifüj tüpleri ve mağaza içine kısım (10 mcL hacmi) </li></ul> 3. Guanozin-5'-trifosfat, disodyum tuzu, GTP (25 mM NaOH tarafından 7 ayarlanabilir gg su, pH) <ul><li> Tartılır ve gg suda çözülür ve 2 M NaOH çözeltisi ile pH ayarlamak 7. </li><li> 260 nm dalga boyunda UV absorbans ölçerek konsantrasyon olun. (11.7 x 103 M -1 cm -1 bir sönüm katsayısı kullanın). </li><li> 0.5 mL mikrosantrifüj tüpleri ve gelecekte kullanılmak üzere -20 ° C'de muhafaza içine kısım (10 mcL hacim). </li></ul> 4. Dimetil sülfoksit, DMSO <ul><li> 0.5 mL mikrosantrifüj tüpleri ve gelecekte kullanılmak üzere -20 ° C'de muhafaza içine kısım (10 mcL hacim). </li></ul> 5. Taxol (DMSO 1 mM) <ul><li> Tartılır ve 1 mM son bir konsantrasyon elde etmek için davlumbaz altında DMSO içinde çözülür. </li><li> 0.5 mL mikrosantrifüj tüpleri ve gelecekte kullanılmak üzere -20 ° C'de muhafaza içine kısım (20 mcL hacim). </li></ul> 6. D-(+)-Glikoz (gg su 2 M) <ul><li> Tartılır ve 2 M. nihai bir konsantrasyon elde etmek için gg su içinde çözülür </li><li> 0.5 mL mikrosantrifüj tüpleri ve gelecekte kullanılmak üzere -20 ° C'de muhafaza içine kısım (20 mcL hacim). </li></ul> 7. Glikoz Oksidaz, (BRB80 içinde 2 mg / ml) <ul><li> 2 mg / ml son bir konsantrasyon elde etmek için BRB80 içinde eritin. </li><li> 0.5 mL mikrosantrifüj tüpleri ve gelecekte kullanılmak üzere -20 ° C'de muhafaza içine kısım (20 mcL hacim). </li></ul> 8. Dithiothreitol, DTT (1 M gg su) <ul><li> 1 M. nihai bir konsantrasyon elde etmek için, davlumbaz altında gg suda çözülür </li><li> 0.5 mL mikrosantrifüj tüpleri ve gelecekte kullanılmak üzere -20 ° C'de muhafaza içine kısım (20 mcL hacim). </li></ul> 9 - Katalaz, (BRB80 içinde 0.8 mg / ml) <ul><li> 0.8 mg / ml son bir konsantrasyon elde etmek için en az 2 kademeli BRB80 içinde eritin. UV absorbansı 276 nm ve 406 nm (276 nm de 3.1 x 10 5 M -1 cm -1 ve 2.2 x 5 10 M 406 nm'de -1 cm -1 bir sönüm katsayısı kullanın ölçerek her aşamada konsantrasyonunu belirlemek ve denklemi A = cL). </li><li> 0.5 mL mikrosantrifüj tüpleri ve gelecekte kullanılmak üzere -20 ° C'de muhafaza içine kısım (20 mcL hacim). </li></ul> 10 Adenozin-5'-trifosfat, ATP (100 mM MgCl 2 100 mM) <ul><li> Gg su içinde 100 mM MgCl 2 stok solüsyonu hazırlayın. Kuru toz tartılır ve 100 mM son bir konsantrasyon elde etmek için bu stok solüsyonu çözülür. </li><li> 260 nm dalga boyunda UV absorbans ölçerek konsantrasyon olun. (15,4 x 10 3 M -1 cm -1 bir sönüm katsayısı kullanın). </li><li> 0.5 mL mikrosantrifüj tüpleri ve gelecekte kullanılmak üzere -20 ° C'de muhafaza içine kısım (20 mcL hacim). </li></ul> 11. Kazein çözeltisi (20 mg / ml kazein BRB80 içinde) <ul><li> Yaklaşık 3 g kazein, 30 ml, 50 ml şahin tüp dd su ekleyin. Vorteks çözüm yaklaşık 1 saat kadar kalın tutarlılık geliştirir. </li><li> 30 dakika boyunca yaklaşık 15000 gr santrifüjleyin. Filtre 0.5 mikron ve 0.2 mikron şırınga filtreler aracılığıyla süpernatantı. </li><li> UV absorbansı 280 nm (0.67 mL mg -1 cm -1 bir sönüm katsayısı kullanın) ölçerek süpernatantı konsantrasyonu belirleyin. 20 mg / ml BRB80 seyreltilir. </li><li> Kısım (20 mcL hacmi)0.5 mL mikrosantrifüj tüpler ve ileride kullanmak üzere -20 ° C'de saklayın. </li></ul> 2) Standart Çözümleri Bu deney gün hazırlanır ve deney bittikten sonra atılmalıdır. Her 1 mL hazırlayın. 