Name: Ekstrasellüler polisakkaritler Oligo Kitle Profil (Olimp) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-20T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Öğrenin bitki hücre duvarı glikostruktürlerinin hızlı ve duyarlı analizi için OLIMP yöntemini. Enzimatik sindirim ve MALDI-TOF/MS kullanarak ekstraselüler matris polisakkaritlerini profilleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Enerji Enstitüsü Biosciences hibe OO0G01 tarafından finanse edildi.

Olimp yöntemi glycosylhydrolase olarak endoglucanase kullanarak, dikotil bitkiler, xyloglucan hücre duvarlarında bulunan başlıca hemiselüloz örneklediği. Bu yöntem bir bitki doku kaynağı olarak tüm Arabidopsis fideler ile gösterilmiştir. Enzim ve hücre dışı matriks malzemesi, aynı prosedür kullanılarak istenilen analiz bağlı olarak değiştirilebilir. 1. Hücre duvar izolasyonu <ol><li> Hasat beş 5 gün eski tüm Arabidopsis fide veya eşdeğer miktarda istenilen malzemenin ve 1.5mL bir reaksiyon tüpü içine aktarabilirsiniz . Malzeme tüp alt yerleştirildiğinden emin olun. </li><li> Sıvı nitrojen içinde örnek ve ek-freeze üst üste iki 3mm metal topları reaksiyon tüpüne ekleyin. </li><li> Bilyalı değirmen (02:30 dakika, 25Hz) kullanılarak dondurulmuş örnek Grind. </li><li> Örnek 1 ml% 70 sulu etanol ekleyin. Bir mıknatıs kullanarak metal topları çıkarın. Iyice Vortex. </li><li> Pelet için 10dk hücre duvarı malzemesi içeren alkol çözünmeyen kalıntı 14.000 rpm'de örnek santrifüjleyin. </li><li> Aspirasyon ile süpernatantı dikkatlice çıkarın. Pelet rahatsız değil emin olun. </li><li> Kloroform / metanol (1:1 v / v) solüsyonu 1 ml ekleyin. Pelletini tekrar iyice karıştırın. </li><li> Örnek 10 dakika 14.000 rpm'de santrifüj ve dikkatli bir aspirasyon ile süpernatantı kaldırmak. Pelet rahatsız değil emin olun. </li><li> Örnek bir konsantratör kullanarak kurutun. </li></ol> 2. Oligosakkaritlerin çözünürleştirme <ol><li> Oligosakkaritler şeklinde çözünürleştirme için özellikle polisakkarit uygun bir tampon 25μl kuru pelet tekrar süspansiyon haline getirin. Endoglucanase 50mm Amonyum format, pH4.5 için kullanılır. Endoglucanase, 0.2U ekleyin. Vorteks aşağı süspansiyon ve spin sıvı. </li><li> 37 16h için örnek inkübe ° C bir kuluçka makinesi, 300rpm az sallayarak. </li><li> Konsantratör kullanarak sindirmek (su) çözücü çıkarın. </li></ol> 3. MALDI-TOF analizi yayımlanan oligosakkaritler <ol><li> BioRex MSZ 501 katyon değişim reçine boncuk sindirilir örnek tuzları ve enzim kaldırmak için kullanılır. Boş bir sütun yerleştirme ve bir kısım boncuk bol miktarda su ile yıkama Durumu boncuk. </li><li> 5-10 BioRex boncuk sindirilir ve kurutulmuş örnek ekleyin. Sonra küçük miktarlarda su malzeme 5μl olabilir, 10μl su ekleyin. Kısaca tüp iplik çözüm boncuk bırakın. Oda sıcaklığında en az 10 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> MALDI hedef plaka üzerine Spot 2μl matris (2,5-dihydroxybenzoic asit (DHB), su 10mg/ml). Homojen matris kimyasal kristalleri giden vakum altında çözücü matris buharlaşır. </li><li> Spot 2μl hedef plakası matris kristallerin üst desalted örnek çözümü. Örnekleri çok sayıda nokta istiyorsanız sadece 3dk maksimum lekelenme devam. Bu zaman çerçevesi ilk benekli örnek henüz kuru olduğunu garanti eder. Son benekli örnek yeniden çözünmüş matris ve örnek oligosakkarit molekülleri tam bir karıştırma sağlamak için ek bir 2min için bekleyin. Sonra kuru bir vakum altında hedef plakası. Örnek / matris karışımı homojen kristalizasyon etkinleştirmek için 1dk daha az kristalize gerekir. </li><li> Hedef plakası MALDI-TOF kütle spektrometresi içine yerleştirin. Makine 20000V hızlanan voltaj ve 350 nm arasında bir gecikme ile olumlu reflectron moduna ayarlanmış olmalıdır seçilen kütle aralığı (olabilir beklenen oligomerler bağımlı değiştirmek) 500-3000 Da olmalıdır. Lazer ateş başlayın ve bir temsilcisi ortalama spektrumu (Şekil 2A) oluşturmak için derlenmiş örnek başına 100-200 spektrumları, toplamak. Belirli oligosakkaritler temsil İyonlar şarj (m / z) oranı üzerinden kitle tarafından tespit edilebilir. Tüm ilgi çekici iyonlarının iyon yoğunlukları (pik yükseklik) örnek her oligosakkarit göreceli bolluk (Şekil 2B)% 100'e kadar ilave edilmelidir. </li></ol> 4. yerinde Olimp analizi Olimp dokusu üzerinde herhangi bir duvar hazırlık