Name: Sabit ve Yaşam Hücreler Sitometrisi ile Calpain Aktivitesi Ölçme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-08T17:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Öğrenin, sabit ve canlı hücrelerde sitometri kullanarak calpain aktivitesini nasıl ölçeceğinizi. Bu yöntem, lösemi ve lenfoma hücrelerinde proteaz aktivitesini analiz etmek için güvenilir bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Kanada Sağlık Araştırma, Lösemi ve Lenfoma Derneği Kanada ve Kanada Lenfoma Vakfı Enstitüleri hibe ile desteklenir.

Reaktifler hazırlayın Not: Tüm PBS içeren Ca 2 + ve Mg 2 + <ol><li> Algılama Reaktif Oda sıcaklığında PBS 20μM 7-amino-4-klorometil kumarin, t-BOC-Leucine-metiyonin amid (BOC-LM-CMAC) ekleyin. Her bir hücre süspansiyonu 2mL algılama reaktif gerekecektir. </li><li> % 1 Paraformaldehit (Sabit Hücreler) Oda sıcaklığında PBS içinde% 4 paraformaldehid stok çözeltinin. % 1 ml 1 paraformaldehid her FACS tüp kısım. Üç FACS tüpleri her deneysel koşul için gereklidir (örneğin 32Dkit, 32Dkit + PD150606, 32Dkit + PD98059 9 FACS tüpleri gerekir) </li><li> PD150606 (calpain inhibitörü) 100 mM nihai konsantrasyonu DMSO içinde sulandırın PD150606. Bu reaktif ve bu deney süresi boyunca ışık ile tedavi edilen tüm hücreleri koruyun. </li><li> PD98059 (MEK1 inhibitörü) 50mm son konsantrasyonu DMSO sulandırın PD98059. </li></ol> Hücreler hazırlayın <ol><li> 5 x 10 Opti-MEM medya ml başına 1 ila 5 x 10 6 hücre% 5 fetal sığır serumu, WEHI-3, IL-3 kaynağı (IL-3 gibi herhangi bir başka kaynak olarak süpernatant ile desteklenmiş 32Dkit hücrelerin büyümesine rekombinant protein gibi),% 0.1 'i 2-merkaptoetanol ve antibiyotikler. </li><li> Üç 15 mL Falcon tüpleri (tüp başına 4 x 10 6 hücre), 12 x 10 6 32Dkit hücreleri toplayın . </li><li> 15 yaşında 5 dakika boyunca 1000 RPM Pelet hücreleri ° C </li><li> Süpernatant aspire. 2mL oda sıcaklığında PBS içinde hücreler tekrar </li><li> 50μM PD150606 bir hücre süspansiyonu davranın. Örnek Falcon tüp alüminyum folyo ile kaplayarak ışıktan korumalı olduğundan emin olun. Vortex karanlıkta, oda sıcaklığında kısa bir süre sonra yirmi ila otuz dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 20μM PD98059 ile ikinci hücre süspansiyonu davranın. Plaka 37, 2 saat boyunca 35mm doku kültürü çanak ve inkübe hücrelerin ° C </li></ol> Sabit Hücreler Calpain Testi <ol><li> Örnekleri PD150606 kuluçka calpain tahlil, tedavi edilmeyen numuneler üzerinde başlar. Her hücre süspansiyonu 2mL algılama reaktif ekleyerek başlayın. % 1 paraformaldehid (0 dakika zaman noktası) ile hemen önceden hazırlanmış FACS tüpler için 1 ml hücre süspansiyonu / algılama reaktif karışımı ekleyin. </li><li> Hücre süspansiyonları oda sıcaklığında 5 dakika boyunca algılama reaktifi ile inkübe edin. Daha sonra 1 ml% 1 paraformaldehid ile hücre süspansiyonu FACS tüpüne 1 ml ekleyin. </li><li> Algılama karışımı ile hücre süspansiyonları ek bir 5 dakika oda sıcaklığında inkübe devam edin. Daha sonra 1 ml% 1 paraformaldehid ile hücre süspansiyonu FACS tüpüne 1 ml ekleyin. </li><li> Inhibitörleri ile tedavi edilmiştir 32Dkit hücreleri calpain tahlil tekrarlayın. </li><li> Fix karanlık gecede hücreleri 4 ° C </li><li> Ertesi gün pelet 5 dakika boyunca 1800 RPM hücreleri 15 ° C </li><li> Süpernatant aspire. 750uL PBS hücrelerin yeniden süspanse edin. Buz üzerinde hücrelerini koyun ve karanlıkta tutmak. </li></ol> Sabit Hücreleri için Veri Edinme <ol><li> LSR II (BD Bioscience) kullanarak hücrelerin analiz edin. Filtreler Lightwave Xcyte (UV) lazer, uyarma hattı 355nm ve lazer gücü 25mW, substrat ve ürün için sırasıyla 405 ve 450 nm emisyon için ayarlanır. Substrat ve ürün Band geçiren filtreler, 405/20 ve 450/50. Uzun geçiren filtreler substrat ve ürün için 405 ve 450. PMT gerilim ürün için substrat için 350-375 ve 325-350 kurulmuştur. </li><li> Yan dağılım; Hint-1 Mavi (log); Mor Hint-1 (log) forward scatter: Aşağıdaki parametreler ile BD FACSDiva deney set-up. Forward scatter canlı hücreler üzerinde kapısı (Şekil 1a), Hint-1 Mavi histogram, Hint-1 Mor histogram, Hint-1 Mavi vs Hint-1 Menekşe ile yan dağılım nokta arsa vs: Çalışma sayfasında aşağıdaki grafikler nokta arsa. </li><li> LSR AlignFlow ve AlignFlow II artı floresan boncuk (Invitrogen) kalibre edin. PMT gerilim her deneyde önce aynı kanalda boncuk floresan histogramın zirvesine yerleştirmek için ayarlanabilir olmalıdır. </li><li> 0 dakika zaman noktada 32Dkit hücreleri kullanarak veri edinme başlayın. Gerekli parametre gerilimler ayarlayın. Edinin ve örnek başına 10.000 olayları kaydetmek. </li><li> Her tüp arasındaki FACS tamponu ile makine durulama, her bir numune için elde tekrarlayın. </li><li> İhracat verileri. Emin olun LSR II enstitü kurallarına göre temizlenir. </li></ol> Canlı Hücrelerde Calpain Testi <ol><li> Hiçbir PD150606, yukarıdaki gibi hücre süspansiyonları hazırlayın. LSR II örnekleri getirin ve yukarıdaki gibi filtreler ve parametrelerini ayarlamak. Yukarıdaki gibi çalışma sayfası ayarlayın. Hint-1 Mavi vs gösteren büyük bir nokta arsa dahil. Maksimum sayı elde etmek için programı ayarlayabilirsiniz.olaylar ber (durak kapısı). </li><li> 32Dkit hücreleri 50μM PD150606 bir hücre süspansiyonu ekleyin. Karanlıkta örnek tutun ve 20-30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Hiçbir PD150606 32Dkit hücre süspansiyonu elde başlayın. Düşük akış hızı saniyede 200-300 olayların kullanın. Tüp 30 saniye ile 1 dakika sonra makineden çıkarın. 20μM BOC-LM-CMAC hücrelere ekleyin. Vortex kısa bir süre sonra veri edinmeye devam. </li><li> 10-20 dakika veya calpain etkinliği yaylalarda kadar veri elde. </li><li> PD150606 ile tedavi 32Dkit hücreleri ile 3. ve 4. adımları tekrarlayın. </li><li> İhracat verileri. Emin olun LSR II enstitü kurallarına göre temizlenir. </li></ol> Kompleks (Karışık) Cep Popülasyonlar Calpain Testi * Bu deney, bir fare dalak hasat bir hücre süspansiyonu 32Dkit hücreleri belirleyecektir. <ol><li> Hasat her fare dalak. NH 4 Cl ile oda sıcaklığında 10 dakika süreyle kırmızı kan hücresi Lyse. </li><li> 2mL PBS tek hücre süspansiyonları hazırlayın. </li><li> Her iki hücre süspansiyonu bölün. 20-30 dakika karanlıkta, oda sıcaklığında 1 hücre süspansiyonu 50μM PD150606 davranın. </li><li> Sabit Hücrelerde Calpain Assay (Adımlar 1-6) için yukarıda açıklandığı gibi devam edin </li><li> Süpernatant aspire. 500μL PBS hücrelerin yıkayın. Süpernatant aspire. </li><li> % 2 BSA ile 200μL boyama tamponu hücrelerin tekrar Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. </li><li> Birincil antikor (FITC anti-fare CD117) hazırlayın. Antikor tampon boyama 1:200 dilüsyon kullanılmalıdır. Antikor karanlıkta tutulur emin olun. </li><li> Hücrelere 200μL primer antikor ekleyin. Karanlık oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. </li><li> Flow sitometri için hacmini artırmak 400μL PBS ekleyin. Hücreleri buz koyun ve karanlıkta tutmak. </li><li> Sabit Hücreleri için Veri Edinme açıklandığı gibi devam edin. Parametrelere FITC ekleyin ve FITC için çalışma sayfasındaki bir histogram dahil. </li></ol> Analiz ve Temsilcisi Sonuçlar <ol><li> FlowJo (Treestar) kullanarak verileri analiz edin. Ileri ve yan dağılım profili (Şekil 1a) göre canlı hücreler üzerinde Kapısı. Canlı hücre kapısı (Şekil 1b) Hint-Blue ortalama floresan belirleyin. </li><li> Karışık Hücre Nüfus a) <ul><li> 32Dkit nüfusu tanımlamak için histogramlar ve nokta araziler FITC floresanı </li><li> Hint-Mavi 32Dkit nüfusun ortalama floresan belirleyin </li></ul></li><li> Microsoft Excel grafik ortalama floresan (Şekil 2a) kullanın. 5 ve 10 dakika arasında çizginin eğimi hesaplayın. Grafik eğimi (Şekil 2b) hücrelerinde calpain etkinliğini belirlemek için bir çubuk grafik olarak. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig1a.jpg" alt="Şekil 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1a"> Şekil 1a ileri ve yan dağılım profiline göre canlı hücreler belirlenmesi. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig1b.jpg" alt="Şekil 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1b"> Şekil 1b 10 dakikalık bir süre boyunca ortalama floresan değişimi. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig2a.jpg" alt="Şekil 2a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2a"> Şekil 2a ortalama floresan Temsilcisi grafik. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig2b.jpg" alt="Şekil 2b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2b"> Inhibitörleri ile 32Dkit hücreler Şekil 2b. Calpain aktivite.

