Name: Teratom Oluşumu İnsan Embriyonik Kök Hücre Kader Haritalama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-01T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Keşfedin, insan embriyonik kök hücrelerinin böbrek kapsülü altında teratoma oluşturarak in vivo farklılaşmasını ve doku özgül kaderlerini izleme yöntemini. Bu protokol, immünohistokimya ile üç germ tabakasına ayrışmayı analiz eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, California Rejeneratif Tıp Enstitüsü (RC1-00104), Kamu Sağlık Hizmetleri NHLBI Grant (HL085377) ve Pollin&#39;in Vakfı HSB bir hediye Kapsamlı Araştırma Fonu tarafından desteklenen

Aşağıda yazılı protokol, bazı değişikliklerle birlikte, yazarlar tarafından bildirilen yayınlanmış parametreler üzerine dayanır. Protokol UCSF Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanımı (IACUC) ve Kök Hücre Araştırma Gözetim (SCRO) Komiteleri tarafından onayı ile yapılır. Insan embriyonik kök hücreleri (hESC) I. Kültür <ol><li> Standart 6 (3.5 cm çapında kuyular) plakaları hESC büyütün. </li><li> Plakalar üzerine besleyici hücrelerin% 1 jelatin (6,7) ile kaplı, en az 12 saat önce hücreleri, tohum fare embriyonik fibroblast (MEF), CF1 gün 1000 Ci az ışınlanmış e12.5 zaman-evlendirilen fareler, elde Pasajlanması. MEFS% 50-60 izdiham, ya da 4 kaplama olmalıdır de 3,5 cm çapına göre x 10 5 hücreleri (Şekil 1). </li><li> Passage koloniler ~% 70 izdiham (Şekil 2) ulaşmıştır hücreleri. </li><li> Geçişi için hücreler aspirat KSR büyüme kuyulardan orta (6) ve 0.5 ml orta 1 mg / ml konsantrasyonda KSR kollajenaz IV içeren ile değiştirin. </li><li> 37 kollajenaz IV plakaları inkübe ° C /% 5, 5 dakika veya koloniler kenarlarına kadar CO 2 plakadan kaldırmaya başlar . </li><li> Plakadan kollajenaz IV çıkarın, her bir kuyu için 0.5 ml KSR ekleyin ve elle plaka tamamen kaldırmak için hücreleri kazıyın. </li><li> 15 ml konik bir tüp içinde, her iyi, yerden hücre süspansiyonu toplayın ve hücreleri 5 dakika boyunca ağırlık yerleşmek için izin. </li><li> ~ 300μl toplam hacmi hücreler ve orta bırakarak, tüpten süpernatantı. </li><li> Tam hacmi 200 ul mikro-pipet seti kullanarak, hafifçe koloniler break up hücre süspansiyonu 5-6 kez pipetle. </li><li> Toplam hacim başına 9 ml KSR orta (yani, bir de hasat ise, tüp 9 ml içermelidir) kullanarak hücrelerin orijinal iyi bir hücre süspansiyonu getirin. 12.5 ng / ml 'lik bir konsantrasyon rekombinant insan temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ile orta tamamlayın. </li><li> Dulbecco'nun fosfat ile MEF hücrelerinin (bkz. adım 2) içeren yeni kuyular yıkandıktan sonra, bütün serum kaldırmak 3 ml hücre süspansiyonu, her bir kuyunun ekleyin ve 37 ° C / 5% CO 2 plakalar inkübe için (DPBS) tuzlu tamponlu . </li><li> BFGF 24 saat geçtikten sonra ve her 24-48 saat hücreleri yeniden geçişli olarak hazır olana kadar KSR orta değiştirin. </li></ol> II. HESC pelet aşılama için hazırlanması <ol><li> Aşılama öncesi 24 saat 10μM nihai konsantrasyonu, hücre canlılığı artırmak için (8) KSR orta ROCK inhibitörü. ~% 70 izdiham (5 x 10 5 hücreleri) hücreler, böbrek kapsül başına eklenen iki pelet iki pelet yaratacaktır. </li><li> Aşılama (9) hücre pelletleri hazırlamak için 5 dakika kollajenaz IV ROCK inhibitörü ile tedavi edilen kültürler, 37 ° C /% 5 CO 2 inkübe. </li><li> Iyi kollajenaz IV aspire edin ve% 10 penisilin / streptomisin (pen / strep) 1 ml DPBS ile değiştirin. </li><li> El plaka koloniler kazımak ile ek bir kalem / strep 1 ml DPBS iyi durulama ve 1,5 ml mikrofuge'de tüp hücre süspansiyonu her bir 1ml kısım transfer. </li><li> 8.000 x g kısaca mikrofuge'de tüpler Spin süpernatantı aspirat ve pelet pen / strep 500μl DPBS tekrar süspansiyon. </li><li> Hücrelerin nakli için bir araya bağlamak yardımcı olmak için, her tüp DPBS içinde 100μl 1 mg / ml Phaseolus vulgaris lektin (PHA) ekleyin. </li><li> Hücre / PHA süspansiyon oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin, sonra 8.000 x g az 2 dakika boyunca dönerler. Rotor kuyu içinde borular 180 ° döndürün ve 8.000 x g 2 dakika için tekrar döndürün. </li><li> Süpernatant pelet zedelemeden dikkatlice aspire. </li><li> Yavaş yavaş yukarı kalkana kadar yavaşça pelet kenarına sonraki 200μl KSR pipetleme tüplerinden hücre pelletleri yerinden oynatın. </li><li> Bir kez yerinden hemen 3 ml KSR içeren 3.5 cm çapında kuyular yerleştirilir 0.4μm MILLICELL ekler pelet transferi, ve 37 ° C /% 5 CO 2 gece konaklama 2 saat inkübe edin. </li></ol> III. Greft renal kapsül <ol><li> Uygun aseptik teknik kullanılarak kurumsal kurallarına uygun olarak tüm hayvan işlemleri gerçekleştirin. </li><li> Inhale isoflurane/0.5%% 3 O2 ve intraperitoneal tribromoethanol (25 mg / taze hazırlanmış kg Avertin) bir kombinasyonu kullanılarak, 8-12 hafta arası SCID bej fareler (CB17.Cg Prkdc SCID LYST bg / CRL), narkoz . Farenin başına iki hücre pelletleri açıklanan teknikler kullanarak (10) engrafted olacaktır. </li><li> Hipotermi önlemek için bir ısıtma yastığı üzerinde fare yerleştirildikten sonra, kesi bölgesi tıraş sonra klorheksidin ile dezenfekte edin. Sadece merkezden cilt ama omurga paralel yoluyla 2,5 cm'lik kesi olun. </li><li> Steril Salin ile kesi bölgesi nemli tutmake, sadece omurga, kaburga ve yaklaşık 1 cm altında, kas üzerinden küçük bir kesi