adımları atlayarak doğrudan da kullanılabilir. Bitki doku kaynağı olarak bir örnek Arabidopsis, hypocotyls solmuş. Yine, bir endoglucanase hemiselülozlar xyloglucan yapısını belirlemek için kullanılır. Enzim ve doku malzemesi aynı prosedür kullanılarak istenilen analiz bağlı olarak değiştirilebilir. <ol><li> Solmuş fide Hasat ve boş bir MALDI hedef plaka üzerine koyun ve fide kurumaya bırakın. </li><li> Istenilen konuma kuru fide 0.5μl endoglucanase (50mm Amonyum format içinde çözünmüş 0.4U/μl, pH4.5) ekleyin. Enzim damla hedef plakası kısmen dokunur emin olun. </li><li> Doyurarak nem önlemek için kapalı bir kapta MALDI hedef plaka koyun enzim damla kurur. 1 odasında plaka inkübeAz 6 saat 37 ° C </li><li> Bitki doku ve vakum altında enzim damla MALDI hedef plakası kurulayın. </li><li> Her kuru enzim spot üstünde; 0.5μl matrisi (10 mg / l DHB) ekleyin. 2min için bekletin. </li><li> Vakum altında MALDI hedef plakası kurulayın. </li><li> MALDI-TOF örnekleri analiz edin. MALDI-TOF kütle spektrometresi içine doku ve enzim / matris spot (ler) ile hedef plakası yerleştirin. Makine 20000V hızlanan voltaj ve 350 nm arasında bir gecikme ile olumlu reflectron moduna ayarlanmış olmalıdır seçilen kütle aralığı (olabilir beklenen oligomerler bağımlı değiştirmek) 500-3000 Da olmalıdır. </li><li> Doku SONRAKİ matris / örnek kristalleri üzerine lazer ateş başlayın. Zaman moleküller uçuş kapalı olacaktır Böyle bir durumda, doku kendisi basmayın emin olun. Nokta, bir temsili ortalama spektrumu (Şekil 3) oluşturmak için derlenmiş başına yaklaşık 20-50 spektrumları toplayın. Belirli oligosakkaritler temsil İyonlar şarj (m / z) oranı üzerinden kitle tarafından tespit edilebilir. Iyon yoğunlukları (iyon yükseklik) olabilir ve tüm ilgi çekici iyonları örnek her oligosakkaritler göreceli bolluk içinde% 100 ilave edilmelidir. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Arabidopsis fide hemiselülozlar xyloglucan Olimp analizinin bir örneği Şekil 2'de gösterilmiştir. Iyonlarının kütle farklılıkları ve bilinen iyi karakterize bir enzim sayesinde (endoglucanase) özgüllüğü iyonları özel oligosakkarit yapılar (Şekil 2A) atanabilir. Açıkçası, yapısal izomerleri ayırt edilemez. Belirlenmesi için çeşitli oligosakkaritler göreceli bolluk temel varsayım (Şekil 2B), kitlesel spec tepki faktörü bu oligosakkaritler için çok benzer olmasıdır. Burada görüldüğü gibi, Olimp kantifikasyon yüksek tekrarlanabilir. Bununla birlikte, yöntemin sağlamlık sinyali çeşitli oligosakkarit iyonları gürültü oranları son derece bağımlı olduğunu lütfen unutmayın. Örneğin bu oran düşük miktarlarda tuz veya oligosakkaritler ile kirlenme azaltabilirsiniz. Olimp doku (in situ analizi) analizi, çok küçük ve belirli alanlarda çalışma sağlar ve çok az numune hazırlama içerir. Örneğin aynı kalitatif (iyonlar) (Şekil 3) Burada sunulan ancak kantitatif farklılıklar (iyon şiddetleri değişimi) Arabidopsis fide sürgün ve kök doku arasında gözlendi. Olimp yöntemi Permütasyonlar böylece doku "görüntüleme" yol açabilir. <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1: Akış şeması bir bitki kaynağı olarak tüm Arabidopsis fide kullanarak Olimp prosedürü. İlk olarak, doku yumuşatılır ve hücre duvarı malzemesi (resim, Fujino ve ark modifiye 10) hazırlanır. Sonra belirli bir hidrolaz kullanarak belirli bir duvar polisakkarit oligosakkaritler serbest bırakılır. Son olarak, çözünür oligosakkaritler bağıl bollukları MALDI-TOF kütle spektrometresi ile belirlenir. <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 Olimp tarafından belirlenir Arabidopsis solmuş fide xyloglucan oligosakkaritler göreceli bolluk. A) Temsilci xyloglucan oligosakkarit kütle spektrumu, her iyon belirli bir oligosakkarit yapısını temsil eder, yapısal izomerleri ayırt edilebilir değildir. B) belirlenmesi için, göreceli oligosakkarit bolluk Sorumlu çubuk diyagramı. <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 Örnek olarak Arabidopsis solmuş fide kullanarak yerinde Olimp analiz. Her enzim / sindirim damlacık (renkli daireler) bağımsız olarak analiz edilebilir ve buna karşılık gelen bir kütle spektrumları elde edilir ve analiz edilebilir. <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. Xylanase (Megazyme) Miscanthus yaprak malzeme sindirerek elde hemiselüloz Xylan Olimp spektrumu.