1. BRB80CS0.5 <ul><li> BRB80, buz üzerinde 0.5 mg / ml ve mağaza nihai bir konsantrasyonu kazein çözüm seyreltilir. Bu çözüm, önce kinesin akış hücresi içine giriliyor ve yüzey adsorpsiyon sonra kinesin aktivite tutmak yardımcı olur. </li></ul> 2. BRB80CA <ul><li> 0.2 mg / ml kazein ve 1 mM ATP BRB80 ve buz üzerinde mağaza hazırlayın. Kinesin daha önce bu çözüm akış hücresi içine giriş kullanarak seyreltilir. </li></ul> 3. BRB80T <ul><li> BRB80 oda sıcaklığında 10 mcM ve mağaza nihai konsantrasyonu taksol çözüm sulandırınız. Bu çözüm, mikrotübül stabilize etmek için kullanılır. </li></ul> 4. BRB80CT <ul><li> 10 mcM taksol ve BRB80 0.2 mg / ml kazein ve oda sıcaklığında saklayın hazırlayın. Bu da antifade ve mikrotübül çözümler hazırlamak için kullanılır. </li></ul> 5. BRB80AF <ul><li> 20 mM D-glukoz, 20 mikrogram / ml glukoz oksidaz, katalaz 8 mcg / mL, 10 mM DTT ve BRB80CT 20 mcM ATP ve oda sıcaklığında saklayın hazırlayın. Bu çözüm streptavidin ve nanokürecikler sulandırmak için kullanılan ve akış hücresi aşırı streptavidin "yıkama". Kinesin hızı bu çözüm ATP konsantrasyonu ayarlayarak kontrol edilebilir. </li></ul> 3.) kinesin Hazırlık <ul><li> Express kinesin yabani tip, tam uzunlukta Drosophila melanogaster kinesin ağır zincir ve C-terminal Onun Escherichia coli-tag oluşan inşa ve 6 açıklandığı gibi bir Ni-NTA sütun kullanarak arındırmak. </li><li> -80 0,5 mL mikrosantrifüj tüpleri ve mağaza alikotları (10 mcL her) ° C ileride kullanmak üzere. Bu alikotları aktif kinesin konsantrasyonu yaklaşık 200 nM. 7 </li><li> Tipik bir deneme için, kinesin çözüm BRB80CA 20 kat sulandırmak. Buz üzerinde çözüm KIN20 ve mağaza etiketleyin. </li></ul> 4.) Mikrotubul Hazırlık <ul><li> 0,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüp, 25 mcL büyüme çözüm hazırlamak: 4 mM MgCl 2, 1 mM GTP ve% 5 DMSO (v / v) BRB80 tampon. </li><li> 20 mg liyofilize biotinlenmiş tubulin bir kısım için bu çözüm 6.25 mcL ekleyin. </li><li> 37 ısı banyo Vortex, sonra yerde ° C ila 30 dakika polimerize. Yavaşça BRB80T ve vorteks 100 kat sulandırınız. Oda sıcaklığında çözüm MT100 ve mağaza etiketleyin. </li><li> BRB80AF MT100, 10 kat seyreltme olun. Çözüm MT1000 Etiket. </li></ul> 5) Streptavidin ve Nanokürecikli Çözüm BRB80AF 100 nM bir konsantrasyon AlexaFluor568-etiketli streptavidin hazırlayın. Buz üzerinde STV100 ve mağaza etiket. Aynı şekilde, BRB80AF çözüm nanokürecikler 5000 kat sulandırmak. Buz üzerinde NS5000 ve mağaza Etiket. 6.) Akış Hücre İnşaat Çift taraflı bant ile ayrılmış iki cam lamelleri kullanarak flowcell oluşturun. Bu akış hücresi, yaklaşık 2 cm uzunluğunda 1 cm genişliğinde ve 100 mm yüksekliğinde ve yaklaşık 20 mcL bir hacmi vardır. Çözümleri filtre kağıdı kullanarak diğer bir pipet ve kötülerin dışarı kullanarak, bir taraftan akış hücresi içine tanıtıldı. 7) Ters Testi Meclisi Cam yüzey ilk kinesin adsorpsiyon üzerine, onun işlevselliğini korumak sağlar kazein ile kaplanmıştır. Kinesin adsorbe sonra, mikrotübül kinesin tarafından tutuldukları tanıtıldı. Mikrotübüller sonra floresan streptavidin ile kaplıdır. Aşırı streptavidin yıkadıktan sonra, biotinlenmiş polistiren floresein nanokürecikler (40 nm çapında) tanıtıldı. Yüzey adsorbe sabit nanokürecikler hareketli mikrotübül ile çarpışır ve onları (Şekil 1) yüklenir. Sonraki çözüm getirilmesi önce izin çözümler ve zaman akış sırasına göre aşağıda listelenmiştir. <ul><li> BRB80CS0.5, 5 dakika </li><li> KIN20, 5 dakika </li><li> MT1000, 5 dakika </li><li> STV100, 5 dakika </li><li> BRB80AF, 3x </li><li> NS5000 </li></ul> 8) Mikroskopi Nanokürecikli giriş hemen sonra mikroskop sahnede akış hücresi monte edin. Bu deneyde, bir 100X petrol hedefi (NA 1.45), bir X-cite 120 lambası (EXFO, Ontario, Kanada) ve bir IXON EMCCD kamera (ANDOR, Eclipse TE2000-U floresan mikroskop (Nikon, Melville, NY) ile donatılmış South Windsor, CT) kullanılmıştır. FITC filtresi küp (# 48001) ve TRITC filtre küp (# 48002, Chroma Teknolojileri, Rockingham, VT), görüntü nanokürecikler ve mikrotübül respecti için kullanılır.vely alt yüzey akış hücreleri. Maruz kalma arasındaki süre 2 sn iken maruz kalma süresi, 0.2s <img src="/files/ftp_upload/2006/2006fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Moleküler mekik şematik çizim.

