Name: Chimeras Üretim Medaka Embriyolar ve Hücre Nakli Dechorionation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-22T17:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Öğrenin medaka embriyolarında dekoriyonasyon ve hücre nakli teknikleriyle kimerik üretim yöntemini. Bu prosedür gen fonksiyonlarını ve otonomisini gelişim biyolojisinde incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, MRC M. FS bir hibe ile desteklenmektedir.

1. Embriyoların geliştirilmesi <ol><li> Serilir zaman, yumurta koryon eklenti filamentler, çünkü kümelenmiş. Embriyoların normal geliştirmek izin vermek için, ayrı yumurta gereklidir. Karışmayan ve iki forseps ile ek filamentler tutarak eklenti filamentler kesmek. </li><li> Unclustering sonra dışkı ve yosun, yumurta ayrılır ve maksimum yoğunluk 6cm Petri kabı başına 40 yumurta, taze embriyo orta transfer. </li><li> Medaka embriyoların 27 zebrafish biraz daha yavaş gelişir ° C. Iki tür arasında kuluçka zamanlaması farklıdır; Medaka embriyolar, 7 gün içinde koryon yumurtadan çıkar ve hemen zebrafish embriyoların 2 gün içinde yumurtadan ise yüzmek ve yemeye başlar ancak 5-6 gün denize girmek ve yemeye başlar. Medaka Geliştirme Iwamatsu hazırlama 4 göre sahnelenir. </li><li> Medaka embriyo gelişimi deneysel planlarına uygun sıcaklık seçerek rahatlıkla ayarlanabilir. Medaka embriyoların Kalkınma erken gelişim 4 ° C'de durdurulabilir. Aşamada 24 saat sonra kalp atmaya başladığında, geliştirme minimum sıcaklık 18 ° C ile yavaşlatılabilir. </li><li> Zebrafish somitegenesis beyin gelişimi öncesinde ise organ / dokuların görünümü zamanlama zebrafish ile karşılaştırıldığında Medaka biraz daha farklı, Medaka somitogenesis yani beyin gelişimi başlamasından sonra ortaya çıkar. </li></ol> 2. Koryon çıkarma Medaka koryon sert bir iç tabaka ve yumuşak bir dış yüzeyi ile iki koruyucu tabaka oluşur. Böylece, bir iki adım proteaz tedavi pronase ve kuluçka enzim istihdam koryon kaldırmak için gereklidir. Bir kez dechorionated, embriyoların 1X BSS tutulmalıdır. Yarı steril koşullarda uzun süreli gözlem gereklidir, özellikle dechorionated embriyoların başarılı kültür artıracaktır. Bunlar% 70 etanol ile 1X BSS ile durulama ardından steril steril solüsyonların kullanımı (örneğin antibiyotik ile 1X BSS sterilize) ve araçları kullanarak içerir. Dechorionated Medaka embriyolar dechorionated zebrafish embriyolar daha yumuşak ve daha kırılgan olduğu için, ekstra bakım sağlamak için pipet hava kabarcıkları temasa geçmeyiniz, bu ani çöküşü neden olarak alınmalıdır. Embriyoların en az zararla sağlamak için, geniş ağızlı ısı pipet pompa ile parlatılmış cam pipet embriyolar transfer için kullanılan olmalıdır ve bir saç döngüsü, gözlem için embriyolar yolunuzu kullanılmalıdır. Sigara yapışık Petri kutularına embriyolar yüzeylere tutunmasını önlemek için kullanılmalıdır. <ol><li> Dechorionation için önce yumurta yeterince ayrılmış ve temizlenmiş olduğu kontrol edilmelidir. </li><li> Pronase ve kuluçka enzimler proteinazı olduğundan, buz üzerinde tutulmalıdır ve bu enzimlerin embriyoların maruziyeti en aza indirmek olmalıdır. </li><li> Zımpara (P2000 tane iriliğine, su geçirmez) 9cm petri kabı kapağı yerleştirilir yumurta transferi. Aşırı orta çıkarın ancak embriyo kurumasını önlemek için yeterli bir hacim kalmasını sağlamak. </li><li> Dış yüzeyi kılların bazılarını kaldırın ve hafifçe koryon yüzeyinde (Şekil 1) puan 45-60 saniye için embriyolar yavaşça döndürün. Orijinal Petri kabı geri embriyo transferine