Mikro Ölçekli Besin Katmanlar Deniz Mikro-organizmalar kemotaktik Tepki

Merhaba, benim adım Marcos. MIT İnşaat ve Çevre Mühendisliği bölümünde Profesör Roman Stalker ile çalışıyorum ve size kendi fotoğrafçılık tekniğini kullanarak nasıl mikro kanal yapılacağını göstereceğim. Başlamak için önce bir maske tasarlamamız gerekiyor.

İşte maske; bu temel olarak oluşturmayı planladığımız mikrokanalın nihai tasarımıdır. Bu bir enjektör tasarımıdır, böylece mikroorganizmaların içinde yüzdüğü ve kemotaksisi nasıl gerçekleştirdiklerini gözlemleyebileceğimiz ince bir besin tabakası oluşturabiliriz; burası ise boşluğun içinde bir mikro vorteks oluşturmak için kullanılan yan boşluk kanalıdır ve maskeyi aldıktan sonra bunu gösteren bir video ileride yayınlanacaktır. Şimdi goferleri temiz odaya götürüp petri kabına yerleştireceğiz. Şu an temiz odaya geçiyoruz.

Maskemiz basıldı ve hazır olduğuna göre, artık gerçek mikro imalat işlemlerini gerçekleştirmek için temiz oda içerisindeyiz. Şimdi yapacağım işlem, yeni satın aldığım temiz bir gofret parçasını alıp, aşağıdaki üç çözücüyü kullanarak ekstra temiz olduğundan emin olmak. İlk adım, aseton ve ardından hemen metanol kullanarak temizlemektir.

Ve ardından son adım izopropanoldür. Kaplama için hazırlanan goferin parlak yüzeyi üzerinde çalışıyoruz. Şimdi azot kullanarak kurutacağım.

Wafer kurutulduktan sonra, wafer yaklaşık 130 °C sıcaklıktaki bir fırına yerleştirilir ve beş ila 10 dakika boyunca pişirilir. Bu sırada, wafer'ın pişmesini beklerken iki sıcak plakayı hazırlayabiliriz; biri 65 °C ve diğeri 95 °C olarak ayarlanır. Böylece beş dakika pişirdikten sonra, wafer fırından çıkarılır ve yaklaşık beş dakika boyunca oda sıcaklığında bekletilir.

Ardından spin coating işlemine hazırız. Fotoresist dökmeden önce, üzerinde toz partikülü olmadığından emin olmamız gerekir; bunun için gofretin üzerine azot püskürtürüz. Püskürtme işlemi merkezden dışa doğru gerçekleştirilir.

Şimdi fotorezistle bu wafer'ın üzerini kaplayacağım. Yaklaşık üç mililitre miktarında döküyoruz. Fotorezisti wafer'ın üzerine dökerken hava kabarcığı oluşmaması için şişeyi mümkün olduğunca düşük tutmaya çalışın.

Şimdi, döndürme işlemine başlamadan önce fotoğraf rezistini gofret üzerinde yaklaşık bir dakika boyunca bekletelim. Bahsettiğim gibi, yüz mikron kalınlığında bir kaplama yapacağım. Bu nedenle toplam döndürme süresini 55 saniyeye ayarlıyoruz ve döndürme işlemini başlatabiliriz.

Öncelikle, döndürme hızını beş saniye içinde sıfırdan 500 RPM'ye çıkarıyoruz ve fotoresistin tüm wafer'ı kapladığını görebilmeniz için yaklaşık 10 saniye boyunca dönmeye bırakıyoruz; ardından hızı yaklaşık yedi saniye içinde 3000 RPM'ye yükseltip 30 saniye boyunca döndürüyoruz. Wafer'ı fotoresist ile kapladıktan sonra, wafer'ı sıcak plakaya yerleştiriyorum ve 65 °C'de beş dakika, ardından 95 °C'de 20 dakika boyunca yumuşak pişirme (soft bake) işlemi yapıyorum. 95 °C'deki yumuşak pişirme tamamlandıktan sonra, oda sıcaklığına kadar soğutuyoruz; ancak sıcaklıkta ani bir düşüş olmaması için bundan önce 65 °C'de yaklaşık iki ila üç dakika boyunca ön soğutma yapıyoruz.

