Name: Retina Pigment Epitel Fizyoloji ve Patofizyoloji Çalışma Deneysel Modeller (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Keşfedin insan fetal retinal pigment epitel hücrelerini yetiştirme yöntemini ve bu modelin göz hastalıkları araştırmalarında nasıl kullanıldığını. Bu teknik, RPE fizyolojisini anlamak ve yeni tedaviler geliştirmek için sağlam bir temel sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Lab üyeleri Jeffrey Adijanto Tina Banzon Rong Li Qin Wan, Congxiao Zhang Jing Zhao, Connie Zhi, Awais Ziya, Natalia Strunnikova bu hücre kültürleri karakterize yardım için teşekkür ederim. Jing Zhao, Connie Zhi, ve Tina Banzon hücre kültürleri büyük stoklar korunmasında yardım ettikleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Sağlık İntramural Araştırma Programı Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından da desteklenmiştir.

1. İnsan Fetal Doku Bütün insan dokusu ile ilgili araştırma, Helsinki Bildirgesi ve NIH kurumsal inceleme kurulu ilkelerini izler. Fetal gözleri buz üzerinde dolu tüpler (ABR tarafından sağlanan) içeren RPMI-1640 medya yerleştirilir rastgele donörler, gebeliğin 16 ila 22 hafta, bağımsız bir pezevengi, Gelişmiş Bioscience Kaynakları (ABR, Alameda, CA) tarafından elde edilen ve bir gecede öncelikli teslimat hizmeti tarafından teslim edilir. Dokular enükleasyon sonra 48 saat kadar canlı kalır. 2. Hücre Kültürü Orta MEM-alfa modifiye orta% 5 (Sigma-Aldrich) hazırlamak için temel aracı olarak kullanılan ve RPE hücrelerinin kültür (RPE orta, aşağıda Tablo 1) için% 15 serum içeren medya. <table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Sigma </td><td> Gibco </td><td> Miktar </td><td> Depolama </td></tr><tr><td> MEM, alfa değişiklik </td><td> M-4526 </td><td></td><td> 500 mL </td><td> +4 ° C </td></tr><tr><td> N1 takviyesi </td><td> N-6530 </td><td></td><td> 5 ml </td><td> +4 ° C </td></tr><tr><td> Penisilin-streptomisin </td><td></td><td> 15140-148 </td><td> 5 ml </td><td> -20 ° C </td></tr><tr><td> GlutaMax - I </td><td></td><td> 35050 </td><td> 5 ml </td><td> -20 ° C </td></tr><tr><td> Sigara esansiyel amino asitleri </td><td> M-7145 </td><td></td><td> 5 ml </td><td> +4 ° C </td></tr><tr><td> THT * </td><td></td><td></td><td></td><td> -80 ° C </td></tr><tr><td> Boğa </td><td> T-0625 </td><td></td><td> 125 mg </td><td></td></tr><tr><td> Hidrokortizon </td><td> H-0396 10 </td><td></td><td> 10 mikrogram </td><td></td></tr><tr><td> Triiodo-thyronin </td><td> T-5516 </td><td></td><td> 0,0065 mg </td><td></td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu ** </td><td></td><td></td><td> % 5 veya% 15 </td><td> -80 ° C </td></tr></tbody></table> Tablo 1. 500 ml Orta hazırlanması için İnsan Fetal RPE Orta Bileşenleri * THT orta yapmadan önce 1 1.5 ml PBS taurin hidrokortizon triiodo-thyronin eriterek yapılır. Birden fazla alikotları -80 yapılır ve saklanır ° C kültür kültür ortamı hazırlanması basitleştirmek için. ** Fetal sığır serumu, Sigma-Aldrich veya Gibco elde değildir. Medya hazırlanmasında kullanılan fetal sığır serumu Atlanta Biyolojik (Norcross, GA) elde edilir. Her şişe serum kullanmadan önce (56 ° C 1hr) inaktive ısı. Aynı lottan serum hücre kültürü tutarlılık büyük miktarda sağlamak için ortam hazırlanması için kullanılması kadar satın alınan ve -20 ° C'de saklanır. % 20 FBS içeren farklı birçok medya birkaç hafta iyi plakaları - veya 12 - 24 hfRPE hücreleri belirli bir toplu seyrek numaralı seribaşı hücreleri yetiştirilmektedir. En klasik RPE morfolojisi (arnavut kaldırımı) ile en hızlı büyüyen melanated hücreleri, hücre kültürü için kullanılabilecek uygun bir serum çok göstermektedir. Hücre kültürü ortamı da içerir: N1 takviyesi (Sigma-Aldrich) 1:100 mL / ml, GlutaMax / penisilin-streptomisin 1:100 ml / ml (Gibco) ve esansiyel olmayan amino asit çözeltisi (Sigma-Aldrich) 1:100 mL / ml. Buna ek olarak, hidrokortizon (20 mg / L), taurin (250 mg / L) ve triiodo-thyronin (0,013 mg / L) (THT) 1:500 bir nihai konsantrasyonu PBS içinde eriterek, bu üç bileşenin önceden hazırlanan (ml / ml). THT, Alikot 80 saklanır ° C kadar RPE orta eklendi. 3. Hücre Kültürü Alındıktan sağlam küreler antibiyotik antimikotik çözüm durulanır (10X seyreltilir. Kedi hayır 15.240-096; Invitrogen) artı gentamisin (1 mg / ml) 3 ila 5 dakika (aşağıda Şekil 1). <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Inkübasyon antibiyotik HBSS veya PBS gibi orta iki kez durulanır sonra. Bir anda göz dünya Sylgard-184 (TEFE) ile kaplı 10 cm Petri kabı aktarılır ve 27G iğne ile güvence altına alınmıştır. K seçik SidePort bıçak kullanma (Alcon) sklerasına siliyer cisim (ön yüzey göz ekvator mesafenin 1 / 3) altında bir kesi ile yapılır. Bu kesi ön göz kısmının çıkarılması için dairesel kesim başlatmak için kullanılır. Bu kesim, bir bıçak tırtıllı (FST) ile bir tungsten-karbür kaplı kavisli iris makası kullanılarak yapılır. Gözün ön kısmının kaldırılması için önce, bir kesim r koparmasını önlemek için vitreus ile yapılırarka kutbunda RPE etina. 