ve incelemek. Zımpara üzerinde yuvarlanma embriyolar minimum basınç uygulayarak ve zımpara kağıdı yüzeyinde parmak paralel tutulması, işaret parmağı kullandığınızda. Bir defada 5-7 embriyolar daha fazla rulo etmeyin. Bu önlem, embriyoları birbirlerine altında ezilme riski en aza indirecektir. </li><li> 27 20mg/ml pronase ve 40-60 dakika inkübe embriyolar ile bulaşık yumurta orta değiştirin ° C. Emin olun embriyolar yeterince pronase kapsadığı ve yemeğin üzerine bir kapak bulunur. Kullanılmayan pronase öz-sindirimi en aza indirmek için bu adımı sırasında buz üzerinde tutulmalıdır ve aktivite (yaklaşık 1-2 hafta) kaybolana kadar tekrar edilebilir. </li><li> Pronase, yeniden kullanım ve 5X yıkama embriyolar eklenecek kuluçka enzim inaktive olarak pronase izlerini kaldırmak için embriyonun orta kurtarma. </li><li> Embriyolar tek tabakalı bir çanak olarak oturup sağlamak, kuluçka enzim ile embriyo orta ve kapak embriyolar çıkarın. Yumurta çanak biri diğerinin üstüne oturup koryon erirken, altta kalanlar ezilmiş olacak. Buz üzerinde kullanılmayan kuluçka enzim tutun. </li><li> 27 embriyolar ° C'de ve 15 dakika sonra bir stereomikroskopta kullanarak kuluçka ilerleme periyodik olarak kontrol edin. Bu ay krater gibi delik bir dizi koryon iç tabakası, kısa sürede kolayca manuall kaldırıldı koryon yumuşak dış tabaka bırakarak aşağıdaki çözünür belirmeye başlar görülecektiry Tüm kuluçka süreci 15-60 dakika sürebilir. </li><li> 1X BSS içeren Petri embriyolar koryon çıkıp, embriyo transferi. Pipet ucu embriyoların yavaşça rulo izin BSS yüzeye dokunarak 1X BSS kuluçka enzim aktarmak için değil emin olun. </li><li> Tüm embriyolar transfer kuluçka enzim sonra, 1X BSS başka bir taze çanak son bir transfer yapmak. Bu maruz kalan embriyoların zarar verecek embriyolar, kuluçka enzim herhangi bir kalıntıları maruz kalmaz sağlar. Bir kere bu son yemek koryon dış tabakası hala sahip herhangi bir embriyolar stereomicroscope altında sterilize mikro-forseps kullanarak elle kurtarılmış olabilir. Embriyolar aşağıdaki dechorionation geliştirilen gerekiyorsa, penisilin / streptomisin bakteri gelişimini engellemek amacıyla BSS ilave edilmelidir. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 dechorionation sırasında haddelenmiş ve kusursuz embriyolar Karşılaştırılması. Paneli B haddelenmiş embriyolar paneli A. kusursuz embriyolar görülen kıllar nasıl eksikliği dikkat edin 3. Montaj dechorionated embriyolar Agaroz gömme, canlı embriyo görüntüleme daha uzun süre (örneğin time-lapse görüntüleme) yanı sıra sabit embriyoların ayrıntılı gözlemler için yararlıdır. Gastrulasyon ve erken organogenez (sahne sahne 28 14) sırasında, Medaka embriyoların periderm, gelişmekte olan embriyo ve yumurta sarısı 5 de kapsayan bir doku tabakası boyunca ritmik kasılma hareketleri dalgaları sergilerler. Embriyolar kasılma hareketleri durdurmak için 6 3.5mm 1-heptanol ile tedavi edilir. Aşamada 28 (64hpf) sonra embriyolar hareketi durdurmak için, embriyolar gömmeden önce Tricaine mesilate (TMS) ekleyerek damla anestezi. TMS (sadece az miktarda ekleyin, bu doz, yaklaşık 01:25 seyreltme optimize edilmesi gerekiyor) agaroz eklenir. <ol><li> 37 ° C ve bu sıcaklıkta muhafaza ısıtma ile% 3 jelleşme sıcaklığı düşük agaroz (1X BSS) küçük bir miktar çözülme. </li><li> Aşağıdaki adımları agaroz embriyo yönlendirici önce katılaşmaya olmadığından emin olmak için hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Eppendorf tüp kap depresyon doldurmak için geniş ağızlı bir cam