Name: Sabit ve Yaşam Hücreler Sitometrisi ile Calpain Aktivitesi Ölçme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-08T17:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Öğrenin, sabit ve canlı hücrelerde sitometri kullanarak calpain aktivitesini nasıl ölçeceğinizi. Bu yöntem, lösemi ve lenfoma hücrelerinde proteaz aktivitesini analiz etmek için güvenilir bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Kanada Sağlık Araştırma, Lösemi ve Lenfoma Derneği Kanada ve Kanada Lenfoma Vakfı Enstitüleri hibe ile desteklenir.

Reaktifler hazırlayın Not: Tüm PBS içeren Ca 2 + ve Mg 2 + <ol><li> Algılama Reaktif Oda sıcaklığında PBS 20μM 7-amino-4-klorometil kumarin, t-BOC-Leucine-metiyonin amid (BOC-LM-CMAC) ekleyin. Her bir hücre süspansiyonu 2mL algılama reaktif gerekecektir. </li><li> % 1 Paraformaldehit (Sabit Hücreler) Oda sıcaklığında PBS içinde% 4 paraformaldehid stok çözeltinin. % 1 ml 1 paraformaldehid her FACS tüp kısım. Üç FACS tüpleri her deneysel koşul için gereklidir (örneğin 32Dkit, 32Dkit + PD150606, 32Dkit + PD98059 9 FACS tüpleri gerekir) </li><li> PD150606 (calpain inhibitörü) 100 mM nihai konsantrasyonu DMSO içinde sulandırın PD150606. Bu reaktif ve bu deney süresi boyunca ışık ile tedavi edilen tüm hücreleri koruyun. </li><li> PD98059 (MEK1 inhibitörü) 50mm son konsantrasyonu DMSO sulandırın PD98059. </li></ol> Hücreler hazırlayın <ol><li> 5 x 10 Opti-MEM medya ml başına 1 ila 5 x 10 6 hücre% 5 fetal sığır serumu, WEHI-3, IL-3 kaynağı (IL-3 gibi herhangi bir başka kaynak olarak süpernatant ile desteklenmiş 32Dkit hücrelerin büyümesine rekombinant protein gibi),% 0.1 'i 2-merkaptoetanol ve antibiyotikler. </li><li> Üç 15 mL Falcon tüpleri (tüp başına 4 x 10 6 hücre), 12 x 10 6 32Dkit hücreleri toplayın . </li><li> 15 yaşında 5 dakika boyunca 1000 RPM Pelet hücreleri ° C </li><li> Süpernatant aspire. 2mL oda sıcaklığında PBS içinde hücreler tekrar </li><li> 50μM PD150606 bir hücre süspansiyonu davranın. Örnek Falcon tüp alüminyum folyo ile kaplayarak ışıktan korumalı olduğundan emin olun. Vortex karanlıkta, oda sıcaklığında kısa bir süre sonra yirmi ila otuz dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 20μM PD98059 ile ikinci hücre süspansiyonu davranın. Plaka 37, 2 saat boyunca 35mm doku kültürü çanak ve inkübe hücrelerin ° C </li></ol> Sabit Hücreler Calpain Testi <ol><li> Örnekleri PD150606 kuluçka calpain tahlil, tedavi edilmeyen numuneler üzerinde başlar. Her hücre süspansiyonu 2mL algılama reaktif ekleyerek başlayın. % 1 paraformaldehid (0 dakika zaman noktası) ile hemen önceden hazırlanmış FACS tüpler için 1 ml hücre süspansiyonu / algılama reaktif karışımı ekleyin. </li><li> Hücre süspansiyonları oda sıcaklığında 5 dakika boyunca algılama reaktifi ile inkübe edin. Daha sonra 1 ml% 1 paraformaldehid ile hücre süspansiyonu FACS tüpüne 1 ml ekleyin. </li><li> Algılama karışımı ile hücre süspansiyonları ek bir 5 dakika oda sıcaklığında inkübe devam edin. Daha sonra 1 ml% 1 paraformaldehid ile hücre süspansiyonu FACS tüpüne 1 ml ekleyin. </li><li> Inhibitörleri ile tedavi edilmiştir 32Dkit hücreleri calpain tahlil tekrarlayın. </li><li> Fix karanlık gecede hücreleri 4 ° C </li><li> Ertesi gün pelet 5 dakika boyunca 1800 RPM hücreleri 15 ° C </li><li> Süpernatant aspire. 750uL PBS hücrelerin yeniden süspanse edin. Buz üzerinde hücrelerini koyun ve karanlıkta tutmak. </li></ol> Sabit Hücreleri için Veri Edinme <ol><li> LSR II (BD Bioscience) kullanarak hücrelerin analiz edin. Filtreler Lightwave Xcyte (UV) lazer, uyarma hattı 355nm ve lazer gücü 25mW, substrat ve ürün için sırasıyla 405 ve 450 nm emisyon için ayarlanır. Substrat ve ürün Band geçiren filtreler, 405/20 ve 450/50. Uzun geçiren filtreler substrat ve ürün için 405 ve 450. PMT gerilim ürün için substrat için 350-375 ve 325-350 kurulmuştur. </li><li> Yan dağılım; Hint-1 Mavi (log); Mor Hint-1 (log) forward scatter: Aşağıdaki parametreler ile BD FACSDiva deney set-up. Forward scatter canlı hücreler üzerinde kapısı (Şekil 1a), Hint-1 Mavi histogram, Hint-1 Mor histogram, Hint-1 Mavi vs Hint-1 Menekşe ile yan dağılım nokta arsa vs: Çalışma sayfasında aşağıdaki grafikler nokta arsa. </li><li> LSR AlignFlow ve AlignFlow II artı floresan boncuk (Invitrogen) kalibre edin. PMT gerilim her deneyde önce aynı kanalda boncuk floresan histogramın zirvesine yerleştirmek için ayarlanabilir olmalıdır. </li><li> 0 dakika zaman noktada 32Dkit hücreleri kullanarak veri edinme başlayın. Gerekli parametre gerilimler ayarlayın. Edinin ve örnek başına 10.000 olayları kaydetmek. </li><li> Her tüp arasındaki FACS tamponu ile makine durulama, her bir numune için elde tekrarlayın. </li><li> İhracat verileri. Emin olun LSR II enstitü kurallarına göre temizlenir. </li></ol> Canlı Hücrelerde Calpain Testi <ol><li> Hiçbir PD150606, yukarıdaki gibi hücre süspansiyonları hazırlayın. LSR II örnekleri getirin ve yukarıdaki gibi filtreler ve parametrelerini ayarlamak. Yukarıdaki gibi çalışma sayfası ayarlayın. Hint-1 Mavi vs gösteren büyük bir nokta arsa dahil. Maksimum sayı elde etmek için programı ayarlayabilirsiniz.olaylar ber (durak kapısı). </li><li> 32Dkit hücreleri 50μM PD150606 bir hücre süspansiyonu ekleyin. Karanlıkta örnek tutun ve 20-30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Hiçbir PD150606 32Dkit hücre süspansiyonu elde başlayın. Düşük akış hızı saniyede 200-300 olayların kullanın. Tüp 30 saniye ile 1 dakika sonra makineden çıkarın. 20μM BOC-LM-CMAC hücrelere ekleyin. Vortex kısa bir süre sonra veri edinmeye devam. </li><li> 10-20 dakika veya calpain etkinliği yaylalarda kadar veri elde. </li><li> PD150606 ile tedavi 32Dkit hücreleri ile 3. ve 4. adımları tekrarlayın. </li><li> İhracat verileri. Emin olun LSR II enstitü kurallarına göre temizlenir. </li></ol> Kompleks (Karışık) Cep Popülasyonlar Calpain Testi * Bu deney, bir fare dalak hasat bir hücre süspansiyonu 32Dkit hücreleri belirleyecektir. <ol><li> Hasat her fare dalak. NH 4 Cl ile oda sıcaklığında 10 dakika süreyle kırmızı kan hücresi Lyse. </li><li> 2mL PBS tek hücre süspansiyonları hazırlayın. </li><li> Her iki hücre süspansiyonu bölün. 20-30 dakika karanlıkta, oda sıcaklığında 1 hücre süspansiyonu 50μM PD150606 davranın. </li><li> Sabit Hücrelerde Calpain Assay (Adımlar 1-6) için yukarıda açıklandığı gibi devam edin </li><li> Süpernatant aspire. 500μL PBS hücrelerin yıkayın. Süpernatant aspire. </li><li> % 2 BSA ile 200μL boyama tamponu hücrelerin tekrar Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. </li><li> Birincil antikor (FITC anti-fare CD117) hazırlayın. Antikor tampon boyama 1:200 dilüsyon kullanılmalıdır. Antikor karanlıkta tutulur emin olun. </li><li> Hücrelere 200μL primer antikor ekleyin. Karanlık oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. </li><li> Flow sitometri için hacmini artırmak 400μL PBS ekleyin. Hücreleri buz koyun ve karanlıkta tutmak. </li><li> Sabit Hücreleri için Veri Edinme açıklandığı gibi devam edin. Parametrelere FITC ekleyin ve FITC için çalışma sayfasındaki bir histogram dahil. </li></ol> Analiz ve Temsilcisi Sonuçlar <ol><li> FlowJo (Treestar) kullanarak verileri analiz edin. Ileri ve yan dağılım profili (Şekil 1a) göre canlı hücreler üzerinde Kapısı. Canlı hücre kapısı (Şekil 1b) Hint-Blue ortalama floresan belirleyin. </li><li> Karışık Hücre Nüfus a) <ul><li> 32Dkit nüfusu tanımlamak için histogramlar ve nokta araziler FITC floresanı </li><li> Hint-Mavi 32Dkit nüfusun ortalama floresan belirleyin </li></ul></li><li> Microsoft Excel grafik ortalama floresan (Şekil 2a) kullanın. 5 ve 10 dakika arasında çizginin eğimi hesaplayın. Grafik eğimi (Şekil 2b) hücrelerinde calpain etkinliğini belirlemek için bir çubuk grafik olarak. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig1a.jpg" alt="Şekil 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1a"> Şekil 1a ileri ve yan dağılım profiline göre canlı hücreler belirlenmesi. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig1b.jpg" alt="Şekil 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1b"> Şekil 1b 10 dakikalık bir süre boyunca ortalama floresan değişimi. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig2a.jpg" alt="Şekil 2a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2a"> Şekil 2a ortalama floresan Temsilcisi grafik. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig2b.jpg" alt="Şekil 2b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2b"> Inhibitörleri ile 32Dkit hücreler Şekil 2b. Calpain aktivite.

