Name: Rastgele bir DNA Kütüphane Kullanımı Primer-Aptamer Seçimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Öğrenin, rastgele DNA kütüphanesi kullanarak S100B proteinine özgü aptamerleri primer-aptamer seçimi ile belirlemeyi. Bu yöntem, sabit primer dizilerinin neden olduğu yanlış pozitif ve negatif sonuçları ortadan kaldırarak SELEX protokollerinin verimliliğini artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Craig Paul Mikroarray Core Tesisleri&#39;nde yaptığı yardım için teşekkür ederim. Bu çalışma NIH / NCI hibe # CA118591 IMAT Programı tarafından desteklenen oldu. SLD de mali destek için Pennsylvania Uzay Grant Konsorsiyumu Bursu kabul eder. Bu yayın da Pennsylvania Eyalet Üniversitesi Malzeme Araştırma Enstitüsü Nano Fabrikasyon Ağ ve Ulusal Bilim Vakfı İşbirliği Anlaşması No: 0335765, Cornell Üniversitesi Ulusal Nanoteknoloji Altyapı Ağı, tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Kulbachinskiy, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+selection+of+aptamers+to+protein+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+%28Moscow%29%22%5BJournal%5D)">Methods for selection of aptamers to protein targets.</a> Biochemistry (Moscow). 72, 1505-1518 (2006).</li>
<li>Mairal, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers%3A+molecular+tools+for+analytical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Aptamers: molecular tools for analytical applications.</a> Anal Bioanal Chem. 390, 989-1007 (2008).</li>
<li>Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SELEX+--+A+%28r%29evolutionary+method+to+generate+high-affinity+nucleic+acid+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolec+Engineering%22%5BJournal%5D)">SELEX -- A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands.</a> Biomolec Engineering. 24, 381-403 (2007).</li>
<li>Que-Gewirth, N. S., Sullenger, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+progress+and+prospects%3A+RNA+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene therapy progress and prospects: RNA aptamers.</a> Gene Ther. 14, 283-2891 (2007).</li>
<li>Cowperthwaite, M. C., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatic+analysis+of+the+contribution+of+primer+sequences+to+aptamer+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Evol%22%5BJournal%5D)">Bioinformatic analysis of the contribution of primer sequences to aptamer structures.</a> J Mol Evol. 67, 95-102 (2008).</li>
<li>Shtatland, T., Gill, S. C., Javornik, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+Escherichia+coli+RNA+with+bacteriophage+MS2+coat+protein%3A+genomic+SELEX%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Interactions of Escherichia coli RNA with bacteriophage MS2 coat protein: genomic SELEX.</a> Nucleic Acids Res. 28, E93-E93 (2000).</li>
<li>Jarosch, F., Buchner, K., Klussmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+using+a+dual+RNA+library+that+allows+primerless+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro selection using a dual RNA library that allows primerless selection.</a> Nucleic Acids Res. 34, E86-E86 (2006).</li>
<li>Vater, A., Jarosch, F., Buchner, K., Klussmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+bioactive+Spiegelmers+to+migraine-associated+calcitonin+gene-related+peptide+rapidly+identified+by+a+novel+approach%3A+tailored-SELEX%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Short bioactive Spiegelmers to migraine-associated calcitonin gene-related peptide rapidly identified by a novel approach: tailored-SELEX.</a> Nucleic Acids Res. 31, E130-E130 (2003).</li>
<li>Wen, J. D., Gray, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+genomic+sequences+that+bind+tightly+to+Ff+gene+5+protein%3A+primer-free+genomic+SELEX%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selection of genomic sequences that bind tightly to Ff gene 5 protein: primer-free genomic SELEX.</a> Nucleic Acids Res. 32, E182-E182 (2004).</li>
<li>Musheev, M. U., Krylov, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+aptamers+by+systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+addressing+the+polymerase+chain+reaction+issue%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Selection of aptamers by systematic evolution of ligands by exponential enrichment: addressing the polymerase chain reaction issue.</a> Anal Chim Acta. 564, 91-916 (2006).</li>
<li>Pan, W. H., Clawson, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-free+aptamer+selection+using+a+random+DNA+library%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Primer-free aptamer selection using a random DNA library.</a> Methods Mol Biol. , Forthcoming (2009).</li>
<li>Pan, W., Xin, P., Clawson, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal-Primer+and+Primer-Free+SELEX+Protocols+for+Selection+of+Aptamers+from+Random+DNA+Libraries%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Minimal-Primer and Primer-Free SELEX Protocols for Selection of Aptamers from Random DNA Libraries.</a> BioTechniques. 44, 351-360 (2008).</li>
<li>Nicewarner-Pena, S., Freeman, G., Reiss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submicrometer+metallic+barcodes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Submicrometer metallic barcodes.</a> Science. 294, 137-141 (2001).</li>
<li>JC, H. ulteen, CR, M. artin <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+template-based+method+for+the+preparation+of+nanomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Materials+Chem%22%5BJournal%5D)">A general template-based method for the preparation of nanomaterials.</a> J Materials Chem. 7, 1075-1087 (1997).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Tris-HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HotMaster TAQ DNA Polimeraz</td><td>5 PRIME</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTP Karışımı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Akrilamid</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10X TBE Tamponu</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amonyum Persülfat</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX174 DNA/Hinf I DNA Markörü</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etidyum Bromür</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P-dCTP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fenol:ChCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;:IAA</td><td>Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Restriksiyona Enzimleri</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Üre</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fotoğrafik Film</td><td>ECE Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agaroz Boncukları</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polipropilen Kolon</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaAc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Detroit-551 hücreleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SK-MEL-31 hücreleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaz</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sülfoksit</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sp6 RNA Polimeraz</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNaz-Free DNaz I</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNaz İnhibitörü</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SensiScript Ters Transkriptaz</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCR-2.1-TOPO Vektörü</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DH5&amp;alpha; Kompetan Hücreler</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plazmit Mini Kiti</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vector NTI</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 Polinükleotid Kinaz</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;#947;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P-ATP</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rastgele bir dna kütüphane kullanımı primer-aptamer seçimi

