Name: Mikroarrayler kullanarak tRNA Aminoacylation (Şarj) Seviyeler genom Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Öğrenin, mikrodizin teknolojisi kullanarak Saccharomyces cerevisiae'de tRNA aminoasillasyon seviyelerini genomik düzeyde analiz etme yöntemini. Bu yaklaşım, hücresel stres yanıtlarını ve protein sentezi dinamiklerini araştırmak için güvenilir bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Pan laboratuarda maya iş Ajinomoto, Inc Japonya ve Sağlık Eğitimi Hibe T32GM007183-33 Ulusal Sağlık Enstitüleri bir hibe ile finanse edildi. Maya projelerin uzun vadeli işbirliği için Indiana Üniversitesi Tıp Fakültesi Dr Ronald Wek teşekkür ederim. Ayrıca şarj tRNA mikroarray yöntemi geliştirmek için Dr. Kimberly Dittmar teşekkür ederim.

Bölüm 1: toplam ücret tRNA İzolasyon <ol><li> 2000 RFC az 5 dakika boyunca bir masaüstü santrifüj Pelet hücreleri. OD 600 1 hücre eşdeğer toplam RNA&#39;nın en az 1μg üretmek ve bir işlem için en az 30 mikrogram önerilir . </li><li> +-Asetat (pH 4.5) ve 10 mM EDTA, 0.3 M oluşan lizis tampon çözelti içinde süspanse edin hücreleri Na tamponlu . 30 saniye, her biri üç kez (pH = 4.5), Na +-asetat-doymuş fenol / kloroform eşit hacmi ile girdap Vorteks arasında her zaman buz örnekleri tutmak için emin olun. Tamponlanmış asetat, asetat, fenol / kloroform, fenol kloroform / 9 parça M asetat tamponlu 1 kısım 5 (pH 4.5) karıştırılarak hazırlanmış olabilir doymuş ise NaOAC ve HOAc hazırlanabilir. Not: toplam RNA izolasyonu ücret tRNA deacylation önlemek için hafif asidik koşullarda ve buz üzerinde yapılmaktadır. </li><li> 18.600 RFC santrifüjleyin az 15 dakika süreyle 4 ° C Sulu katman çıkarın ve başka bir asetat-doymuş fenol / kloroform ekstraksiyon gerçekleştirmek. </li><li> Ikinci ekstraksiyon, etanol 2.7x hacim ekleme ve 4, 30 dakika boyunca 18.600 RFC santrifüj ° C RNA çökelmesine sonra </li><li> Lizis tampon çözeltisi ve sonra yeniden süspanse RNA pelet etanol ile ikinci defa hızlandırabilir. </li><li> Son olarak, 10 mM tamponlu asetat (pH 4.5) ve daha sonraki tedavi için 1 mM EDTA içeren bir çözüm RNA tekrar süspansiyon haline getirin. Örnek stably yaklaşık iki hafta -80 ° C&#39;de saklanabilir. Bazı ücret tRNA deacylate başlayacak gibi uzun süreli saklama tavsiye edilmez. </li></ol> Bölüm 2: tRNA Standartlarının Hazırlanması <ol><li> Isı E. 10.5 mcM az 85 coli tRNA standartları ° C 2 dakika süreyle 45 mM Tris-Cl pH 7.5. Tüp dışarı atın ve 3 dakika boyunca oda sıcaklığında bırakın. </li><li> MgCl 2, 37, 20 mM ve inkübe bir final konsantrasyon ° C 5 dakika ekleyin. </li><li> Nihai reaksiyon, 5 mcM tRNA, 60 mM Tris-HCl (pH 7.5), 12.5 mM MgCl 2, 10 mM KCl, 3 mM dithiothreitol, 1.5 mM ATP, 1 mM spermin, 1 mM ilgili içerecek şekilde sentetaz reaksiyon karışımı ekleyin amino asit, ve 4.2 adet / ml E. coli Aminoasil-tRNA sentetaz karışımı. 37 ° C&#39;de 15 dakika boyunca. </li><li> 0.5 M asetat tamponlu (pH 4.5) eşit hacimde ekleyin ve pH 4.5 asetat-doymuş fenol CHCl / 3 ile ayıklayın. </li><li> 4 30 dakika 18.600 RFC ° C, etanol ve santrifüj 2.7x hacimleri ile tRNA standartlarına çöktürün </li><li> Bir ay kadar -80 az 1 mM EDTA ve mağaza ° C ile 50 mM tamponlu asetat (pH 4.5) standartlarına tekrar </li></ol> Bölüm 3: tRNA Cy3/Cy5 etiketleme <ol><li> Ücret tRNA örnek için her E. 0,066 mcM ile 0.1 mikrogram / ​​ml &#39;lik bir konsantrasyon toplam RNA inkübe coli tRNA standartları (yani pmole 0.67 mg total RNA başına her bir standart) ve 50 mM NaIO4 varlığında oda sıcaklığında 30 dakika süreyle 100 mM tamponlu asetat (pH 4.5). Kontrol toplam tRNA örnek kullanmak için 50 mM NaCl NaIO4 bir yerde. Sadece şarj korumak için tamponlu çözümleri ile RNA sulandırmak için unutmayın. </li><li> Reaksiyon gidermek için 100 mM şekeri ekleyin ve 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Örnek kalan NaIO4 kaldırmak G25 spin kolon kullanarak bir tampon değişimi gerçekleştirmek için. En iyi sonuçlar, örnek uygulamadan önce, 200 mM tamponlu asetat tamponu (pH 4.5) çalışan ilk sütun dengelenmesi için. </li><li> Tamponlu asetat (pH 4.5) eklenerek nihai konsantrasyonu 133 mM NaCl, 66 mM ve 2.7x hacimlerde etanol bir final konsantrasyon örnek çöktürün. Bazen ikinci bir yağış okside örnekleri için gerekli olabilir. Pelet aynı örnek kontrolü pelet önemli ölçüde farklı görünüyor sadece bu gereklidir. Örneğin, önemli ölçüde daha büyük veya daha yaygın pelet. Ikinci bir etanol yağış 50 mM asetat tamponu pH 4,5 ve 200 mM NaCl etanol eklenmesi önce tekrar süspansiyon pelet gerekiyorsa. </li><li> Deacylation için 50 mM Tris-HCl tRNA örnekleri yeniden süspanse (pH 9) ve 30 dakika süreyle 37 ° C&#39;de inkübe. Reaksiyon eşit hacmi 50 mM tamponlu asetat (pH 4.5) ve 100 mM NaCl ilavesi ile nötralize edilir. 