<ol><li>Lerouxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+structural+phenotyping+of+plant+cell+wall+mutants+by+enzymatic+oligosaccharide+fingerprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rapid structural phenotyping of plant cell wall mutants by enzymatic oligosaccharide fingerprinting.</a> Plant Physiology. 130 (4), 1754-1754 (2002).</li>
<li>Obel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microanalysis+of+plant+cell+wall+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Microanalysis of plant cell wall polysaccharides.</a> Molecular Plant. 2 (5), 922-922 (2009).</li>
<li>Mouille, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+trait+loci+analysis+of+primary+cell+wall+composition+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative trait loci analysis of primary cell wall composition in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 141 (3), 1035-1035 (2006).</li>
<li>Bauer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+suite+of+polysaccharide-degrading+enzymes+for+analyzing+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Development and application of a suite of polysaccharide-degrading enzymes for analyzing plant cell walls.</a> PNAS. 103 (30), 11417-11417 (2006).</li>
<li>Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+xyloglucan-specific+endo-beta-1%2C4-glucanase+from+Aspergillus+aculeatus%3A+expression+cloning+in+yeast%2C+purification+and+characterization+of+the+recombinant+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">A xyloglucan-specific endo-beta-1,4-glucanase from Aspergillus aculeatus: expression cloning in yeast, purification and characterization of the recombinant enzyme.</a> Glycobiology. 9 (1), 93-93 (1999).</li>
<li>Aboughe-Angone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+carbohydrates+from+fruit+pulp+of+Argania+spinosa%3A+structural+analysis+of+pectin+and+xyloglucan+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Res%22%5BJournal%5D)">Cell wall carbohydrates from fruit pulp of Argania spinosa: structural analysis of pectin and xyloglucan polysaccharides.</a> Carbohydr Res. 343 (1), 67-67 (2008).</li>
<li>Brown, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+five+xylan+synthesis+mutants+reveals+new+insight+into+the+mechanisms+of+xylan+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Comparison of five xylan synthesis mutants reveals new insight into the mechanisms of xylan synthesis.</a> Plant Journal. 52 (6), 1154-1154 (2007).</li>
<li>Lee, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PARVUS+gene+is+expressed+in+cells+undergoing+secondary+wall+thickening+and+is+essential+for+glucuronoxylan+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The PARVUS gene is expressed in cells undergoing secondary wall thickening and is essential for glucuronoxylan biosynthesis.</a> Plant Cell Physiol. 48 (12), 1659-1659 (2007).</li>
<li>Obel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pectin+may+hinder+the+unfolding+of+xyloglucan+chains+during+cell+deformation%3A+implications+of+the+mechanical+performance+of+Arabidopsis+hypocotyls+with+pectin+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+%22%5BJournal%5D)">Pectin may hinder the unfolding of xyloglucan chains during cell deformation: implications of the mechanical performance of Arabidopsis hypocotyls with pectin alterations.</a> Molecular Plant . , (2009).</li>
<li>Cavalier, D. M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+xyloglucan+xylosyltransferases+catalyze+the+addition+of+multiple+xylosyl+residues+to+cellohexaose%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Two xyloglucan xylosyltransferases catalyze the addition of multiple xylosyl residues to cellohexaose.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34197-34197 (2006).</li>
<li>Leonard, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+Arabidopsis+gene+encoding+a+GH95+alpha1%2C2-fucosidase+active+on+xyloglucan+oligo-+and+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of an Arabidopsis gene encoding a GH95 alpha1,2-fucosidase active on xyloglucan oligo- and polysaccharides.</a> Phytochemistry. 69 (10), 1983-1983 (2008).</li>
<li>Cavalier, D. M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+xyloglucan+xylosyltransferases+catalyze+the+addition+of+multiple+xylosyl+residues+to+cellohexaose%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Two xyloglucan xylosyltransferases catalyze the addition of multiple xylosyl residues to cellohexaose.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34197-34197 (2006).</li>
<li>Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+irregular+xylem9+mutant+is+deficient+in+xylan+xylosyltransferase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">The irregular xylem9 mutant is deficient in xylan xylosyltransferase activity.</a> Plant and Cell Physiology. 48 (11), 1624-1624 (2007).</li>
<li>Iglesias, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoplastic+glycosidases+active+against+xyloglucan+oligosaccharides+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Apoplastic glycosidases active against xyloglucan oligosaccharides of Arabidopsis thaliana.</a> Plant and Cell Physiology. 47 (1), 55-55 (2006).</li>
<li>Fujino, T., Sone, Y., Mitsuishi, Y., Itoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cross-links+between+cellulose+microfibrils%2C+and+their+occurrence+during+elongation+growth+in+pea+epicotyl%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of cross-links between cellulose microfibrils, and their occurrence during elongation growth in pea epicotyl.</a> Plant Cell Physiol. 41 (4), 486-486 (2000).</li>
<li>Vanzin, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mur2+mutant+of+Arabidopsis+thaliana+lacks+fucosylated+xyloglucan+because+of+a+lesion+in+fucosyltransferase+AtFUT1%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">The mur2 mutant of Arabidopsis thaliana lacks fucosylated xyloglucan because of a lesion in fucosyltransferase AtFUT1.</a> PNAS. 99 (5), 3340-3340 (2002).</li>
<li>Cavalier, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupting+two+Arabidopsis+thaliana+xylosyltransferase+genes+results+in+plants+deficient+in+xyloglucan%2C+a+major+primary+cell+wall+component%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Disrupting two Arabidopsis thaliana xylosyltransferase genes results in plants deficient in xyloglucan, a major primary cell wall component.</a> Plant Cell. 20 (6), 1519-1519 (2008).</li>
<li>Hilz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+liquid+chromatography%2C+capillary+electrophoresis%2C+and+mass+spectrometry+methods+to+determine+xyloglucan+structures+in+black+currants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">A comparison of liquid chromatography, capillary electrophoresis, and mass spectrometry methods to determine xyloglucan structures in black currants.</a> Journal of Chromatography A. 1133 (1-2), 275-275 (2006).</li>
<li>Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+mur1+mutation+on+xyloglucans+produced+by+suspension-cultured+Arabidopsis+thaliana+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Effects of the mur1 mutation on xyloglucans produced by suspension-cultured Arabidopsis thaliana cells.</a> Planta. 214 (1), 67-67 (2001).</li>
</ol>