yapmak. Kesi ile böbrek çekmeye yetecek büyüklükte, ancak kuvvet olmadan böbrek karın boşluğuna geri kayma olmaz bu kadar küçük olmalıdır. </li><li> Künt, hafif kavisli bir kanca şeklini içine çekti bir bardak Pasteur pipeti kullanarak kas kesiden böbrek yavaşça çekin. </li><li> Kapsül kurumasını önlemek için steril DPBS böbrek ıslatın. Bu kapsül, çok kırılgan olduğu gibi, işlem boyunca tekrarlamak gerekli olabilir. </li><li> Dumont # 5 forseps kullanarak hafifçe böbrek kapsülü yukarı çekin ve Vannas yaylı makas kullanılarak 2 mm kesi yapmak. </li><li> Çok ince, körelmiş bir prob içine çekilmiş olan başka bir cam pipet ile, kapsül ve böbrek arasında küçük bir cep olun. </li><li> MILLICELL eklemek, tek bir transferi pipet yerleştirilen büyük orifis pipet kullanarak, tek bir hücre pelletini. Fazla medya pelet transferi ile müdahale gibi, mümkün olduğunca birlikte biraz ekstra medya olarak emin olun. </li><li> Cebine oluşturmak için kesi kenarını tutarken, nazikçe açılması yanında pelet yeri ve tek kutuplu doğru çekti pipet ile böbrek cebine doğru itin. </li><li> Ikinci bir pelet işlemi tekrarlayın. Bu aynı böbrek kapsülü altında yerleştirin, fakat zıt kutup doğru. </li><li> Pelet üzerine geri aşağı kapsül dikkatlice yerleştirin. Pelet cebi içinde kalmalıdır ve hiçbir sütür kapsül kapatmak için gereklidir. </li><li> Böbrek karın boşluğuna yavaşça geri itin ve ekli ters kesme iğne ile 4-0 ipekle (veya daha küçük) kullanarak kas duvarı kapatın. Kesi, sadece tek bir sütür gerekli olduğu kadar küçük olmalıdır. </li><li> Aynı sütür materyali kullanarak, bir dizi 4-5 kesintiye dikiş cilt kapatın. </li><li> Fare kendi kafesine yerleştirmeden önce, sırasıyla 0.05 mg / kg buprenorfin (11,12) ve 5 mg / kg Ketoprofen (12,13), kısa vadeli ve uzun vadeli analjezikler olarak yönetmek. Kontrollü maddeler sadece kurumsal kurallarına uygun olarak kullanılmalıdır. </li><li> Hayvan kendi kafesine geri aktarın ve bir ısıtma yastığı anestezi kurtarmak için izin verir. Bu yaklaşık 20-30 dakika sürer. </li><li> Fare tam ayaktan sonra, hayvan barınağı tesisi iade edilebilir. </li></ol> IV. Teratom hasat, fiksasyon ve kesit <ol><li> 8-12 hafta ameliyat sonrası, böbrek yakınlarındaki bir zorlukla palpabl teratom olması gerekir. Büyük, içi sıvı dolu kistler genellikle 6-8 hafta başlayan, hem de gelişecektir. Hayvana sıkıntı neden oluyorsa bu bir erken hasat gerekebilir. Teratomlar kistler daha yavaş büyüdüğünden, ancak analiz için yeterli büyüklükte (yani, en az 8 hafta) teratom elde etmek için mümkün olduğunca uzun süre beklemek isteyeceksiniz. </li><li> Böbrek, teratom ve çevresindeki kistleri, böbrek ilk erişilen aynı cerrahi yaklaşım ile karın boşluğuna doku bir blok olarak herhangi bir çıkarın (bkz. Bölüm III, yukarıdaki adımları 1-4). </li><li> Eksize edilen doku tüm blok% 10 formalin solüsyonu içeren bir tüp içine yerleştirin. </li><li> Teratom 4 gece düzeltmek için izin ver ° C </li><li> Ertesi gün, tüp teratom çıkarın. (Şekil 3) teratom kendisi zarar vermeden, mümkün olduğu kadar herhangi bir kist ve çok böbrek olarak parçalara ayır. Büyük teratomlar diseksiyon ve gömme kolaylaştırmak için yarım kesilebilir. </li><li> Standart bir parafin fiksasyon tekniği kullanılarak teratom işleyin. Otomatik üniteler (örneğin, Shandon Hypercenter) mevcuttur: <table border="0"><tbody><tr><td> I. </td><td> % 80 Flex alkol </td><td> 2 saat </td></tr><tr><td> II. </td><td> % 80 Flex alkol </td><td> 1 saat </td></tr><tr><td> III. </td><td> % 85 Flex alkol </td><td> 1.5 saat </td></tr><tr><td> IV. </td><td> % 95 Flex alkol </td><td> 1 saat </td></tr><tr><td> V. </td><td> % 100 Flex alkol </td><td> 1 saat </td></tr><tr><td> VI. </td><td> % 100 Flex alkol </td><td> 1 saat </td></tr><tr><td> VII. </td><td> % 100 Flex alkol </td><td> 1 saat </td></tr><tr><td> VIII. </td><td> Clear-Rite 3 </td><td> 1 saat </td></tr><tr><td> IX. </td><td> Clear-Rite 3 </td><td> 1 saat </td></tr><tr><td> X </td><td> Clear-Rite 3 </td><td> 1 saat </td></tr><tr><td> XI. </td><td> Parafin (TissuePrep) </td><td> 2 saat </td></tr><tr><td> XII. </td><td> Parafin (TissuePrep) </td><td> 2 saat </td></tr></tbody></table></li></ol> V. İmmünohistokimya ve analiz <ol><li> Bir zamanlar üzerine parafin, slaytlar bölümünde döner mikrotom kullanarak 5μm seri dilimleri teratom ve float bölümleri gömülü. </li><li> Boyama önce slaytlar, en az bir saat pişirin. </li><li> Her üç embriyonik germ (Şekil 4) temsilcisi doku yapıları belirlemek için standart yöntemler kullanılarak hematoksilen ve eozin ile slaytlar Leke: <table border="0"><tbody><tr><td> I. </td><td> Ksilen yıkama </td><td> 3-5 dakika </td></tr><tr><td> II. </td><td> Ksilen </td><td> 3-5 dakika </td></tr><tr><td> III. </td><td> % 100 alkol </td><td> 3-5 dakika </td></tr><tr><td> IV. </td><td> % 100 alkol </td><td> 3-5 dakika </td></tr><tr><td> V. </td><td> % 95 alkol </td><td> 3-5 dakika </td></tr><tr><td> VI. </td><td> % 80 alkol </td><td> 3-5 dakika </td></tr><tr><td> VII. </td><td> Suyla yıkayın (çeşitli değişiklikler) </td><td> 2 dakika </td></tr><tr><td> VIII. </td><td> Gül'ün Hematoksilen # 3 </td><td> 2-5 dakika </td></tr><tr><td> IX. </td><td> Suyla yıkayın (çeşitli değişiklikler) </td><td> suyu temiz çalışır kadar </td></tr><tr><td> X </td><td> Scott'ın su (mavi