5% 40-60 dakika süreyle serum içeren orta gözün ön kısmı çıkarıldıktan sonra, arka kutupta dispase-I çözeltisi (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN. 2 U / ml, kedi hayır 04942086001) ile inkübe edilir 37 ° C-% 5 CO 2. Dispase tedaviden sonra, posterior direkleri silikon dolgu (Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) Petri kapları bir HBSS aktarılır ve kadran veya dokuların yeterince düzleştirmek için büyük parçalar halinde disseke. Daha sonra retinanın forseps ile yavaşça kaldırılır. Tek hücreli RPE katmanları sayfaları sıyrılır ve soğuk tripsin-EDTA (Gibco, # 25.200-056) çözümü doğrudan toplanmıştır. RPE toplandıktan sonra, tripsin-EDTA doku tüpler 37 mühürlü ve 10-15 dakika su banyosunda aktarılır ° C Inkübasyon 10 dakika sonra, küçük kümeler halinde RPE ayrı tüpler şiddetle sarsıldı. Mesafeyi tam değilse, tüpler 5 dakika su banyosu içine yerleştirilmiştir. Tripsin-EDTA inkübasyondan sonra, tüpler mümkün un çözünmüş karışık hücre kümeleri için denetlenmektedir. Herhangi bir gözlenen kümeleri ince uçlu cam Pasteur pipeti kullanarak kaldırılır. Aşağı iplik (4 dakika için 1.4 klinik santrifüj rpm) sonra, hfRPE hücrelerin% 15 RPE medyada yeniden askıya alınır ve daha sonra (örneğin primaria şişeler içine koyun: kedi hayır 08-772-45; Fisher Scientific, Pittsburgh, PA. .) Bu orta,% 5 serum içeren RPE orta ile 1 gün sonra değiştirilir ve 2 ila 3 günde bir sonraki değişiklikler yapılmıştır. 3 ila 4 hafta sonra, hücreler belirsiz ve düzgün pigmentli oldu. Corning Costar Daha sonra% 15 serum içeren RPE hücre kültür ortamı yeniden askıya alınmış ve ortalama 150 200K hücreleri (transwell açık hücre kültürü ekler üzerine numaralı seribaşı, 10 ila 15 dakika boyunca% 0.25 'lik tripsin-EDTA tripsinize. kedi hayır 07-200-161 Fisher Scientific): 12 mm çap ekler, 0.4-um gözenekleri, polyester membranlar (örneğin kullanarak Corning, NY). Tohumlama önce, kuyulardan insan ekstrasellüler matriks (ortalama iyi 150 mcL HBSS 10 mikrogram, kedi hayır 354.237, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) ile kaplandı ve 2 saat boyunca başlık UV ışık ile tedavi. Bazı durumlarda, trypsinization prosedürü ilk trypsinization sonra ayırmak vermedi hücreleri toplamak için, ikinci kez tekrarlandı. Aynı protokolü (ECM ile kaplama hariç), matara, hücre P1 nüfus oluşturmak için kültür hücreleri kullanıldı. Bu hücreler ≥ 200 Ω • cm 2 olmak üzere toplam doku direnci vardı ve düzgün pigmentli deneylerde kullanıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2032/2032fig1full.jpg">Daha büyük bir şekil 1 için buraya tıklayınız</a> . 4. Adım Adım Prosedürleri <ol><li> Birden fazla çözümleri (4 kuyu ihtiyaç duyulan her gözün) ile 12-plaka hazırlayın: <ol class="lalpha"><li> 1 / göz - 10x antibiyotik antimikotik çözüm eklemek </li><li> PBS / HBSS durulama için bir çözüm eklemek - 2 kuyuları / göz </li><li> dispase çözüm - 1 / göz </li></ol></li><li> Petri kabı 5 fiksasyon iğneler açma ve HBSS ile doldurma diseksiyon hazırlayın </li><li> Paketinden çıkarın gözleri ve 3-5 dakika (adım 1 hazırlanan) antibiyotik antimikotik çözüm içine yerleştirin </li><li> Iki kuyu (adım 1 hazırlanan) PBS / HBSS ile yıkayınız, daha sonra çanak diseksiyon aktarabilirsiniz. </li><li> Trim aşırı kas ve göz çevresindeki bağ dokuları </li><li> Güvenli 27G iğneler (silikon taban aşağı pin) gözleri korneanın yukarı bakacak şekilde hizalayarak çanak diseksiyon kullanma. </li><li> Dairesel kesme başlayacak SidePort bıçak kullanarak, kornea altında kesi yapmak </li><li> Kullanarak iris makası, göz etrafında vitreus üzerinden kesilmiş ve gözün ön kısmını kaldırın sonra aynı makas kullanarak kesin. Not: 3 ile 8 adımda göz küresinin herhangi bir aşırı mekanik basınç önlemek. </li><li> (Adım 1 hazırlanan) dispase çözüm Transfer açık göz </li><li> 37, 40-60 dakika süreyle göz fincan inkübe ° C ile% 5 CO 2 </li><li> Taze bir çanak diseksiyon HBSS çözüm değiştirin. </li><li> Dispase çözüm diseksiyon çanak göz aktarın. </li><li> Konum Petri kabındaki göz (göz küresinin fincan yukarı bakacak şekilde) ve iki 27G iğne ile güvenli. </li><li> Yavaşça kaldırın ve kısmen ayrılmış retina retina makas kullanarak optik sinir uzak retina kesti. Retinanın atın. </li><li> Iris makası kullanarak, optik sinir doğru göz çevreden bir kesi yapmak. </li><li> Tüm beş 27G iğneler kullanarak güzel gergin göz yapma RPE düzleştirmek. </li><li> Retina makas kullanarak optik sinir bağlılık RPE ayıran optik sinir etrafında dairesel kesim olun. Not: 13-17 adımları düşük büyütme ya da stereo mikroskop olmadan yapılabilir </li><li> 250x büyütme stereomikroskopta ayarlayın.veya daha fazla ve iris makas tarafından yapılan kesim birlikte optik sinir yakın RPE sayfasının kenarına bulmak. </li><li> Koroidal doku tabakası ayrı RPE-Bruch membran iki forseps kullanma. Kenarı boyunca RPE ve koroid bağlantı zayıf olduğu alanı bulmak için birkaç girişim gerekebilir. </li><li> Yeri RPE yaprak soğuk tripsin-EDTA çözeltisi içine 15 ml tüp </li><li> 37 RPE 10-15mins tripsin-EDTA