<ol><li>Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).</li>
<li>Niapour, M., Berger, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometric+Measurement+of+Calpain+Activity+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells.</a> Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).</li>
<li>Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+ERK%2FMAP+kinase+signalling+pathway+in+milli-calpain+activation+and+myogenic+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Involvement of the ERK/MAP kinase signalling pathway in milli-calpain activation and myogenic cell migration.</a> The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39, 1177-1189 (2007).</li>
</ol>

Bu video protokolü sabit ve yaşam 32Dkit hücrelerinde calpain aktivite tespit edilmiştir. Calpain inhibitörü PD150606 ile hücre hattı Tedavi, hücrelerin calpain aktivitesinin inhibisyonu ile sonuçlandı. Buna ek olarak, MEK1 inhibitörü PD98059 tedavisi, hücrelerin calpain aktivitesinin inhibisyonu ile sonuçlandı. ERK calpain-2 (3) büyük bir aktivatör. Bu sonuçlar calpain-2 aktivitesinin 32Dkit hücreleri baskın olduğunu düşündürmektedir. Laboratuvarımızda Şu çalışmalar artmış calpain aktivite lösemi calpain-1 v...

<table><tbody><tr><td>PBS BOC-LM-CMAC %4 paraformaldehit</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;4g paraformaldehidi 100mL PBS içinde çözün. Çeker ocak altında, numuneyi berraklaşana kadar karıştırarak ısıtın.&lt;br/&gt;Soğumaya bırakın ve ardından 4°C'de saklayın&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>PD150606</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Maksimum kalpain inhibisyonu için yeni hazırlanmış PD150606 kullanın.</td></tr><tr><td>PD98059</td><td>Cell Signaling Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AlignFlow, floresan boncuklu AlignFlow plus FACS tüpleri</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>&lt;br/&gt;Bu deneylerde, WEHI-3 hücrelerinin süpernatantı IL-3 kaynağı olarak kullanılmıştır. WEHI-3 süpernatantının her bir toplama işlemi, 32Dkit hücre büyümesi için kullanılan optimal konsantrasyonu belirlemek amacıyla titre edilmektedir. </td></tr></tbody></table>

sabit ve yaşam hücreler sitometrisi ile calpain aktivitesi Ölçme

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains her yerde hücre içi kalsiyum duyarlı, nötr sistein proteazlar<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpains sinyalizasyon, sitoskeletal yeniden şekillenme, gen ekspresyonu, apoptozis düzenlenmesi ve hücre döngüsünün ilerlemesi de dahil olmak üzere birçok fizyolojik süreçleri, önemli rol oynarlar<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpains kas distrofiler, kanser, diyabet, Alzheimer hastalığı ve multipl skleroz gibi birçok patolojiler suçlanmıştır<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpain yönetmelik karmaşık ve tam olarak anlaşılamamıştır. mRNA ve protein düzeyleri calpain aktivitesini ölçmek için gen veya protein anlatım tekniklerinin kullanımı sınırlayıcı, aktivite ile zayıf ilişkilidir. Bu video protokol detayları calpain aktivitesini ölçmek için sabit ve canlı hücrelerin laboratuvar, bir akım sitometrik tahlil gelişti. Bu yöntem, calpain özellikle bölünmüş floresan substrat BOC-LM-CMAC, calpain aktivitesini ölçmek için kullanır.<sup&gt; 2</sup&gt; Bu video, sabit ve yaşayan bir fare 32Dkit lösemi hücrelerinin, tek başına veya bir splenocyte nüfusun bir parçası olarak faaliyet calpain bir LSRII (BD Bioscience) ile ölçülür. 32Dkit hücrelerin artmış aktivite normal dalak olduğu gösterilmiştir.

Bu makale, flow sitometri kullanarak sabit ve canlı hücrelerin calpain aktivitesini ölçmek için ayrıntılı protokol.

Sabit ve Yaşam Hücreler Sitometrisi ile Calpain Aktivitesi Ölçme

Kalpainler, yaygın olarak bulunan hücre içi, kalsiyuma duyarlı, nötral sisteink proteazlardır 1. Kalpainler birçok fizyolojik süreçte kritik roller oynamaktadır, ...