<ol><li>Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).</li>
<li>Niapour, M., Berger, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometric+Measurement+of+Calpain+Activity+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells.</a> Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).</li>
<li>Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+ERK%2FMAP+kinase+signalling+pathway+in+milli-calpain+activation+and+myogenic+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Involvement of the ERK/MAP kinase signalling pathway in milli-calpain activation and myogenic cell migration.</a> The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39, 1177-1189 (2007).</li>
</ol>

Bu video protokolü sabit ve yaşam 32Dkit hücrelerinde calpain aktivite tespit edilmiştir. Calpain inhibitörü PD150606 ile hücre hattı Tedavi, hücrelerin calpain aktivitesinin inhibisyonu ile sonuçlandı. Buna ek olarak, MEK1 inhibitörü PD98059 tedavisi, hücrelerin calpain aktivitesinin inhibisyonu ile sonuçlandı. ERK calpain-2 (3) büyük bir aktivatör. Bu sonuçlar calpain-2 aktivitesinin 32Dkit hücreleri baskın olduğunu düşündürmektedir. Laboratuvarımızda Şu çalışmalar artmış calpain aktivite lösemi calpain-1 v...

<table><tbody><tr><td>PBS BOC-LM-CMAC %4 paraformaldehit</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;4g paraformaldehidi 100mL PBS içinde çözün. Çeker ocak altında, numuneyi berraklaşana kadar karıştırarak ısıtın.&lt;br/&gt;Soğumaya bırakın ve ardından 4°C'de saklayın&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>PD150606</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Maksimum kalpain inhibisyonu için yeni hazırlanmış PD150606 kullanın.</td></tr><tr><td>PD98059</td><td>Cell Signaling Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AlignFlow, floresan boncuklu AlignFlow plus FACS tüpleri</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>&lt;br/&gt;Bu deneylerde, WEHI-3 hücrelerinin süpernatantı IL-3 kaynağı olarak kullanılmıştır. WEHI-3 süpernatantının her bir toplama işlemi, 32Dkit hücre büyümesi için kullanılan optimal konsantrasyonu belirlemek amacıyla titre edilmektedir. </td></tr></tbody></table>