Ardından, yaklaşık beş dakika boyunca oda sıcaklığında soğumaya bıraktık. Şimdi, maruz kalan kısımların sertleşmesi ve maruz kalmayan kısımların daha sonra yıkanarak uzaklaştırılması için örneği UV ışığına maruz bırakacağım. Burası maskeyi kullandığımız aşamadır ve gördüğünüz gibi, maske iki kısımdan oluşmaktadır: şeffaf olan kısım ve bu düzenekte tamamen opak veya siyah olan diğer kısım.

Şimdi bu maskeyi kaplanmış wafer'ın üzerine yerleştireceğim. Baskı şirketinden aldığınız maskenin iki tarafı vardır. Bunlardan biri, mürekkeple baskı yaptıkları taraftır.

Burası, wafer ile temas ettirmek istediğiniz bölgedir. Şimdi maske aracılığıyla wafer'ı UV ışığına maruz bırakacağım. Güvenlik amacıyla bu koruyucu gözlükleri takacağım.

Pozlama süresi, kullandığınız SUA'ya ve ulaşmaya çalıştığınız kalınlığa bağlıdır. Pozlama işleminin ardından, wafer'ı 65 °C'deki ısıtıcı plakaya yerleştirip beş dakika boyunca tekrar pişiriyorum ve ardından 20 dakika boyunca 95 °C'de tutuyorum. Şunu hatırlatmak isterim ki, bu pişirme süresi istenen kalınlığa ve kullandığınız farklı SUA'lara göre değişiklik gösterir.

Bu aşamadan sonra, gofretin geliştirme işlemini gerçekleştireceğiz. Geliştirme, pozlanmış bölgenin gofret üzerinde kalması için fotoresist'in istenmeyen kısımlarının uzaklaştırılması anlamına gelir. Gofreti geliştirmek ve fotoresist'in istenmeyen kısımlarını yıkayarak temizlemek için geliştirici çözelti kullanıyoruz.

Bu örnekte, geliştirici olarak pomonal asetat kullanıyorum; bu çözücüyü behere dökeceğim, wafer'ı yerleştireceğim ve yaklaşık 10 dakika boyunca beherin içinde bekleteceğim. Yine belirtmek gerekir ki, süre kullandığınız çözücüye ve kalınlığa bağlı olarak değişir. Şimdi, 10 dakika sonra wafer üzerinde sadece istenen kanal tasarımının kaldığını ve istenmeyen tüm kısımların temizlendiğini görebilirsiniz; şimdi sadece durulama işlemi yapacağım.

Aynı çözücüden taze bir miktar ve aynı poliyon asetat kullanarak, sadece durulamak amacıyla gofretin üzerine püskürtüyoruz. Son olarak, çözücüyü uzaklaştırmak için izopropanol kullanıp durulama yapıyoruz. Ardından, azot kullanarak kurutuyoruz.

Böylece üzerinde istenen desenin bulunduğu temiz bir wafer'a sahip oldunuz. Buna master diyoruz. Şimdi, üzerine PDMS dökmek ve prosedürün geri kalanına devam etmek için laboratuvarımıza dönüyoruz.

Şimdi temiz odadan döndük ve temel olarak yapacağımız işlem için kalıp görevi görecek olan ana kalıba sahibiz. Bir sonraki adımda, kürlenecek bir polimer olan PDMS'yi dökeceğiz. Gördüğünüz üzere, bu kalıbın üzerine bir polimer döktüğümüzde, polimer üzerinde bazı kanallar oluşacaktır ve sonuçta bu polimeri bir lamla bağladığımızda, polimerin kendisi kanalı oluşturacaktır.

Şimdi PDMS'yi hazırlayacağız. Bu, polimer olan polidimetilsiloksan PDMS'dir. Bu da bir kürleme ajanıdır.