2.7x hacimlerde etanol ile çöktürün. Yağış sonra, RNA ~ 1 mcg / ml su içinde yeniden süspanse. Kontrolü ve okside örnekleri de RNA kalitesini kontrol etmek için agaroz jel çalıştırmak olmalıdır. </li><li> 1x ligaz tamponu,% 15 DMSO, 4 mcM Cy3 veya Cy5 içeren oligonükleotidler, 0.5 ünite / ml T4 DNA ligaz tRNA 0.1 mg / ml deacylated RNA üzerine floresan oligo etiketleri eklemek için inkübe ve maya exo-fosfataz (5.000 16 adet / ml) ° C gece (16 saat boyunca). Exo-fosfataz sadece maya alınan numuneler için gerekli olan ve omitte olabilird Bu protokol E. için kullanılır. coli ya da insan örnekleri. </li><li> Ligasyonu örnekleri, sonra eşit miktarda fenol kloroform / çıkarılan 50 mM KOAc (pH 7), 200 mM KCl ve 4 cilt karıştırılır sonra. RNA hazırlıkları, sulu faz ekstraksiyonu takiben etanol ile çöktürülür ve yaklaşık 0.1 mg / ml su içinde yeniden süspanse. </li><li> Ligasyonu verimliliği% 12 poliakrilamid jeller 7M üre içeren örneklerin% 5-10 çalışan tarafından değerlendirilmeli ve bir floresan jel tarayıcı ile görüntülendi. Bu SAYFA analizi, okside ve mikroarray hibridizasyon için gerekli kontrol örnekleri miktarını belirlemek için de yararlıdır. ~ Cy3/Cy5 içeren oligonükleotid% 10 veya daha fazla tRNA bağlandı olmanın iyi bir ligasyonu sonucu göstermelidir. Iyi etiketleme verimliliği ile örnekler için, örnek başına 0.1-0.5 mg total RNA dizi hibridizasyon için kullanılır. </li></ol> Bölüm 4: Mikroarray Hibridizasyon ve Analiz <ol><li> Hibridizasyon mikroarray slaytlar önce bağlanmamış oligonükleotidler kaldırmak için 1-2 dakika distile suda haşlanır. </li><li> Cy3/Cy5 etiketli örnekleri hibridizasyon tamponu ve somon sperm DNA nihai konsantrasyonu 140 mg / ml ve 70 mcg / ml bir final konsantrasyon poli (A) 140 ul birleştirilir. </li><li> Hibridizasyon programı, (Tablo 1), otomatik bir dizi hybridizer çalıştırılır. TRNA iş için son derece elle melezleme yüksek arka plan üretir beri otomatik hibridizasyon makinesi kullanılması tavsiye edilir. </li><li> Programı tamamlandıktan sonra en az iki kez 50 ml konik bir tüp içerisinde 3-5 dakika hafifçe sallayarak elle yıkayın 3 çözüm slaytları yıkayın. </li><li> Slaytlar, düşük hız, 200 RFC az 5-10 dakika santrifüj kurulanmalıdır. Bu ışığa maruz çamaşır suyu fluorophores beri ışık slaytlar dışarıda tutmak için önemlidir. </li><li> Slaytlar kurutulur sonra en iyi sonuçlar için hemen taranabilir; gerekirse, oda sıcaklığında, kuru bir karanlık bir yerde birkaç gün saklanabilir. Slaytlar 2-3 kat görüntü kalitesinde gözle görülür bir bozulma olmadan taranabilir. </li></ol> Bölüm 5: Temsilci Sonuçlar 2 civarındaki OD 280 oranı: düzgün bir şekilde izole edilen total RNA örnek bir OD 260 ile çok temiz bir spektrum üretmek gerekir. Saptanabilir bir protein ya da fenol kirlenme olmamalıdır. % 1 agaroz jel üzerinde çalıştırdığınızda, güçlü bir tRNA bandı organizmalar arasında değişen diğer olası nükleik asit bantları ile dikkat edilmelidir. Oksidasyon sonra temiz bir tRNA bant dikkat edilmelidir. Bir örnek, diğer örnekleri veya bulaşması görülmektedir göre belirgin zayıf ise, numuneler mikroarray&#39;ler için kullanılan olmamalıdır. Mikroarray&#39;ler çok düşük arka plan zayıf tRNA prob daha düşük büyüklükte bir düzen olmalıdır. Yüksek arka plan genellikle yıkama işlemleri sırasında sorunlar nedeniyle. Bu genellikle taze yıkama çözümler hazırlanması ve kalan ve çöktürülmüş SDS kaldırmak için her türlü ekipman ve boru iyice yıkama ile tespit edilebilir. <table border="1"><tbody><tr><td> Adım </td><td> Ayrıntılar </td></tr><tr><td> O-halka Klima </td><td> 75 ° C, 2 dak </td></tr><tr><td> Örnek tanıtın </td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td> Denatüre Örnek </td><td> 90 ° C, 5 dak. </td></tr><tr><td> Melezleme </td><td> 60 ° C, 16h </td></tr><tr><td> 1 yıkayın </td><td> 50 ° C, akış 10s 20s tutun </td></tr><tr><td> 2 yıkayın </td><td> 42 ° C, akış 10s 20s tutun </td></tr><tr><td> 3 Yıkama </td><td> 42 ° C, akış 10s 20s tutun </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Hibridizasyon protokol