sabit ve yaşam hücreler sitometrisi ile calpain aktivitesi Ölçme

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains her yerde hücre içi kalsiyum duyarlı, nötr sistein proteazlar<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpains sinyalizasyon, sitoskeletal yeniden şekillenme, gen ekspresyonu, apoptozis düzenlenmesi ve hücre döngüsünün ilerlemesi de dahil olmak üzere birçok fizyolojik süreçleri, önemli rol oynarlar<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpains kas distrofiler, kanser, diyabet, Alzheimer hastalığı ve multipl skleroz gibi birçok patolojiler suçlanmıştır<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpain yönetmelik karmaşık ve tam olarak anlaşılamamıştır. mRNA ve protein düzeyleri calpain aktivitesini ölçmek için gen veya protein anlatım tekniklerinin kullanımı sınırlayıcı, aktivite ile zayıf ilişkilidir. Bu video protokol detayları calpain aktivitesini ölçmek için sabit ve canlı hücrelerin laboratuvar, bir akım sitometrik tahlil gelişti. Bu yöntem, calpain özellikle bölünmüş floresan substrat BOC-LM-CMAC, calpain aktivitesini ölçmek için kullanır.<sup&gt; 2</sup&gt; Bu video, sabit ve yaşayan bir fare 32Dkit lösemi hücrelerinin, tek başına veya bir splenocyte nüfusun bir parçası olarak faaliyet calpain bir LSRII (BD Bioscience) ile ölçülür. 32Dkit hücrelerin artmış aktivite normal dalak olduğu gösterilmiştir.

Bu makale, flow sitometri kullanarak sabit ve canlı hücrelerin calpain aktivitesini ölçmek için ayrıntılı protokol.

Sabit ve Yaşam Hücreler Sitometrisi ile Calpain Aktivitesi Ölçme

Kalpainler, yaygın olarak bulunan hücre içi, kalsiyuma duyarlı, nötral sisteink proteazlardır 1. Kalpainler birçok fizyolojik süreçte kritik roller oynamaktadır, ...

Kalpainler; sinyalleme, hücre iskeleti yeniden şekillenmesi, gen ekspresyonunun düzenlenmesi, apoptoz ve hücre döngüsü ilerlemesi dahil olmak üzere birçok fizyolojik süreçte kritik roller oynayan, yaygın, hücre içi kalsiyuma duyarlı, nötr kistein proteazlardır. Sabitlenmiş ve canlı hücrelerde kalpain aktivitesini ölçmek için floresan substrat BUC, LMC MAC eklenir. Buc LMC MAC spesifik olarak kalpain tarafından parçalanır ve bu durum floresan artışıyla sonuçlanır. Floresanstaki değişim, 30 2D kit hücrelerinde normal sitlere kıyasla artmış kalpain aktivitesini ortaya koyan akış sitometrisi ile izlenir.Merhaba, ben Toronto Üniversitesi İmmünoloji Bölümü ve Üniversite Sağlık Ağı'ndaki Dr. Stewart Berger'in laboratuvarından Christina Farr. Bugün size, akış sitometrisi tabanlı bir analiz kullanarak fikse edilmiş ve canlı hücrelerde calpain aktivitesinin nasıl ölçüleceğini göstereceğim. Laboratuvarımızda bu analizi lösemi ve lenfoma hücrelerindeki calpain aktivitesini incelemek için kullanıyoruz.Öyleyse başlayalım. Deneylere başlamadan önce, %1 paraformaldehit, kalsipain inhibitörü PD 150606 ve MEC1 inhibitörü PD 98059 dahil olmak üzere gerekli reaktifleri hazırlayın. Bu reaktiflerin hazı

measuring-calpain-activity-in-fixed-and-living-cells-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, nöronal hücrelerin mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri, mitokondriyal DNA ile ilişkili protein ve mitokondriyal dış zar proteini için antikorlarla etiketlenmesini ve ardından seviyelerini ölçmek için akış sitometrisini göstermektedir.

Nöronlarda Çoklu Mitokondriyal Parametrelerin Flow Sitometri Kullanılarak Ölçülmesi

Hücre içi Ca Ölçme<sup&gt; 2 +</supDört Teknikleri ile İnsan rm&gt; Değişiklikler: Konvansiyonel Florometre, Akış Florometre, Sitometrisi ve Tek Hücre Görüntüleme Durduruldu

Bu protokol, hassas, hücre bazlı bir sitotoksisite testini tanımlar. Artan sayıda efektör CD8 + T hücresinin varlığında canlı hedef CD4 + T hücrelerinin frekansındaki azalmayı numaralandırarak, bu test antijene özgü CD8 + T hücrelerinin sitolitik aktivitesinin doğrudan değerlendirilmesine izin verir.