Primer-Free Aptamer Selection Using A Random DNA Library

Aptamers antikorlar 1 karşılaştırılabilir yakınlık hedefleri bağlamak oldukça yapılandırılmış oligonükleotidler (DNA veya RNA). In vitro seçim sürecinde hedeflerin geniş bir yelpazede tanımak için, küçük moleküller proteinlerin ve diğer makromoleküllerin 2-4, üstel zenginleştirme (SELEX) Ligandlar Sistematik Evrim denilen aracılığıyla tespit edilir . Aptamers in vivo teşhis ve / veya terapötik uygulamalar için uygun özelliklere sahiptir: iyi özgüllük ve sıhri yanı sıra, kolayca sentezlenir, daha titiz işleme koşullarında hayatta, onlar kötü immünojenik ve onların göreceli olarak küçük boyutu, uyduruk penetrasyon neden olabilir dokular. Genellikle her iki tarafta ~ 40 nt uzun randomize bölgelerde artı ~ 20 nt sabit astar siteleri ile nükleik asit kütüphaneleri seçili olduğundan standart SELEX süreci ile tespit Aptamers genellikle ~ 80 nükleotidler (nt) oluşmaktadır. Biyoinformatik yaklaşımlar sabit dizileri 5 seçim sonra aptamer yapısı önemli ölçüde katkıda yoktur ki rağmen sabit astar dizileri, böylece ~ kütüphane dizilerinin neredeyse% 50 oluşur, ve bu yüzden olumlu veya olumsuz, seçim süreci 3 aptamers belirlenmesi tehlikeye atabilir . Bu potansiyel sorunları çözmek için, astar dizileri tamamlayıcı oligonükleotidler tarafından bloke veya SELEX 6 turda farklı dizileri yarıda geçiş, ya da 6-9 nt 7, 8 kesilmiş edilmiştir edilmiştir. Wen ve Gri 9, astar ücretsiz genomik SELEX yöntemi tasarlanmış olan astar dizileri seçiminden önce kütüphane tamamen çıkarıldı ve sonra seçilen genomik parçalarının amplifikasyonu izin rejenere olmuştur. Ancak, tekniği istihdam, benzersiz bir genomik kütüphane inşa edilmesi için, sınırlı bir çeşitlilik sahiptir ve seçim turundan sonra, yenilenme, doğrusal bir reamplification adım dayanır. Alternatif olarak, yüksek verim bölümleme kullanarak sabit primer dizilerinden kaynaklanan sorunları aşmak için çabalar PCR 10 ile ilgili sorunları ile karşılanmaktadır . Biz SELEX prosedürler önemli ölçüde kolaylaştıran ve etkili bir astar-parazit sorunları 11, 12 ortadan kaldırır bir astar-free (PF) seçim yöntemi geliştirdik. Protokolleri basit bir şekilde çalışır. Kütüphane merkezi rastgele bölgede gereksiz yan dizileri olmadan saflaştırılmış ve uygun bir hedef (örneğin bir saflaştırılmış protein veya hücre hatları gibi karmaşık bir karışım) bağlıdır. Sonra bağlı dizileri, elde edilen yan dizileri ile bir araya ve seçilen alt-kütüphaneleri oluşturmak için tekrar amplifiye. Bir örnek olarak, burada S100B, melanoma için protein işaretleyici aptamers seçilmiş. Seçim bir kaç tur sonra 10 -8 M aralığı, ve biz aptamers sandviç bağlayıcı bir formatta verimli çalışmasını gösteriyor - Cilt testleri 10 -7 Kd gösterdi.