su banyosu içine dokuları ile, şapka ve transfer borular toplandıktan sonra ° C </li><li> 10 dakika inkübasyondan sonra, şiddetle, küçük kümeler halinde RPE ayırmak için 15 ml tüpler sallayın. Mesafeyi tam değilse, başka bir 5 dakika su banyosunda geri tüpler içine yerleştirin. </li><li> Mümkün un çözünmüş karışık hücre kümeleri için tüpleri kontrol edin. Herhangi bir gözlenen kümeleri ince uçlu cam Pasteur pipeti kullanarak çıkarılmalıdır. </li><li> (4 dakika için 1.4 klinik santrifüj rpm) hfRPE hücreleri aşağı Spin,% 15 RPE medya (9 ml toplam) süpernatant kaldırmak ve yeniden askıya hücreleri </li><li> Primaria şişeler 2 mL taze% 15 RPE medya, ertesi gün (37 ° C,% 5 CO 2) kadar kuvöz içine balon içine 3 ml hücre süspansiyonu koyun </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Fonksiyonel doğrulama hfRPE hücre kültürü Daha önceki deneylerde, plazma membran transport proteinleri ifade, kutuplaşma ve işlevini belirlemek ve uygulanabilir özellikleri ayarlanan bir doğrulama sağlamak birikmiş olarak RPE fonksiyonu 1-11 Bu özellikler düzenleyen özel sinyalizasyon yollar tanımlamak için bu primer kültürlerinde var her hücre nesil. Transepitelyal sıvı taşıma ve paracellular yolun bütünlüğünü belirleyen proteinleri tespit deneyler aşağıda özetlenmiştir. Bu in vitro deneylerde retina yeniden yatıştırıldı 6 bir hayvan modelinde onaylanmıştır . <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. HfRPE hücreleri CFTR Yerelleştirme Sol üst paneli: CFTR hfRPE hücrelerin membran zenginleştirilmiş özler kullanılarak tespit edildi. M, moleküler ağırlık belirteci; şeritli 1, Merkezi alt panelde büyük olgun (bant C) ve immatür (A ve B grupları): CFTR immünofloresan lokalizasyonu (yeşil etiket) Top sağ panelde gösteren z düzlemi boyunca büyük kesit görünümü. z-ekseni üzerinden maksimum yoğunluk projeksiyon. ZO-1 (kırmızı olarak işaretlenmiş) RPE apikal ve bazolateral tarafı tasvir sıkı bir bağlantı belirteci olarak hizmet vermektedir. DAPI (mavi), bazal membran bulunan çekirdeklerin yakın etiketler. ZO-1 CFTR kırmızı etiket örtüşmektedir yeşil floresan bu yana, sarı / turuncu olarak görünür. <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. HfRPE içinde IFNγ indüklenen fizyolojik değişiklikler A: bazal banyo IFNγ Ayrıca, ilköğretim, kültürlü hfRPE hücrelerin tek tabaka üzerinde transepitelyal sıvı taşımacılığı (J v) artmış J v üst izlemesi zaman fonksiyonu ve net sıvı olarak çizilir . emme (bazal banyo için apikal) pozitif değerler ile gösterilir; transepitelyal potansiyeli (TEP) ve total doku direnci (R T) alt izleri zamanın bir fonksiyonu olarak çizilir. B: bazal banyo CFTRinh-172 (5 mcM) eklenmesi IFNγ uyarılmış J v artması engellenir. Aşağıda hayvan modeli deneyler vitro bulgular hfRPE doğrulayan bir örnektir. Bu deneyde, yapay olarak oluşturulmuş retina dekolmanı (Şekil 4 A, B) dış göz yüzeyine IFNg eklenmesinden sonra önemli ölçüde azalmıştır. Bu etki kısmen tarafından bloke edilebilir: (1) Ayrıca cAMP bloker (Şekil 4D), (2) JAK + cAMP blokerler eklenmesinden sonra tamamen engellendi. Aşağıdaki resimlere Ekim tarayıcı kullanılarak elde edilir. <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4, in vivo retina dekolmanı deneylerde in vivo deneylerde bu prosedürleri daha önce ayrıntılı 6 tarif edilmiştir . Bu deneylerde, retina dekolmanları subretinal boşluk (SRS), tek başına ya JAK-STAT ve PKA yolak inhibitörleri kombinasyonu ile modifiye PBS çözüm 0,5-3 mcL enjeksiyon yoluyla sıçan göz yaratıldı. Her deneyde, retina dekolmanı oluşturulmasından sonra, 40-70 dk bir başlangıç ​​kontrolü süre vardı. Bu süre zarfında, bleb hacminin değişim oranı bleb istikrar sigorta ölçüldü. Optik koherens tomografi görüntüleme (Uygulamalı Fizik Enstitüsü, Rusya Bilimler Akademisi, Nizhniy Novgorod, Rusya) SRS ses düzeyini değiştirmek zaman ders ölçmek için kullanılmıştır. Re-eki vol zaman kursuume değişiklik Optik Koherens Tomografi (OCT) ile ölçüldü. Dekolmanı boyutlarda bir değişim göstermektedir (A, B, oklar, ve D) 40-70 dakika süreyle ön yüzeyine IFNγ Ayrıca aşağıdaki 4 farklı deneyler (AD soldaki paneller) OCT görüntüleri. Paneller A ve IFNγ kontrol oranı JV arttığını B gösterisi (≈ 2 ul • 2 • saat -1) sırasıyla 14 ve 12 ul • cm 2 saat-1 cm. Kaynaklı emme oranları önemli ölçüde JAK-STAT yolu ve PKA inhibitörleri (C ve D), IFNγ ilavesinden sonra 0.2 ve 7.9 azaldı ul • cm 2 • saat-1, sırasıyla. Oklar, kesikli çizgi içine alan, (başlangıç ​​hacim) ile karşılaştırıldığında bleb sınırını gösterir. Figürün sağ tarafı: t = 0 dekolmanı mekansal kapsamı ve çeşitli deneyler Ölçülen JV oranları üst panelde özeti; orta panel film ( <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2032/Bleb%205.wmv">buraya tıklayın</a> ); alt panel-3D B. mavi Pseudocolor özetlenebilir deney bölümleri gösterir . INFγ ek 40 dakika sonra. Vizyon Araştırma ve Oftalmoloji bildirimde Derneği ile uyumlu Tüm hayvan deneyleri yapılmıştır. Protokolü Ulusal Sağlık Enstitüleri Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı.