pipet aktarımı yeterli erimiş agaroz kullanma. </li><li> BSS embriyo üzerinde taşıma kap depresyon en aza indirmek için bir dechorionated embriyo transferi. Hemen alımı kap depresyon ve bir Petri kabındaki kültür odasına transfer agaroz ve embriyo. Altındaki bir cam pencere ile 3.5cm Petri kabı kullanılır. Ters bir mikroskop kullanarak görüntüleme için, embriyolar yönelik gövde ön yüzü aşağı bakacak şekilde ve kapak cam yakın yerleştirilir. Dik bir mikroskop kullanarak görüntüleme için, agaroz kalınlığı en aza indirilmiştir. </li><li> 3.5cm Petri kabı, buz ve su (suyun büyük bir çanak kabaca 1 / 3 toplam derinlik doldurulur) içeren bir 14cm çaplı Petri kabı içine aktarın. Odanın alt 14cm Petri kabı sıkıca aşağı tutarken, hafifçe erimiş agaroz istediğiniz gibi embriyo yolunuzu bir saç döngüsü kullanımı ve embriyo agaroz orijinal konumuna yavaşça yükselterek daha küçük çanak ve indirme katılaşır kadar basılı tutun. buz gibi soğuk su. </li></ol> 4. Medaka embriyolar hücre nakli Bu prosedürün amacı, ilgi gen hücre özerk (hücre içinde) veya olmayan hücre-otonom (hücreler arası) eylemleri belirlemek için. Donör hücreleri nakli değerlendirme sağlayan, nakli için önce rodamin-dekstran gibi bir izleme boya (eşlik eden Jüpiter protokol 'Medaka Embriyolar Of Mikroenjeksiyon' belirtildiği gibi) veya kullanılan olabilir GFP ekspresyonu ile transgenik gerginlik etiketli olabilir. Hem etiketleme teknikleri bir arada sık sık karşılaşılan otomatik floresan üstesinden gelmek için yararlıdır. Transplantasyonundan sonra zaman atlamalı çalışmalar için, GFP ifade yararlıdır. Bu işlem boyunca pipet pompa ile geniş ağızlı cam pipet kullanın ve% 70 ile tüm araçları (slaytlar dahil) önceden sterilize EtOH steril 1X BSS ile durulama kapsamlı izledi. Bu nakli yürüten ventral ve dorsal direkleri ayrımcılığa izin Alıcı embriyolar genellikle etrafında aşamada 12 geliştirilmiştir. <ol><li> Enzim inkubasyon sırasında nakli ve kurulum enjeksiyon aparat önce embriyolar 1.5 saat dechorionating başlar. </li><li> Boşluğuna mikroskop lamı 9cm çaplı Petri kabı içine yerleştirin. </li> % 3 metilselüloz küçük bir miktar boşluğuna steril bir pipet kullanarak slayt merkezi ekleyin ve ince yayılabilir. <li> Kuru metilselüloz yaklaşık 1-2 dakika. </li><li> Slayt depresyon doldurmak için steril 1X BSS 350μl ekleyin. </li><li> Cam bir pipet kullanarak slayt için bir donör embriyo ve dört adede kadar alıcı embriyoların transferi. </li><li> Embriyonun blastodermin yukarı bakacak şekilde bir saç döngü kullanarak yolunuzu embriyolar. Embriyolar daha da artması istikrar birbirlerine karşı leant olabilir. </li><li> Donör blastodermin ve yavaş yavaş alımı 10-20 hücreler yavaşça içine mikro iğne takın. </li><li> Alıcı embriyo blastodermin gerekli bölgeye hafifçe iğne yerleştirin ve hücrelerin yavaş yavaş dışarı atmak. Alıcı blastodermin hücreler ekleyerek bu embriyonun ölümüne neden olacağı gibi, hücre-yolk kesesi sınır bozmak için değil, büyük bir titizlikle alınmalıdır. </li><li> Sterilize 1X BSS Petri kabı içine dökün. Dikkatle BSS embriyolar bozabilir yemeğin yanında değil mümkün olduğunca yakın olarak çanak içine dökün. Embriyoların üzerine doğrudan BSS dökün ve slayt ve embriyolar dalmış olduğu gibi yeterli BSS ilave edilmemelidir. </li><li> Penisilin / streptomisin çanak ve kapak 100μl ekleyin. Normal gelişimi sağlamak için dikkatli bir şekilde 27 ° C inkübatör çanak aktarmak. </li><li> Embriyolar periyodik olarak istediğiniz gibi görülebilir. Kazanç-fonksiyonu ve / veya fenotip kurtarma deneyleri yürütmek için nakli kullanırken, görülen bazı morfolojik değişiklikler nakli etkileri nedeniyle olabilir. Böylece birden fazla transplantasyon gereklidir. 