Burada sunulan Olimp yöntemi ekstrasellüler matrisler bulunan polimerlerin çok hassas ve hızlı analiz sağlar. Olimp enzimatik sonraki MALDI-TOF analizi ile oligomerler sürümü birleştirir. MALDI-TOF yelpazenin nesil bir dakikadan az sürer, dolayısıyla Olimp mutant ekranlar gibi yüksek verimli çalışmaları da dahil olmak üzere geniş bir uygulama yelpazesi için uygundur. Olimp bitki polisakkaritler ile sınırlı değildir ancak potansiyel olarak sadece özel hidrolitik enzimlerin durumu ile sınırlı polimerler, geniş bir yelpazede uygulanabilir. Ancak, Olimp bir sınırlama polimer mutlak bir bereket elde edilemez. Olimp çeşitli türlerin çeşitliliği ekstraselüler matriks polisakkaritlerin yapısını incelemek için, kullanılmadan önce de belirtildiği gibi. Bir örnek olarak, Şekil 4, ot türleri başlıca hemiselüloz, Xylan bir Olimp spektrum temsil eder. Burada, hücre duvar malzemesi ılıman çim Miscanthus türetilmiş bir xylanase kullanılarak sindirilir.

<table><tbody><tr><td>2,5-dihidroksibenzoik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37550</td><td>su içinde 10mg/mL</td></tr><tr><td>BioRex MSZ 501(D) Reçinesi</td><td>Bio-Rad</td><td>142-7425</td><td></td></tr><tr><td>Endoglukanaz</td><td>Megazyme</td><td>E-CELTR</td><td></td></tr><tr><td>Ksilanaz M6</td><td>Megazyme</td><td>E-XYRU6</td><td></td></tr><tr><td>3mm metal bilyalar</td><td>Retsch</td><td>22.455.0011</td><td></td></tr><tr><td>Bilyalı değirmen</td><td>Retsch</td><td>Mixer Mill MM400</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF</td><td>Shimadzu Corporation</td><td>Axima Performance</td><td></td></tr><tr><td>MALDI hedef plakası</td><td>Kratos Analytical</td><td>DE4555TA</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Eppendorf</td><td>Vacufuge 5301</td><td></td></tr><tr><td>Vakum manifoldu</td><td>EMD Millipore</td><td>MSVMHTS00</td><td></td></tr><tr><td>Vakum pompası</td><td>Welch Allyn</td><td>DryFast Ultra 2032</td><td></td></tr></tbody></table>

ekstrasellüler polisakkaritler oligo kitle profil (olimp)