çekirdekleri) </td><td> 3 dakika veya daha fazla </td></tr><tr><td> XI. </td><td> Suyla yıkayın (çeşitli değişiklikler) </td><td> 1-2 dakika </td></tr><tr><td> XII. </td><td> Eosin Y </td><td> 1 dakika </td></tr><tr><td> XIII. </td><td> Suyla yıkayın (çeşitli değişiklikler) </td><td> 30 saniye </td></tr><tr><td> XIV. </td><td> % 80 alkol </td><td> 1 dakika </td></tr><tr><td> XV. </td><td> % 95 alkol </td><td> 2 dakika </td></tr><tr><td> XVI. </td><td> % 95 alkol </td><td> 2 dakika </td></tr><tr><td> XVII. </td><td> % 100 alkol </td><td> 3 dakika </td></tr><tr><td> XVIII. </td><td> % 100 alkol (temiz) </td><td> 3 dakika </td></tr><tr><td> XIX. </td><td> Ksilen </td><td> 2 dakika veya daha fazla </td></tr><tr><td> XX. </td><td> Ksilen </td><td> 2 dakika veya daha fazla </td></tr></tbody></table></li><li> Permount her slayt bir lamel monte edin. </li></ol> VI. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Kültür farklılaşmamış hESC için besleyici bir katman olarak ışınlanmış CF1 fare embriyonik fibroblastlar Kaplama. MEFS ~% 50 birleştiği noktada yer kaplama, burada gösterildiği gibi, ya da başına 4 x 6 kuyu kültür çanak iyi 3.5 cm çapında 10 5 hücre. Bar, 100 mm. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. MEF besleyici tabaka farklılaşmamış hESC akışkan kültür örneği. HESC sonra geçişli olarak tanımlanan, burada görüldüğü gibi, ~% 70 konfluent kadar MEF besleyici katmanlar üzerinde yetiştirilmektedir. Bar, 100 mm. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Eksplante teratomlar Örnek eksplantasyonu ardından, teratom, böbrek ve herhangi bir aksesuar doku formalin bir blok olarak sabit, sonra böbrek ve aksesuar doku dikkatlice parafin içine gömmeden önce kesilmiş bulunmaktadır . <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. Farklılaşmamış hESC türetilen Teratomlar her üç germ in vivo doku temsilcisi içerir. Teratom, Şekil 3'te gibi embriyonik dokular tespit kesitli ve hematoksilen ve eozin ile boyandı. hESC üç embriyonik germ (ektoderm (A, B), mezoderm (C), endoderm türetilen dokulara doğuran (D). (A) Doğan nöral tüp yapısı. (B) İlkel skuamöz epitel. (C) Kıkırdak yoğunlaştırılmış mezenşimin kapsül ile çevrilidir. (D) Salgı bağırsak yapısı. Bar, 100 mm. Görüntüler yazarın izniyle yeniden basıldı. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5. Teratom analiz etiketli, farklılaşmamış hESC kaderi eşlemek için kullanılır. Daha önce yayınlanmış gibi (9), ile özel etiketli etiketsiz hESC hESC bir karışım teratom oluşum denemesi etiketli hücrelerinin kaderi harita için kullanılabilir. Burada gösterildiği gibi, yüzey işaretleyici, CD133, ve gelişmiş yeşil flüoresan protein (eGFP) etiketli ifade farklılaşmamış hESC etiketsiz, farklılaşmamış hESC ile karıştırıldı. Bu aşılama renal kapsül tarafından teratomlar oluşturmak için kullanılır. Anti-eGFP antikoru ile immünohistokimyasal analizi, hematoksilen ve eozin lekeli teratom bölümleri CD133 + hESC nöroektodermal kaderi gösteriyor. Teratomlar Şekil 4 gibi işlenmiş ve dokular içinde CD133 + GFP + hücreler türevleri lokalize anti-eGFP antikor (kahverengi) ile zıt. CD133 + elde edilen hücreler (ok) embriyonik ektoderm, özellikle sinir epiteli (solda) ve doğmakta olan nöral tüp benzeri yapılar (sağda) kaynaklanan dokularda gözlendi . Bar, 100 mm. Görüntüler yazarın izniyle yeniden basıldı. Jelâtin <ul><li> % 0,1 'Domuz jelatin </li><li> % 99.9 DPBS <ul><li> 37 ° C (0.22μm) bir saat veya tüm jelatin solüsyonu içine girene kadar, ve sterilize kullanmadan önce inkübe DPBS, jelatin ekleyin. </li></ul></li></ul> MEF orta <ul><li> % 10 fetal sığır serumu (Nitelikli) </li><li> % 90 Dulbecco'nun (D-MEM) Esansiyel Orta Modifiye bulunuyor </li><li> 1x L-Glutamine </li><li> 1x Pen / Strep <ul><li> Kullanımdan önce sterilize Filtre. </li></ul></li></ul> KSR (Knockout Serum Değiştirme) orta <ul><li> % 20 nakavt Serum Değiştirme </li><li> % 80 nakavt D-MEM </li><li> 1x L-Glutamine </li><li> 1x gerekli olmayan Amino Asitler </li><li> 0.1 mM β-mercaptoethanol / </li><li> 12.5 ng / ml bFGF <ul><li> Sterilize Filtresi. </li><li> 37 ° C, ama sıcak ° C hücrelere eklemeden önce 4 saklayın. </li><li> BFGF kullanımdan hemen önce ekleyin. </li></ul></li></ul> Kollajenaz IV. <ul><li> 1 mg / ml KSR ortamda tüm toz çözüm girene kadar 1-2 saat ya da 37 ° C yerleştirerek eritin. </li><li> Sterilize Filtresi. </li></ul> Avertin <ul><li> 0,25 g 2,2,2-tribromoethanol </li><li> 0.25 ml 2-metil-2-bütanol <ul><li> 37 ° ° C'de% 100 çözüm oluşturmak için bir gecede. </li><li> Ameliyat öncesi birkaç saat, 37 DPBS ve inkübe kullanarak sulandırmak için% 2,5 'çalışma çözüm ° C en az 1 saat. </li><li> Kısım sterilize ve Filtre. </li><li> Tribromoethanol yüksek ışığa duyarlı hazırlanması ve kullanımının her aşamasında, bu yüzden ışıktan korur. </li><li> Kullanmadan önce 12-24 saatten fazla hazırlayın. </li></ul></li></ul> Buprenorfin <ul><li> Metanol içinde 1 mg / ml stok solüsyonu <ul><li> 0.015 mg / ml steril H 2 O. kullanarak çalışma çözeltisi ile seyreltilir </li><li> 1 aya kadar -20 ° C'de saklayın. </li></ul></li></ul> Ketoprofen <ul><li> DPBS 0.5 mg / ml çalışma çözeltisi <ul><li> DPBS 37 o gecede inkübe ° C'de 1-2 saat veya tüm toz çözüm içine girene kadar. </li><li> Sterilize Filtre ve 4 saklamak ° C </li></ul></li></ul>

