Kinesin Powered Moleküler minibüsleri üzerine Kargo Yükleniyor

Bu prosedürün genel amacı, kinesin motorlarıyla kaplanmış bir yüzey üzerinde kayan mikrotübüllere nanoküreler yüklemektir. Bu işlem, öncelikle cam bir akış hücresinin yüzeyinin kazein solüsyonu ile kaplanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise kinesin motor proteinlerinin akış hücresi yüzeyine absorbe edilmesidir.

Prosedürün üçüncü adımı mikrotübülleri eklemektir. Prosedürün son adımı ise mikrotübüllere bağlanacak olan streptaverin moleküllerini eklemek ve ardından nanosferleri eklemektir. Nanosferler, mikrotübüller tarafından yakalanabilecekleri akış hücresi yüzeyine bağlanır.

Sonuç olarak, nanokürelerin mikrotübüller tarafından nasıl yakalandığı ve yüzey boyunca nasıl taşındığı floresan mikroskobu kullanılarak gözlemlenebilir. Merhaba, ben Florida Üniversitesi, Materyal Bilimi ve Mühendisliği Bölümü'nden ve Dr. Henry Hess'in laboratuvarından Elaine Jen Smith. Bugün size ters motilite deneyi prosedürünü göstereceğiz.

Laboratuvarımızda, kargonun mikrotübüllere yüklenmesini ve moleküler mekiklerin hareketini incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu prosedüre başlamadan önce, bu videonun yazılı kısmında belirtildiği şekilde tüm stok çözeltileri taze olarak hazırlayın.

Stok çözeltiler hazırlandıktan sonra, 0,65 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne 25 mikrolitre büyüme çözeltisi pipetleyerek mikro tübül hazırlığına başlayın. Ardından, 20 mikrogram liyofilize biotinillenmiş tübüline 6,25 mikrolitre büyüme çözeltisi ekleyin. Çözeltiyi vorteksleyin ve polimerizasyon için 37 °C sıcaklıktaki bir ısı banyosunda 30 dakika bekletin; inkübasyon sonrası çözeltiyi Taxol Tamponu ile 100 kat seyreltin ve hafifçe vorteksleyin.

Bu solüsyon, mikrotübülleri stabilize etmeye yarar. Solüsyonu MT 100 olarak etiketleyin ve oda sıcaklığında saklayın. Ardından, anti-fade tamponu içerisinde MT 100'ün on katlı bir seyreltmesini hazırlayın ve bu solüsyonu MT 1000 olarak etiketleyin.

Ardından, kinesin solüsyonunu TP tamponunda 20 kat seyrelterek Kinezin motorlarını hazırlayın. Solüsyonu kinase in 20 olarak etiketleyin ve buz üzerinde saklayın. Son olarak, streptavidin ve nanoküre solüsyonlarını hazırlayın.

Öncelikle, Antifa Buffer içerisine 100 nano molar konsantrasyona gelecek şekilde Alexa Fluor 5 6 8 işaretli streptavidin ekleyin. Çözeltiyi STV 100 olarak etiketleyin, ardından nanoküreleri Antifa Buffer ile 5.000 kat seyreltin ve bu karışımı NS 5,000 olarak etiketleyin. Bu iki çözeltiyi de buz üzerinde saklayın.

Yükleme deneyi için çözelti hazırlama işleminin ardından, bir lamel ve çift taraflı bantla birbirinden ayrılmış bir cam lam kullanılarak bir akış hücresi oluşturun. İlk olarak, iki şerit çift taraflı bandı, şeritler arasında yaklaşık bir santimetrelik bir boşluk bırakacak şekilde bir lamelin kenarlarına yapıştırın. Ardından, lamelin üzerine bir cover slip yerleştirin.

Sızdırmazlığı sağlamak için bir cımbızın düz kenarını kullanarak lamel üzerine basınç uygulayın. Oluşturulan akış hücresi yaklaşık iki santimetre uzunluğunda, bir santimetre genişliğinde ve 100 mikron yüksekliğindedir ve yaklaşık 20 mikrolitre hacme sahiptir. Ters assay kurulumuna başlamak için.