<ol><li>Zaborske, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+tRNA+charging+and+activation+of+the+eIF2+kinase+Gcn2p%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p.</a> J Biol Chem. 284 (37), 25254-25267 (2009).</li>
<li>Wek, S. A., Zhu, S., Wek, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histidyl-tRNA+synthetase-related+sequence+in+the+eIF-2+alpha+protein+kinase+GCN2+interacts+with+tRNA+and+is+required+for+activation+in+response+to+starvation+for+different+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The histidyl-tRNA synthetase-related sequence in the eIF-2 alpha protein kinase GCN2 interacts with tRNA and is required for activation in response to starvation for different amino acids.</a> Mol Cell Biol. , 4497-4506 (1995).</li>
<li>Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+Regulation+of+GCN4+and+the+General+Amino+Acid+Control+of+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Translational Regulation of GCN4 and the General Amino Acid Control of Yeast.</a> Annual Review of Microbiology. 59 (1), 407-450 (2005).</li>
<li>Braeken, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+horizons+for+%28p%29ppGpp+in+bacterial+and+plant+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology.</a> Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).</li>
<li>Dong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncharged+tRNA+Activates+GCN2+by+Displacing+the+Protein+Kinase+Moiety+from+a+Bipartite+tRNA-Binding+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Uncharged tRNA Activates GCN2 by Displacing the Protein Kinase Moiety from a Bipartite tRNA-Binding Domain.</a> Molecular Cell. 6 (2), 269-279 (2000).</li>
<li>Cashel, M. The Stringent Response. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCashel%2C+M+%22Escherichia+coli+and+Salmonella%3A+cellular+and+molecular+biology%22">Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology</a>. Neidhardt, F. C. , ASM Press. Washington DC. 1458-1496 (1996).</li>
<li>Dittmar, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino-acid+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation.</a> EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).</li>
<li>Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+tRNA+abundance+and+alteration+of+tRNA+charging+by+bortezomib+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">High levels of tRNA abundance and alteration of tRNA charging by bortezomib in multiple myeloma.</a> Biochem Biophys Res Commun. 385 (2), 160-164 (2009).</li>
</ol>