<ol><li>Agarwal, A., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+motors+at+the+intersection+of+nanotechnology+and+polymer+science%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Biomolecular motors at the intersection of nanotechnology and polymer science.</a> Progress in Polymer Science. 35 (1-2), 252-252 (2010).</li>
<li>Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+microtubule+movement+driven+by+single+kinesin+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules.</a> Methods Cell Biol. 39, 137-137 (1993).</li>
<li>Agarwal, A., Katira, P., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond+curing+time+of+a+molecular+adhesive+causes+velocity-dependent+cargo-loading+of+molecular+shuttles%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Millisecond curing time of a molecular adhesive causes velocity-dependent cargo-loading of molecular shuttles.</a> Nano Lett. 9 (3), 1170-1170 (2009).</li>
<li>Diez, S., Reuther, C., Dinu, C., Seidel, R., Mertig, M., Pompe, W., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+and+Transporting+DNA+Molecules+Using+Motor+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Stretching and Transporting DNA Molecules Using Motor Proteins.</a> Nano Lett. 3 (9), 1251-1251 (2003).</li>
<li>Bachand, G. D., Rivera, S. B., Boal, A. K., Gaudioso, J., Liu, J., Bunker, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+transport+of+nanocrystal+CdSe+quantum+dot+nanocomposites+using+microtubules+and+kinesin+motor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Assembly and transport of nanocrystal CdSe quantum dot nanocomposites using microtubules and kinesin motor proteins.</a> Nano Lett. 4 (5), 817-817 (2004).</li>
<li>Coy, D. L., Wagenbach, M., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+takes+one+8-nm+step+for+each+ATP+that+it+hydrolyzes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Kinesin takes one 8-nm step for each ATP that it hydrolyzes.</a> J. Biol. Chem. 274 (6), 3667-3667 (1999).</li>
<li>Katira, P., Agarwal, A., Fischer, T., Chen, H. -Y., Jiang, X., Lahann, J., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+performance+of+protein-resisting+surfaces+at+ultra-low+protein+coverages+using+kinesin+motor+proteins+as+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Quantifying the performance of protein-resisting surfaces at ultra-low protein coverages using kinesin motor proteins as probes.</a> Advanced Materials. 19, 3171-3171 (2007).</li>
<li>Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Microtubules+Break+Up+Under+Illumination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination.</a> J. Cell Biol. 107, 1011-1011 (1988).</li>
<li>Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -H., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifetime+of+biomolecules+in+hybrid+nanodevices%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices.</a> Nanotechnology. 15 (10), S540-S540 (2004).</li>
</ol>