Kalpainler; sinyalleme, hücre iskeleti yeniden şekillenmesi, gen ekspresyonunun düzenlenmesi, apoptoz ve hücre döngüsü ilerlemesi dahil olmak üzere birçok fizyolojik süreçte kritik roller oynayan, yaygın, hücre içi kalsiyuma duyarlı, nötr kistein proteazlardır. Sabitlenmiş ve canlı hücrelerde kalpain aktivitesini ölçmek için floresan substrat BUC, LMC MAC eklenir. Buc LMC MAC spesifik olarak kalpain tarafından parçalanır ve bu durum floresan artışıyla sonuçlanır. Floresanstaki değişim, 30 2D kit hücrelerinde normal sitlere kıyasla artmış kalpain aktivitesini ortaya koyan akış sitometrisi ile izlenir.Merhaba, ben Toronto Üniversitesi İmmünoloji Bölümü ve Üniversite Sağlık Ağı'ndaki Dr. Stewart Berger'in laboratuvarından Christina Farr. Bugün size, akış sitometrisi tabanlı bir analiz kullanarak fikse edilmiş ve canlı hücrelerde calpain aktivitesinin nasıl ölçüleceğini göstereceğim. Laboratuvarımızda bu analizi lösemi ve lenfoma hücrelerindeki calpain aktivitesini incelemek için kullanıyoruz.Öyleyse başlayalım. Deneylere başlamadan önce, %1 paraformaldehit, kalsipain inhibitörü PD 150606 ve MEC1 inhibitörü PD 98059 dahil olmak üzere gerekli reaktifleri hazırlayın. Bu reaktiflerin hazırlanışına ilişkin ayrıntılar için lütfen ekteki yazılı protokole bakın. Her bir FACS tüpüne 1 mL %1 paraformaldehit ekleyin.Bu videoda gösterilen fikse edilmiş hücreler için her bir deneysel koşul başına üç fax tüpü gereklidir. Üç koşul test edildiğinden, toplamda dokuz fax tüpü gerekmektedir. Optimum medyada büyütülen, mililitre başına 0.5 ila 1 × 10⁶ hücre yoğunluğundaki 32 dki hücreleri ile başlayın.Fetal bovine serum, IL-3, tumor necrosis factor-alpha, etanol ve antibiyotiklerle desteklenmiştir. Her bir 15 ml'lik falcon tüpüne 4 × 10⁶ hücre aktarın. Tüpleri santrifüje yerleştirin ve 15 °C'de 5 dakika boyunca 225 ×g'de döndürerek hücreleri çöktürün.Santrifüj işleminden sonra süpernatantı aspire edin ve hücreleri iki mililitre oda sıcaklığındaki PBS içinde yeniden süspanse edin; bir hücre süspansiyonunu 50 micromolar calpain inhibitörü PD 1 50 0 6 0 6 ile muamele edin. Tüpü alüminyum folyo ile kaplayarak örneğin ışıktan korunduğundan emin olun. Kısaca vorteksleyin ve ardından karanlıkta, oda sıcaklığında 20 ila 30 dakika inkübe edin.İkinci hücre süspansiyonunu 20 µM MEK inhibitörü PD 98059 ile işleme tabi tutun. Hücreleri 35 mm'lik bir doku kültürü kabına ekleyin ve örnekler inkübe olurken onları 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. İşlem görmemiş örnekler üzerinde Calpain analizine başlayın.Hücre süspansiyonuna iki mililitre tespit reaktifi ekleyerek başlayın. T sıfır örneğini oluşturmak için hücre süspansiyonu ile tespit reaktifi karışımından bir mililitreyi önceden hazırlanmış faks tüplerine hemen ekleyin. Tespit reaktifli hücre süspansiyonlarını beş dakika boyunca inkübe edin.Oda sıcaklığında, T eşittir 5 örneğini oluşturmak için, önceden hazırlanmış 1% paraformaldehit içeren faks tüpüne bir mililitre hücre süspansiyon tespit reaktifi karışımı ekleyin. Kalan hücre süspansiyonlarını tespit karışımı ile oda sıcaklığında beş dakika daha inkübe etmeye devam edin. Beş dakika sonra, hücre süspansiyonundan