<ol><li>Bharti, K., Miller, S. S., Arnheiter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+paradigm%3A+Retinal+pigment+epithelium+cells+generated+from+embryonic+stem+cells+or+induced+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+%26+Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">The new paradigm: Retinal pigment epithelium cells generated from embryonic stem cells or induced pluripotent cells.</a> Pigment Cell & Melanoma Research. , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Strunnikova, N. V., Maminishkis, A., Barb, J. J., Wang, F., Zhi, C., Sergeev, Y., Chen, W., Edwards, A. O., Stambolian, D., Abecasis, G., Swaroop, A., Munson, P. J., Miller, S. S., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+and+molecular+signature+of+human+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis and molecular signature of human retinal pigment epithelium.</a> Hum Mol Genet. 19 (12), 2468-2486 (2010).</li>
<li>Miller, S. S., Maminishkis, A., Li, R., Adijanto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+184%3A+Phototransduction%3A+RPE+transport+Retina+Phototransduction%3A+RPE+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+the+Eye%22%5BJournal%5D)">Chapter 184: Phototransduction: RPE transport Retina Phototransduction: RPE transport.</a> Encyclopedia of the Eye. , Elsevier. 2540-2540 (2010).</li>
<li>Bryant, D. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+cells+to+organs%3A+Building+polarized+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">From cells to organs: Building polarized tissue.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (11), 887-901 (2008).</li>
<li>Maminishkis, A., Chen, S., Jalickee, S., Banzon, T., Shi, G., Wang, F. E., Ehalt, T., Hammer, J. A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).</li>
<li>Shi, G., Maminishkis, A., Banzon, T., Jalickee, S., Li, R., Hammer, J., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+chemokine+gradients+by+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Control of chemokine gradients by the retinal pigment epithelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 4620-4630 (2008).</li>
<li>Economopoulou, M., Hammer, J., Wang, F. E., Fariss, R., Maminishkis, A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+localization%2C+and+function+of+junctional+adhesion+molecule-C+%28JAM-C%29+in+human+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Expression, localization, and function of junctional adhesion molecule-C (JAM-C) in human retinal pigment epithelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (3), 1454-1463 (2008).</li>
<li>Li, R., Maminishkis, A., Banzon, T., Wan, Q., Jalickee, S., Chen, S., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN%7Bgamma%7D+Regulates+Retinal+Pigment+Epithelial+Fluid+Transport%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">IFN{gamma} Regulates Retinal Pigment Epithelial Fluid Transport.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 297, C1452-C1465 (2009).</li>
<li>Li, R., Maminishkis, A., Wang, F. E., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGF-C+and+-D+induced+proliferation%2Fmigration+of+human+RPE+is+abolished+by+inflammatory+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">PDGF-C and -D induced proliferation/migration of human RPE is abolished by inflammatory cytokines.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 5722-5732 (2007).</li>
<li>Maminishkis, A., Jalickee, S., Blaug, S. A., Rymer, J., Yerxa, B. R., Peterson, W. M., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P2Y%282%29+receptor+agonist+INS37217+stimulates+RPE+fluid+transport+in+vitro+and+retinal+reattachment+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">The P2Y(2) receptor agonist INS37217 stimulates RPE fluid transport in vitro and retinal reattachment in rat.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 43, 3555-3566 (2002).</li>
<li>Wang, F. E., Zhang, C., Maminishkis, A., Dong, L., Zhi, C., Li, R., Zhao, J., Majerciak, V., Gaur, A. B., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-204%2F211+alters+epithelial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology.</a> FASEB J. 24, (2010).</li>
<li>Adijanto, J., Banzon, T., Jalickee, S., Wang, N. S., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CO2-induced+ion+and+fluid+transport+in+human+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">CO2-induced ion and fluid transport in human retinal pigment epithelium.</a> J Gen Physiol. 133, 603-622 (2009).</li>
<li>Li, R., Maminishkis, A., Zahn, G., Vossmeyer, D., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+alpha5beta1+mediates+attachment%2C+migration%2C+and+proliferation+in+human+retinal+pigment+epithelium%3A+relevance+for+proliferative+retinal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Integrin alpha5beta1 mediates attachment, migration, and proliferation in human retinal pigment epithelium: relevance for proliferative retinal disease.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 5988-5996 (2009).</li>
<li>Peterson, W. M., Meggyesy, C., Yu, K., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+ATP+activates+calcium+signaling%2C+ion%2C+and+fluid+transport+in+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extracellular ATP activates calcium signaling, ion, and fluid transport in retinal pigment epithelium.</a> J Neurosci. 17, 2324-2337 (1997).</li>
<li>Voloboueva, L. A., Liu, J., Suh, J. H., Ames, B. N., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R%29-alpha-lipoic+acid+protects+retinal+pigment+epithelial+cells+from+oxidative+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">R)-alpha-lipoic acid protects retinal pigment epithelial cells from oxidative damage.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 4302-4310 (2005).</li>
</ol>