SELEX protokolleri da rasgele kütüphane bölgeleri kuşatan sabit primer dizilerinden gerektiren bağlı ligandlar, yenilenme gerektiren her hangi seçimin birden fazla mermi, oluşmaktadır. Bu sabit astar dizileri seçim süreci (yanlış pozitif ve negatif) ile karışabilir. Burada bir astar ücretsiz protokol sunuyoruz.

Rastgele bir DNA Kütüphane Kullanımı Primer-Aptamer Seçimi

Aptamerler, antikorlarla kıyaslanabilir afinitelerle hedeflere bağlanabilen, yüksek derecede yapılandırılmış oligonükleotidlerdir (DNA veya RNA) 1. Bunlar ...

Bu prosedürün genel amacı, bu durumda S 100 B proteini olan bir hedef proteine spesifik olarak bağlanan aberleri rastgele bir kütüphaneden tanımlamaktır. Bu işlem, öncelikle rastgele dizileri çevreleyen sabit primer dizilerinden ayırmak için kütüphanenin restriksiyon endonükleaz ile sindirilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, rastgele kütüphane dizilerini saflaştırılmış S 100 B proteinine bağlamak ve bunları geri kazanmaktır.Prosedürün üçüncü adımı, bağlanmış sekansların hibridizasyon ve ligasyon yoluyla sabitlenmiş primer sekanslarla yeniden birleştirilmesidir. Prosedürün son adımı, bağlanmış aday aber havuzunun R-T-P-C-R ile yeniden amplifikasyonuna izin vermek için ligasyon ürünlerinin transkribe edilmesidir; bunu, bu seçilim prosedürünün ek turları izler. Nihayetinde, seçilen aberlerin S 100 B proteinine spesifik olarak bağlandığını gösteren sonuçlar elde edilebilir.Örneğin burada, mikro diziler kullanılarak sandviç bağlama analizleri gerçekleştirilmekte ve aynı zamanda fonksiyonelleştirilmiş nanoteller ile 15 nanometer altın nanoparçacıklara bağlanmış ikinci antikorlar kullanılarak floresan işaretli ikinci antikor analizleri yapılmaktadır. Bugün, rastgele bir D sekans kütüphanesinden S hundred B proteinine bağlanan optimal seçimler için bir prosedür göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, kanserin erken teşhisi için bir sensör platformu geliştirmek de dahil olmak üzere çeşitli amaçlarla kullanmaktayız.Hadi başlayalım. Bu prosedüre başlamak için, daha önce açıklandığı şekilde primer içermeyen (primer free) veya PF DNA kütüphanesi oluşturun. Çift sarmallı DNA kütüphanesinin kesilmesini takiben %10 denatüre poliakrilamid jel ile jel saflaştırması yapılması, 30 cc'de beş prime fosfatlı 32 nükleotidlik bir fragman ve 30'da beş prime fosfatlı 30 nükleotidlik bir fragmanla sonuçlanacaktır; bunlar sırasıyla 32 artı ve 30 artı fragman olarak adlandırılır.32 artı fragmanı, 3' ucunda CC minimal yan dizisine sahip 30 nükleotidlik rastgele alanı içerirken, 30 artı fragmanı yalnızca 30 nükleotidlik rastgele alan dizisinden oluşur. PF kütüphanesi DNA fragmanlarını aptamer seçimi için hazırlamak için, her bir 32 artı ve 30 artı fragmanını 40 µL 20 mM tris, HCl pH 7.4 içerisinde yeniden süspande edin. Ardından numuneleri inkübasyonu takiben 85 °C'de üç dakika boyunca ısıtın.Numuneleri 37 °C'lik bir su banyosu inkübatöründe üç dakika boyunca soğutun, ardından 760 µL seleksiyon tamponu ekleyin ve 37 °C'de üç dakika boyunca inkübe edin. Üç dakika sonra numuneyi 10 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. İnkübasyonun ardından, çözeltiyi seleksiyon tamponu ile önceden yıkanmış nikel NTA agaroz boncuklar içeren bir