Rastgele bir DNA Kütüphane Kullanımı Primer-Aptamer Seçimi
July 26th, 2010
SELEX protokolleri da rasgele kütüphane bölgeleri kuşatan sabit primer dizilerinden gerektiren bağlı ligandlar, yenilenme gerektiren her hangi seçimin birden fazla mermi, oluşmaktadır. Bu sabit astar dizileri seçim süreci (yanlış pozitif ve negatif) ile karışabilir. Burada bir astar ücretsiz protokol sunuyoruz.
Bu prosedürün genel amacı, bu durumda bir hedef proteine, S 100 B proteinine spesifik olarak bağlanan rastgele bir kütüphaneden aberleri tanımlamaktır. Bu, rastgele dizileri yan sabit primer dizilerinden kurtarmak için önce kitaplığın kısıtlama endonükleaz ile sindirilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, rastgele kütüphane dizilerini saflaştırılmış S 100 B proteinine bağlamak ve bunları geri kazanmaktır.
Prosedürün üçüncü adımı, bağlı dizileri hibridizasyon ve ligasyon yoluyla sabit primer dizileri ile yeniden birleştirmektir. Prosedürün son adımı, bağlı aday aper havuzunun R-T-P-C-R yeniden amplifikasyonuna izin vermek için bağlanmış ürünleri yazıya dökmek ve ardından bu seçim prosedürünün ek turlarını yapmaktır. Sonuç olarak, seçilen aberlerin S 100 B proteinine spesifik bağlanmasını gösteren sonuçlar elde edilebilir.
Örneğin, burada, sandviç bağlama testleri mikrodiziler kullanılarak gerçekleştirilir ve floresan etiketli ikinci abers testleri de işlevselleştirilmiş nanoteller ve 15 nanometre altın nanopartiküllere bağlı ikinci abers kullanılarak gerçekleştirilir. Bugün, rastgele D dizileri kütüphanesinden S yüz B proteinine bağlanan optimal seçimi için bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda, kanserin erken teşhisi için bir sensör platformu geliştirmek de dahil olmak üzere çeşitli amaçlar için kullanıyoruz.
Öyleyse başlayalım. Bu prosedüre başlamak için, daha önce açıklandığı gibi primer içermeyen veya PF DNA kitaplığı oluşturun. Çift sarmallı DNA kütüphanesinin bölünmesi ve ardından %10 denatüre edici poli akrilamid jel ile jel saflaştırılması, 30 cc'de beş asal fosfattan oluşan 32 nükleotidlik bir fragman ve 30'da beş asal fosfattan oluşan 30 nükleotidlik bir nükleotid fragmanı ile sonuçlanacaktır, sırasıyla 32 artı ve 30 artı fragman.
32 artı fragman, üç asal uçta CC minimal yan dizi ile 30 nükleotid rastgele alanını içerirken, 30 artı fragman sadece 30 nükleotid rastgele alan dizisinden oluşur. PF kütüphanesi DNA fragmanlarını aptr seçimi için hazırlamak için, 32 artı ve 30 artı fragmanlarının her birini 40 mikrolitre 20 mili tris, HCL pH 7.4'te tekrar askıya alın. Daha sonra numuneleri inkübasyonun ardından 85 santigrat derecede üç dakika ısıtın.
Soğutun, numuneler 37 santigrat derece su banyosu inkübatörde üç dakika bekletin, daha sonra 760 mikrolitre seçimde, tamponlayın ve 37 santigrat derecede üç dakika inkübe edin. Üç dakika sonra numuneyi 10 dakika oda sıcaklığında tutun. İnkübasyondan sonra, çözeltiyi seçim tamponu ile önceden yıkanmış nikel NTA agro boncukları içeren bir kolondan geçirin.
Spesifik olmayan DNA'yı çıkarmak için, sütuna bağlanmayan PF kütüphanesi DNA parçalarını toplayın ve daha sonra kullanmak üzere bir kenara koyun. S 100 B'ye bağlı boncukları hazırlamak için, önce 400 mikrolitre nikel NDA boncuklarını bir mikro santrifüjde üç saniye döndürün ve süpernatanı atın. Daha sonra boncukları 400 mikrolitre bağlayıcı tampon ile beş kez hafifçe pipetleyerek yıkayın.