2-3 gün sonra, melanophores yolk kesesi, baş, göz ve gövde mevcut olmalıdır. Nakledilen embriyoların bulunması daha sonra başarılı bir chimera büyük olasılıkla üretilen varsa (Şekil 3). </li></ol> Eğer 55 ° C 4 saat 10 dakika 94 ° C ve PCR yürütmek. 20mg/ml proteinaz K. inkübe 25μl içeren PCR tüp (ler) transfer gerekli, genotip donör embriyo (lar) 5. Temsilcisi sonuçları <img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2: Örnek bir agaroz gömülü embriyonun konumu . Anterior Sağda gösterilen ve görünümü dorsal. Panel B: endotel hücreleri embriyo vücudun her iki tarafında görülebilir ve fli organizatörü tarafından tahrik GFP ile etiketlenir. <img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 transplantasyon sonrası embriyoların Görüntüler. Image hemen transplantasyon sonrası bir donör ve alıcı embriyo gösterir. Donör embriyo tamamen kırmızı blastodermin (ok) sağ tarafta gösterilmiştir. Alıcı embriyo soldaki gösterilir ve blastodermin (ok ucu) görünür kırmızı nakledilen hücrelerin küçük bir kitle tarafından kolayca tanımlanır. Resim B iki alıcı embriyolar sonrası transplantasyonu (27 ° C'de inkübe) yaklaşık 7 saat. Nakledilen hücrelerin nakli sitesinden göç etmiş ve şimdi blastodermin (oklar) dağılmış dikkat edin. Resim C st.29 (yaklaşık 74hpf) bir alıcı embriyo gösterir. Pigmentasyon, gövde ve beyin bölgesi (oklar) göz ve melanophores varlığını unutmayın. Rodamin etiketli hücrelerin embriyonik yapıların bir kabus başarılı bir üretim olduğunu gösteren birçok kolonize görülebilir.

<ol><li>Furutani-Seiki, M., Sasado, T., Morinaga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+genome-wide+screen+for+mutations+affecting+organogenesis+in+Medaka%2C+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">A systematic genome-wide screen for mutations affecting organogenesis in Medaka, Oryzias latipes.</a> Mech Dev. 121, 647-658 (2004).</li>
<li>Furutani-Seiki, M., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medaka+and+zebrafish%2C+an+evolutionary+twin+study%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Medaka and zebrafish, an evolutionary twin study.</a> Mech Dev. 121, 629-6237 (2004).</li>
<li>Hirose, Y., Varga, Z. M., Kondoh, H., Furutani-Seiki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+lineage+and+regionalization+of+cell+populations+during+Medaka+neurulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Single cell lineage and regionalization of cell populations during Medaka neurulation.</a> Development. 131, 2553-2563 (2004).</li>
<li>Iwamatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+normal+development+in+the+medaka+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Zool+Sci%22%5BJournal%5D)">Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes.</a> Zool Sci. 11, 825-839 (1994).</li>
<li>Cope, J., Fluck, R., Nicklas, L., Plumhoff, L. A., Sincock, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stellate+layer+and+rhythmic+contractions+of+the+Oryzias+latipes+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">The stellate layer and rhythmic contractions of the Oryzias latipes embryo.</a> J Exp Zool. 254, 270-275 (1990).</li>
<li>Brend, T., Holley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Whole+Mount+High-Resolution+Double+Fluorescent+In+Situ+Hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