Küçük değişiklikler ile bu protokolü kinesin-mikrotübül tabanlı motilite testleri başarıyla monte etmek için çeşitli gruplar tarafından kullanılan olmuştur. Son motilite çözüm 10 mM DTT,% 0.5 &#39;β-mercaptoethanol ile değiştirilebilir. 2 saatten fazla standart çözümler (BRB80AF KIN20 ve MT1000) olmamalıdır. Taksol ve özellikle mikrotübül içeren herhangi bir çözüm, buz üzerinde atÛlmamalÛdÛr. Işlevsel bileşenleri fotohasar UV uyarma ışık akışını hücrenin aşırı maruz kalma: mikrotübül ve kinesin akış hücresi gibi polistr...

<table><tbody><tr><td>Adenozin-5&amp;rsquo;-trifosfat (ATP)</td><td>Invitrogen</td><td>A1049</td><td></td></tr><tr><td>Biyotinli tubulin</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>T333</td><td></td></tr><tr><td>Kazein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-0376</td><td></td></tr><tr><td>Katalaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-9322</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7528</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsülfoksit (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-8779</td><td></td></tr><tr><td>Ditiyotreitol (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0610</td><td></td></tr><tr><td>Etilen glikol-bis(2-amino&amp;#8211;etileter)-&lt;em&gt;N,N,N&amp;#8242;,N&amp;#8242;&lt;/em&gt;-tetraasetik asit (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-4378</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres Biyotinlenmiş mikroküreler, 40 nm, sarı-yeşil floresan (505/515)</td><td>Invitrogen</td><td>F-8766</td><td></td></tr><tr><td>Glukoz oksidaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7016</td><td></td></tr><tr><td>Guanozin-5&amp;rsquo;-trifosfat (GTP)</td><td>Roche Group</td><td>106399</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum Klorür (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63069</td><td></td></tr><tr><td>Paklitaksel (Taxol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1912</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Piperazindietansülfonik asit, Piperazin-1,4-bis(2-etansülfonik asit), Piperazin-N,N&amp;#8242;-bis(2-etansülfonik asit) (PIPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6757</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum hidroksit (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6310</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>480878</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Alexa Fluor 568 konjugatı</td><td>Invitrogen</td><td>S11226</td><td></td></tr></tbody></table>