Biz aynı anda genomik ölçekte tüm tRNAs göreli şarj seviyelerini belirlemek için bir yöntem mevcut. Burada sunulan protokol S. için optimize edilmiştir cerevisiae, ve aynı zamanda başarılı bir şekilde E. tRNA şarj profilleri ölçmek için kullanılır olmuştur coli ve insan hücre kültürleri. Toplam ücret tRNA elde edilebilir olarak bilinen genom dizileri (tRNA genleri ek açıklama için izin) sürece herhangi bir organizmanın karşılamak için modifiye edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Microspin G-25 kolonları</td><td>GE Healthcare</td><td>25-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA&lt;sup&gt;Phe&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3143</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA&lt;sup&gt;Tyr&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0258</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA&lt;sup&gt;Lys&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6018</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; aminoasil-tRNA sentetazlar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3646</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligaz</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>70042X</td><td></td></tr><tr><td>PerfectHyb Plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-7033</td><td></td></tr><tr><td>Hyb4 istasyonu</td><td>Digilab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GenePix 4000B tarayıcı</td><td>Axon instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GenePix 6.0</td><td>Axon instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mikroarray&#39;ler kullanarak trna aminoacylation (Şarj) seviyeler genom analizi

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylation veya şarj seviyeleri hızla çevre [1] yanıt olarak bir hücre içinde değiştirebilirsiniz. Düzeyleri hem prokaryotik ve ökaryotik hücreler şarj tRNA değişiklikler, stres yanıtı önemli bir hücresel mekanizmadır translasyonel düzenlemeye neden olur. Benzer örnekler sıkı yanıt olarak<em&gt; E. coli</em&gt; Maya Gcn2 stres yanıtı yolu ([2-6]). Son çalışma<em&gt; E. coli</em&gt; Ve<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; TRNA şarj desen son derece dinamik olduğunu göstermiştir ve hücreleri [1, 6, 7] yaşadığı stres türü bağlıdır. TRNA şarj son derece dinamik, değişken doğası, tamamen çevresel farklılıklar hücresel yanıt aydınlatmak için genomik ölçekte tRNA şarj seviyeleri değişiklikleri belirlemek için gerekli kılar. Bu derlemede, aynı anda tüm tRNAs göreli şarj seviyelerini ölçmek için bir yöntem mevcut<em&gt; S. cerevisiae</em&gt;. Burada sunulan protokol maya olsa da, bu protokolü başarıyla organizmalar da dahil olmak üzere geniş bir yelpazede göreceli şarj seviyeleri belirlenerek uygulanır olmuştur<em&gt; E. coli</em&gt; Ve insan hücre kültürleri [7, 8].