<ol><li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Hoof, D. V. an, D'Amour, K. A., German, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+insulin-producing+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Derivation of insulin-producing cells from human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Res. 3, 73-87 (2009).</li>
<li>Li, Z., Han, Z., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+endothelial+cells+for+vascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Transplantation of human embryonic stem cell-derived endothelial cells for vascular diseases.</a> J Cell Biochem. 106, 194-194 (2009).</li>
<li>Safinia, N., Minger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of hepatocytes from human embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 481, 169-180 (2009).</li>
<li>Nury, D., Neri, T., Puceat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+and+cardiac+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells and cardiac cell fate.</a> J Cell Physiol. 218, 455-459 (2009).</li>
<li>Cowan, C. A., Klimanskaya, I., McMahon, J., Atienza, J., Witmyer, J., Zucker, J. P., Wang, S., Morton, C. C., McMahon, A. P., Powers, D., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+embryonic+stem-cell+lines+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts.</a> N Engl J Med. 350, 1353-1356 (2004).</li>
<li>Schatten, G., Smith, J., Navara, C., Park, J. H., Pedersen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Culture of human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 2, 455-463 (2005).</li>
<li>Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li>
<li>King, F. W., Ritner, C., Liszewski, W., Kwan, H. C., Pedersen, A., Leavitt, A. D., Bernstein, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subpopulations+of+human+embryonic+stem+cells+with+distinct+tissue-specific+fates+can+be+selected+from+pluripotent+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Subpopulations of human embryonic stem cells with distinct tissue-specific fates can be selected from pluripotent cultures.</a> Stem Cells Dev. 18, 1441-1450 (2009).</li>
<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelio-mesenchymal+interactions+in+primordial+gland+structures+which+become+responsive+to+androgenic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Epithelio-mesenchymal interactions in primordial gland structures which become responsive to androgenic stimulation.</a> Anat Rec. 172, 179-195 (1972).</li>
<li>Kirsch, J. H., Klaus, J. A., Blizzard, K. K., Hurn, P. D., Murphy, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pain+evaluation+and+response+to+buprenorphine+in+rats+subjected+to+sham+middle+cerebral+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Contemp+Top+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Pain evaluation and response to buprenorphine in rats subjected to sham middle cerebral artery occlusion.</a> Contemp Top Lab Anim Sci. 41, 9-14 (2002).</li>
<li>Lee-Parritz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analgesia+for+rodent+experimental+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Isr+J+Vet+Med%22%5BJournal%5D)">Analgesia for rodent experimental surgery.</a> Isr J Vet Med. 62, 74-78 (2007).</li>
<li>Julou, L., Guyonnet, J. C., Ducrot, R., Pasquet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+pharmacological+and+toxicological+studies+on+ketoprofen%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatol+Rehabil%22%5BJournal%5D)">Some pharmacological and toxicological studies on ketoprofen.</a> Rheumatol Rehabil. , Suppl 5-10. (1976).</li>
</ol>