Mevcut deneylerde, göz başına elde edilen hücrelerin daha yüksek bir numaraları ile tutarlı hfRPE primer kültürlerinde üretmek için gerekli çoklu adımları kolaylaştırmak için tasarlanmış, daha önce yayınlanan teknikler 3 ek değişiklikler açıklanmaktadır. Orijinal prosedür her değişiklik, titizlikle değişiklikler eserleri tanıtmak etmedi ve sürekli olarak bu hücreleri kullanarak birçok diğer laboratuvarlar tarafından test edilen sağlamak için birden fazla fizyoloji ve moleküler biyoloji deneyleri test edildi. Son olarak, ek deneyler, hayvan modellerinde in vitro sonuçlar benzer tedirginlikler karşılaştırmak için yapılmıştır .

Diseksiyonu protokol için gerekli Aletleri <ol><li> Stereo Mikroskop - diseksiyon için gerekli çalışma büyütme x250 ile herhangi bir </li><li> Diseksiyon çanak - örneğin Kimble 100 x 20mm # 23062 (diseksiyon başına bir) herhangi bir kaynaktan </li><li> Sylgard 184 - TEFE Kedi. # SYLG184 * * Çanak Sylgard 184 karıştırma talimatları takip diseksiyon hazırlamak için, 5-8mm tabaka oluşturur karışık sıvı elastomer Petri kabı içine dökün. Elastomer en az 24 saat için tedavi etmek için izin ver. Tedavi elastomer Bulaşık% 70 etanol ve tekrar birden çok kez (~ 100 kat) ile sterilize edilebilir </li><li> 27 G iğne BD PrecissionGlide 1 ¼ uzunluğu (diseksiyon başına 5) herhangi bir kaynaktan </li><li> Ca ve Mg tuzları içeren HBSS 1X Çözüm - Gibco Kedi # 14025 500ml (çok diseksiyonlarının iyi). </li><li> Iris makas karbür tırtıklı bıçağı, kavisli - FST Kedi # 14.559-11 (bir). </li><li> Retina makas - Katena Kedi # K4-5300 (bir). </li><li> Forseps - örneğin Dumont Cımbız # 5 TEFE Cat cilalı ipuçları # 500.085 (2 adet). </li><li> Bıçak SidePort - Alcon, k seçik 1mm, Çift Konik, açılı Kedi # 8065921540. </li><li> Tüp 15ml Santrifüj (bir göz için) herhangi bir kaynaktan </li><li> Pasteur, cam pipet (diseksiyon başına bir) herhangi bir kaynaktan </li><li> Plaka iyi 12 (diseksiyon başına bir) herhangi bir kaynaktan </li><li> Primaria 25cm 2 balon - (göz için 2-3) herhangi bir kaynaktan </li></ol>