Biz tüm tRNAs göreceli aminoacylation düzeylerini belirlemek için mikroarray analizi için bir yöntem tarif<em&gt; S. cerivisiae.</em

Mikroarray&#39;ler kullanarak tRNA Aminoacylation (Şarj) Seviyeler genom Analizi

tRNA aminoaçillenmesi veya yüklenmesi seviyeleri, çevreye yanıt olarak bir hücre içinde hızla değişebilir[1]. Hem ... hem de ... tRNA yüklenme seviyelerindeki değişiklikler...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, tRNA şarjlanma seviyelerindeki göreceli değişimleri belirlemektir. Bu, şarjlanma seviyeleri bozulmamış tRNA'ları izole etmek amacıyla, işlemden önce ve sonra düşük pH'da RNA izolasyonu yapılarak gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak RNA, göreceli şarjlanma seviyelerinin belirlenmesine olanak tanıyan bir periyodat oksidasyon işlemine tabi tutulur.Ardından, ligasyon seviyelerindeki değişimleri ölçmek amacıyla örnekleri floresan bir oligonükleotide ligatleyin ve bir mikroarray üzerinde hibritleyin; böylece A-T-R-N-A şarjlanma sonuçları elde edilir. TRNA mikroarray teknolojisine dayalı olarak CHO genomik düzeyindeki TRNA şarjlanma değişimleri. Merhaba, ben Chicago Üniversitesi Biyokimya ve Moleküler Biyoloji bölümünde, DRT Pan laboratuvarından John Zai.Bugün size genomik düzeyde şarjlı TRNA'ların izole edilmesi ve ölçülmesi için uygulanan bir prosedürü göstereceğim. Laboratuvarımızda, stres faktörlerine maruz kalma sırasında TNA şarjındaki değişimleri ölçmek için bu yöntemi kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.Toplam yükü TRNA'ya izole etmek için, öncelikle 30 µg toplam RNA üretmesi beklenen, en az 30 OD 600 eşdeğerinde maya hücresi büyüterek başlayın; hücreleri masaüstü santrifüjde çöktürün. Hücreleri bir lizis tamponu çözeltisinde yeniden süspande edin. Eşit hacimde sodyum asetat ve doygun fenil kloroform ekleyip 30 saniye boyunca vorteksleyin ve ardından en az 30 saniye boyunca buz üzerinde bekletin.Vorteksleme ve parçalama işlemini iki kez daha tekrarlayın. Numuneyi 4 °C'de, 15 dakika boyunca 18.600 RFC hızında santrifüjleyin. Ardından sulu tabakayı uzaklaştırın ve ikinci ekstraksiyondan sonra asetat doyurulmuş fenil kloroform ekstraksiyonunu bir kez daha gerçekleştirin.2,7 kat hacminde etanol ekleyerek RNA'yı çöktürün ve 4 °C'de 30 dakika boyunca 18.600 RFC'de santrifüjleyin. RNA peletlerini lizis tamponu çözeltisinde yeniden süspande edin ve ardından etanol ile ikinci kez çöktürün. Son olarak, sonraki işlemler için RNA'yı 10 millimolar tamponlu asetat ve 1 millimolar EDTA içeren bir çözeltide yeniden süspande edin.Numune, -80 °C'de yaklaşık iki hafta daha stabil bir şekilde saklanabilir. Bazı yüklü tRNA'lar, S3 veya SCI five floresan oligonükleotid etiketlerle işaretlenmeden önce bozunmaya başlayacağı için saklama önerilmez. Toplam tRNA, bağıl yüklenme seviyelerinin belirlenmesine olanak tanıyan bir sodyum periodat oksidasyon işlemine tabi tutulur; toplam RNA'yı, 50 mM sodyum periodat varlığında 0,066 µM'lık her bir eko tRNA standardı ve 100 mM tamponlu asetat ile karıştırın. Okside edilmeyecek olan kontrol tRNA numunesi için sodyum periodat yerine 50 mM sodyum klorür kullanın.Reaksiyonları oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin; 30 dakika sonra, glikoz ekleyerek konsantrasyonu 100 millimolar'a çıkarın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe ederek reaksiyonu durdurun. Reaksiyon durdurulduktan sonra, örneklerde kalan sodyum propionatları uzaklaştırmak için bir G 25 spin