Sitotoksik Aktiviteyi Ölçmek için Hücre Bazlı Akış Sitometrisi Testi

Kalsiyum çeşitli fizyolojik ve patofizyolojik sinyal yollarında rol oynamaktadır. Canlı hücre görüntüleme özel ekipman gerektirir ve zaman alıcı olabilir. Süspansiyon haline getirilmiştir yapışık epitel hücrelerinde sitozolik kalsiyum göreli değişiklikleri belirlemek için bir akış Sitometreyi kullanarak hızlı, basit bir yöntem optimize edilmiştir.

Sitometrisi ile Böbrek Hücrelerine sitozolik kalsiyum Ölçümleri

Kalıtsal kardiyak aritmiler genellikle bir veya daha fazla iyon kanallarının yüzey teslim değiştiren mutasyonlar neden olur. Burada, TSA-201 hücrelerinde eksprese edilen rekombinant iyon kanallarının göreli ve toplam hücre yüzeyi protein ekspresyonunun bir ölçümünü sağlamak için tahliller flow sitometri uyum sağlar.

Akım Sitometri Kullanımı rekombinant İyon Kanallarının göreli Hücre Yüzey ve toplam İfade tayini

Mitophagy, mitokondri, seçici bozulması mitokondrial homeostazı karıştığı ve çeşitli insan hastalıklarda deregüle. Ancak, mitophagy etkinliğini ölçmek için uygun deneysel yöntemleri çok sınırlıdır. Burada, biz hassas bir tahlil akış sitometresi kullanarak mitophagy etkinliğini ölçmek için sağlar.

Hassas ölçüm Mitophagy floresan muhabir akış sitometresi kullanarak pH bağımlı mt-Keima tarafından

Efferocytosis, apoptotik hücreler, fagositik kaldırılması homeostazı korumak için gerekli ve reseptörleri ve tanıma, engulfment ve apoptotik hücreler içselleştirilmesi için izin sinyal yollar tarafından yönetilir. Burada, biz efferocytosis miktar ve efferocytic sinyal yolları etkinlik için bir floresans mikroskobu Protokolü mevcut.

Efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar

Tek hücreli duyarlılığı sağlayarak, gerçek zamanlı Akış Sitometresi multimodal reseptör işlevleri canlı kültürlerin ölçmek için benzersiz olarak uygundur. Yetişkin nöral progenitör hücreler kullanarak, P2X7 reseptör işlevi tarafından elde kalsiyum göstergesi boya, transmembran gözenek oluşumu etidyum bromür alımı ve floresan lateks boncuk kullanarak fagositoz ile kalsiyum akını ile değerlendirildi.

Kalsiyum akını, gözenek oluşumu ve P2X7 reseptörleri yetişkin nöral progenitör hücreler tarafından fagositoz araştırmak için gerçek zamanlı canlı hücre Akış Sitometresi

Burada, proteinlerin hücre zarları veya mikro-parçacıklarla etkileşimini karakterize etmek için bir dizi yöntem açıklıyoruz.

Floresan Etiketli Proteinlerin Yapay Fosfolipid Mikrovezikülleri ile Etkileşiminin Kantitatif Akış Sitometrisi Kullanılarak Analiz Edilmesi

Mevcut protokol, akış sitometrisi veya spektroflorometre kullanarak florojenik bir substrat yoluyla kaspaz aktivitesini ölçmek için iki yöntem tanımlamaktadır.

Florometrik Tahlil veya Akış Sitometrisi Kullanarak Kaspaz Aktivitesinin Ölçülmesi

Burada, maya örneklerinde stres sonrası sağkalımı ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Test, plazma zarı bütünlüğünü ölçmek için SYTO 9 ve propidyum iyodür (PI) olmak üzere iki floresan boya kullanır. Oksidatif stres sonrası numuneler için canlı, ölü ve hasarlı hücre fraksiyonlarının kantitatif ve tekrarlanabilir tahminlerini sağlamak için akış sitometrisi kullanır.

Maya Hücrelerinde Stres Sonrası Sağkalımı Ölçmek için Akış Sitometrisi ile Birleştirilmiş Optimize Edilmiş Bir CANLI / ÖLÜ Testi

Öğrenin, sabit ve canlı hücrelerde sitometri kullanarak calpain aktivitesini nasıl ölçeceğinizi. Bu yöntem, lösemi ve lenfoma hücrelerinde proteaz aktivitesini analiz etmek için güvenilir bir protokol sunar.

Sabit ve Yaşam Hücreler Sitometrisi ile Calpain Aktivitesi Ölçme

Daha fazla video keşfet