Bu video dechorionate ve Medaka embriyolar hücre transplanataion yürütmek nasıl göstermektedir. Bu gelişim sırasında gen / protein fonksiyonunun yanı sıra çalışma, söz konusu gen / protein özerklik nedenlerine açıklık için kimerik embriyolar üretmek için güçlü bir tekniktir. Medaka vivo gerçek-zamanlı görüntüleme de iyi kurulmuş kaderi haritalar ve şeffaflık kredi nedeniyle bu teknik için yararlı bir omurgalı model sistem. Nakli nakledilen hücrelerin davranışını kolayca görülebilir, böylece mikroenjeksiyon (eşlik eden Jüpiter protokol &#39;Medaka Embriyolar Of Mikroenjeksiyon belirtildiği gibi) ile kombine edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Embriyo medyumu</td><td>Reaktif</td><td>Kurum içi üretim</td><td>YOK</td><td>200ml 50X stok çözelti, 10 litre RO su içerisinde 1ml %1 metilen mavisi in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (50X stok çözelti: 14.7g NaCl, 0.6g KCl, 2.4g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 4.0g MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O/1 litre RO su.)</td></tr><tr><td>Mikro-dissection pensi</td><td>Araç</td><td>55 INOX A.DUMONT&amp;amp;FILS</td><td>YOK</td><td>Koryonun uzaklaştırılması için çok keskin ince uçlar.</td></tr><tr><td>İnce su geçirmez zımpara kağıdı - p2000 kum boyutu</td><td>Araç</td><td>Hermes Abrasives Ltd.</td><td>YOK</td><td>Koryonlu embriyoların yuvarlanması/temizlenmesi için çok ince kum boyutu.</td></tr><tr><td>%3 metilselüloz</td><td>Reaktif</td><td>Sigma</td><td>M 0512</td><td>Transplantasyon sırasında embriyoları sabit tutmak için yüksek viskozite.</td></tr><tr><td>1X BSS</td><td>Reaktif</td><td>Kurum içi üretim</td><td>YOK</td><td>20XBSS: 1L MilliQ su içerisinde 130g NaCl, 8g KCl, 4g MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 4g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O ve 10mg Fenol Kırmızısı, ardından otoklav; MilliQ su içerisinde otoklavlanmış 500mM Hepes. 25ml 20XBSS ve 15ml 500ml Hepes pH7.0 ekleyin, hacmi 500ml'ye tamamlayın ve kullanmadan önce filtre sterilizasyonu yapın.</td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin</td><td>Reaktif</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Dekoryone edilmiş embriyolar inkübe edilirken BSS'ye eklenir.</td></tr><tr><td>Pronaz</td><td>Reaktif</td><td>Calbiochem</td><td>53702</td><td>Dekoryonasyon için.</td></tr><tr><td>Çıkış (hatching) enzimi</td><td>Reaktif</td><td>Kurum içi üretim</td><td>YOK</td><td>Dekoryonasyon için.</td></tr><tr><td>Trikain mezilat (TMS)</td><td>Reaktif</td><td>Sigma</td><td>A-5040</td><td>97.9ml distile su ve 2.1ml 1M Tris içerisinde 400mg trikain, pH 7'ye ayarlanmış; 100ml temiz tank suyu içerisinde bu çözeltiden 4.2ml.</td></tr><tr><td>%3 ultra-düşük jelleşme sıcaklıklı agaroz</td><td>Reaktif</td><td>Sigma</td><td>A-2576</td><td>Tip IX-A. Gözlem için embriyoların gömülmesi (embedding) sırasında kullanılır.</td></tr><tr><td>Petri kabı kültür odası</td><td>Araç</td><td>Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.</td><td>11-004-008</td><td>12mm pencereli 35mm Iwaki cam tabanlı kap. Gözlem için embriyoların gömülmesi sırasında kullanılır.</td></tr><tr><td>Mikromanipülatör</td><td>Ekipman</td><td>Narishige</td><td>YOK</td><td>Model MN151. Transplantasyon sırasında hücrelerin çıkarılması ve yerleştirilmesi için.</td></tr><tr><td>Borosilikat cam kapilerler</td><td>Araç</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC100-10T</td><td>Transplantasyon iğneleri yapmak için.</td></tr><tr><td>Alevleme/Brown mikropipet çekici</td><td>Ekipman</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Model P-97</td><td>Transplantasyon iğneleri yapmak için.</td></tr></tbody></table>