kolon kullanarak tampon değişimi gerçekleştirin. Örnekleri; final konsantrasyonu 133 millimolar olan tamponlu asetat, final konsantrasyonu 66 millimolar olan sodyum klorür ve 2.7 kat hacimce etanol ekleyerek çöktürün.Ardından, tRNA örneklerini Resus ile izole edin; örnekleri 50 millimolar tris HCL içinde süspande ederek 37 degrees Celsius'ta 30 dakika boyunca inkübe edin. 30 dakika sonra, eşit hacimde 50 millimolar tamponlu asetat ekleyerek reaksiyonu nötralize edin ve 2.7 x hacim etanol ile çöktürün. RNA peletini, mikrolitre başına yaklaşık bir microgram olacak şekilde suda yeniden süspande edin.Kontrol ve oksitlenmiş örneklerin RNA kalitesi agaroz jellerde çalışılarak kontrol edildikten sonra, tRNA'ya floresan oligo etiketleri eklemek için floresan işaretleme işlemine geçebiliriz. 0.1 µg/µL de RNA'yı, 4 µM SI3 veya SI5 içeren oligonükleotidler, ligaz tamponu, %15 DMSO, 0.5 U/µL T4 DNA ligaz ve maya ekzo fosfataz ile birleştirin ve 16 °C'de 16 saatten fazla inkübe edin. Ligasyon sonrası, örnekleri dört hacim potasyum asetat ve potasyum klorür ile karıştırın ve ardından eşit hacimde fenil kloroform ile ekstraksiyon yapın. Sulu fazın ekstraksiyonunun ardından, RNA preparatlarını etanol ile çöktürün. Son olarak, RNA peletlerini hibridizasyon öncesinde yaklaşık 0.1 µg/µL olacak şekilde suda yeniden süspande edin; bağlanmamış oligonükleotidleri uzaklaştırmak için mikroarray lamlarını ve distile suyu bir ila iki dakika boyunca kullanın.Ardından, S3 veya SCI etiketli beş örneği, final konsantrasyonu 140 µg/mL olacak şekilde somon spermi DNA'sı içeren 140 µL hibridizasyon tamponu ve final konsantrasyonu 7 µg/mL olacak şekilde poly A ile birleştirin; otomatik bir array hibridizatöründe hibridizasyon programını çalıştırın. Manuel hibridizasyon yüksek arka plan oluşturduğundan, tRNA çalışmaları için otomatik bir hibridizasyon cihazının kullanılmasını şiddetle tavsiye ederiz. Hibridizasyon programı tamamlandığında, lamları 50 mL'lik konik bir tüp içerisinde üç ila beş dakika boyunca nazikçe çalkalayarak wash 3 solüsyonu ile manuel olarak yıkayın.Lamları, alüminyum folyoya sarılmış tüpler içerisinde en az iki kez yıkayın. En iyi sonuçlar için lamları düşük hızda 5 ila 10 dakika santrifüj ederek kurutun. Lamlar, kurutulduktan hemen sonra taranmalıdır.Slaytlar, görüntü kalitesinde fark edilebilir bir bozulma olmadan iki ila üç kez taranabilir; uygun şekilde izole edilmiş bir toplam RNA örneğinin ve analizinin temsilci sonuçları burada gösterilmektedir. Bu örnek, %1 agro jellerde çalıştırıldığında, tespit edilebilir bir protein veya fenol kontaminasyonu olmaksızın, OD 260/OD 280 oranı ikiye yakın olan çok temiz bir spektrum sergilemektedir. Hem okside edilmiş hem de kontrol örnekleri, organizmalar arasında farklılık gösteren diğer olası nükleik asit bantlarıyla birlikte güçlü bir RNA bandı göstermelidir.Bir örnek diğer örneklerden belirgin şekilde daha zayıfse veya yayılma (smearing) gözlemleniyorsa, örnekler mikro diziler için kullanılmamalıdır. Mikro diziler, en zayıf TRNA probundan bir büyüklük mertebesi daha düşük olan, çok düşük bir arka plana sahip olmalıdır. Bu prosedürü uygularken TRNA'nın nasıl izole edileceğini ve göreceli yükleme seviyelerinin nasıl belirleneceğini size az önce gösterdim.Özellikle oksidasyon ve seyreltme basamakları sırasında, reaktiflerin nükleazlardan arındırılmış tutulması gerektiğini unutmamak önemlidir. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