kolondan geçirin. Spesifik olmayan DNA'yı uzaklaştırmak için, kolona bağlanmayan PF kütüphanesi DNA fragmanlarını toplayın ve daha sonra kullanmak üzere kenara ayırın. S 100 B bağlı boncukları hazırlamak için öncelikle 400 microliters nikel NDA boncuklarını bir mikrosantrifüjde üç saniye boyunca döndürün ve süpernatanı atın. Ardından, beş kez hafifçe pipetleyerek boncukları 400 microliters bağlanma tamponu ile yıkayın.Ardından boncukları santrifüjleyip süpernatantı atın. Bu işlemi tekrarlayın. İki kez yıkayın.Ardından, daha önce saflaştırılmış histidin etiketli proteini boncukların üzerine dökün. Burada, insan S 100 kalsiyum bağlayıcı protein B kullanılmıştır. Çözeltiyi her üç dakikada bir beş kez, toplam 15 dakika boyunca pipetle nazikçe aşağı yukarı çekin.15 dakika sonra, boncukları santrifüjle çevirin ve süpernatantı atın. Son olarak, boncuğa bağlı S 100 B'yi 400 µL seçme tamponu ile üç kez nazikçe pipetleyerek yıkayın. Boncukları tekrar santrifüjle çöktürün ve süpernatantı atın.S 100 B'ye bağlı abersleri seçmek için bu adımı, toplamda üç nihai yıkama olacak şekilde iki kez daha tekrarlayın. Daha önce kenara ayrılan 32 plus ve 30 plus fragmanlarını geri alın. Fragmanları boncuğa bağlı S 100 B'ye ekleyin. Ardından örneği 15 dakika boyunca inkübe edin.15 dakika boyunca her üç dakikada bir hafifçe pipetleyerek karıştırın, boncukları kısa süreliğine santrifüjleyin, süpernatantı uzaklaştırın ve ardından S 100 BDNA kompleksini 800 µL seleksiyon tamponu ile hafifçe pipetleyerek yıkayın. Daha sonra boncukları santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın. Bu yıkama adımını iki kez tekrarlayın.S 100'ü geri kazanmak için, boncuklara 200 µL 20 mM Tris-HCl pH 7.4 ekleyin. Ardından süspansiyonu 85 °C'de üç dakika boyunca ısıtın. İnkübasyonu takiben.Boncukları bir dakika boyunca vorteksleyin ve santrifüjle çöktürün. Ardından süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın ve süpernatanları birleştirin.Son olarak, seçilen DNA fragmanlarını saflaştırın. PCR ürünlerini, eş hacimde fenil kloroform ve izopropil alkol ile iki kez ekstrakte edin. Bunları 250 millimolar sodyum klorür ve hacmin 2,5 katı %100 Ethanol ile minus 70 degrees Celsius sıcaklıkta 15 dakika boyunca çöktürün.4 °C'de 15 dakika boyunca 21.000 GS'de santrifüjleyin. Ardından süpernatantı atın. Peleti %75 etanol ile etkili bir şekilde yıkayın.4 °C'de 21,000 GS ile beş dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatantı atın. 10 tur seçimin ardından, peleti bir hız vakumunda üç dakika boyunca kurutun. Ortaya çıkan PCR amplifiye DNA fragmanlarını, Vitrogen core'dan temin edilen PCR 2.1 topo vektörüne klonlayın.Ardından, seçilen N 30 cc ve N 30 fragmanlarının her biri için 40 ile 50 arası tek koloniyi M 13 forward primer ile sekanslayın. Seçilen sekansları infomax vector NTI yazılımını kullanarak hizalayın. Daha sonra hizalamalara dayanarak konsensüs sekansları belirleyin.Konsensüs dizileri belirlendikten sonra, yazılı protokolde açıklandığı şekilde konsensüs aberleri satın alın. Beş prime Amin C altı grubuyla sentezlenen ilk aptameri, baskı tamponu içerisinde 15 micromolar son konsantrasyona gelecek şekilde süspanse edin. Ardından, aptamer çözeltisini bir apogen discoveries mikrogrid dizisi kullanarak