bir mililitre daha, 1% paraformaldehit içeren hazırlanmış bir faks tüpüne aktarın.Bu, T eşittir 10 dakikalık zaman noktasıdır. Ardından, inhibitörlerle işlem görmüş 30 2D kit hücreleri üzerinde cal pain analizini tekrarlayın. Rafı alüminyum folyo ile kapatın.Hücreleri karanlıkta, 4 °C'de gece boyunca fikse edin. Ertesi gün, hücreleri 15 °C'de beş dakika boyunca 725 Gs hızında santrifüj ederek çöktürün. Santrifüj işleminin ardından süpernatantı aspire edin ve ardından hücreleri 750 µL PBS içinde yeniden süspande edin.Hücreleri buz üzerine yerleştirin ve akış sitometrisi uygulama zamanı gelene kadar karanlıkta tutun. Burada, veri toplama işlemi fikse edilmiş hücreler üzerinden gösterilmektedir. Akış sitometrisini bir LSR II kullanarak gerçekleştirin.Işık dalga uyarımı veya UV lazer uyarım hattı filtrelerini 355 nanometreye, lazer gücünü 25 milliwatt'a ve emisyonu substrat için 405, ürün için ise 450 nanometreye ayarlayın. Substrat ve ürün için kullanılan BAM geçiş filtreleri 405/20 ve 450/50 olmalıdır. Substrat ve ürün için kullanılan uzun geçişli filtreler sırasıyla 405 ve 450 olmalıdır.PMT voltajını substrat için 350 ile 375, ürün için ise 325 ile 350 arasına ayarlayın. Aşağıdaki parametrelerle bir BD FACSDiva deneyi kurun. Logaritmik ölçek kullanarak İleri saçılım (Forward scatter), yan saçılım (side scatter), Indo one blue ve bir adet violet.Ayrıca çalışma sayfasında logaritmik ölçek kullanın. Aşağıdaki grafikleri oluşturun. Canlı hücreler üzerinde bir kapı (gate) bulunan, ileri saçılım (forward scatter) ile yan saçılım (side scatter) karşılaştırma grafiği.Bir Indo one mavi histogram, bir Indo one menekşe histogramı ve bir Indo one mavi ile Indo one menekşe nokta grafiği, LSR iki cihazını line flow ve line flow plus floresan boncuklar ile kalibre eder. Her deneyden önce, boncuk floresan histogramının zirvesini aynı kanala yerleştirmek için PMT voltajı ayarlanmalıdır. Sıfırıncı dakika zaman noktasında 30 2D kit hücrelerini kullanarak veri toplamaya başlayın.Parametre voltajlarını gerektiği şekilde ayarlayın. Örnek başına 10.000 olay edinin ve kaydedin. Cihazı fax buffer ile durulayın ve edinme işlemini her örnek için tekrarlayın.Veri toplamanın ardından verileri dışa aktarın. LSR two cihazının kurum kılavuzlarına uygun olarak temizlendiğinden emin olun. Hücre süspansiyonlarını, tespit reaktifi veya cal pain inhibitörü eklemeden, daha önce olduğu gibi hazırlayın.Numuneleri LSR ikiye getirin ve filtreleri ile parametreleri daha önce olduğu gibi ayarlayın. Çalışma sayfasını daha önce olduğu gibi düzenleyin. Indo bir maviye karşı zamanı gösteren geniş bir nokta grafiği ekleyin.Programı maksimum sayıda olay toplama şeklinde ayarlayın. Durdurma kapısı (stop gate) kullanmayın. 