kinesin powered moleküler minibüsleri üzerine kargo yükleniyor

Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles

Hücreler kinesin motor proteinlerin ve mikrotübül filamentler gibi aktif hücre içi kargo taşımacılığı desteklemek için, gelişmiş moleküler makineler gelişmiştir. Kinesins kuyruk etki alanı yüklerin çeşitli bağlar iken, kinesins baş etki alanı mikrotübül kafes boyunca adım ATP molekülleri depolanan kimyasal enerjiyi kullanır. Uzun, sert mikrotübül, uzun mesafe hücre içi ulaşım için parça olarak hizmet vermektedir. Bu motorlar ve filamentler, aynı zamanda moleküler mekik 1 bileşenleri olarak microfabricated sentetik ortamlarda istihdam edilebilir. Sık kullanılan bir tasarım, kinesin motorlar kendi kuyrukları ile parça yüzey demirlemiş ve Fonksiyonlu mikrotübüllerin bu motorlar ile hareketli yük taşıyan unsurları, olarak hizmet vermektedir. Bu mekik, biotin ve streptavidin arasında güçlü ve seçici bir bağlayıcılığı kullanan kargo ile yüklenebilir. Anahtar bileşenleri (biotinlenmiş tubulin, streptavidin ve biotinlenmiş kargo) ticari olarak kullanılabilir. Klasik ters motilite tayini 2 Bina, inşaat moleküler mekiklerinin burada ayrıntılı. Kinesin Motor proteinleri kazein ile kaplanmış bir yüzeye adsorbe; mikrotübül, biotinlenmiş tubulin polimerize kinesin yapıştırılır ve daha sonra rodamin etiketli streptavidin ile kaplı. ATP konsantrasyonu kargo 3 yükleme için optimum bir mikrotübül kayma hızı elde etmek için subsaturating konsantrasyon tutulur. Son olarak, biotinlenmiş floresein etiketli nanokürecikler kargo olarak eklenir. Nanokürecikler kayma yüzeyine yapışan mikrotübül ve nanokürecikler arasındaki çarpışmalar sonucu olarak mikrotübül eklemek. Protokol biotinlenmiş DNA 4, kuantum noktaları 5 veya biotinlenmiş antikorlar 4-6 aracılığıyla antijenleri geniş bir yelpazede çeşitli yüklerin kolayca yüklemek için modifiye edilebilir.

Fonksiyonlu mikrotübül üzerinde kayma yüzeyi yapıştırılır kinesin motorlu proteinlerinin nano ölçekli bir taşıma sistemi olarak hizmet verebilir oluşan Moleküler mekik. Burada, tipik bir servis sistemi montaj açıklanmıştır.

Kinesin Powered Moleküler minibüsleri üzerine Kargo Yükleniyor

Hücreler, aktif hücre içi taşımayı desteklemek için kinesin motor proteinleri ve mikrotübül filamentleri gibi gelişmiş moleküler mekanizmalar geliştirmiştir...