code link aktive edilmiş lamlar üzerine damlatın.Kod bağlantısındaki önerilen protokolleri takip edin. Her slaytı 12 dizi olacak şekilde yazdırın. İki kere sekiz formatını kullanın.Hibridizasyon için mikroarray hibridizasyon kaseti. S 100 B proteinini 70 µL PBS içinde uygun konsantrasyona seyreltin. Ardından solüsyonu mikroarray kasetinin kuyucuklarına uygulayın.Buharlaşmayı önlemek için mikroarray kasetini nükleaz içermeyen yapışkan tavan folyosu ile mühürleyin. Proteinlerin kod bağlantısı üzerindeki basılı antikorlara bağlanması için oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübasyona bırakın.Kasetin kuyucuklarını üç kez PBS beş milimolar magnezyum klorür veya PBSM ile yıkayın. Ardından, floresan işaretli ikincil antikorları 70 mikrolitre PBSM içerisinde 0,125 mikromolar olacak şekilde seyreltin. Karışımı 85 santigrat derece sıcaklıkta üç dakika boyunca ısıtın.Ardından, işaretlenmiş ABERS'lerin buz üzerinde soğumasını bekleyin. ABERS'leri üç dakika boyunca mikroarray kasetinin kuyucuklarına uygulayın. Kaseti tekrar yapışkan folyo ile mühürleyin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.Yine, tek tek. Yıkama işleminin ardından kuyucukları üç kez PBSM ile yıkayın. Kaseti sökün ve tüm lamı PBSM ile durulayın.Ardından lamı santrifüj ile iyice kurutun. Son olarak, lamı bir Packard Biosciences tarama dizisi kullanarak tarayın. Gamma P 32 A TP beş prime ucundan etiketlenmiş aptamerlerin S 100 B proteinine 4.000 XL bağlanması belirlenmiş ve KD tayini için konsantrasyona karşı grafiğe dökülmüştür.Yaklaşık yedi seçilim turu sonrası temsili Kd değerleri genellikle 10⁻⁷ molar aralığındadır. Beş prime uçlu ilk aptamerler code-link mikro dizilere bağlandı; saflaştırılmış S100B proteini ilk aptamerlere bağlandı ve LOR 546 etiketli ikinci aptamerler, S100B kompleksleri üzerinden ilk aptamerlere bağlandı.Floresans, bir tarama dizisi tarayıcı kullanılarak nicelleştirildi. Orta satır, üstteki ve alttaki satırlarda yer alan KD analizlerinde eklemeli bağlanma ile karakterize edilen sandviç bağlanmayı göstermektedir. Abers beş birim prime tiyol türevlendirilmiş ilk abers için sandviç bağlanma yoktur; bunlar standart tiyol kimyası kullanılarak altın nanotellere bağlandı.İkinci aptamerler, aynı yöntemle 50 nM altın nanopartiküllere bağlandı. Ardından saflaştırılmış S 100 B proteini önce türetilmiş nanotellere, ardından 50 nM altın nanopartiküllü ikinci aptamerler ise birinci aptamer nanotel S 100 B komplekslerine bağlandı. Bağlanan sandviç kompleksleri FE-SEM kullanılarak görselleştirildi.S 100 B proteini yerine HTRA one proteini ile gerçekleştirilen bir bağlanma deneyi için negatif bir kontrol görülebilir. Tamam, prosedürle ilgili en önemli konulardan biri, dizilerin kendilerinin rastgele bölgeye baskın gelerek yalancı pozitiflere ve yalancı negatiflere neden olabileceği sabit dizilerin bulunmadığı, primer içermeyen bir yaklaşım kullanıyor olmamızdır. Bu prosedür uygulanırken, her ters transkripsiyon reaksiyonundan önce DNA kalıbının yok edildiğinden emin olmak ve her yeniden amplifikasyondan sonra spesifik R-T-P-C-R ürününü izole etme konusunda dikkatli olmak önemlidir.İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkür ederiz, deneylerinizde başarılar dileriz.