Şimdi yapacağım işlem, kürleme ajanını bu kaba, PDMS'yi ise diğer kaba boşaltmak ve bunları 1:10 oranında karıştırmaktır. Homojen bir şekilde karıştırmak için genellikle bir karıştırıcı kullanırız. Karıştırdıkça çok sayıda kabarcık oluşur ve bu kabarcıklar, karışımın yeterince karıştırılıp karıştırılmadığını anlamamıza yardımcı olan bir gösterge niteliğindedir.

Şimdi, PDMS'i kürleme ajanı ile karıştırdıktan sonra, bu karışımı bir wafer olan master'ın üzerine dökmeye hazırız. Dökme işlemi sırasında wafer'ın hareket etmediğinden emin olmak için, wafer'ı bir bantla sabitledik. PDMS karışımını wafer'ın üzerine dökmeden önce, wafer'ın üzerine düşmüş olabilecek tozlardan mümkün olduğunca temizlenmesini sağlamak istiyoruz.

Wafer'daki tozları temizlemek için kompresörü çalıştırıyoruz. Tamam, PDMS'de çok fazla kabarcık olduğunu görebilirsiniz. Bu yüzden, bunu bir vakum odasına yerleştirerek kabarcıkları gidereceğiz.

Tüm kabarcıkları gidermek için vakumlama işlemi yaklaşık 30 dakika sürer. Kabarcıkları giderme işlemi tamamlandığında, örneği çıkarıp 65 °C'deki fırına yerleştiriyoruz ve en az 12 saat boyunca pişiriyoruz. 12 saat sonra, wafer kesim için hazır olacaktır.

PDMS'i kesmek ve gofret üzerinden çıkarmak için bu bıçağı, boru giriş ve çıkışları için delik açmak için ise bu delgeçle kullanacağım. Keserken, bıçağı gofrete değene kadar bastırın ancak gofreti kırmamak için çok fazla basınç uygulamayın ve kanalınızın etrafından kesin. Şimdi ise parçayı soyarak çıkarın.

Şu anda bunun, wafer'dan gelen desenle aynı olan kanal olduğunu görebilirsiniz. Yani, aynı olduklarını görebiliyorsunuz. Ve şimdi bu desen, bu polimer olan PDMS üzerine kazınmış durumda.

Bunlar bir cam lamla yapıştırıldıktan sonra, deneyimiz için kanal oluşturacaktır. Önemli olan bir sonraki adım, PDMS içindeki mikro kanallara giriş ve çıkışları yerleştirebilmek için mikro kanallara delikler açmayı hatırlamaktır. Bu nedenle, kanal tarafını, yani oluğun bulunduğu kısmı bantlamak için şeffaf bant kullandık ve orayı bantladık.

Bu kanalı şeffaf bantla kapatmamızın nedeni, tüm toz partiküllerini temizlemektir. Bir sonraki adım plazma yapıştırmadır. Diğer laboratuvarda gerçekleştireceğimiz plazma yapıştırma işleminden önce, bandı çıkararak yapıştırmak istediğimiz yüzeyi, yani bu yüzeyi ve cam lamı birlikte açığa çıkaracağız; ardından bunları oksijen plazmasına maruz bırakacağız ve sonrasında bir araya getireceğiz, böylece birbirlerine yapışacaklar.

Merhaba, benim adım Justin Seymour ve MIT'deki Roman Stocker laboratuvarında doktora sonrası araştırmacıyım. Araştırmalarım mikrobiyal ekoloji üzerine, daha spesifik olarak deniz mikroplarının okyanustaki besin odaklarını nasıl bulabildikleri üzerine yoğunlaşmıştır. Bu tür kalıpları incelemek için mikroakışkan teknikler kullanıyoruz.

Marcus'un daha önce nasıl üretileceğini gösterdiği kanalın plazma yapıştırma işleminden sonraki halini kullanacağız. Ardından bunu bir mikroakışkan deneyde özgürce kullanabiliriz. Bu deneyden önce, deneyde kullanacağımız substratları hazırlamamız gerekiyor.

Bugünkü deneyde, deniz fitoplanktonu olan Donella turcica'nın mikro ölçekli besin yamalarını nasıl bulabildiğini inceleyeceğiz. Bu örnekte besin olarak amonyum kullanacağız ve organizmaya 100 µM konsantrasyonunda amonyum sağlayacağız. Bu deneylerde, sağladığımız besin maddelerine floresan bir boya ekleyerek besin yamalarını görselleştirebiliyoruz.

