Mikroarray'ler kullanarak tRNA Aminoacylation (Şarj) Seviyeler genom Analizi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, tRNA şarjlanma seviyelerindeki göreceli değişimleri belirlemektir. Bu, şarjlanma seviyeleri bozulmamış tRNA'ları izole etmek amacıyla, işlemden önce ve sonra düşük pH'da RNA izolasyonu yapılarak gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak RNA, göreceli şarjlanma seviyelerinin belirlenmesine olanak tanıyan bir periyodat oksidasyon işlemine tabi tutulur.

Ardından, ligasyon seviyelerindeki değişimleri ölçmek amacıyla örnekleri floresan bir oligonükleotide ligatleyin ve bir mikroarray üzerinde hibritleyin; böylece A-T-R-N-A şarjlanma sonuçları elde edilir. TRNA mikroarray teknolojisine dayalı olarak CHO genomik düzeyindeki TRNA şarjlanma değişimleri. Merhaba, ben Chicago Üniversitesi Biyokimya ve Moleküler Biyoloji bölümünde, DRT Pan laboratuvarından John Zai.

Bugün size genomik düzeyde şarjlı TRNA'ların izole edilmesi ve ölçülmesi için uygulanan bir prosedürü göstereceğim. Laboratuvarımızda, stres faktörlerine maruz kalma sırasında TNA şarjındaki değişimleri ölçmek için bu yöntemi kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Toplam yükü TRNA'ya izole etmek için, öncelikle 30 µg toplam RNA üretmesi beklenen, en az 30 OD 600 eşdeğerinde maya hücresi büyüterek başlayın; hücreleri masaüstü santrifüjde çöktürün. Hücreleri bir lizis tamponu çözeltisinde yeniden süspande edin. Eşit hacimde sodyum asetat ve doygun fenil kloroform ekleyip 30 saniye boyunca vorteksleyin ve ardından en az 30 saniye boyunca buz üzerinde bekletin.

Vorteksleme ve parçalama işlemini iki kez daha tekrarlayın. Numuneyi 4 °C'de, 15 dakika boyunca 18.600 RFC hızında santrifüjleyin. Ardından sulu tabakayı uzaklaştırın ve ikinci ekstraksiyondan sonra asetat doyurulmuş fenil kloroform ekstraksiyonunu bir kez daha gerçekleştirin.

2,7 kat hacminde etanol ekleyerek RNA'yı çöktürün ve 4 °C'de 30 dakika boyunca 18.600 RFC'de santrifüjleyin. RNA peletlerini lizis tamponu çözeltisinde yeniden süspande edin ve ardından etanol ile ikinci kez çöktürün. Son olarak, sonraki işlemler için RNA'yı 10 millimolar tamponlu asetat ve 1 millimolar EDTA içeren bir çözeltide yeniden süspande edin.

Numune, -80 °C'de yaklaşık iki hafta daha stabil bir şekilde saklanabilir. Bazı yüklü tRNA'lar, S3 veya SCI five floresan oligonükleotid etiketlerle işaretlenmeden önce bozunmaya başlayacağı için saklama önerilmez. Toplam tRNA, bağıl yüklenme seviyelerinin belirlenmesine olanak tanıyan bir sodyum periodat oksidasyon işlemine tabi tutulur; toplam RNA'yı, 50 mM sodyum periodat varlığında 0,066 µM'lık her bir eko tRNA standardı ve 100 mM tamponlu asetat ile karıştırın. Okside edilmeyecek olan kontrol tRNA numunesi için sodyum periodat yerine 50 mM sodyum klorür kullanın.

Reaksiyonları oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin; 30 dakika sonra, glikoz ekleyerek konsantrasyonu 100 millimolar'a çıkarın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe ederek reaksiyonu durdurun. Reaksiyon durdurulduktan sonra, örneklerde kalan sodyum propionatları uzaklaştırmak için bir G 25 spin kolon kullanarak tampon değişimi gerçekleştirin. Örnekleri; final konsantrasyonu 133 millimolar olan tamponlu asetat, final konsantrasyonu 66 millimolar olan sodyum klorür ve 2.7 kat hacimce etanol ekleyerek çöktürün.