primer-free-aptamer-selection-using-a-random-dna-library

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Ayarlanabilir sıkılık manyetik boncuk seçim yöntemine dayalı olarak küçük moleküllü hedefler için yapı anahtarlamalı aptamerleri seçmek için bir protokol sağlanır. Yapı değiştirme özelliklerine sahip olarak seçilen aptamerler, tarif edilen altın nanopartikül tahlili gibi bir hedefin varlığını işaret etmek için konformasyonel bir değişiklik gerektiren tahliller için faydalıdır.

Bir Kolorimetrik Altın Nanopartikül Testi Uygulanan Yapı-anahtarlama aptamers seçilmesi için bir yöntem

Bu el yazması, yeni nesil dizileme için DNA parçalarını saflaştırmak için otomatik bir jel boyutu seçim yaklaşımını açıklamaktadır. Ranger Teknolojisi, agaroz jel yükleme, elektroforetik analiz ve hedeflenen DNA parçalarının geri kazanılması sürecinin tamamının tam otomasyonunu sağlayarak yüksek verimli ve yüksek kaliteli yeni nesil dizileme kitaplıklarına olanak tanır.

Otomatik Jel Boyut Seçimi Çevre Su Örneklerinden hazırlanmıştır nesil Sıralama Kütüphaneler Kalitesi Geliştirmek için

Biz yüksek verimli sıralama kullanan proteinlerin kapsamlı tek site doyma mutagenezi kütüphanelerinin fonksiyonel değerlendirme için bir protokol mevcut. Daha da önemlisi, bu yaklaşım kütüphane inşaatı ve sıralama multipleks dik primer çiftleri kullanır. ampisilin klinik olarak anlamlı bir doz için seçilen TEM-1 β-laktamaz kullanılarak Örnek sonuçlar verilmiştir.

Yüksek verimlilik sıralaması kullanılması Tüm-Protein Doygunluk Mutagenez Kütüphaneleri Fonksiyonel Değerlendirme Protokolü

MicroScale Thermophoresis (MST), aptamer-hedef etkileşimlerini karakterize etmek için hassas bir teknolojidir. Bu el yazması, aptamer-küçük molekül etkileşimlerini karakterize etmek için bir MST protokolünü açıklamaktadır.