Biz, in vivo ortamda bir hESC ayırt kaderi haritalama amaç için son derece verimli teratom oluşum denemesi adapte var. HESC az sayıda özel olarak seçilmiş, farklılaşmamış vahşi tip hESC ve bir hücre granüle Phaseolus vulgaris lektin ile karıştırılır. Bu immünyetmezligi bir fare böbrek kapsül altında aşılı. Başlangıçta seçilen hESC kaderi immünohistokimya tarafından belirlenir (Şekil 5), daha önce de bildirilmiştir (9). Bu yöntem, doku, hücre tabanlı tedavi için özel reaktifler belirlenmesi ve üretmek için değerli bir araç sağlar.

<table><tbody><tr><td>2-Metil-2-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240486</td><td>Avertin</td></tr><tr><td>2,2,2-Tribrom&amp;#8211;etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td>Avertin</td></tr><tr><td>4-0 ipek sütürler</td><td>Ethicon Inc.</td><td>641G</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233FB</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7536</td><td></td></tr><tr><td>Clear-Rite 3</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-046-341</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenaz IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Dupont #5 pens</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500233</td><td>Böbrek kapsülü</td></tr><tr><td>Eozin Y</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-245-658</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (Kalifiye)</td><td>Invitrogen</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Flex alkol</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-046344</td><td></td></tr><tr><td>Gill&amp;rsquo;s Hematoksilin #3</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-050-204</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat, düz</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501241</td><td>Genel cerrahi</td></tr><tr><td>İris pensi</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>15914</td><td>Genel cerrahi</td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K2012</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut D-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replasmanı</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25020-081</td><td></td></tr><tr><td>MILLICELL insertler</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>Esansiyel Olmayan Amino Asitler</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Operasyon makası</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501754</td><td>Genel cerrahi</td></tr><tr><td>Parafin (TissuePrep)</td><td>Fisher Scientific</td><td>8002-74-02</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>PHA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1668</td><td></td></tr><tr><td>Porcin jelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6144</td><td></td></tr><tr><td>ROCK inhibitörü</td><td>Calbiochem</td><td>Y-27632</td><td></td></tr><tr><td>SCID beige fareler</td><td>Charles River Laboratories</td><td>250</td><td></td></tr><tr><td>Scott&amp;rsquo;s Wash</td><td>Fisher Scientific</td><td>6697-32</td><td>Ricca Chemicals</td></tr><tr><td>Vannas yaylı makas</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>14003</td><td>Böbrek kapsülü</td></tr><tr><td>&amp;#946;-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr></tbody></table>