retina pigment epitel fizyoloji ve patofizyoloji Çalışma deneysel modeller

 Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

Biz yerli insan RPE morfolojik, fizyolojik ve genetik özellikleri ile birincil insan fetal retina pigment epitel (hfRPE) kültürler konfluent mono tabakaları büyük miktarlarda üretebilir bir hücre kültürü prosedürü geliştirdik. Bu hfRPE hücre kültürleri ağır pigmentasyon sergi ve elektron mikroskobu geniş apikal membran mikrovilluslar göstermektedir. Junctional kompleksleri çeşitli sıkı kavşak proteinlerin immünofloresan etiketlenmesi ile tespit edildi. Bu kolayca tekrarlanabilir birincil kültürlerin Epitel polarite ve fonksiyon yakından Daha önce insan dahil olmak üzere yerli RPE memeli modelleri, çalışılan benzerler. Bu sonuçlar, birçok hayvan modellerinde insan göz hastalığı tedavi edici girişimlerin geliştirilmesi ile uzatıldı. Biz, retina veya subretinal alan anormal sıvı birikimi kaldırılması için stratejiler üzerinde duruldu. Ekstrasellüler subretinal alan fotoreseptör dış segmentleri ve RPE apikal membran ayırır ve retina ekleri bakım ve RPE / retinanın etkileşimi bir bütün ana için kritik öneme sahiptir.

Biz insan fetal retina pigment epitel hücreleri (hfRPE) hücrelerin kültür konfluent mono tabakaları, morfoloji, fizyoloji, polarite, ve yetişkin doğal doku protein ve gen ekspresyonu sergilediği için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Bu çalışma, çeşitli göz hastalıkları bir hayvan modeli uzatıldı.

Retina Pigment Epitel Fizyoloji ve Patofizyoloji Çalışma Deneysel Modeller

Primer insan fetal retinal pigment epiteliyle konfluent monokatmanların büyük miktarlarda üretilebileceği bir hücre kültürü prosedürü geliştirmiş bulunmaktayız...