Bu prosedürün genel amacı, kinesin motorları ile kaplanmış bir yüzey üzerinde kayan mikrotübüllere nanoküreler yüklemektir. Bu işlem, öncelikle bir cam akış hücresinin yüzeyinin kazein solüsyonu ile kaplanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, kinesin motor proteinlerinin akış hücresi yüzeyine absorbe edilmesidir.Prosedürün üçüncü adımı mikrotübüllerin eklenmesidir. Prosedürün son adımı, mikrotübüllere bağlanacak olan streptavidin moleküllerini eklemek ve ardından nanokürecikleri eklemektir. Nanokürecikler, mikrotübüller tarafından yakalanabilecekleri akış hücresi yüzeyine bağlanır.Sonuç olarak, nanosferlerin mikrotübüller tarafından nasıl yakalandığı ve yüzey boyunca nasıl taşındığı floresan mikroskobu kullanılarak gözlemlenebilir. Merhaba, ben Dr. Henry Hess'in laboratuvarından ve Florida Üniversitesi Malzeme Bilimi ve Mühendisliği Bölümü'nden Elaine Jen Smith. Bugün size ters motilite analizi prosedürünü göstereceğiz.Laboratuvarımızda, kargonun mikrotübüllere yüklenmesini ve moleküler mekiklerin hareketini incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu prosedüre başlamadan önce, tüm stok çözeltileri bu videonun yazılı kısmında açıklandığı şekilde taze olarak hazırlayın.Stok çözeltiler hazırlandıktan sonra, 0,65 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne 25 mikrolitre büyüme çözeltisi pipetleyerek mikro tübül hazırlığına başlayın. Ardından, 20 mikrogram liyofilize biotinillenmiş tübuline 6,25 mikrolitre büyüme çözeltisi ekleyin. Çözeltiyi vorteksleyin ve polimerizasyon için 37 derece Celsius sıcaklıktaki bir ısı banyosunda 30 dakika bekletin; inkübasyonun ardından çözeltiyi Taxol Tamponu ile 100 kat seyreltin ve hafifçe vorteksleyin.Bu solüsyon mikrotübülleri stabilize etmeye yarar. Solüsyonu MT 100 olarak etiketleyin ve oda sıcaklığında saklayın. Ardından, anti-fade tamponu içerisinde MT 100'ün on katlık bir dilüsyonunu hazırlayın ve bu solüsyonu MT 1000 olarak etiketleyin.Ardından, kinesin çözeltisini TP tamponu içerisinde 20 kat seyrelterek Kinesin motorlarını hazırlayın. Çözeltiyi "kinase in 20" olarak etiketleyin ve buz üzerinde saklayın. Son olarak, streptavidin ve nanoküre çözeltilerini hazırlayın.İlk olarak, Antifa Buffer içerisine 100 nano molars konsantrasyona gelecek şekilde Alexa Fluor 5 6 8 işaretli streptavidin ekleyin. Çözeltiyi STV 100 olarak etiketleyin, ardından nanoküreleri Antifa Buffer ile 5, 000 kat seyreltin ve bu karışımı NS 5, 000 olarak etiketleyin. Her iki çözeltiyi de buz üzerinde saklayın.Kargo yükleme analizi için çözelti hazırlığının ardından, çift taraflı bantla birbirinden ayrılmış bir lamel ve cam örtü lameli kullanarak bir akış hücresi oluşturun. İlk olarak, iki şerit çift taraflı bandı, şeritler arasında yaklaşık bir santimetrelik bir boşluk bırakacak şekilde bir lamelin kenarlarına yapıştırın. Ardından, bir örtü lamelini bandın üzerine yerleştirin.Sızdırmazlık sağlamak için bir cımbızın düz kenarını kullanarak lamel üzerine baskı uygulayın. Oluşturulan akış hücresi yaklaşık iki santimetre uzunluğunda, bir santimetre genişliğinde ve 100 mikron yüksekliğindedir ve yaklaşık 20 mikrolitrelik bir hacme sahiptir. Ters analiz düzeneğinin kurulumuna başlamak için.Pipet ucunu lamel ile lam arasına yerleştirin. Ardından, akış