Sonra boncukları aşağı doğru döndürün ve süpernatanı atın. Bunu tekrarla. İki kez yıkayın.
Daha sonra, daha önce saflaştırılmış histidin, boncukların üzerine proteini etiketledi. Burada, insan S 100 kalsiyum bağlanması. Protein B, çözeltiyi toplam 15 dakika boyunca her üç dakikada bir beş kez yukarı ve aşağı nazikçe pipetlemek için kullanılır.
15 dakika sonra boncukları döndürün ve süpernatanı atın. Son olarak, boncuk bağlı S 100 B'yi 400 mikrolitre seçme tamponu ile üç kez yukarı ve aşağı okşayarak nazikçe yıkayın. Yine, boncukları aşağı doğru döndürün ve süpernatanı atın.
S 100 B bağlı yapıştırıcıları seçmek için toplam üç son yıkama için bu adımı iki kez tekrarlayın. Daha önce bir kenara bırakılan 32 artı ve 30 artı parçalarını alın. Parçaları boncuk ciltli S 100 B'ye ekleyin, ardından numuneyi 15 dakika inkübe edin.
15 dakika sonra hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek her üç dakikada bir karıştırın, boncukları kısa bir süre döndürün, süpernatanı atın, ardından S 100 BDNA kompleksini nazikçe pipetleyerek 800 mikrolitre seçim tamponu ile yıkayın. Sonra boncukları aşağı doğru döndürün ve süpernatanı atın. Bu yıkama adımını iki kez tekrarlayın.
S 100'ü geri kazanmak için, boncuklara 200 mikrolitre 20 milimolar tris, HCL pH 7.4'te aberler seçilmelidir. Daha sonra bulamacı 85 santigrat derecede üç dakika ısıtın. Kuluçka sonrası.
Boncukları bir dakika boyunca girdap haline getirin ve döndürün. Ardından süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Bu adımı bir kez tekrarlayın ve süpernatanları birleştirin.
Son olarak, seçilen DNA parçalarını saflaştırın. PCR ürünlerini eşdeğer hacimde fenil kloroform, izopropil alkol ile iki kez ekstrakte edin. Bunları 250 milimolar sodyum klorür ve eksi 70 santigrat derecede 15 dakika boyunca %100 Etanol hacminin 2,5 katı ile çökeltin.
15 dakika boyunca dört santigrat derecede 21.000 GS'de döndürün. Sonra süpernatanı atın. Peletleri %75 etanol ile verimli bir şekilde durulayın.
Beş dakika boyunca dört santigrat derecede 21.000 GS'de döndürün ve süpernatanı atın. Peletleri 10 tur seçimden sonra üç dakika boyunca hızlı bir vakumda kurutun. Elde edilen PCR amplifiye DNA fragmanlarını, bir vitrojen çekirdeğinden elde edilen PCR 2.1 topo vektörüne klonlayın.
Ardından, seçilen N 30 cc ve N 30 fragmanlarının her biri için M 13 ileri astar ile 40 ila 50 tek koloni arasında sıralayın. Infomax vektör NTI yazılımını kullanarak seçilen dizileri hizalayın. Ardından, hizalamalara dayalı olarak konsensüs dizilerini belirleyin.
Konsensüs dizileri belirlendikten sonra, yazılı protokolde açıklandığı gibi konsensüs sağlayıcılarını satın alın. Baskı tamponunda beş asal Amin C altı parçası ile sentezlenen ilk aptamer'i 15 mikromolar nihai konsantrasyona kadar askıya alın. Ardından, aptamer çözümünü, bir apogen keşifleri mikro şebeke dizisi kullanarak kod bağlantısıyla etkinleştirilen slaytlara yerleştirin.
Aşağıdaki kod bağlantısı önerilen protokollerdir. Her slaydı 12 diziyle yazdırın. İkiye sekiz biçim kullanın.