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

Çevre hücreleri doğrudan temas ekstraselüler matriks tarafından birçok organizmalarda aracılık eder. Ekstrasellüler matrisler bir ortak yönü glikoproteinlerin şeklinde kompleks şeker moieties proteoglikanlar ve / veya polisakkaritler içerir. Örnekler, fibriler protein ve proteoglikanlar veya bitki ve mantar hücre duvarları polisakkarit başlıca oluşan insan ve hayvan hücreleri ekstrasellüler matriks ve proteoglikan / bakteri hücre duvarlarının glikolipid içerir. Tüm bu glycostructures hücre-hücre ve hücre-çevre haberleşme ve sinyalizasyon hayati rol oynamaktadır. Ekstraselüler matriks bir olağanüstü karmaşık bir örnek yüksek bitki hücrelerinin duvarları mevcut. Onların duvar şekerlerin kuru ağırlığının% 75 kadar, neredeyse tamamen, ve bu gezegen üzerindeki en bol biyopolimerlerin oluşur. Bu nedenle, araştırma, fosil yakıt elde edilen petrokimya yerine karbon-nötr bir yenilenebilir kaynak olarak en iyi bu malzemelerin nasıl kullanılacağını yapılır. Yakıt dönüşümü için temel zorluk, bu eşsiz biokompozit benzersiz glycostructures nedeniyle enzimatik veya kimyasal bozunmaya duvarların dinlemezlik kalır. Burada, bitki hücre duvarının glycostructures hızlı ve hassas bir analiz için bir yöntem mevcut. Bu yöntem, oligo Kitle Profil (Olimp) (MALDI-TOF/MS matriks yardımlı lazer desorpsiyon / iyonizasyon zaman-uçuş-kütle spektrometresi kullanarak özel glycosylhydrolases ve çözündüğünü oligosakkarit karışımları sonraki analizi kolaylaştırmak duvar malzemeleri oligosakkaritler enzimatik serbest dayanır 1) (Şekil 1). Olimp, tam bir analiz için sadece 5000 hücrelerinin duvarları, doku kendisini 2 yapılabilir gerektirir ve yüksek verimlilik analizleri 3 için uygun . Mutlak miktarda çözünür oligosakkaritler Olimp tarafından belirlenir mümkün olmasa bile, çeşitli oligosakkarit iyonların göreceli bolluk, duvarda bulunan yerli bir polisakkarit ikame model hakkında anlayışlar veren kitle spektrumu tarif edilebilir. Olimp sadece belirli enzimler 4 durumu ile sınırlı duvar polimerlerin geniş bir yelpazede, analiz için kullanılabilir. Örneğin, bitki hücre duvarı enzimler bulunan polimerlerin analizi için bir endo-β-(1-4)-xylanase 6,7 kullanarak xyloglucanase 5, 11, 12, 13, Xylan kullanarak hemiselülozlar xyloglucan analiz etmek için kullanılabilir. veya polygalacturonase ve methylesterase 8 bir arada kullanarak pektik polisakkaritler. Ayrıca, aynı ilkeler Olimp glycosylhydrolase ve hatta glycosyltransferase faaliyetleri izlenir ve 9 tespit edilebilir.

Bir ekstrasellüler matriks polisakkaritlerin yapısına anlayışlar kazanmak için hızlı bir şekilde açıklanmıştır. Yöntemi dakika miktarda malzeme analiz edilmesi için izin kütle spektrometresi glycosylhydrolases özgüllüğü ve duyarlılığı yararlanır. Bu teknikte doku kendisini doğrudan kullanılmak üzere uyarlanabilir.

Ekstrasellüler polisakkaritler Oligo Kitle Profil (Olimp)

Hücrelerin çevreyle olan doğrudan teması, birçok organizmada bir hücre dışı matris aracılığıyla sağlanır. Hücre dışı matrislerin ortak bir özelliği ...