32 G kit hücrelerinden oluşan bir hücre süspansiyonuna 50 µM calpain inhibitörü ekleyin.Hücreler inkübe olurken, örneği karanlıkta tutun ve oda sıcaklığında 20 ila 30 dakika inkübe edin. Cal pain inhibitörü içermeyen 30 2D kit hücre süspansiyonu üzerinde veri toplamaya başlayın. Saniyede 200 ila 300 olay şeklinde düşük bir akış hızı kullanın.30 saniye ila bir dakika sonra tüpü cihazdan çıkarın. Hücrelere 20 micromolar Bach LMC mac ekleyin. Bu, tespit reaktifidir.Kalsin tarafından spesifik olarak parçalanır ve bu parçalanma, substrat floresanında bir artışla sonuçlanır; vorteksleyin. Ardından kısa bir süre bekleyip veri toplamaya devam edin. Verileri 10 ila 20 dakika boyunca veya kalpain aktivitesi platoya ulaşana kadar toplayın.Ardından, cal pain inhibitörü ile işlenmiş 32 gki hücreleri ile görüntüleme işlemini tekrarlayın. İşlem tamamlandığında, verileri analiz için dışa aktarın. Fare dalağından elde edilen bir hücre süspansiyonu ile karışık hücre analizine başlayın.Her bir hücre süspansiyonunu ikiye bölün. Bir hücre süspansiyonunu 50 micromolar calpain inhibitörü ile işleme tabi tutun, folyo ile kapatın ve oda sıcaklığında, karanlıkta 20 ila 30 dakika inkübe edin. Sabitlenmiş hücreler için daha önce açıklandığı şekilde calpain analizi gerçekleştirdikten sonra, tüpleri folyo ile kapatın ve hücreleri dört degrees Celsius'ta, karanlıkta gece boyunca inkübe edin.Ertesi gün, 15 °C'de beş dakika boyunca 725 Gs'de santrifüj edin. Süpernatantı aspire edin, hücreleri 500 µL PBS ile yıkayın ve süpernatantı tekrar aspire edin; hücreleri %2 BSA içeren 200 µL boyama tamponunda resüspande ederek oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Ardından, primer antikoru (burada ZI anti-US) hazırlayın.CD17, nihai dilüsyon 1/200 olacak şekilde boyama tamponunda hazırlanır. Antikorun karanlıkta tutulduğundan emin olun. Hücrelere 200 µL primer antikor ekleyin ve oda sıcaklığında, karanlıkta 30 dakika inkübe edin.Ardından, akış sitometrisi için hacmi artırmak amacıyla 400 µL PBS ekleyin. Hücreleri buz üzerine yerleştirin ve karanlıkta tutun. Sabitlenmiş hücreler için gösterilen akış sitometrisi prosedürünün aynısını kullanarak verileri elde edin.Akış sitometresinde veri toplama işleminin ardından, parametrelere ZI'yı ekleyin ve çalışma sayfasına ZI için bir histogram dahil edin. İleri ve yan saçılım profiline göre canlı hücreler üzerinde FlowJo gating kullanarak analiz yapın. Canlı hücre kapısından Indo Blue için ortalama floresan değerini belirleyin.Bu grafikte kırmızı çizgi sıfırıncı dakikadaki ortalama substrat floresansını, mavi ve yeşil çizgiler ise beşinci ve onuncu dakikalardaki ortalama substrat floresansını göstermektedir. Karışık hücre popülasyonu için, 30 2D kip popülasyonunu belirlemek amacıyla histogramlarda ve nokta grafiklerinde FXI floresansını kullanın. 30 2D kip popülasyonunun endo blue için ortalama floresansını belirleyin.Son olarak, ortalama floresansı grafiğe dökmek için Microsoft Excel'i kullanın. Beş ile 10 dakika arasındaki doğrunun eğimini hesaplayın. Hücrelerdeki cal pain aktivitesini belirlemek için eğimi bir sütun grafiği olarak çizin.Burada gösterilen veriler, 30 2D hücrelerin yüksek seviyelerde calpain aktivitesine sahip olduğunu ve calpain aktivitesinin MEK inhibitörleri ile inhibe edilebileceğini göstermektedir. Sabitlenmiş ve canlı hücrelerde calpain aktivitesinin nasıl ölçüleceğini az önce gösterdik. Bu teknik uygulanırken, LSR two cihazının doğru şekilde kurulması ve makinenin floresan boncuklar kullanılarak kalibre edilmesi önemlidir.Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