Mikro Termoforesis kullanarak ATP bir aptamer Bağlama Sitesi Haritalama

Vitro seçimi ve gruba özgü maddedir asit ester-bağlama DNA aptamers karakterizasyonu için bir protokol sunulmuştur. Bir elektrokimyasal aptasensor içinde seçilen aptamer uygulanması da dahil edilir.

Maddedir asit Ester-bağlama DNA Aptamer seçimi, karakterizasyonu ve elektrokimyasal bir Aptasensor uygulamaya

Yeni nesil sıralama (NGS) platformu (~0.5–2.0%) yüksek hata oranı tarafından sınırlı genomik karakterizasyonu için güçlü bir araçtır. NGS hata oranı önlemek ve mutasyonlar varyant alleli kesirler 0,0001 nadir, tespit etmemize izin bizim hata düzeltilmiş sıralama yöntemleri açıklanmaktadır.

Nadiren de olsa algılama hatası düzeltildi DNA ve RNA sıralama

Dizi özgüllüğü gen regülasyonu için çok önemlidir. Belirli dizileri tanıyan düzenleyici proteinler gen regülasyonu için önemlidir. Bu tür proteinler için fonksiyonel bağlama alanlarının tanımlanması zorlu bir biyolojik sorundur. RNA bağlayıcı protein için bağlayıcı bir alanın tanımlanması için yinelemeli bir yaklaşım burada açıklanmıştır ve tüm RNA bağlayıcı proteinler için geçerlidir.

Düzenleyici RNA Bağlayıcı Proteinler için Bağlayıcı Siteleri Belirlemek için Sıra Alanını Keşfetmek

Protein bağlayıcı mikrodizi (PBM) deneyleri biyokimyasal tahlillerle birleşince, şablon DNA üzerinde RNA astarlarını sentezleyen bir enzim olan DNA primazının bağlayıcı ve katalitik özelliklerini birbirine bağlar. Yüksek iş itrifli primase profilleme (HTPP) olarak tanımlanan bu yöntem, çeşitli enzimlerin DNA bağlayıcı desenlerini ortaya çıkarmak için kullanılabilir.

Dna İlkase tarafından DNA Dizisi Tanıma Yüksek-Throughput Primase Profilleme kullanarak

Yeni dizi özgüllüğü olan restriksiyon endokleazları kısmen dejenere olmuş bir diziyi tanıyan enzimlerden geliştirilebilir. Burada, NlaIV enziminin dizi özgüllüğünü değiştirmek için başarıyla kullandığımız ayrıntılı bir protokol salıyoruz. Protokolün temel bileşenleri transkripsiyon/çeviri reaksiyonunun in vitro bölümleme ve yeni dizi özellikleri ile varyantların seçimidir.

In Vitro Yönettiği Evrim bir Kısıtlama Enonuklelease Daha Sıkı Özgüllük ile

Genel olarak, bir dezenfeksiyon yöntemiyle bulaşıcı olmayan hale getirilmiş virüslere veya diğer benzer virüslere değil, yalnızca bulaşıcı virüslere bağlanan belirli aptamerlere uygulanabilecek bir protokol sunuyoruz. Bu, taşınabilir ve hızlı testlerde bulaşıcılık durumunu belirleme olasılığını açar.

Enfeksiyöz ve Enfeksiyöz Olmayan Virüsleri Ayırt Etmek için Aptamerlerin İn Vitro Seçimi

Öğrenin, rastgele DNA kütüphanesi kullanarak S100B proteinine özgü aptamerleri primer-aptamer seçimi ile belirlemeyi. Bu yöntem, sabit primer dizilerinin neden olduğu yanlış pozitif ve negatif sonuçları ortadan kaldırarak SELEX protokollerinin verimliliğini artırır.

Rastgele bir DNA Kütüphane Kullanımı Primer-Aptamer Seçimi

Daha fazla video keşfet