Burada gösterilen oligo kütle profilleme veya Olympic deneyi, bir organizmanın hücre dışı matrisi veya hücre duvarındaki polimerlerin yapısı hakkında hızlıca bilgi edinilmesini sağlar. Buradaki durumda hücre duvarları, öncelikle hücresel bileşenlerin %70 ethanol ile uzaklaştırılmasıyla bitki fidelerinden hazırlanır. Hedef duvar polimeri, daha sonra belirli duvar bileşenlerini oligomerler şeklinde çözünür kılan spesifik bir hidrolaz ile sindirilir.Alternatif bir yaklaşım, hücre duvarını C iki'deki enzim ile doğrudan doku üzerinde sindirmektir. Serbest kalan ligamentlerin göreceli bolluğu, MALDI kütle spektrometrisi ve istatistiksel analiz ile belirlenir. Merhaba, ben Kaliforniya Üniversitesi Berkeley'deki Enerji Biyobilimleri Enstitüsü'nden Marcus Polly.Merhaba, ben Marcus Re. Ben de Asha Giller. Bizler de Energy Biosciences Institute'danız. Organizmalar, organizmaya bağlı olarak kompleks polimer ağlardan oluşan hücre dışı matrislerle çevrilidir.Hücre dışı matrisi değerlendirmenin hızlı ve hassas bir yolu, bugün size göstereceğimiz ve kısaca oli kütle profilleme olarak adlandırdığımız bir yöntemdir. Bu prosedür doğrudan bitki dokusu üzerinde de gerçekleştirilebilir. Öyleyse başlayalım.Bu prosedüre, bitki dokularının hücre dışı matriksini veya hücre duvarını izole ederek başlayın. Beş adet arabidopsis fidanesi veya eşdeğer miktarda başka bitki materyali toplayın ve bunları 1,5 mililitrelik bir reaksiyon tüpüne aktarın. Materyalin tüpün dibine yerleştirildiğinden emin olun.Reaksiyon tüpüne iki adet üç milimetrelik metal bilye ekleyin ve sıvı azot içerisinde şok dondurun. Ardından, donmuş örneği bir bilya değirmen kullanarak 25 hertz hızda 2,5 dakika boyunca öğütün. Materyali öğüttükten sonra, örneğe bir mililitre %70'lik sulu etanol ekleyin.Metal bilyeleri bir mıknatıs kullanarak çıkarın ve iyice vorteksleyin. Bu işlem çoğu proteini ve hücre organelini çözünür hale getirir; alkolde çözünmeyen kalıntıları çöktürmek için örneği 14, 000 RPM'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Hücre duvarı materyalini temsil eden süpernatantı, pellet'i rahatsız etmemeye dikkat ederek dikkatlice aspire edin.Tüpte kalan pelete bir mililitre kloroform metanol çözeltisi ekleyin ve vorteksleyerek iyice karıştırın. Peleti yeniden süspansiyon haline getirmek için santrifüjleyin; kloroform metanol, lipidler gibi hidrofobik bileşikleri ekstrakte eder. Santrifüj işleminden sonra üst fazı uzaklaştırın ve peleti vakumlu santrifüj kullanarak tamamen kurutun; bu işlem, belirli ligandlarla işlenebilecek olan hücre duvarı materyalinin izolasyonunu tamamlar.Burada gösterilen örnek, Arabidopsis gibi dikotil bitkilerin hücre duvarlarında bulunan temel hemiselüloz olan Xlo glukanın çözünür hale getirilmesidir. Xlo glukan, diğer şeker kalıntılarıyla yoğun şekilde sübstitüe edilmiş bir glukan omurgasından oluşan bir polimerdir. Bu polimeri çözünür hale getirmek için fungal bir endo glukan kullanılır. Kurutulmuş izole hücre duvarı peletini 25 µL 50 mM amonyum format (pH 4.5) içinde yeniden süspanse edin ve 0.2 ünite endo glukan ekleyin. Süspansiyonu vorteksleyin ve sıvıyı santrifüjle çöktürün.Tüpü bir karıştırıcıya yerleştirin ve duvarların 37 °C'de, çalkalamalı olarak 16 saat boyunca sindirilmesini sağlayın. 