measuring-calpain-activity-in-fixed-and-living-cells-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, nöronal hücrelerin mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri, mitokondriyal DNA ile ilişkili protein ve mitokondriyal dış zar proteini için antikorlarla etiketlenmesini ve ardından seviyelerini ölçmek için akış sitometrisini göstermektedir.

Nöronlarda Çoklu Mitokondriyal Parametrelerin Flow Sitometri Kullanılarak Ölçülmesi

Hücre içi Ca Ölçme<sup&gt; 2 +</supDört Teknikleri ile İnsan rm&gt; Değişiklikler: Konvansiyonel Florometre, Akış Florometre, Sitometrisi ve Tek Hücre Görüntüleme Durduruldu

Bu protokol, hassas, hücre bazlı bir sitotoksisite testini tanımlar. Artan sayıda efektör CD8 + T hücresinin varlığında canlı hedef CD4 + T hücrelerinin frekansındaki azalmayı numaralandırarak, bu test antijene özgü CD8 + T hücrelerinin sitolitik aktivitesinin doğrudan değerlendirilmesine izin verir.

Sitotoksik Aktiviteyi Ölçmek için Hücre Bazlı Akış Sitometrisi Testi

Kalsiyum çeşitli fizyolojik ve patofizyolojik sinyal yollarında rol oynamaktadır. Canlı hücre görüntüleme özel ekipman gerektirir ve zaman alıcı olabilir. Süspansiyon haline getirilmiştir yapışık epitel hücrelerinde sitozolik kalsiyum göreli değişiklikleri belirlemek için bir akış Sitometreyi kullanarak hızlı, basit bir yöntem optimize edilmiştir.