hücresine 0.5 mg/mL kazein çözeltisi enjekte edin. Akış hücresindeki bu kaplama, kinesinin absorpsiyon sonrası işlevselliğini korumasını sağlayacaktır.Kazein solüsyonunun kaplama yapması için beş dakika bekleyin. Ardından, pipet ucunu lam ve lamel arasına yerleştirerek 20 solüsyon çözeltileri halindeki kinazı akış hücresine aktarın ve Kinezin'in akış hücresine absorbe olmasını sağlayın. Daha sonra solüsyon akış hücresine bir taraftan enjekte edilirken, eş zamanlı olarak diğer taraftan emilerek dışarı çıkarılır.Filtre kağıdı kullanarak, kinazın emilmesi için beş dakika bekleyin. Ardından, MT 1000 solüsyonunu akış hücresine pipetleyerek mikrotübülleri akış hücresine aktarın. Mikrotübüllerin kinaz motorlarına tutunmasının ardından, mikrotübüllerin çökmesi ve kinaz motorlarına bağlanması için beş dakika bekleyin.STV 100 çözeltisini akış hücresine ekleyerek mikrotübülleri floresan işaretli strep TTR ile kaplayın. Strep TTR moleküllerinin mikrotübüllere bağlanması için beş dakika bekleyin. Akış hücresine üç kez 30 µL Antifa çözeltisi ile yıkama yaparak fazla strep TTR'yi uzaklaştırın.Son olarak, NS 5,000 çözeltisini akış hücresine pipetleyerek biyotinlenmiş polistiren floresein nanokürelerini ekleyin. Yüzey sabitleyici olarak emilim yapar. Nanoküreler hareket halindeki mikrotübüllerle çarpışacak ve onların üzerine yüklenecektir.Bu deneyde, 100 x yağlı objektif, X site, tek bir 20 lamba ve bir exon E-M-C-C-D kamera ile donatılmış bir eclipse TE 2000 U floresan mikroskobu kullanılmıştır. Öncelikle, objektifin üzerine bir damla immersiyon yağı damlatın. Ardından, trixy filtre küpünü kullanarak akış hücresini mikroskop tablasına yerleştirin.Mikrotübülleri odağa getirin, ardından nanoküreleri görüntülemek için fitzy filtre küpüne geçin. Sonrasında, and veya I exon programını açın ve kazanım modunu kinetik olarak ayarlayın. 0,5 saniyelik bir pozlama süresi, 20'lik bir kinetik seri uzunluğu ve altı saniyelik bir kinetik döngü süresi kullanın.Mikroskobu okülerden kameraya geçirin ve görüntüleri almaya başlayın. İlk dört görüntü için mikrotübülleri görüntülemek üzere trixi küpünü kullanın. Sonraki 12 görüntü için nanokürelerin görüntülerini almak amacıyla Fitz filtre küpüne geçiş yapın.Ardından tekrar trixi filtre küpüne geçiniz. Mikrotübülleri görüntülemek için çekilen son dört görüntüde, mikrotübüller Trissy filtre küpü kullanılarak gözlemlenmiş, filtre küpü fite konumuna getirilmiştir. Buradaki nanoküreleri görselleştirmek için, mikrotübüller tarafından taşınan nanoküreler oklarla belirtilmiştir. Tüm nanoküreler mikrotübüller tarafından yakalanmamıştır.Şimdi, nanokürelerin konumunun 36 saniye sonraki görünümü, nanokürelerin yer değiştirdiğini ortaya koymaktadır. Mikrotübüller tekrar görüntülendiğinde, mikrotübüllerin de görüş alanı boyunca hareket ettiği açıkça görülmektedir. Bu görüntüler, nanokürelerin mikrotübüler taşıma nedeniyle yer değiştirdiğini kanıtlamaktadır.Ters hareketlilik analizinin nasıl gerçekleştirileceğini size göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, görüntüler alınırken hem mikrotübüllerin hem de nanokürelerin görülebilmesi için filtre küplerinin değiştirilmesinin önemli olduğunu unutmayın. Hepsi bu kadar.İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