300 RPM hızında. İzole edilmiş hücre duvarının sindirimi tamamlandığında, çözücüyü bir vakumlu santrifüj kullanarak uzaklaştırın ve açığa çıkan oligosakkaritleri kütle spektrometrisi ile analiz etme aşamasına geçin; sindirilmiş örnekten tuzlar ve enzimler, Biox MSD 5 0 1 katyon değişim reçine boncukları kullanılarak uzaklaştırılır.Boncuklar, önce gerekli miktar boş bir kolona yerleştirilip bol miktarda su ile yıkanarak kondisyonlanır. Sindirilmiş ve kurutulmuş numuneye 5 ila 10 adet kondisyonlanmış biox katyon boncuğu ekleyin. Ardından, daha düşük miktardaki materyaller için 10 µL su ekleyin.Beş µL su kullanılabilir. Tüpü kısa süreli olarak santrifüjleyerek boncukları çözeltiye daldırın; sindirim işlemi boncuklarla birlikte gerçekleşirken oda sıcaklığında en az 10 dakika inkübe edin. Bir MALDI hedef plakası üzerine iki µL DHB matrisi damlatın.Matris çözücüsünü vakum altında buharlaştırarak matris kimyasal kristallerinin oluşmasını sağlayın; ardından, hedef plaka üzerindeki matris kristallerinin üzerine iki µL Tuzdan Arındırılmış Sindirim çözeltisi damlatın. Numune matris noktasının çözücüsü tekrar vakum altında buharlaştırılır.Eşlik eden yazılı protokolde ayrıntılı olarak açıklandığı üzere, kristalleşme öncesinde örnek matriks sıvısının karıştırılması için uygun bir sürenin korunması önemlidir. Örnek kuruduktan sonra, hedef plakayı bir MALDI kütle spektrometresine yerleştirin. Cihazı 20,000 volt hızlandırma voltajı ve 350 nanometre gecikme ile pozitif moda ayarlayın.Bu hemiselüloz ligamentleri için seçilen kütle aralığı 500 ile 3000 Dalton arasındadır. Kütle aralığı, beklenen ligamentlerin boyutuna göre modifiye edilmelidir. Lazeri ateşlemeye başlayın ve numune başına, temsilci bir ortalama spektrum oluşturmak için derlenen 100 ila 200 spektrum toplayın.Bu, hemiselüloz oly spektrumudur. Bu videoda gösterilen oly yöntemi, herhangi bir duvar hazırlama adımını atlayarak doğrudan bitki dokusu üzerinde de kullanılabilir. Bu in situ analiz prosedürü, karanlıkta büyütülmüş arabidopsis fideleri üzerinde gösterilmiştir.Numune doğrudan bir hedef plak üzerine yerleştirilir ve plaka üzerindeki kuru fide kuruyana kadar havada kurutulur. İstenilen konumlara 0,5 µL uygun enzim tampon karışımı ekleyin. Enzim damlasının kısmen dokuya ve hedef plaka temas ettiğinden emin olun.Enzim damlacıklarının kurumasını önlemek için MALDI hedef plakasını doygun nem içeren kapalı bir kaba yerleştirin. Plakayı 37 °C'de 16 saat inkübe edin. İnkübasyon süresinin sonunda, enzim lekelerini vakum altında kurutun ve her bir kurumuş enzim lekesinin üzerine 0,5 µL sıvı DHB matriksi ekleyin.Ardından MALDI hedef plakasını vakum altında kurutun. NC'yi analiz etmek için iki örneği, doku örneği enzim matrisi lekeleriyle birlikte hedef plakaya yerleştirin ve izole hücre duvarı örneği için kullanılan ayarların aynısını kullanarak kütle spektrometresinde kütle spektrumlarını kaydedin.Lazeri matris üzerine ateşlemeye başlayın. Doku yanındaki örnek kristallerini seçin. Moleküllerin uçuş süresinin sapmaması için dokunun kendisine isabet ettirmediğinizden emin olun.Nokta başına yaklaşık 20 ila 50 spektrum toplayın ve temsilci bir Ortalama spektrum oluşturmak için bunları derleyin. Bu, AOP'lerde bulunan HemosIL glukanından türetilen oligosakkaritlerin temsilci ortalama spektrumudur. İlgi duyulan tüm iyonların sinyalleri, iyon yoğunlukları veya iyon yükseklikleri %100'e tamamlanarak çeşitli oligosakkaritlerin bağıl bolluğu elde edilir.NC iki OMP yönteminin sonucu benzer sonuçlar vermektedir. Renkli bir daire ile işaretlenmiş her bir enzim sindirim damlacığı bağımsız olarak analiz edilebilir ve ilgili kütle spektrumları elde edilip analiz edilebilir. Uygun bir hidroliz enzimi mevcutsa, Oola ekstraselüler matriksin diğer polimerleri üzerinde de gerçekleştirilebilir.Örnek olarak, bu, biyoenerji ürününde bulunan hemo selüloz silinin oola spektrumudur. Bir mecampus yaprağından alınan materyal xin ile sindirilirken Bayan Canus sunulan verileri elde etmiştir. İyonların yapısal atamaları için lütfen beraberindeki protokole bakınız.Hücre dışı matrislerde oligo kütle profilleme prosedürünü size az önce göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, OV MS analizi için homojen matris sonuçları elde edildiğinde en iyi sonuçların alınabileceğini hatırlamak önemlidir. Hepsi bu kadar.İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