Bu nedenle floresein boyası kullanıyoruz. Burada, besin olarak kullandığımız amonyumun içerisine 100 micromolar nihai konsantrasyonda floresein pipetliyorum. Ardından bu besini floresan mikroskobu altında görüntüleyebiliriz; bu da besin kümesinin nasıl yayıldığını gözlemlememize ve sonrasında organizmaların bu besin kümesine verdiği tepkiyi incelememize olanak tanır.

Mikroakışkanlık deneylerinde cam şırıngalar kullanıyoruz. İlk olarak, kullanacağımız şırıngalara substratları ve organizmaları eklemek istiyoruz. Bir sonraki adım, tüpleri mikroakışkan düzeneğe yerleştirmektir.

Ve bunu mikroskop tablası üzerinde gerçekleştiriyoruz. Mikroakışkan kanalımızı mikroskop tablasına yerleştiriyor ve ardından giriş ve çıkışlara tüpleri takıyoruz. Daha sonra bir atık rezervuarı yerleştiriyoruz ve atık rezervuarındaki tüpün tamamen suya gömülmesi için rezervuarın yarıya kadar sıvı ile dolu olduğundan emin oluyoruz.

Bu sayede kanal içerisinde sabit bir basınca sahip olabiliyoruz. Ardından, organizmaları (bu durumda donella lector) ve besin substratını (bu durumda amonyum) içeren mikroakışkan kanalı besleyen borulara şırıngaları takıyoruz. Deneylere başlamadan önce mikroskobu kuruyor ve mikroakışkan kanalın uygun konumda olduğunu kontrol ediyoruz.

Kanal konumlandırıldıktan sonra, kanalı kamera ile görüntülemek için geçiş yaparız ve bilgisayar üzerinden görselleştirebiliriz. Artık odaklama ile daha hassas ayarlamalar yapabilir ve besinleri enjekte ettiğimiz enjektörü görebiliriz. Bu enjektör, mikroakışkan kanala entegre edilmiş 100 µm tel iğne ucundan oluşmaktadır.

Besin maddelerini enjekte ederek bir besin gradyanı oluşturabiliriz. Deneylere başlamadan önceki bu aşamada, mikroakışkanlar sistemine girmiş olabilecek tüm kabarcıkları gidermemiz gerekir. Bunu, bu durumda bir valf aracılığıyla mikroakışkan kanala bağlayabileceğimiz, yapay deniz suyuyla doldurulmuş bir şırınga kullanarak yaparız.

Ardından, kanaldaki kabarcıkları gidermek için şırıngayı itiyoruz. Kabarcıkları iki yöntemden biriyle temizleyebiliriz; ya şırınganın oluşturduğu basınçla onları çıkıştan dışarı itebiliriz ya da gazlara geçirgen olan PDMS materyalin duvarlarından geçerek uzaklaşmalarını sağlayabiliriz. Kabarcıklar giderildikten ve deneye başlamaya hazır olduğumuzda, bir şırınga pompası kullanarak kanal içine enjeksiyon ve materyaller için uygun akış hızlarını ayarlıyoruz.

Bu durumda, kanaldaki 266 µm/s akış hızına eşdeğer olan dakikada iki µL'lik bir akış hızı kullanıyoruz. Uygun akış hızını ayarladıktan sonra, besinlerden oluşan ince bir bant oluşturmak için akışı başlatarak deneye başlayabiliriz. Besinlere floresein boyası ekleyip APF floresan mikroskobu altında görüntüleyerek, besinlerin enjeksiyon noktasından kanala enjekte edilişini görselleştirebiliriz; ardından mikroakışkan kanaldaki akışı durdurup besin bandının orijinal konumundan yanlara doğru difüze oluşunu görüntüleyerek yama dinamiklerini inceleyebiliriz.