Hibridizasyon için mikrodizi hibridizasyon kaseti. S 100 B proteinini 70 mikrolitre PBS'de uygun konsantrasyona seyreltin. Daha sonra çözeltiyi mikrodizi kasetinin kuyucuklarına uygulayın.
Buharlaşmayı önlemek için mikrodizi kasetini nükleaz içermeyen yapışkan tavan folyosu kullanarak kapatın. Proteinin kod bağlantısında yazılı olan aberlere bağlanmasına izin verin. Tek tek inkübasyonu takiben oda sıcaklığında bir saat kaydırın.
Kasetin kuyularını PBS beş milimolar magnezyum klorür veya PBSM ile üç kez yıkayın. Daha sonra, floresan etiketli ikinci aberleri 70 mikrolitre PBSM'de 0.125 mikromolar ile seyreltin. Karışımı 85 santigrat derecede üç dakika ısıtın.
Ardından etiketli ABERS'in buz üzerinde soğumasına izin verin. Üç dakika boyunca, aberleri mikrodizi kasetinin kuyucuklarına uygulayın. Yine, kaseti yapışkan folyo ile kapatın ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.
Yine bireysel olarak. Yıkamayı takiben kuyuları PBSM ile üç kez yıkayın. Kaseti sökün ve tüm slaytı PBSM ile durulayın.
Daha sonra slaydı santrifüjleme ile iyice kurulayın. Son olarak, bir tarama Packard Biosciences tarama dizisi kullanarak slaydı tarayın. Gama P 32 A TP beş asal uçlu aptamerler için S 100 B proteinine 4.000 XL bağlanma belirlendi ve KD tayini için konsantrasyona karşı çizildi.
Yaklaşık yedi tur seçimden sonra temsili kds tipik olarak 10 ila negatif yedi molar aralıktadır. Beş asal hedefleme dert ilk aptamer, kod bağlantı mikrodizilerine bağlandı, saflaştırılmış S 100 B proteini birinci optimere bağlandı ve LOR 5 46 olarak etiketlendi. Optimer, ilk optimer S 100 B komplekslerine bağlıydı.
Floresan, bir tarama dizisi tarayıcısı kullanılarak ölçüldü. Orta sıra, üst ve alt sıralarda KD tahlillerinde katkı maddesi bağlama ile karakterize edilen sandviç bağlama soldurucularını göstermektedir. Aberler için sandviç bağlayıcı yoktur: beş asal tiyol türevlendirilmiş ilk aberler, standart til kimyası kullanılarak altın nanotellere bağlanmıştır.
İkinci aberler aynı şekilde 50 NMO veya altın nps'ye bağlandı. Saflaştırılmış S 100 B proteini daha sonra önce türev nanotellere, ikinci aptamer 50 nano molar altın mps'ye daha sonra birinci aptamer nanotel S 100 B komplekslerine bağlandı. Bağlı sandviç kompleksleri F FE SEM kullanılarak görselleştirildi. Burada.
S 100 B proteini yerine HTRA bir proteini ile gerçekleştirilen bir bağlanma testi için negatif bir kontrol görülebilir. Tamam, prosedürle ilgili en önemli şeylerden biri, rastgele bölgeyi ezen dizilere bağlı olarak yanlış pozitiflere ve yanlış negatiflere neden olabilecek sabit dizilere sahip olmadığımız, astarsız bir yaklaşım kullanmamızdır. Bu prosedürü yaparken, her ters transkripsiyon reaksiyonundan önce DNA şablonunun yok edildiğinden emin olmak ve her yeniden amplifikasyondan sonra spesifik RTPCR ürününü izole etmeye dikkat etmek önemlidir.
İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneylerinizde iyi şanslar.
Genel Bakış
Bu makale, rastgele bir DNA kütüphanesinden S100B proteinine özgü olarak bağlanan aptamerlerin seçimi için primer içermeyen bir protokol sunmaktadır. Yöntem, sabit primer dizileri kaynaklı parazitleri ortadan kaldırarak SELEX protokollerinin verimliliğini artırmayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyokimya
- Protein Mühendisliği
- Biyoteknoloji
Arka Plan
- SELEX protokolleri genellikle, yanlış pozitif ve negatif sonuçlara yol açabilecek sabit primer dizileri gerektirir.