cargo-loading-onto-kinesin-powered-molecular-shuttles

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Tek molekül mikroskopi, nükleer taşıma yeni bakış açıları sağlanan Yaklaşım.

Tek Molekül Görüntüleme Nükleer Ulaştırma

Veziküller veya organeller gibi yüklerin hücre içi taşınması, polarize mikrotübüller üzerinde izlenen moleküler motor proteinler tarafından gerçekleştirilir. Bu protokol, nöronların içinde hareket eden bireysel kargo parçacıklarının taşınma yönlülüğünün, ilişkili motor proteinlerin nispi miktarı ve türü ile korelasyonunu tanımlar.

Kullanımı Akson Kargo Hareketli Moleküler Motors Kompozisyon karakterize &quot;Kargo Haritalama&quot; Analizi

Burada, bir protokol kinesin-1 yükleri belirlemek için sunulmuştur. Kinesin-1 ağır zincir (KIF5B) bir motorsuz mutant sitoplazmasında agrega ve kargoların agregasyonunu uyarır. Her iki agrega floresan mikroskobu altında tespit edilir. Benzer bir yöntem, diğer motor proteinlerinin yükleri tespit edilmesi için kullanılabilir.

Floresan mikroskobu kullanarak kinesin-1 Cargos Tanımlanması

Biz moleküler mekikler, kurmak için bir protokol nerede yüzeye yapıştırılır kinesin motor proteinler boya etiketli mikrotübüller itmek mevcut. Kinesins yüzeyi ile zayıf etkileşimler tersinir kendi eki sağlar. Bu dinamik montaj ve demontaj bir bileşen işlevselliğini korurken sergileyen bir nano sistemi oluşturur.

Moleküler mekikler Powered by geri dönülebilir olarak montaj Kinesins bağlı

Bu protokolün amacı, DNA origami nanoyapılar üzerinde moleküler motor toplulukları oluşturmak ve toplam iç yansıma floresan mikroskopisi kullanarak topluluk hareketliliğini gözlemlemektir.

Tek Molekülgözlem için DNA Origami Nanoyapılar üzerinde Dynein ve Kinesin Motor Toplulukları üretimi

Çift yönlü mitotik kinesin-5 Cin8, hareketlilikleri sırasında bölünen ve birleşen kümelerde birikir. Kümelerdeki birikim ayrıca Cin8'in hızını ve yönlülüğünü de değiştirir. Burada, saflaştırılmış Cin8-GFP ile motilitesi tahlilleri ve tek moleküllerin ve Cin8 kümelerinin hareketli özelliklerinin analizi için bir protokol açıklanmaktadır.

Tek Moleküllerin Motilitesi ve S. cerevisiae Hücrelerinden Saflaştırılmış Çift Yönlü Kinesin-5 Cin8 Kümeleri

Bu çalışma, kinezin-3 ailesinin bir üyesi olan KIF1A'nın (1-393LZ) Sf9-bakülovirüs ekspresyon sistemi kullanılarak saflaştırılmasını detaylandırmaktadır. Bu saflaştırılmış motorların in vitro tek moleküllü ve çok motorlu kayma analizi, memeli hücre lizatından elde edilen motorlarla karşılaştırılabilir sağlam hareketlilik özellikleri sergilemiştir. Bu nedenle, Sf9-bakülovirüs sistemi, ilgilenilen motor proteini ifade etmek ve saflaştırmak için uygundur.

Sf9 Saflaştırılmış Süperprosesif Kinesin-3 Ailesi Motorlarının Tek Moleküllü Analizi

In vitro sistemde aynı anda dört tendon kültür yüklemek için yeni bir tarif edilir.

Tendon ex vivo Mekanik Yükleniyor

Kalsiyum sinir sistemi her yerde bulunan bir haberci, sinaptik gücü nörotransmitter salınımı ve değişiklikleri tetiklenmesi için gerekli. Burada Ca 2 +-göstergeler Drosophila sinir uçları içine yüklemek için bir teknik göstermektedir. Biz de gerekli aparat imalatı göstermek ve tekniğinin başarısı için kritik noktaları vurgulamak.

Kalsiyum Göstergeleri ile yükleme Drosophila Sinir Terminalleri

Burada yönettiği, moleküler evrim yoluyla Tre recombinase nesil raporu. Tre recombinase enfekte insan hücreleri provirus eksizyon ve eradikasyon, HIV-1 provirus LTR dizileri içinde önceden tanımlanmış bir hedef sırası tanır. Hala emekleme döneminde olsa da, yönlendirilmiş moleküler evrim moleküler cerrahi ve moleküler tıp araçları olarak hizmet verecek özel enzimlerin yaratılmasına izin verecek.

Tre Recombinase Moleküler Evrim

Öğrenin, kinesin motor proteinleri üzerinde kayan mikrotübüllere nanokürelerin yüklenmesi yöntemini. Bu sistem, nanobotanik ve biyofizik alanlarında hücre içi taşıma mekanizmalarını incelemek için kullanılır.

Kinesin Powered Moleküler minibüsleri üzerine Kargo Yükleniyor

Daha fazla video keşfet