Pipet ucunu lamel ile lam arasına yerleştirin. Ardından akış hücresine 0,5 mg/mL kazein çözeltisi enjekte edin. Akış hücresindeki bu kaplama, kinezinin absorpsiyon sonrası fonksiyonelliğini korumasını sağlayacaktır.

Kazein solüsyonunun kaplaması için beş dakika bekleyin. Ardından, kinazı 20 solüsyon çözeltileri şeklinde tanıtarak Kinezin'in akış hücresi üzerine absorbe olmasını sağlayın; solüsyonlar, pipet ucunun lam ve lamelle arasına yerleştirilmesiyle akış hücrelerine aktarılır. Daha sonra solüsyon akış hücresine bir taraftan enjekte edilirken, aynı zamanda diğer taraftan emilerek dışarı alınır.

Süzgeç kağıdı kullanarak, kinazın emilmesi için beş dakika bekleyin. Ardından, MT 1000 solüsyonunu akış hücresine pipetleyerek mikrotübülleri akış hücresine aktarın. Mikrotübüllerin kinaz motorlarına tutunmasının ardından, mikrotübüllerin çökelmesi ve kinaz motorlarına bağlanması için beş dakika bekleyin.

STV 100 çözeltisini akış hücresine göndererek mikrotübülleri floresan strep TTR ile kaplayın. Strep TTR moleküllerinin mikrotübüllere bağlanması için beş dakika bekleyin. Akış hücresine üç kez 30 µL Antifa çözeltisi ile yıkama yaparak fazla strep TTR'yi uzaklaştırın.

Son olarak, NS 5, 000 çözeltisini akış hücresine pipetleyerek biyotinlenmiş polistiren floresein nano küreleri ekleyin. Yüzey sabit kalacak şekilde absorbe eder. Nano küreler, hareket halindeki mikrotübüllerle çarpışacak ve üzerlerine yüklenecektir.

Bu deneyde, 100x yağlı objektif, X site, bir 20 lamba ve bir exon E-M-C-C-D kamera ile donatılmış bir eclipse TE 2000 U floresan mikroskobu kullanılmıştır. İlk olarak, objektifin üzerine bir damla imersiyon yağı uygulayın. Ardından, trixy filtre küpünü kullanarak akış hücresini mikroskop tablasına yerleştirin.

Mikrotübülleri odaklayın, ardından nanoküreleri görüntülemek için fitzy filtre küpüne geçin. Sonra, and veya I exon programını açın ve veri toplama modunu kinetik olarak ayarlayın. 0,5 saniyelik bir pozlama süresi, 20'lik bir kinetik seri uzunluğu ve altı saniyelik bir kinetik döngü süresi kullanın.

Mikroskobu okülerden kameraya getirin ve görüntüleri almaya başlayın. İlk dört görüntü için mikrotübülleri görüntülemek amacıyla trixi küpünü kullanın. Sonraki 12 görüntü için nanokürelerin görüntülerini almak üzere Fitz filtre küpüne geçiş yapın.

Ardından tekrar trixi filtre küpüne geçin. Mikrotübülleri görüntülemek için çekilen son dört görüntüde, mikrotübüller Trissy filtre küpü kullanılarak gözlemlenmiş, ardından filtre küpü fite konumuna getirilmiştir. Burada nanoküreleri görselleştirmek için, mikrotübüller tarafından taşınan nanoküreler oklarla belirtilmiştir. Tüm nanoküreler mikrotübüller tarafından yakalanmamıştır.

Nanokürelerin konumu 36 saniye sonra tekrar gösterildiğinde, nanokürelerin yer değiştirdiği görülmektedir. Mikrotübüller tekrar görüntülendiğinde, mikrotübüllerin de görüş alanı boyunca hareket ettiği belirginleşmektedir. Bu görüntüler, nanokürelerin mikrotübüler taşıma nedeniyle yer değiştirdiğini kanıtlamaktadır.

Size ters hareketlilik analizinin nasıl gerçekleştirileceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, hem mikrotübüllerin hem de nanokürelerin görülebilmesi için görüntüleme sırasında filtre küplerini değiştirmeyi hatırlamanız önemlidir. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.