Bu prosedürün genel amacı, model olarak kullanılabilecek insan fetal retinal pigment epiteli veya RPE kültürleri oluşturmaktır. İnsan göz hastalıkları araştırmalarında, dokular donörlerden bütün göz küreleri şeklinde alınır. Prosedürün ilk adımı, fazla kas ve bağ dokusunu temizlemek ve ardından kornea ile lensi çıkararak gözü açmaktır.Göz, dispaz ile işlenip düzleştirilir ve ardından RPE tek tabakası koroidden soyularak ayrılır. Disseke edilen RPE hücreleri flasklara ekilir ve konfluent tek tabakalar oluşturup pigment geliştirene kadar birkaç hafta boyunca büyütülür. Hücre kültürleri, in vitro fonksiyonel deneylerde kullanılır.Başarılı in vitro deneyler, RPE yanıtlarının daha karmaşık sinyalizasyon ortamlarında daha iyi değerlendirilebildiği preklinik deneme hayvan modellerinde tekrarlanır. Burada gösterilen model, RPE fizyolojisinin daha iyi anlaşılmasını sağlayacak ve oküler hastalıkların tedavisine yönelik yeni terapötik müdahalelere yol açacaktır. Merhaba, benim adım Sheldon Miller.Laboratuvarım, Bethesda Maryland kampüsündeki Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin bir parçası olan Ulusal Göz Enstitüsü'nde yer almaktadır. Merhaba, ben Miller Laboratuvarı'ndan Arki. Bugün size insan fetal retinal pigment epitelyal hücrelerinin primer kültürlerinin hazırlanması prosedürünü göstereceğiz.Bu hücreler, modifiye edilmiş tekli odacıklara yerleştirilebilen konfluen tek tabakalar halinde hazırlanacaktır. Ayrıca, bu izole insan RPE hücrelerini biyokimya ve genetik çalışmalarında da kullanacağız. Laboratuvarımızda bu prosedürü, fizyolojik ve patofizyolojik süreçlerin işlevini ve düzenlenmesini incelemek ve hastalıkların klinik hayvan modellerini geliştirmek amacıyla epitel hücrelerinin primer kültürlerini oluşturmak için kullanmaktayız.Gözün arka kısmında yer alan, nöral retina ile koroid kan akımını birbirinden ayıran retinal pigment epiteline veya RPE'ye odaklanıyoruz. Gözün bu şematik diyagramı, RPE tabakasının gözün arka kısmında, fotoreseptörlerin hemen bitişiğinde olan konumunu göstermektedir. Ek görsel, retinadaki hücreleri, sağda fotoreseptörler ve solda ganglion hücreleri olacak şekilde göstermektedir.Bu epitelyum metabolik olarak son derece aktiftir. Fotoreseptörleri günlük olarak sürekli fagosite eder; görsel pigment vitamin A'yı depolar, yeniden sentezler ve fotoreseptörlere taşır. Görme döngüsünde, çevredeki hücre dışı boşlukların kimyasal bileşimini ve hacmini korumak için homeostatik bir rol oynar.Epitel hücrelerin kritik bir özelliği polariteleridir. Proteinlerin apikal ve bazal lateral membranlara sürekli asimetrik iletimi, epitelin metabolitlerin, iyonların ve sıvıların bir hücre dışı alandan diğerine vektörel taşınımını gerçekleştirmesini sağlayan düzenlenmiş bir süreçtir. Bu aktivite, epitelin nöral retinanın sağlığını ve bütünlüğünü korumasına yardımcı olur.Burada tarif ettiğimiz in vitro hazırlık, diseksiyona başlamadan önce epitelyal polariteyi ve fonksiyonu belirleyen transport proteinlerinin, reseptörlerin ve sinyal yolaklarının analiz edilmesine olanak tanır. Oda sıcaklığındaki çözeltileri kullanarak laminer akışlı kabinde 12 kuyucuklu bir plaka hazırlayın. Her göz için 10 x antibiyotik antimikotik çözeltisi içeren bir kuyucuk, bir X PBS içeren iki kuyucuk ve serumlu %5 RPE ortamında mililitre başına iki ünite disk alanı ile seyreltilmiş bir kuyucuk gereklidir. Silikon pedli bir diseksiyon kabını bir X-H-B-S-S ile doldurun, sıvıyı boşaltın ve her bir gözü antibiyotik antimikotik çözeltisi içeren bir kuyucuğa aktarın.Oda sıcaklığında üç ila beş dakika inkübe edin. Göz küresine aşırı basınç uygulamaktan kaçının. Fazla antibiyotiği uzaklaştırmak için gözü, XPBS içeren iki ardışık kuyucukta durulayın.Ardından, bir diseksiyon stereo mikroskobu altında, örneği bir X-H-B-S-S ile doldurulmuş diseksiyon kabına aktarmak için pens kullanın. Göz çevresindeki fazla kas ve bağ dokusunu temizlemek için iris makası kullanın. Gözü, kornea yukarı bakacak şekilde hizalayın.Sklera'ya zarar vermeden, gözü bağ dokusundan silikon ped üzerine sabitlemek için iki adet steril 27 gauge iğne kullanın. Bu konumlandırmada, sklera boyunca bir insizyon yapmak için yan port bıçağı kullanın. Kesik, göz ekvatorundan ön yüzeye olan mesafenin üçte biri kadar olmalıdır.Retinal pigment epitelyumunun (kısaca RPE) vitreus retina çekintisi nedeniyle zarar görmesini önlemek için iris makası kullanarak kesim işlemine göz çevresinde dairesel olarak devam edin. Ön göz flebini göz çukurundan ayırmak için aynı makasla vitreus cismi boyunca kesin.IOA'nın anterior kısmını kaldırın ve atın. Açık gözü dys kuyucuğuna aktarmak için pens kullanın. Gözün içinde hava kabarcığı kalmadığından emin olun.Kap.%5 karbondioksit içeren 37 °C sıcaklıkta 40 ila 60 dakika inkübe edin. Gözü, taze oda sıcaklığındaki 1X HBSS ile doldurulmuş olan diseksiyon kabına geri aktarın. Gözü, çukur kısmı yukarı bakacak şekilde konumlandırın ve 2 adet 27 gauge iğne ile sabitleyin.Diseksiyon mikroskobu altında, kısmen ayrılmış retinayı retinal makasıyla nazikçe kaldırmak için ince pensler kullanın. Retinayı optik sinirden kesin. Retinayı iris makasıyla uzaklaştırın.Gözün çevresinden optik sinire doğru bir insizyon yapın. Gözü 5 adet 27 gauge iğne ile sabitleyerek açın. RPE tabakasını germek için, optik sinirin etrafında retinal makas kullanarak dairesel bir kesi yapın.250x veya daha yüksek büyütmeye geçerek RPE tabakasını ayırın. İris makasıyla yapılan kesi boyunca ve optik sinire yakın bölgede RPE tabakasının kenarını bulun. RPE ve Bruch membranını koroid doku tabakasından ayırmak için iki çift pens kullanın.RPE ile koroid arasındaki bağlantının en zayıf olduğu noktayı bulmak için kesim kenarı boyunca birkaç farklı bölgeyi deneyin. Membranı tamamen çıkarmak için nazikçe geriye doğru soyun. RPE tabakalarını, oda sıcaklığındaki Trypsin-EDTA ile doldurulmuş 15 mililitrelik konik tüpe yerleştirin.Tüm tabakalar toplandığında tüpün kapağını kapatın ve tüpleri 37 °C'deki bir su banyosunda 10 dakika boyunca inkübe edin. RPE'yi küçük kümelere ayırmak için tüpü kuvvetlice çalkalayın. Koyu renkli hücre kümelerinin kalmaması, ayrışmanın tamamlandığı anlamına gelir.Tüpü beş dakika daha su banyosuna geri yerleştirin. Sindirilmemiş doku kalıntılarını uzaklaştırmak için bir pastör, pipet ve hafif vakum kullanın. Hücreleri bir santrifüjde 280 5G hızında dört dakika boyunca çöktürün.Süpernatantı uzaklaştırın. Resüspansiyon için hacmi %15 RPE medyum ile dokuz mililitreye tamamlayın. Hücre süspansiyonundan üç mililitreyi 25 santimetrekarelik bir flaska pipetleyin.İki mililitre taze oda sıcaklığında, %15 RPE kültür ortamı ekleyin. Hücreleri 37 °C ve %5 karbondioksit altında gece boyunca bekletin. Kültürler olgunlaştıkça, üç ila dört hafta sonra pigmentasyonları artacaktır.Başarılı kültürler konfluan ve tekdüze şekilde yoğun pigmentli olacaktır. Sizlere insan fetal RP primer kültürlerinin nasıl hazırlanacağını göstermiş olduk. Hepsi bu kadar.İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

experimental-models-for-study-retinal-pigment-epithelial-physiology

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Burada retina pigment epiteli (RPE) hücreleri insan pluripotent kök hücre hasta kaynaklı mutasyonlar taşıyan ayırt etmek için bir iletişim kuralı mevcut. Mutant hücre hatları immunoblotting, ayirt ve yama kelepçe gibi fonksiyonel analizleri için kullanılabilir. Bu hastalık içinde yemek yaklaşım yerel insan RPE hücrelerinin alma zorluğu kaçınmanızı sağlar.

