İnsan Derisi Keratinosit İzolasyonu: Deri Örneklerinden Primer Keratinositlerin Kültürlenmesinde Bir Yöntem

- Keratinositler, epidermiste veya cildin en dış tabakasında bulunan en belirgin hücrelerdir. Melanositler, dendritik hücreler ve merkel hücreleri gibi diğer çeşitli hücre tipleriyle ilişkili olarak dermis üzerinde birden fazla katman halinde düzenlenirler.

Keratinositleri izole etmek için, epidermal dokuyu insan derisinden alarak başlayın. Daha sonra, enzimatik bir sindirim tamponu ile muamele edin. Tampondaki enzimler, epidermal dokuda bulunan hücre dışı matriks proteinlerini bozar ve böylece hücre ayrışmasını başlatır. Şimdi uygun bir ortam ekleyin ve dokuyu mekanik olarak bozun.

Ayrışmış hücreleri süspansiyona bırakmak için, hücre kümelerini veya kalıntılarını gidermek için epidermal hücre süspansiyonunu bir süzgeçten süzün. Epidermal hücreleri peletlemek ve bunları enzim içeren süpernatandan ayırmak için santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve tercih edilen bir keratinosit büyüme ortamı kullanarak hücreleri yeniden süspanse edin. Hücreleri istenen süre boyunca kültürleyin.

Kültür sırasında, optimize edilmiş ortam, diğer epidermal hücre tiplerine göre seçici büyümelerini teşvik ederek keratinositlerin genişlemesini zenginleştirir. Aşağıdaki protokolde, keratinositlerin yetişkin insan cilt dokusundan izolasyonunu göstereceğiz.

- Estetik cerrahi geçiren sağlıklı yetişkin gönüllülerden 10 santimetreye 15 santimetre cilt örnekleri toplayın. Cilt örneklerini bir soğutma elemanı içeren bir Strafor kutu içinde taşıyarak cildi serin tutun. Gerekirse, cilt örneğini gece boyunca 4 santigrat derecede saklayın. Sterilize edilmiş makas, neşter ve forseps kullanarak cilt bölümünün altındaki yağları alın.

Ardından, iğneler kullanarak, cilt bölümünü bir plakanın üzerindeki steril bir örtü üzerine bağlayın. Kuru, sterilize edilmiş bir gazlı bezle cildi temizleyin. Ardından, sterilize edilmiş bir gazlı bez üzerinde %70 etanol ile devam edin. Daha sonra, bir ayak planyası kullanarak, cilt bölümünün üst epidermal tabakasını kesin ve 9 santimetrelik bir petri kabına aktarın.

Ardından, önceden hazırlanmış DPBS / tripsin / glikoz çözeltisinden hemen 25 mililitre petri kabına ekleyin. Numuneleri 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Bir pipet kullanarak, DPBS/tripsin/glikoz çözeltisini petri kabından çıkarın ve tripsini etkisiz hale getirmek için 10 mililitre RPMI-1640 artı %2 FBS ekleyin.

Şimdi, iki forseps ile, cilt bölümlerinin hem epidermal hem de dermal bölmesini nazikçe kazıyarak ve çalkalayarak epidermal hücreleri ortama bırakın. Epidermal hücre süspansiyonunu metal bir filtreden süzün ve süzüntüyü 50 mililitrelik bir tüpe toplayın. Kalan cilt bölümlerini FBS olmadan 10 mililitre RPMI-1640 içeren 50 mililitrelik bir tüpe ekleyin ve 10 saniye boyunca girdap yapın.

Bu süspansiyonu metal filtreden epidermal hücre süspansiyonunu içeren 50 mililitrelik bir tüpe süzün. Ardından, DPBS'yi toplam 50 mililitre hacme ekleyin. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 450 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı çıkarın ve hücre peletinin boyutuna bağlı olarak, epidermal hücre peletini yaklaşık 10 mililitre 37 santigrat derece KSFM'de yeniden süspanse edin.

Tripan Mavisi boyama yöntemini kullanarak, hücreleri mikroskop altında sayın. Daha sonra, her 75 santimetre karelik kültür şişesine, 12 mililitre 37 santigrat derece KSFM ile birlikte altıncı hücrelere 8 kez 10 aktarın. Hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için kültür şişelerini hafifçe sallayın. Keratinositleri% 100 nem ve% 5 CO₂ ile 37 santigrat derece inkübatörde inkübe edin. Ortamı iki gün sonra ve ardından haftada 3 kez değiştirin.