Retina Pigment Epitel Fizyoloji ve Patofizyoloji Çalışma Deneysel Modeller

Bu prosedürün genel amacı, model olarak kullanılabilecek insan fetal retinal pigment epitelyumu veya RPE kültürleri oluşturmaktır. İnsan göz hastalıkları araştırmalarında, dokular donörlerden bütün göz küreleri şeklinde alınır. Prosedürün ilk adımı, fazla kas ve bağ dokusunu budamak ve ardından korneayı ve lensi çıkararak gözü açmaktır.

Göz dispa ile işleme tabi tutularak düzleştirilir ve ardından RPE monokatmanı koroidden soyulur. Disseke edilen RPE'ler flasklara ekilir ve konflüent monokatmanlar oluşturup pigment geliştirene kadar birkaç hafta boyunca büyütülür. Hücre kültürleri, in vitro fonksiyonel deneylerde kullanılır.

Başarılı in vitro deneyler, RPE yanıtlarının daha karmaşık sinyalizasyon ortamlarında daha iyi değerlendirilebildiği preklinik deneme hayvan modellerinde tekrarlanır. Burada gösterilen model, RPE fizyolojisinin daha iyi anlaşılmasını ve oküler hastalıkların tedavisine yönelik yeni terapötik müdahalelerin geliştirilmesini sağlayacaktır. Merhaba, benim adım Sheldon Miller.

Laboratuvarım, Bethesda Maryland kampüsündeki Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin bir parçası olan Ulusal Göz Enstitüsü'nde yer almaktadır. Merhaba, ben Miller Laboratuvarı'ndan Arki. Bugün sizlere insan fetal retinal pigment epitelyal hücrelerinin primer kültürlerinin hazırlanması için uygulanacak bir prosedürü göstereceğiz.

Bu hücreler, modifiye tekli odacıklara yerleştirilebilen konfluens monolayerlar şeklinde hazırlanacaktır. Ayrıca, izole edilen bu insan RPE hücrelerini biyokimya ve genetik çalışmalarında da kullanacağız. Laboratuvarımızda bu prosedürü, fizyolojik ve patofizyolojik süreçlerin fonksiyonlarını ve düzenlenmesini incelemek ve hastalıkların klinik hayvan modellerini geliştirmek amacıyla epitel hücrelerinin primer kültürlerini oluşturmak için kullanmaktayız.

Gözün arkasında yer alan, nöral retina ile koroid kan akımını birbirinden ayıran retinal pigment epitelyumuna veya RPE'ye odaklanıyoruz. Gözün bu şematik diyagramı, RPE tabakasının gözün arkasında, fotoreseptörlerin hemen yanındaki konumunu göstermektedir. Ek yerleştirme, sağda fotoreseptörlerin ve solda ganglion hücrelerinin bulunduğu retina hücrelerini göstermektedir.

Bu epitel metabolik olarak son derece aktiftir. Günlük olarak sürekli fotoreseptörleri fagosite eder ve görsel pigment vitamin A'yı depolar, işler ve fotoreseptörlere taşır. Görme döngüsünde, çevredeki hücre dışı boşlukların kimyasal bileşimini ve hacmini korumak için homeostatik olarak görev yapar.

Epitellerin kritik bir özelliği polariteleridir. Proteinlerin apikal ve bazal lateral membranlara sürekli asimetrik iletimi, epitelyumun metabolitlerin, iyonların ve sıvıların bir hücre dışı boşluktan diğerine vektörel taşınımını gerçekleştirmesini sağlayan düzenlenmiş bir süreçtir. Bu aktivite, epitelyumun nöral retinanın sağlığını ve bütünlüğünü korumasına yardımcı olur.

Burada tanımladığımız in vitro hazırlama yöntemi, diseksiyona başlamadan önce epitelyal polariteyi ve fonksiyonu belirleyen transport proteinlerinin, reseptörlerin ve sinyal yolaklarının analiz edilmesine olanak tanır. Oda sıcaklığındaki çözeltilerle laminar akışlı kabinde 12 kuyucuklu bir plak hazırlayın. Her bir göz için; 10 x antibiyotik antimikotik çözeltisinden bir kuyucuk, bir X PBS'den iki kuyucuk ve serumlu %5 RPE ortamında mililitre başına iki ünite olarak seyreltilmiş disk boşluğundan bir kuyucuk gereklidir. Silikon pedli bir diseksiyon kabını bir X-H-B-S-S ile doldurun, sıvıyı boşaltın ve her bir gözü antibiyotik antimikotik çözeltisinin bulunduğu bir kuyucuğa aktarın.