Farklılaşma, bakım ve insan Retina Pigment epitel hücre Analizi: BEST1 mutasyonlar için bir tabak içinde hastalık modeli

Burada, ilk olarak Marmorstein, Peachey ve meslektaşları tarafından 2000'li yılların başında tanımlanan DC-ERGs olarak bilinen bir tekniği kullanarak farelerde retina pigment epitelinin (RPE) ışık uyarılmış elektriksel tepkilerini kaydetmek için bir yöntem saklı tutuyoruz.

Mouse Retinal Pigment Epitelinin Işık Uyarılmış Elektriksel Tepkilerini Kaydetmek için Doğrudan Birleştirilmiş Elektroretinogram (DC-ERG)

İlk olarak 20161'deFernandez-Godino ve arkadaşları tarafından bildirilen bu protokol, Transwell plakalarında bir hafta içinde işlevsel ve polarize bir RPE monolayer oluşturan fare RPE hücrelerini verimli bir şekilde izole etmek ve kültüre etmek için bir yöntem tanımlamaktadır. İşlem yaklaşık 3 saat sürer.

Birincil Fare Retina Pigment Epitel Hücrelerinin Verimli Diseksiyonu ve Kültürü

Bu protokol, yetişkin bir fareden elde edilen retinal eksplantların izolasyonu, diseksiyonu, kültürlenmesi ve boyanması için adımları sunar ve açıklar. Bu yöntem, diyabetik retinopati gibi farklı retinal nörovasküler hastalıkları incelemek için ex vivo bir model olarak faydalıdır.

Retinal Nörovasküler Hastalıkları İncelemek için Ex Vivo Modeli Olarak Yetişkin Fare Retinasının Retinal Eksplantı

İnsan gözünde retinal pigment epitelini (RPE) retinadan etkin bir şekilde ayırmak ve RPE'nin histolojik ve morfometrik analizleri için tüm RPE / koroid düzlüklerini üretmek için bir yöntem tanımladık.

Histolojik Analiz için İnsan Gözünden Retinal Pigment Epitel/Koroid Flatmount'larının Verimli ve Tutarlı Üretimi

Retinal pigment epitel (RPE) hücrelerinin hücrelerini genç pigmentli kobayların gözlerinden izole etmek için basit ve etkili bir yöntem sunuyoruz. Bu prosedür, gen ekspresyon analizleri de dahil olmak üzere izole RPE üzerinde moleküler biyoloji çalışmalarının izlenmesine izin verir.

Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin Guinea Pig Gözlerinden İzolasyonu

Fare modelleri, retinal pigmentli epitelin (RPE) biyolojisini araştırmak için yararlı araçlar olabilir. Farelerin bir dizi RPE patolojisi geliştirebileceği tespit edilmiştir. Burada, ışık, iletim elektronu ve konfokal mikroskopi kullanarak farelerde RPE patolojilerini aydınlatmak ve ölçmek için bir fenotipleme protokolü tarif ediyoruz.

Yaşa Bağlı Makula Dejenerasyonunun Fare Modellerinde Retinal Pigmentli Epitel Patolojilerini Değerlendirme ve Ölçme Protokolü

Gözün retina pigment epitel tabakasını etkileyen dejeneratif göz hastalıkları monogenik ve poligenik kökenlidir. Çeşitli hastalık modelleri ve bir yazılım uygulaması olan LipidUNet, hastalık mekanizmalarını ve potansiyel terapötik müdahaleleri incelemek için geliştirilmiştir.

LipidUNet-Machine Learning Tabanlı iPSC Kaynaklı Retinal Pigment Epiteli Kullanılarak Lipid Birikintilerinin Karakterizasyonu ve Nicelleştirilmesi Yöntemi

Bu protokol, lokal kaynaklı domuz gözlerinden primer retinal pigment epitel (RPE) hücrelerinin elde edilmesi ve kültürlenmesi prosedürünü özetlemektedir. Bu hücreler, kök hücrelere yüksek kaliteli bir alternatif olarak hizmet eder ve in vitro retinal araştırmalar için uygundur.

İn Vitro Modelleme için Primer Domuz Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

Retina pigment epiteli (RPE), koroid ve retina arasında çok önemli bir bariyer görevi görür ve fotoreseptörler gibi retina hücre tiplerinin sağlığını ve işlevini destekler. Burada, yetişkin murin RPE'yi izole etmek ve kültürlemek için basit ve etkili bir protokol açıklıyoruz.

Yetişkin Farelerden Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü için Basitleştirilmiş Bir Yöntem

Keşfedin insan fetal retinal pigment epitel hücrelerini yetiştirme yöntemini ve bu modelin göz hastalıkları araştırmalarında nasıl kullanıldığını. Bu teknik, RPE fizyolojisini anlamak ve yeni tedaviler geliştirmek için sağlam bir temel sunar.

Retina Pigment Epitel Fizyoloji ve Patofizyoloji Çalışma Deneysel Modeller

Daha fazla video keşfet