Retina Pigment Epitel Fizyoloji ve Patofizyoloji Çalışma Deneysel Modeller

Bu prosedürün genel amacı, model olarak kullanılabilecek insan fetal retinal pigmenti, epitel veya RPE kültürleri oluşturmaktır. İnsan gözü hastalığının araştırılmasında dokular donörlerden sağlam Göz küreleri olarak alınır. İşlemin ilk adımı, fazla kas ve bağ dokusunu kesmek ve ardından kornea ve lensi çıkararak gözü açmaktır.

Göz dispa ile tedavi edilir ve düzleştirilir ve daha sonra RPE tek tabakası koroidden soyulur. Disseke. RPE, şişelere ekilir ve birleşen tek tabakalara ulaşana ve pigment geliştirene kadar birkaç hafta boyunca büyütülür. Hücre kültürleri in vitro fonksiyonel deneylerde kullanılır.

Başarılı in vitro deneyler, RPE yanıtlarının daha karmaşık sinyalizasyon ortamında daha iyi değerlendirilebildiği klinik öncesi deneme hayvan modellerinde tekrarlanır. Burada gösterilen model, RPE fizyolojisinin daha iyi anlaşılmasına ve oküler hastalıkların tedavisinde yeni terapötik müdahalelere yol açacaktır. Merhaba, benim adım Sheldon Miller.

Laboratuvarım, Bethesda Maryland kampüsündeki Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin bir parçası olan Ulusal Göz Enstitüsü'nde bulunuyor. Merhaba, ben Miller Lab'den Arki. Bugün size insan fetal retinal pigment epitel hücrelerinin birincil kültürlerini hazırlamak için bir prosedür göstereceğiz.

Bu hücreler, modifiye edilmiş şarkı odalarına monte edilebilen birleşik tek tabakalar olarak hazırlanacaktır. Bu izole insan RPE hücrelerini biyokimya ve genetik alanındaki çalışmalar için de kullanacağız. Laboratuvarımızda, fizyolojik ve patofizyolojik süreçlerin işlevini ve düzenlenmesini incelemek ve hastalıkların klinik hayvan modellerini geliştirmek için epitel hücrelerinin birincil kültürlerini oluşturmak için bu prosedürü kullanıyoruz.

Gözün arkasında yer alan, nöral retina ve koroidal kan akışını ayıran retina pigment epiteli veya RPE'ye odaklanıyoruz. Gözün bu şematik diyagramı, gözün arkasında, fotoreseptörlerin hemen bitişiğindeki RPE tabakasının konumunu gösterir. Ek, sağda fotoreseptörler ve solda ganglion hücreleri ile retina hücrelerini gösterir.

Bu epitel metabolik olarak son derece aktiftir. Fotoreseptörleri günlük olarak sürekli olarak fagositoz eder ve reis depolar, mizes eder ve görsel pigment A vitaminini fotoreseptörlere taşır. Görsel döngüde, çevredeki hücre dışı boşlukların kimyasal bileşimini ve hacmini korumak için homeostatik olarak hareket eder.

Epitelin kritik bir özelliği polariteleridir. Proteinlerin apikal ve bazal lateral membranlara devam eden asimetrik iletimi, epitelin metabolitlerin, iyonların ve sıvının bir hücre dışı boşluktan diğerine vektörel trafiğini gerçekleştirmesine izin veren düzenlenmiş bir süreçtir. Bu aktivite, epitelin nöral retinanın sağlığını ve bütünlüğünü korumasına yardımcı olur.

Burada tarif ettiğimiz in vitro preparat, diseksiyona başlamadan önce epitel polaritesini ve fonksiyonunu belirleyen taşıma proteinlerinin, reseptörlerin ve sinyal yollarının analizine izin verir. Oda sıcaklığında çözeltiler içeren bir laminer akış başlığında 12 oyuklu bir plaka hazırlayın. Her göz, 10 x antibiyotik antimikotik solüsyondan oluşan bir kuyucuk, bir XPBS'den iki kuyu ve serumla seyreltilmiş% 5 RPE ortamında seyreltilmiş mililitre disk boşluğu başına iki birimlik bir kuyu gerektirir Silikon yastıklı bir diseksiyon kabını bir X-H-B-S-S ile doldurun, sıvıyı boşaltın ve her bir gözü bir antibiyotik antimikotik solüsyon kuyusuna aktarın.