Ardından, kanal içinde yüzen organizmaları görselleştirmek ve besin yamasına göre konumlarına bakmak için faz kontrast mikroskobisine geçiyoruz. Bunu, saniyede 10 karelik bir hızla bir dizi kare alarak yapabiliyoruz; bu işlem, organizmaları görselleştirebildiğimiz bir video oluşturur. Daha sonra, bir karenin bir önceki kareden çıkarıldığı iki ayrı kare arasındaki zaman farklarını alarak, yalnızca hareket eden nesnelerin görselleştirildiği yüzen organizmaları görebiliriz.

Böylece görüntülerdeki arka plan gürültüsünü giderebiliriz. Ardından, besin yamasının ilk salınımından sonra 10 ila 20 dakika boyunca düzenli aralıklarla videolar kaydederiz. Görüntü analiz yazılımını kullanarak dizideki bir karedeki organizma konumlarını diğerinin üzerine bindirerek, bu organizmaların konumlarındaki değişimleri inceleyebilir ve yüzme yörüngeleri hakkında bilgi edinebiliriz; buradan da hızlar ve yön değişimleri dahil olmak üzere yüzme istatistikleri hakkında daha detaylı bilgi elde edebiliriz.

Böylece bu deneyler, deniz mikroplarının mikro ölçekli besin yamalarını nasıl bulabildiğini ve bunlardan nasıl yararlanabildiğini ilk kez doğrudan incelememize olanak tanıdı. Bu durum, okyanustaki trofik dinamikler ve besin döngüsü için önemli sonuçlar doğurabilir. Justin'in değindiği konuyu takip edecek olursak, mikroorganizmaların, özellikle de bakterilerin okyanustaki besinleriyle nasıl etkileşime girdiği biyokimyasal döngüler üzerinde birçok etkiye sahip olabilir.

Buna karşın, okyanus hiçbir zaman tamamen durgun değildir; rüzgar veya yüzey tarafından oluşturulan türbülans gibi birçok akış durumu mevcuttur. Mikroorganizmalar ölçeğinde, deneyimledikleri şey aslında büyük ölçekli türbülans değil, kayma kuvvetidir ve türbülansın en küçük kalıntıları Kolmogorov girdabı olarak bilinir. Burada yapmaya çalıştığımız şey, bu girdapların mikroorganizmaların yüzme davranışları üzerindeki etkilerini incelemektir.

Bunu yapmak için, size daha önce gösterdiğim bu kütleyi kullanarak başka bir kanal oluşturuyoruz. Ve merkezde bir boşluk var. Şemayı büyütmek için şimdi onu çizeyim.

Kanal görünümü şu şekildedir; bu, yukarıdan gördüğümüz görünümdür ve akışı soldan sağa doğru enjekte ediyoruz ve kayma nedeniyle bu boşluğun içinde yeniden dolaşım olan bir bölge oluşmaktadır. Ve bu boşluk, bir graft Addis'in temsilidir. Şırınga pompası kapalıyken ve herhangi bir akışı başlatmadığımda, Justin'in daha önce açıkladığı aynı düzeneği kullanabiliriz; bakterilerin bu boşluk içinde oldukça rastgele ve rahatça yüzdüklerini görebilirsiniz.

Ve tercih edilen bir yönelim yoktur. Gördüğünüz görüntü bir zaman farkı videosudur ve bu, Justin'in kullandığıyla tamamen aynı tekniktir. Gördüğünüz üzere, akış çok hızlı olduğunda bakteriler vorteks tarafından sürüklenmektedir.

Bakterilerin kendi yörüngeleri, girdabın akış hattını takip eder. Aslında daha ilginç olan ise, şırınga pompasını çalıştırdığımızda gerçekleşen durumdur; ancak hız çok yüksek değildir.

Bakterilerin karşı koyamayacağı kadar hızlı değil; ancak bu videoda hâlâ bir girdaba benzer bir yapı olduğunu görebilirsiniz. Dolayısıyla bu deneyden, çok güçlü ve türbülanslı bir akış varlığında bakterilerin akışın insafına kaldıklarını ve akışa karşı koyamadıklarını öğrenmiş olduk.

Buna rağmen, hafif türbülanslı bir bölgede hala kendi başlarına yüzebilmektedirler.