Ardından, tRNA örneklerini Resus ile izole edin; örnekleri 50 millimolar tris HCL içinde süspande ederek 37 degrees Celsius'ta 30 dakika boyunca inkübe edin. 30 dakika sonra, eşit hacimde 50 millimolar tamponlu asetat ekleyerek reaksiyonu nötralize edin ve 2.7 x hacim etanol ile çöktürün. RNA peletini, mikrolitre başına yaklaşık bir microgram olacak şekilde suda yeniden süspande edin.

Kontrol ve oksitlenmiş örneklerin RNA kalitesi agaroz jellerde çalışılarak kontrol edildikten sonra, tRNA'ya floresan oligo etiketleri eklemek için floresan işaretleme işlemine geçebiliriz. 0.1 µg/µL de RNA'yı, 4 µM SI3 veya SI5 içeren oligonükleotidler, ligaz tamponu, %15 DMSO, 0.5 U/µL T4 DNA ligaz ve maya ekzo fosfataz ile birleştirin ve 16 °C'de 16 saatten fazla inkübe edin. Ligasyon sonrası, örnekleri dört hacim potasyum asetat ve potasyum klorür ile karıştırın ve ardından eşit hacimde fenil kloroform ile ekstraksiyon yapın. Sulu fazın ekstraksiyonunun ardından, RNA preparatlarını etanol ile çöktürün. Son olarak, RNA peletlerini hibridizasyon öncesinde yaklaşık 0.1 µg/µL olacak şekilde suda yeniden süspande edin; bağlanmamış oligonükleotidleri uzaklaştırmak için mikroarray lamlarını ve distile suyu bir ila iki dakika boyunca kullanın.

Ardından, S3 veya SCI etiketli beş örneği, final konsantrasyonu 140 µg/mL olacak şekilde somon spermi DNA'sı içeren 140 µL hibridizasyon tamponu ve final konsantrasyonu 7 µg/mL olacak şekilde poly A ile birleştirin; otomatik bir array hibridizatöründe hibridizasyon programını çalıştırın. Manuel hibridizasyon yüksek arka plan oluşturduğundan, tRNA çalışmaları için otomatik bir hibridizasyon cihazının kullanılmasını şiddetle tavsiye ederiz. Hibridizasyon programı tamamlandığında, lamları 50 mL'lik konik bir tüp içerisinde üç ila beş dakika boyunca nazikçe çalkalayarak wash 3 solüsyonu ile manuel olarak yıkayın.

Lamları, alüminyum folyoya sarılmış tüpler içerisinde en az iki kez yıkayın. En iyi sonuçlar için lamları düşük hızda 5 ila 10 dakika santrifüj ederek kurutun. Lamlar, kurutulduktan hemen sonra taranmalıdır.

Slaytlar, görüntü kalitesinde fark edilebilir bir bozulma olmadan iki ila üç kez taranabilir; uygun şekilde izole edilmiş bir toplam RNA örneğinin ve analizinin temsilci sonuçları burada gösterilmektedir. Bu örnek, %1 agro jellerde çalıştırıldığında, tespit edilebilir bir protein veya fenol kontaminasyonu olmaksızın, OD 260/OD 280 oranı ikiye yakın olan çok temiz bir spektrum sergilemektedir. Hem okside edilmiş hem de kontrol örnekleri, organizmalar arasında farklılık gösteren diğer olası nükleik asit bantlarıyla birlikte güçlü bir RNA bandı göstermelidir.

Bir örnek diğer örneklerden belirgin şekilde daha zayıfse veya yayılma (smearing) gözlemleniyorsa, örnekler mikro diziler için kullanılmamalıdır. Mikro diziler, en zayıf TRNA probundan bir büyüklük mertebesi daha düşük olan, çok düşük bir arka plana sahip olmalıdır. Bu prosedürü uygularken TRNA'nın nasıl izole edileceğini ve göreceli yükleme seviyelerinin nasıl belirleneceğini size az önce gösterdim.

Özellikle oksidasyon ve seyreltme basamakları sırasında, reaktiflerin nükleazlardan arındırılmış tutulması gerektiğini unutmamak önemlidir. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.