- Rastgele kütüphanelerden özgü bağlayıcıları belirlemek, sensör geliştirme gibi çeşitli uygulamalar için kritik öneme sahiptir.
- S100B proteini, kanser tespitindeki önemi nedeniyle ilgi çekici bir hedeftir.
- Geleneksel yöntemler, sabit dizilerin varlığı nedeniyle seçim sürecini engelleyebilir.
Çalışmanın Amacı
- S100B proteinine bağlanan aptamerlerin seçimine yönelik primer içermeyen bir yöntem geliştirmek.
- SELEX sürecini basitleştirmek ve özgüllüğü artırmak.
- Alanında araştırma yapanlar için detaylı bir protokol sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Rastgele DNA kütüphanesinin sabit primer dizilerini çıkarmak için sindirilmesi.
- Kütüphanenin saflaştırılmış S100B proteinine bağlanması.
- Bağlı dizilerin sabit dizilerle yeniden birleştirilmesi için hibridizasyon ve ligasyon.
- Seçilen aptamerlerin R-T-P-C-R yoluyla transkripsiyonu ve amplifikasyonu.
Ana Sonuçlar
- S100B proteinine özgü olarak bağlanan aptamerlerin başarılı bir şekilde tanımlanması.
- Mikrodizi kullanan sandviç tahlillerle bağlanmanın gösterimi.
- Fonksiyonelleştirilmiş nanoteller ve altın nanopartiküller kullanılarak seçilen aptamerlerin doğrulanması.
- Erken kanser tespitinde potansiyel uygulamaların vurgulanması.
Sonuçlar
- Primer içermeyen protokol, parazitlerin azaltılmasıyla SELEX sürecini geliştirir.
- Seçilen aptamerler, biyosensör uygulamalarında kullanılmaya umut vericidir.
- Bu yöntem, S100B proteininin ötesinde çeşitli hedefler için uyarlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Primer-free aptamer selection addresses a critical bottleneck in early discovery by eliminating fixed sequence interference, enabling more accurate identification of high-affinity binders. This innovation enhances predictive confidence in target validation and supports robust assay development for protein targets such as S100B. The approach is strategically relevant for biopharma portfolios seeking reliable molecular recognition tools for diagnostics and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables unbiased interrogation of molecular interactions by removing primer-induced artifacts.
- Improves functional target validation by isolating aptamers with true specificity for the protein of interest.
- Supports predictive confidence in downstream biological assays and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated aptamer libraries for high-throughput screening platforms.
- Enhances assay reproducibility by minimizing sequence-related variability.
- Delivers quantitative binding data (e.g., Kd values) for reliable compound or biomarker evaluation.
- Enables scalable and reusable assay formats, including microarrays and nanowire-based sensors.
Translational & Preclinical Research
- Aligns aptamer selection with disease-relevant protein targets such as S100B, supporting translational biomarker strategies.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by generating robust molecular probes.
- Reduces mechanistic ambiguity in preclinical models by ensuring aptamer specificity.
Pipeline & Workflow Integration
This primer-free selection method integrates at the interface of early discovery and assay development, supporting workflows from target validation to preclinical research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating aptamers with minimal sequence bias.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative binding outputs suitable for high-throughput and multiplexed assays.
- Analytics: Provides robust Kd measurements and consensus sequence identification for comparative analysis.
- Translational Research: Enables alignment with disease biomarkers and supports continuity into preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for aptamer selection against diverse protein targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes aptamer selection, improving reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of molecular diagnostics.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid chemistry and protein biochemistry.
- Needs access to instrumentation for DNA purification, amplification, and microarray or nanowire assays.
- Demands cross-team standardization of selection and validation protocols.
- Adaptation may be needed for different protein targets or sample matrices.
- Careful control of template destruction and product isolation is essential to avoid false positives.