Sitometrisi ile Böbrek Hücrelerine sitozolik kalsiyum Ölçümleri

Kalıtsal kardiyak aritmiler genellikle bir veya daha fazla iyon kanallarının yüzey teslim değiştiren mutasyonlar neden olur. Burada, TSA-201 hücrelerinde eksprese edilen rekombinant iyon kanallarının göreli ve toplam hücre yüzeyi protein ekspresyonunun bir ölçümünü sağlamak için tahliller flow sitometri uyum sağlar.

Akım Sitometri Kullanımı rekombinant İyon Kanallarının göreli Hücre Yüzey ve toplam İfade tayini

Mitophagy, mitokondri, seçici bozulması mitokondrial homeostazı karıştığı ve çeşitli insan hastalıklarda deregüle. Ancak, mitophagy etkinliğini ölçmek için uygun deneysel yöntemleri çok sınırlıdır. Burada, biz hassas bir tahlil akış sitometresi kullanarak mitophagy etkinliğini ölçmek için sağlar.

Hassas ölçüm Mitophagy floresan muhabir akış sitometresi kullanarak pH bağımlı mt-Keima tarafından

Efferocytosis, apoptotik hücreler, fagositik kaldırılması homeostazı korumak için gerekli ve reseptörleri ve tanıma, engulfment ve apoptotik hücreler içselleştirilmesi için izin sinyal yollar tarafından yönetilir. Burada, biz efferocytosis miktar ve efferocytic sinyal yolları etkinlik için bir floresans mikroskobu Protokolü mevcut.

Efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar

Tek hücreli duyarlılığı sağlayarak, gerçek zamanlı Akış Sitometresi multimodal reseptör işlevleri canlı kültürlerin ölçmek için benzersiz olarak uygundur. Yetişkin nöral progenitör hücreler kullanarak, P2X7 reseptör işlevi tarafından elde kalsiyum göstergesi boya, transmembran gözenek oluşumu etidyum bromür alımı ve floresan lateks boncuk kullanarak fagositoz ile kalsiyum akını ile değerlendirildi.

Kalsiyum akını, gözenek oluşumu ve P2X7 reseptörleri yetişkin nöral progenitör hücreler tarafından fagositoz araştırmak için gerçek zamanlı canlı hücre Akış Sitometresi

Burada, proteinlerin hücre zarları veya mikro-parçacıklarla etkileşimini karakterize etmek için bir dizi yöntem açıklıyoruz.

Floresan Etiketli Proteinlerin Yapay Fosfolipid Mikrovezikülleri ile Etkileşiminin Kantitatif Akış Sitometrisi Kullanılarak Analiz Edilmesi

Mevcut protokol, akış sitometrisi veya spektroflorometre kullanarak florojenik bir substrat yoluyla kaspaz aktivitesini ölçmek için iki yöntem tanımlamaktadır.

Florometrik Tahlil veya Akış Sitometrisi Kullanarak Kaspaz Aktivitesinin Ölçülmesi

Burada, maya örneklerinde stres sonrası sağkalımı ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Test, plazma zarı bütünlüğünü ölçmek için SYTO 9 ve propidyum iyodür (PI) olmak üzere iki floresan boya kullanır. Oksidatif stres sonrası numuneler için canlı, ölü ve hasarlı hücre fraksiyonlarının kantitatif ve tekrarlanabilir tahminlerini sağlamak için akış sitometrisi kullanır.

Maya Hücrelerinde Stres Sonrası Sağkalımı Ölçmek için Akış Sitometrisi ile Birleştirilmiş Optimize Edilmiş Bir CANLI / ÖLÜ Testi

Öğrenin, sabit ve canlı hücrelerde sitometri kullanarak calpain aktivitesini nasıl ölçeceğinizi. Bu yöntem, lösemi ve lenfoma hücrelerinde proteaz aktivitesini analiz etmek için güvenilir bir protokol sunar.

Sabit ve Yaşam Hücreler Sitometrisi ile Calpain Aktivitesi Ölçme

Daha fazla video keşfet