teratom oluşumu İnsan embriyonik kök hücre kader haritalama

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation 

İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC) için sınırsız bir kendini yenileme kapasitesi ve her üç embriyonik germ (1) türetilen hücrelerin içine ayırt etme yeteneği var. Spesifik hücre tiplerine hESC Yönetmen farklılaşma, rejeneratif tıp alanında (örneğin, (2-5)) çok fazla ilgi ve belirlenmesi için yöntemler vardır<em&gt; In vivo</em&gt; Seçilen ya da manipüle hESC kaderi bu çaba için gerekli. Biz, bu amaç için son derece verimli bir teratom oluşum denemesi adapte var. HESC az sayıda özel olarak seçilmiş, farklılaşmamış vahşi tip hESC ve bir hücre granüle Phaseolus vulgaris lektin ile karıştırılır. Bu immünyetmezligi bir fare böbrek kapsül altında aşılı. 2.5 x 10 gibi az bir<sup&gt; 5</sup&gt; HESC 16 cm oluşturmak için gerekli<sup&gt; 3</sup8-12 hafta içinde teratom. Başlangıçta seçilen hESC kaderi sonra immünohistokimyasal olarak tespit edilebilir. Bu yöntem, doku, hücre tabanlı tedavi için özel reaktifler tanımlamak için değerli bir araç sağlar.

Belirli hücrelerin içine hESC Yönetmen farklılaşma, rejeneratif tıp alanında büyük ilgi yarattı. Biz belirlemek için bir özlü, adım-adım protokolü<em&gt; In vivo</em&gt;, Doku, hücre tabanlı tedavi için özel reaktifler karakterize için çok değerli bir araç sağlar seçilen hESC kaderi.

Teratom Oluşumu İnsan Embriyonik Kök Hücre Kader Haritalama

İnsan embriyonik kök hücreleri (hESK'ler), sınırsız bir kendi kendini yenileme kapasitesine ve her üç ...'dan türeyen hücrelere farklılaşma yeteneğine sahiptir.