genome-wide-analysis-aminoacylation-charging-levels-trna-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bakteriyel Gen İfadesi Analizi Mikroarray&#39;ler Kullanımı

Pre-mRNA geçici doğası nedeniyle, izole etmek ve incelemek için zor...

İnsan pre-mRNA üzerinde Haritalama Ribonucleoproteins Hızlı Yüksek verim için Yöntemi (RNPs)

Kaynak: Stenum, T. S. ve diğerleri. Escherichia coli'de transfer RNA'larının bolluğu ve şarj seviyelerinin nicelendirilmesi. J. Vis. Exp. (2017)Bu video, E. coli'de transfer RNA'larının şarj seviyelerini tespit etmek ve karşılaştırmak için jel elektroforezi ve kuzey blotlama kullanımını göstermektedir; aminoasillenmiş ve deasillenmiş formları ayırarak karşılaştırılır.

E. coli'de tRNA şarj seviyelerini tespit etmek için jel elektroforezi ve kuzey blotlama ile

Ribozomlar protein sentezinde önemli bir rol oynamaktadır. Sükroz yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile Polyribosome (Polizom) fraksiyonlara ayırma, bir genom geniş bir ölçekte tek mRNA translasyon etkinliklerine doğrudan belirlenmesini sağlar. Buna ek olarak, bu yöntem, şaperonlar ve sinyal molekülleri gibi ribozom-ve Polizomdan ilişkili faktörleri biyokimyasal analizi için kullanılabilir.

Bir genom Ölçeği Polizom Fraksiyonu ve Memeli Translatomes Analizi

TRNA (UUU) üretimi ve agaroz jel geciktirme testleri ile TcdA enzimi ile kompleks içinde tRNA (UUU) analizi için bir protokol sunulmuştur.

Analiz için Protein-tRNA Agaroz Jel Retardasyon Testleri<em&gt; K</em<sup&gt; 6</sup&gt; Threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Burada doğrudan transfer RNA transfer RNA'ın göreli düzeyleri, ya da herhangi bir kısa diğer RNA, spike-in toplama göre farklı örnekleri arasında karşılaştırmak için bir yol yanı sıra arıtılmış Escherichia coli RNA düzeyleri şarj ölçmek için bir yöntem mevcut hücre başvurusu gen ifade.

Miktar bolluk ve Escherichia coli olarak Transfer RNA'ların düzeyde şarj

Bu iletişim kuralı ChIP-seq, 4sU seq, toplam RNA-seq ve hücre satırları ve Primer hücre için profil oluşturma ribozom Kombinatorik kullanımını açıklar. Transkripsiyon faktörü de novo transkripsiyon, RNA işlenmesi, ciro ve çeviri zamanla, bağlama ve olayların genel gidişatı harekete geçirmek ve/veya hızla değişen hücrelerde görüntüleme izleme değişiklikleri sağlar.

Gerçek zamanlı analiz bağlama, transkripsiyon, çeviri ve ciro hücresel etkinleştirme sırasında küresel olayları görüntülemek üzere transkripsiyon faktörü

Biz orijinal bir transfer RNA analizi platformu nokta (akıcı tRNA gözlemlemek için Platform) adlı tanımlamak. Nokta aynı anda hücresel düzeyde tüm tRNA biyolojik örnekleri, sadece üç adım ve 24 saatten az bir süre ölçer.

Metabolik etiketleme ve Transfer RNA Macroarrays kullanarak profil oluşturma

Burada, maya RNA-modifiye enzim, Mod5, biyokimyasal karakterizasyonu için bir iletişim kuralı tanımlamak ve nasıl diğer RNA enzimler için bu iletişim kuralı uygulanırsa tartışıyorlar.

TRNA-Isopentenyl transferaz aktivite tespit etmek için bir In Vitro tahlil

Mutlak miktar tayini RNA dizilimi (AQRNA-seq), biyolojik karışımlardaki tüm küçük RNA'ların manzarasını ölçmek için geliştirilmiş bir teknolojidir. Burada, açlığın neden olduğu uyku hali sırasında Mycobacterium bovis BCG'deki transfer RNA (tRNA) havuzundaki değişiklikleri ölçen AQRNA-seq'nin hem kütüphane hazırlama hem de veri işleme adımları gösterilmektedir.

Küçük RNA'ları Ölçmek için AQRNA-seq

Öğrenin, mikrodizin teknolojisi kullanarak Saccharomyces cerevisiae'de tRNA aminoasillasyon seviyelerini genomik düzeyde analiz etme yöntemini. Bu yaklaşım, hücresel stres yanıtlarını ve protein sentezi dinamiklerini araştırmak için güvenilir bir araç sunar.

Mikroarray'ler kullanarak tRNA Aminoacylation (Şarj) Seviyeler genom Analizi

Daha fazla video keşfet