oligo-mass-profiling-olimp-of-extracellular-polysaccharides

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Mikroarray&#39;ler kullanarak Bitki Hücre Duvarı Polimerlerin glukanıdır Profilleme

Kaynak: Hu, Y. ve diğerleri. Endobiyotikler ile İnsan bağırsak mikrobiyotası arasındaki etkileşimlerin In vitro banyo fermantasyon sistemleri kullanılarak analizi. J. Vis. Exp. (2019)Bu video, insan dışkı mikrobiyotası tarafından ekzopolisakkaridlerin (EPS) parçalanmasını değerlendirmek için ince katmanlı kromatografi (TLC) kullanımını göstermektedir. Fermantasyon süpernatantlarındaki EPS parçaları, TLC kullanılarak boyut ve polariteye göre ayrılır, ardından karbonhidrat-spesifik boyama sonrası...

Bakteriyel ekzopolisakkarit bozunmasını değerlendirmek için ince katmanlı kromatografi yapılması

O-bağlı glikanların çeşitliliğini kapsamlı bir şekilde araştırmak için, permetilasyon ve hızlı bir faz bölme yöntemi ile birlikte jel içi indirgeyici β-eliminasyon için yeni bir prosedür, SDS-PAGE tarafından çözülen glikoproteinlerden doğrudan salınan O-bağlı glikanların analizine uygulanır ve kütle spektrometresi ile müteakip glikomik analize uygundur.

Kütle spektrometresi ile In-jel Geliştirilmiş İndirgemeli β-Eleme Kapsamlı O-bağlı ve için Sulfo-Glikomik

Küçük ölçekte mikrobiyal ekzopolisakkaritlerin tanımlanması ve karakterizasyonu için otomatikleştirilmiş modüler yüksek verimli bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, yeni izole edilen bakteri suşlarının veya tüm suş koleksiyonlarının hızlı bir şekilde taranmasını sağlamak için salgılanan polisakkaritlerin toplam miktarını ayrıntılı bir karbonhidrat parmak izi ile analiz etmek için hızlı bir ön seçimi birleştirir.

Otomatik Modüler Yüksek Verimli Ekzopolisakkarit Tarama Platformu Oldukça hassas Karbonhidrat Parmak İzi Analizi ile birleştiğinde

Bu protokol, enzimatik (endoksilanaz) hidrolizden önce RE'yi 2 aminobenzamid ile etiketleyerek ve ardından elde edilen oligosakkaritlerin kütle spektrometresi (MS) ve nükleer manyetik rezonans (NMR) kullanılarak analiz edilmesiyle, heteroksilanların indirgeyici uç (RE) ve iç bölge glikosil dizi(ler)inin yapısal karakterizasyonu için kullanılan spesifik teknikleri açıklar.

Enzimatik, kimyasal (Metilasyon) ve Fiziksel (Kütle Spektrometre, Nükleer Manyetik Rezonans) Teknikleri Kullanarak Bitki Duvar heteroksilanlar sıralanması

Bu kağıt, ECM protein bileşiminin (1) analizi, glikozilasyon yerleri (2) tespit edilmesi ve glıkan formlarının (3) yapısal karakterizasyon için sağlar, MS analizi için kardiyovasküler doku örnekleri hazırlamak için bir yöntem anlatılmaktadır. Bu metodoloji, diğer dokularda ECM'nin çalışma, minör modifikasyonlarla, uygulanabilir.

Hücre dışı Matrix Glycoproteomics: Kütle Spektrometresi kullanarak Sağlam GLİKOPEPTİT Analizi için Bir Yöntem

Bir iletişim kuralı tarafından mannan örnek olarak kullanarak Jel Elektroforez (AKPM), polisakkaritler yapısal analizi için tanımlanır.

Yapısal Mannan hücre duvarı polisakkaritler hızı kullanarak tesislerinde karakterizasyonu

Burada, siyanobakteryal serbest karbonhidrat polimerlerinin izolasyonu ve exoproteomlarının izolasyonu için protokoller açıklanmıştır. Her iki prosedür de, daha fazla analiz veya uygulama için kullanılabilecek yüksek saflık derecelerine sahip Polimerler veya proteinleri elde etmek için önemli adımları somutlaştırmak. Ayrıca, belirli kullanıcı ihtiyaçlarına göre kolayca adapte edilebilir.

Dışa bakıyor: Siyanobacterial serbest karbonhidrat polimerleri ve proteinleri Izolasyonu

Bu protokol, moleküler kütlenin ve lipit membranlarla etkileşime giren makromoleküllerin difüzyon davranışının eşzamanlı olarak araştırılmasını sağlayan iSCAT tabanlı bir görüntü işleme ve tek parçacık izleme yaklaşımını açıklar. Numune hazırlama, kütleden kontrasta dönüştürme, film edinme ve son işleme için adım adım talimatlar, olası tuzakları önlemek için talimatlarla birlikte sağlanır.

Membranla İlişkili Makromolekül Dinamiğini Karakterize Etmek için Kütleye Duyarlı Partikül İzleme

Burada, müsinlerden O-glikanların salınması ve ardından MALDI-TOF kütle spektrometresi kullanılarak tuzdan arındırma, permetilasyon ve analiz için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Matris Destekli Lazer Desorpsiyon/İyonizasyon Uçuş Süresi Kütle Spektrometresi Kullanılarak Permetillenmiş Müsin O-glikanlarının Profillenmesi

Öğrenin bitki hücre duvarı glikostruktürlerinin hızlı ve duyarlı analizi için OLIMP yöntemini. Enzimatik sindirim ve MALDI-TOF/MS kullanarak ekstraselüler matris polisakkaritlerini profilleyin.

Ekstrasellüler polisakkaritler Oligo Kitle Profil (Olimp)

Daha fazla video keşfet