Bu prosedürün genel amacı, insan embriyonik kök hücrelerini in vivo olarak farklılaştırmak ve dokuya özgü kaderlerini belirlemektir. Bu işlem, öncelikle ilgilenilen genetik olarak işaretlenmiş hücrelerden bir pelet oluşturularak gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, peletin cerrahi olarak immün yetmezlikli bir farenin böbrek kapsülünün altına yerleştirilmesidir.Prosedürün üçüncü adımı, hücre peletinin fare böbreği kapsülünün altında sekiz ila 12 hafta boyunca farklılaşmasına izin vermektir. Prosedürün son adımı, oluşan teratomu toplamak, formalinde sabitlemek ve işaretli hücrelerin akıbetini immünohistokimya ile analiz etmektir. Nihayetinde, oluşan teratomların histolojisi ve immünohistokimyası aracılığıyla, işaretli hücrelerin üç germ tabakasından birine veya daha fazlasına dönüştüğünü gösteren sonuçlar elde edilebilir.Merhaba, ben San Francisco'daki California Üniversitesi Kardiyovasküler Araştırma Enstitüsü'nde Dr. Harold Bernstein'ın laboratuvarından Carissa Ritner. Bugün size böbrek kapsülü nakli yoluyla teratom geliştirme prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, çalıştığımız her bir hattın üç germ tabakasının her birine gelişebildiğinden emin olmak ve genetik olarak işaretlenmiş kök hücrelerin in vivo kaderini takip etmek amacıyla, embriyonik kök hücrelerin farklılaşmasını incelemek için kullanıyoruz.Size göstereceğimiz tüm prosedürler, UCSF Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin onayıyla gerçekleştirilmiştir. Ayrıca, insan embriyonik kök hücreleriyle yapılan tüm çalışmalar, UCSF Kök Hücre Araştırma Denetim Komitesi'nin onayıyla yürütülmektedir. Öyleyse başlayalım.İnsan embriyonik kök hücre kültürlerini hazırlamak için lütfen bu protokolün metin kısmına bakınız. Laminar akışlı kabin içerisindeki işlemler için, rock inhibitörü ile işlem görmüş insan embriyonik kök hücre kültürlerini 1 mg/mL kollagenase four ile muamele edin, 37 °C ve %5 CO2'de beş dakika inkübe edin ve kollagenase four'ü kuyucuktan aspire edin. Bunu, %10 penisilin streptomisin ile desteklenmiş 1 mL oda sıcaklığındaki DPBS ile değiştirin.Kolonileri plakadan sıyırmak için düz uçlu bir hücre kaldırıcı kullanın ve hücre süspansiyonundan 0,5 mililitreyi iki mikro santrifüj tüpünün her birine aktarın. Kuyucuğu bir mililitre DPBS ile durulayın ve durulama sıvısından 0,5 mililitreyi her bir tüpe aktarın. Tüpleri 8.000 ×g hızında 20 saniye boyunca döndürün, süpernatantı aspire edin ve her bir peleti 500 µL taze DPBS ve 100 µL 1 mg/mL konsantrasyonundaki çözeltide yeniden süspande edin.Hücrelerin transplantasyon için birbirine bağlanmasına yardımcı olmak amacıyla her tüpe DPBS içinde Fasi vulgaris lektini ekleyin. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. Pelleti düzeltmek için hücreleri 8,000 ×g kuvvetinde iki dakika boyunca santrifüjleyin.Tüpleri rotor yuvaları içerisinde 180 derece döndürün. Ardından 8,000 ×g hızında iki dakika boyunca tekrar santrifüjleyin.Pelletlerin tüpten ayrılmasını sağlamak için, pelletlere dokunmadan SUP nasin'i dikkatlice aspire edin. Pellet yavaşça kalkana kadar, pelletin kenarına nazikçe 200 µL KSR medyumu pipetleyin. Pellet ayrıldıktan sonra, medyumu derhal 0,4 µm'lik bir milli cell içine çekin.KSR.Medium içeren bir kuyuya üç mililitre ekleyin. 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında iki saatten gece boyunca sürecek şekilde inkübe edin. Hipotermiyi önlemek için anestezi uygulanmış immunodeficient bir fareyi ısıtıcı pedin üzerine yerleştirin.Omurgaya paralel ancak merkez hattının hemen dışından, cilt üzerinden 2,5 santimetre uzunluğunda bir insizyon yapmak için ameliyat makası ve iris pensi kullanın. Kaburgaların hemen altında ve omurgadan yaklaşık bir santimetre uzaklıkta, kas üzerinden daha küçük bir insizyon yapın.Kesi, böbreği dışarı çekebilecek kadar geniş, ancak böbreğin zorlanmadan karın boşluğuna geri kaçmayacağı kadar küçük olmalıdır. Küt bir kanca şeklinde çekilmiş bir pasta pipeti kullanarak, böbreği kas kesisinden nazikçe dışarı çekin. Hassas kapsülün kurumasını önlemek için böbreği periyodik olarak ince pens yardımıyla steril DPBS ile nemlendirin.Kapsülü böbrekten nazikçe ayırın. Kapsülde iki milimetrelik bir insizyon yapmak için Venice Spring Makası kullanın. Böbreğin merkezinde, ucu çok ince ve küt bir prob haline getirilmiş pasta pipeti, kapsül ile böbrek arasına yerleştirin ve küçük bir cep oluşturmak için nazikçe oynatın; böbreğin diğer tarafında da aynısını tekrarlayarak iki cep oluşturun.Böbreğin her bir kutbuna birer adet. Tek kullanımlık bir transfer pipeti ve geniş ağızlı bir pipet ucu kullanarak, milli cell insert içerisinden tek bir pellet kaldırın.Fazla besiyeri pellet transferini engelleyebileceğinden mümkün olduğunca az besiyeri alın. Böbrekteki cebin kenarını kaldırmak için pens kullanın. Pelleti nazikçe açıklığın yanına yerleştirin ve onu çekilmiş pipet ucuyla cebin içine, böbreğin bir kutbuna doğru itin.İkinci bir peletle karşı kutba doğru olan cebe yerleştirin. Kapsülü peletlerin üzerine dikkatlice geri kapatın. Kapsülü kapatmak için dikiş atılmasına gerek yoktur.Böbreği nazikçe karın boşluğuna geri itmek için kancalı bir pipet kullanın. Kas insizyonu, tek bir ipek sütür ile kapatılabilecek kadar küçük olmalıdır. Deriyi dört ila beş adet ayrı dikişle kapatın ve ameliyat sonrası hayvanın iyileşmesine izin vererek, ameliyattan sekiz ila 12 hafta sonra hayvan tesisine geri gönderin.Böbrek teratomunu ve çevresindeki tüm kistleri, karın boşluğundan tek bir doku bloğu halinde çıkarın. Eksize edilen doku bloğunun tamamını, %10 tamponlu formalin içeren 50 mililitrelik bir polipropilen tüpe yerleştirin. Teratomun dört derece Celsius sıcaklıkta gece boyunca fikse olmasını sağlayın.Teratoma tüpten çıkarın ve bir mat üzerine yerleştirin. Kistleri ve teratomun kendisine zarar vermeden mümkün olduğunca fazla böbrek dokusunu uzaklaştırmak için bir skalpel kullanın. Diseksiyon ve gömme işlemlerini kolaylaştırmak için daha büyük teratomlar ikiye bölünebilir.Teratoma'yı standart parafin fiksasyon tekniği kullanarak işleyin ve analiz ve görüntüleme için lamlar üzerine yerleştirilen kesitleri boyayın. Detaylar için protokolün metin kısmındaki notlara bakın. Burada size tipik bir teratoma'dan alınan doku kesitlerini göstereceğiz.Bu teratom, her üç germ tabakasını da temsil eden embriyonik dokuları belirlemek için hematoksilin ve eozin ile boyanmıştır ve vektör dermi temsil eden yeni oluşmuş bir nöral tüp yapısı göstermektedir. Bu kesit, bu durumda primitif skuamöz epitel olan, vektör derme başka bir örnek sunmaktadır. Burada, yoğunlaşmış mezenşim kapsülü ile çevrili kıkırdak, embriyonik mezodermden türeyen dokuları temsil etmektedir.Son olarak, bez yapılı intestinal bir yapının görüldüğü bu bölüm, teratoma içindeki endodermal dokuyu göstermektedir; genetik olarak işaretlenmiş kök hücrelerin akıbetini haritalandırmak için teratomlar, vahşi tip ve CD 1 33 pozitif insan embriyonik kök hücrelerinin bir karışımı ile ekilmiştir. Oklarla belirtilen CD 1 33 pozitif türevli hücreler, embriyonik ektodermden gelişen dokularda, özellikle nöroepitel ve yeni oluşan sinir tüpü benzeri yapılarda gözlemlenmiştir. Ben Dr. Harold Bernstein.Carissa, in vivo bir gelişim analizi sağlamak amacıyla insan embriyonik kök hücre kültürlerinden teratomların nasıl oluşturulacağını size az önce gösterdi. Bu prosedürü uygularken, hücrelerinize karşı dikkatli olmanız ve aseptik tekniğe uymanız gerektiğini hatırlamanız önemlidir. Hepsi bu kadar.İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

fate-mapping-of-human-embryonic-stem-cells-by-teratoma-formation

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Zebra balığı hücre nakli, doku spesifik kimeralar üretmek için genetik ve embriyoloji kombinasyonu sağlar. Bu video gastrula laboratuarımızda önbeyin komissür oluşumu sırasında, Astroglial nüfus ve özel rehberlik ipuçları rollerini araştırmak için izin hücre transplantasyon sahnelenen göstermektedir.

