Mekanik Ayrışma: Bir Dokudan Canlı Hücre Elde Etme Yöntemi

İlk olarak, bir doku parçasını tartın ve uzunluğunu, genişliğini ve yüksekliğini ölçün. Dokuyu bir kültür ortamı ile bir kültür kabına yerleştirin ve bir neşter kullanarak küçük parçalara ayırın. Bir Pasteur pipeti kullanarak homojenizasyon için her şeyi bir C-tüpüne aktarın.

Tüpü mekanik bir ayırıcıya yerleştirin ve döngüleri gerektiği gibi çalıştırın. Aparat, yüzey proteinleri de dahil olmak üzere hücresel bütünlüğü korurken doku örneğinden canlı tek hücreleri çıkarmak için mekanik kuvvetler kullanır. Homojenatı bir santrifüj tüpüne sabitlenmiş bir hücre süzgecinden boşaltın.

Kalan dokuyu yeniden homojenize edin ve homojenatı hücre süzgecinden tüpe süzün. Homojenatı santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Şimdi, hücre peletini kültür ortamında yeniden süspanse edin ve az miktarda hücre süspansiyonunu tripan mavisi boyası içeren bir tüpe aktarın.

Boyamadan sonra, hücreleri bir hemositometre lamına aktarın. Saydam canlı hücreleri sayın. Ölü hücreler, hücre zarları sağlam olmadığı için lekeyi alır. Aşağıdaki protokolde, CD45+ hücrelerinin kantitatif ve kalitatif analizi için taze insan dokusunun enzimatik olmayan ayrışmasını gerçekleştireceğiz.

- Doku örneğini tartarak ve ardından dokunun uzunluğunu, genişliğini ve yüksekliğini ölçerek başlayın. Daha sonra doku parçasını, kimyasal olarak tanımlanmış, serum içermeyen, hematopoietik hücre ortamının 1 mililitresini içeren küçük bir petri kabına aktarın ve örnekleri 1 ila 2 milimetre karelik küçük parçalara ayırmak için steril bir neşter kullanın. Daha sonra, çanak içeriğini mekanik bir ayrıştırıcı C-tüpüne aktarın ve tabağı ve neşteri 2 mililitre orta ile durulayın.

Yıkamayı C-tüpüne ekleyin ve ardından doku parçalarını tek bir hücre süspansiyonu halinde nazikçe homojenize etmek için 8.01 mekanik ayrıştırıcı programını art arda iki kez çalıştırın. İkinci döngüden sonra, homojenatı 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik konik bir tüpe boşaltın. Ardından, C-tüpünde kalan sıvıyı hücre süzgecine aktarmak için petri kabını yıkarken aynı Pasteur pipetini kullanın.

Ardından, filtrelenmiş sıvıyı 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için 1 mililitrelik bir mikropipet kullanın ve C-tüpünü ek 3 mililitre ortamla durulayın. Bu yıkamayı hücre süzgecinden geçirerek 50 mililitrelik tüpe aktarın. Ardından, dokuda sıkışan maksimum kalıntı sıvı miktarını 50 mililitrelik tüpe sıkmak için homojenize edilmemiş dokuyu temiz 1 mililitrelik bir uçla süzgecin etrafında nazikçe hareket ettirin. Şimdi hücre süzgecini orijinal C-tüpünün üzerine baş aşağı yerleştirin ve süzgeci 3 mililitre daha orta ile durulayın, böylece homojenize edilmemiş doku C-tüpüne geri düşer.

Dokuyu az önce gösterildiği gibi iki döngü daha yeniden homojenize edin ve ardından ikinci homojenatı tekrar hücre süzgecinden dökün. C-tüpünü 3 mililitre başka bir ortamla durulayın. Daha sonra süpernatanı süzgeçten süzün ve az önce gösterildiği gibi kalan sıvıyı dokudan sıkın. Bu noktada, 15 mililitrelik tüpte yaklaşık 2,5 mililitrelik bir hacim bulunmalı ve 50 mililitrelik tüpte yaklaşık 9 mililitre gözlenmelidir.

Doku süpernatantını hücrelerden ayırmak için, önce her iki homojenat tüpünü oda sıcaklığında 600 Gs'de 15 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı 15 mililitrelik tüpten 1.5 mililitrelik bir tüpe boşaltın, 4 santigrat dereceye yerleştirin ve süpernatanı 50 mililitrelik tüpten atın. Ardından, hücre topaklarının her birini parçalamak için her bir tüpü sert bir yüzeye hafifçe vurun.

50 mililitrelik tüpteki gevşek hücre peletini 500 mikrolitre ortamla yeniden askıya aldı ve ikinci peleti yeniden süspanse etmek için hücreleri 15 mililitrelik tüpe aktardı. Daha sonra 50 mililitrelik tüpü başka bir 500 mikrolitre ortamla durulayın ve maksimum hücre geri kazanımı için yıkamayı 15 mililitrelik tüpe aktarın. Tripan mavisi dışlaması ile canlı hücrelerin sayısını saydıktan sonra, hücre süspansiyonunu peletleyin.

Son olarak, ayrılmış doku süpernatanı aşağı doğru döndürün. Ardından, süpernatanı pelete dokunmadan veya rahatsız etmeden en az bir temiz tüpe dikkatlice aktarın ve gelecekteki aşağı akış analizi için eksi 80 santigrat derecede saklayın.