Oda sıcaklığında üç ila beş dakika inkübe edin. Göz küresine aşırı basınç uygulamaktan kaçının. Fazla antibiyotiği uzaklaştırmak için gözü, bir XPBS içeren art arda iki kuyucukta durulayın.

Ardından, bir diseksiyon stereo mikroskobu altında, örneği bir X-H-B-S-S ile dolu diseksiyon kabına transfer etmek için pens kullanın. Göz çevresindeki fazla kas ve bağ dokusunu temizlemek için iris makası kullanın. Gözü, kornea yukarı bakacak şekilde hizalayın.

Sklera zarar vermeden, gözü bağ dokusundan silikon pede sabitlemek için iki adet steril 27 gauge iğne kullanın. Bu konumlandırmada, sklera üzerinden bir insizyon yapmak için yan port bıçağı kullanın. Kesim, göz ekvatoru ile ön yüzey arasındaki mesafenin üçte birinde olmalıdır.

Retinal pigment epitelyumuna (kısaca RPE) vitreus retina çekilmesi nedeniyle zarar vermemek için iris makasıyla göz çevresindeki dairesel kesime devam edin. Ön göz flebini göz kupundan ayırmak için aynı makasla vitreus cismi boyunca kesin.

IOA'nın ön kısmını kaldırın ve atın. Açık gözü dys kuyucuğuna aktarmak için pens kullanın. Gözün içinde hava kabarcığı kalmadığından emin olun. Cup.

%5 karbondioksit içeren 37 °C ortamda 40 ila 60 dakika inkübe edin. Gözü, taze oda sıcaklığında 1X HBSS ile doldurulmuş olan diseksiyon kabına geri aktarın. Gözü kubbe kısmı yukarı bakacak şekilde konumlandırın ve 2 adet 27 gauge iğne ile sabitleyin.

Diseksiyon mikroskobu altında, ince pensler kullanarak kısmen ayrılmış retinayı retina makasıyla nazikçe kaldırın. Retinayı optik sinirden kesin. Retinayı iris makasıyla atın.

Gözün çevresinden optik sinire doğru bir insizyon yapın. Gözü 5 adet 27 gauge iğne ile sabitleyin. RPE tabakasını germek için, optik sinirin etrafında retinal makas kullanarak dairesel bir kesi yapın.

250x büyütmeye veya daha fazlasına geçerek RPE tabakasını ayırın. İris makasıyla yapılan kesim boyunca ve optik sinire yakın olan RPE tabakasının kenarını bulun. RPE ve Bruch membranını koroid doku tabakasından ayırmak için iki çift pens kullanın.

RPE ile koroid arasındaki bağlantının en zayıf olduğu bölgeyi bulmak için kesik kenar boyunca birkaç farklı alanı deneyin. Membranı tamamen çıkarmak için nazikçe geri soyun. RPE tabakalarını, oda sıcaklığındaki trips in EDTA ile doldurulmuş 15 milliliter konik tüpe yerleştirin.

Tüm tabakalar toplandığında tüpü kapatın ve tüpleri 37 °C'deki bir su banyosunda 10 dakika boyunca inkübe edin. RPE'yi küçük kümeler halinde ayırmak için tüpü kuvvetlice çalkalayın. Koyu renkli hücre kümelerinin kalmaması, ayırma işleminin tamamlandığı anlamına gelir.

Tüpü beş dakika daha su banyosuna geri yerleştirin. Sindirilmemiş doku kalıntılarını uzaklaştırmak için bir pastör pipetiyle hafifçe vakum yapın. Hücreleri bir santrifüjde 280 5G'de dört dakika boyunca çöktürün.

Süpernatantı uzaklaştırın. Resüspansiyon için final hacmini %15RPE medyum ile dokuz mililitreye tamamlayın. Hücre süspansiyonundan üç mililitre pipetleyerek 25 santimetrekarelik bir flaska aktarın.

İki mililitre taze, oda sıcaklığında %15 RPE kültür ortamı ekleyin. Hücreleri 37 °C ve %5 karbondioksit altında gece boyunca bekletin. Kültürler olgunlaştıkça, üç ila dört hafta sonra pigmentasyonları artacaktır.

Başarılı kültürler konfluen olacak ve tekdüze, yoğun şekilde pigmente olacaktır. İnsan fetal RP primer kültürlerinin nasıl hazırlanacağını göstermiş olduk. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.