Oda sıcaklığında üç ila beş dakika inkübe edin. Göz küresine aşırı baskı uygulamaktan kaçının. Fazla antibiyotiği çıkarmak için gözü bir XPBS'nin iki ardışık kuyusunda durulayın.

Daha sonra, bir diseksiyon stereo mikroskobu altında bir X-H-B-S-S ile doldurulmuş diseksiyon kabına aktarmak için forseps kullanın. Göz çevresindeki fazla kas ve bağ dokusunu çıkarmak için iris makası kullanın. Gözü, kornea yukarı bakacak şekilde hizalayın.

Silikon pedin sklerasına zarar vermeden gözü bağ dokusu ile sabitlemek için iki steril 27 gauge iğne kullanın. Bu yönde, sklera boyunca bir kesi yapmak için bir yan port bıçağı kullanın. Kesim, göz ekvatorundan ön yüzeye olan mesafenin üçte biri kadar olmalıdır.

Retina pigmentine zarar vermemek için kesime göz çevresinde dairesel olarak devam etmek için iris makası kullanın. Epitel, vitreus Retina çekimi ile kısaltılmış RPE. Ön göz kanadını göz kabından ayırmak için vitreus gövdesini kesmek için aynı makası kullanın.

IOA'nın ön kısmını kaldırın ve atın. Açık gözü dys kuyusuna aktarmak için forseps kullanın. Gözde hava kabarcığı olmadığından emin olun. Fincan.

% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede 40 ila 60 dakika inkübe edin. Gözü dis boşluğundan tekrar taze oda Sıcaklığı bir X-H-B-S-S ile doldurulmuş olan diseksiyon kabına aktarın. Gözü fincan yukarı bakacak şekilde konumlandırın ve 2 adet 27 gauge iğne ile sabitleyin.

Diseksiyon mikroskobu altında, kısmen ayrılmış retinayı retina makasıyla nazikçe kaldırmak için ince forseps kullanın. Retinayı optik sinirden uzakta kesin. Retinayı iris makasıyla atın.

Gözün çevresinden optik sinire doğru bir kesi yapın. Gözü 5 adet 27 gauge iğne ile sabitleyin. RPE tabakasını germek için, optik sinirin etrafında dairesel bir kesim yapmak için retina makası kullanın.

RPE katmanını ayırma, 250 x veya daha fazla büyütmeye geçme. İris makası tarafından yapılan kesi boyunca ve optik sinire yakın olan RPE tabakasının kenarını bulun. RPE ve brus membranını koroidal doku tabakasından ayırmak için iki çift forseps kullanın.

RPE ve koroid arasındaki bağlantının en zayıf olduğu yeri bulmak için kesme kenarı boyunca birkaç alanı deneyin. Tamamen çıkarmak için zarı nazikçe soyun. RPE levhalarını EDTA'da oda sıcaklığında yolculuklarla doldurulmuş 15 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin.

Tüm tabakalar toplandığında, tüpü kapatın, tüpleri 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca bir su banyosunda inkübe edin. RPE'yi küçük kümelere ayırmak için tüpü kuvvetlice çalkalayın. Koyu hücre kümelerinin olmaması, ayrılmanın tamamlandığı anlamına gelir.

Tüpü beş dakika daha su banyosuna geri koyun. Sindirilmemiş doku kalıntılarını gidermek için bir macun, pipet ve hafif emme kullanın. Hücreleri dört dakika boyunca 280 5G'de bir santrifüjde döndürün.

Süpernatanı çıkarın. Yeniden askıya almak için %15 RPE orta pipet ile son hacmi dokuz mililitreye getirin. Hücreler, hücre süspansiyonunun üç mililitresini 25 santimetre karelik bir şişeye pipetler.

İki mililitre taze oda sıcaklığında,% 15 RPE orta kültür ekleyin. Hücreler gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte. Kültürler olgunlaştıkça, pigmentasyonları üç ila dört hafta sonra artacaktır.

Başarılı kültürler birleşik ve homojen, yoğun pigmentli olacaktır. Size az önce insan fetal RP primer kültürlerinin nasıl hazırlanacağını gösterdik. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.