Doku Hedeflenen Embriyonik Chimeras: Zebra balığı Gastrula Hücre Nakli

Genetik Đndüklenebilir Kader Haritalama (GIFM) işaretleri ve ince, mekansal ve zamansal kontrolü ile parça...

Genetik Đndüklenebilir Kader Haritalama Pratik Bir Yaklaşım: Hücreler Mark ve Track Görsel Bir Rehberi In Vivo</em

İnsan pluripotent kök hücreler (hPSCs) farklı hastalıkların sayısız tedavi potansiyeline sahiptir. Bu hücrelerin yardımcı vücutta herhangi bir hücre tipinde farklılaşabilmektedir olduğu yatmaktadır. Burada hPSCs arasında pluripotence göstermek için kullanılan deney teratomlar, açıklanmaktadır.

Testis Kapsül içinde teratom Üretimi

Tek bir embriyonik hücre kaderi, kalıtsal molekülleri ve / ya da hücrede gelen sinyalleri tarafından etkilenebilir. Klivaj dönemi Xenopus embriyosunun kaderi haritaları kullanarak, tek blastomer hücre-hücre etkileşimleri karşı kalıtsal molekül katkıları değerlendirmek için izole kültür için tespit edilebilir.

Blastomer Eksplantlarından Embriyonik gelişim sırasında Hücre Kader Taahhüt Test Etmek için

Insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) farklılaştırmak ve farklı doku kalıpları içine kendini organize içsel yeteneği var; Bu mekansal çevre geçişlerini sunulmasını gerektirir rağmen. Biz hPSC farklılaşma desenleri kontrol etmek için biyokimyasal ve mekanik geçişlerini oluşturmak için basit ve sağlam bir yöntem olarak şablon micropatterning sunuyoruz.

Farklılaşma Fates Mekansal Organizasyonu Probing İnsan pluripotent kök hücrelerin Stencil micropatterning

Bu çalışmada, viral olmayan bir transpozon sistemi kullanarak fare amniyotik sıvı hücrelerinden indüklenmiş pluripotent kök hücreler üretiyoruz.

Bir Transpozon Sistemi Kullanılarak Fare Amniyotik Sıvı Hücreleri pluripotent kök hücrelerin üretimi

Bu iletişim kuralı birincil amniyotik sıvı ve membran Mezenkimal kök hücrelerin içine İndüklenmiş pluripotent kök hücreler tamamen kimyasal olarak tanımlanan koşullarda bir sigara entegre episomal yaklaşım kullanarak yeniden programlama açıklar. Yordamlar, ayıklama, kültür, yeniden programlama ve elde edilen İndüklenmiş pluripotent kök hücreler sıkı yöntemlerle karakterizasyonu ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Birincil amniyotik sıvı ve membran hücreler Pluripotent Xeno-Alerjik koşullarında için yeniden programlama

Hücre dışı matriks ligandlar poliakrilamid hidrojeller üzerine uyumlu yüzeyler üzerinde sınırlı kolonilerde insan embriyonik kök hücrelerin kültürünü sağlamak için desenli olabilir. Bu yöntem, doku geometrisi, hücre tarafından oluşturulan kuvvetler ve kader özellikleri arasındaki etkileşimi incelemek için çekiş kuvveti mikroskobu ve biyokimyasal tahlillerle kombine edilebilir.

Doku Seviyesi Mekaniğinin Kontrol Altına Almak İçin Uyumlu Yüzeylerde İnsan Embriyonik Kök Hücre Kolonilerinin Geometrisinin Desenlemi

Bu çalışmada, teratojenik kimyasalları tanımlamak için bir in vitro hücre testi sunuyoruz. Fibroblast büyüme faktörü (FGF)/serum yanıt faktörü (SRF) sinyallemesinin dinamikleri, insan kaynaklı pluripotent kök (iPS) raportör hücrelerinde ölçüldü ve teratojenite riski, bu sinyal yolunun kimyasal bozulması ölçülerek değerlendirildi.<br...

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerde fibroblast büyüme faktörü sinyal bozulmasının gerçek zamanlı izlenmesine dayalı gelişimsel toksisite testi

İnsan Embriyonik Kök Hücre (ES) yayılması

Keşfedin, insan embriyonik kök hücrelerinin böbrek kapsülü altında teratoma oluşturarak in vivo farklılaşmasını ve doku özgül kaderlerini izleme yöntemini. Bu protokol, immünohistokimya ile üç germ tabakasına ayrışmayı analiz eder.

Teratom Oluşumu İnsan Embriyonik Kök Hücre Kader Haritalama

Daha fazla video keşfet