chimeras Üretim medaka embriyolar ve hücre nakli dechorionation

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka, hem de genetik ve embriyolojik analizler sağlar ve genom fenotip odaklı mutant ekranlarında 1 yürütülen edildiği üç omurgalı model organizmaların biridir yumurta küçük bir tatlı su balığı . Medaka ve zebrafish arasında ilgili genlerin fonksiyonel örtüşme Farklılıklar, böylece tek bir türün 2, Medaka ve zebrafish omurgalı genomu fonksiyonları genetik diseksiyon için tamamlayıcı tanımlanamayan roman fenotiplerinin kimlik sağlar . Manipülasyon gibi dechorionation Medaka embriyolar, görüntüleme ve hücre nakli için montaj embriyolar, bir laboratuvarda, Medaka ve zebrafish hem de üzerinde çalışmak için temel prosedürler vardır. Hücre nakli Medaka mutasyonlar hücre özerklik inceler. Chimeras etiketsiz alıcı embriyolara nakli donör embriyolardan etiketli hücreler tarafından üretilir. Donör hücreleri nakledilen hücrelerin klonları geliştirme sırasında ilgi doku entegre edilebilir ve böylece kaderini haritaları 3 dayanan alıcı embriyolar belirli alanlarda transplante edilebilir. , Sert koryon ve yumuşak embriyolar, Medaka embriyo manipülasyonu nedeniyle daha zebrafish içinde daha fazla yer almaktadır. Bu video, Medaka embriyolar işlemek için ayrıntılı yordamlar göstermektedir.

, Sert koryon ve yumuşak embriyolar, Medaka embriyo manipülasyonu nedeniyle daha zebrafish içinde daha fazla yer almaktadır. Bu video görüntüleme ve kuruntulardan üretimi için hücre nakli için agaroz dechorionation montaj Medaka embriyolar işlemek için nasıl adım adım yordamlar, gösterir. Bu prosedürler, omurgalı genomu fonksiyonları genetik diseksiyon için tamamlayıcı özellikleri tam olarak yararlanmak için bir laboratuvar Medaka ve zebrafish kullanmak için gereklidir.

Chimeras Üretim Medaka Embriyolar ve Hücre Nakli Dechorionation

Medaka, hem genetik hem de embriyolojik analizlere olanak tanıyan, yumurtlayan küçük bir tatlı su balığıdır ve ... içindeki üç omurgalı model organizmadan biridir.

Bu prosedürün genel amacı, ilgilenilen bir genin veya proteinin otonomisini incelemek amacıyla bir embriyoda klonlar üretmektir. Bu, bu videonun tamamlayıcısı olan Maka embriyolarına mikroenjeksiyon videosunda gösterildiği gibi, tek hücreli aşamada Rod Domine dekstran ile donör embriyoların mikroenjeksiyon yoluyla etiketlenmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, hem donör hem de alıcı embriyoları uygun aşamaya getirmektir.Prosedürün üçüncü adımı, hem donörün hem de alıcının embriyolarının kaplanmasıdır. Prosedürün son adımı ise, işaretli donör embriyolarından alınan hücrelerin alıcı embriyolara nakledilmesidir. Sonuç olarak, nakledilen hücreler floresansları veya soy izleyicileri aracılığıyla tespit edilerek, nakledilen hücrelerin klonlarının dağılımı, proliferasyonu ve diferansiyasyonu analiz edilerek sonuçlar elde edilebilir.Merhaba, ben Bath Üniversitesi Biyoloji ve Biyokimya Bölümü'nde Dr. Makoto Fuki'nin laboratuvarından Sean Brazinski. Aynı zamanda Zeki laboratuvarındayım. Bugün size, karanlık balık embriyolarında hücre transplantasyonu prosedürünü göstereceğiz.Laboratuvarımızda bu prosedürü, ilgi duyulan bir genin veya mutasyonun hücre içi veya hücre dışı otonom bir fonksiyona sahip olup olmadığını incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Maka yumurtalarını kaplarken, uzun süreli gözlem ve kültür başarısını artırmak için steril solüsyonlar ve araçlar kullanın.Dokuz santimetrelik yapışmaz bir Petri kabının kapağına P 2000 kumlu su geçirmez zımpara kağıdının bir parçasını yerleştirin. Yumurta ortamı kabındaki 10 adede kadar taze, kümelenmemiş, temizlenmiş ve etiketlenmiş yumurtayı zımpara kağıdına aktarmak için geniş ağızlı, uç kısmı cilalanmış bir pasta pipeti kullanın.Yumurtaların kurumasını önleyecek kadar besiyeri kapta kalacak şekilde fazla besiyerini uzaklaştırın. Eldivenli bir parmak ucuyla, her seferinde 10 yumurtayı zımpara kağıdı üzerinde 45 ila 60 saniye boyunca nazikçe yuvarlayın. Dış yüzey kıllarını temizlemek ve Corian yüzeyini çizmek için minimum basınç uygulayın ve parmak ucunu zımpara kağıdına paralel tutun.Yumurtaları orijinal besiyeri kabına aktarın. Besiyerini uzaklaştırın, yumurtaların üzerini 20 mg/mL'lik pron çözeltisi ile kaplayın. Kabın kapağını kapatın ve 27 °C'de 60 dakika boyunca inkübe edin.Embriyoların enzimle yeterince temas etmesi için petri kabının açılı yerleştirildiğinden emin olun. Gereken enzim miktarını en aza indirmek için, pronazı geri kazanıp yeniden kullanmak amacıyla plastik bir transfer pipeti kullanın ve enzimi buz üzerinde tutun. Kuluçka enziminin sindirilmesini önlemek için, pronazın tüm kalıntılarını temizlemek amacıyla yumurtaları embriyo ortamı ile beş kez yıkayın.Yıkanmış yumurtaları örtecek kadar kuluçka enzimi ekleyin. Corian çözünürken ezilmeleri önlemek için yumurtaların kabın tabanında tek bir katman halinde kaldığından emin olun. Yumurtaları 27 degrees Celsius'de inkübe edin.Embriyoların enzim içinde yeterince kaldığından emin olmak için çanağı eğik bir açıyla yerleştirin. Gereken enzim miktarını minimize etmek için ilerlemeyi bir stereo diseksiyon mikroskobu altında kontrol edin; korion tamamen çözünmeden önce iç tabakada benzer delikler oluşacaktır. İşlem, enzim aktivitesine bağlı olarak 60 dakikaya kadar sürebilir.Koryonun küçük bir kısmı çözüldüğünde, embriyonun kuluçka enzimi tarafından sindirilmesini önlemek için ilgili yumurtayı hemen bir pipetle çekin. Kuluçka enziminin transferini minimize etmek için pipet ucunu nazikçe 1x BSS içeren temiz bir kaba değdirip yumurtanın dışarı kaymasına izin vererek yumurtayı 1x BSS içeren temiz bir kaba aktarın. Tüm yumurtalar kuluçka enziminden aktarıldıktan sonra, koryonun geri kalanını uzaklaştırmak için pens kullanın.Son transferi, bir kat BBSS içeren yeni bir kaba yapın. Embriyolar embriyonik gelişimin daha ileri bir evreye getirilecekse antibiyotik ekleyin. Bu işlem için dekortikasyon sürecine, transplantasyondan 1,5 saat önce evre 12 embriyoların dekortikasyonuna başlayarak başlayın. Bir pipet ucu kullanarak, kavite mikroskobunun merkezine küçük bir miktar %3 metil selüloz ekleyin.Dokuz santimetrelik bir petri kabına yerleştirin. Sıvıyı çukurun yüzeyine ince bir tabaka halinde yayın. Metil selülozu iki dakika boyunca kurutun.Bir dissekte mikroskobu altında, lamdaki çukuru 350 µL steril bir katlı BSS ile doldurun. Bir donör ve dört adete kadar resipiyent embriyoyu lama aktarmak için geniş ağızlı, uçları ateşle cilalanmış bir cam pipet kullanın. Blastoderm yukarı bakacak şekilde embriyoları yönlendirmek için bir kıl döngüsü (hair loop) kullanın.Gerekirse, stabilite sağlamak için embriyoları birbirine yaslayın. Bir mikroiğneyi nazikçe donör blastosiste yerleştirin. Yavaşça 10 ila 20 hücre alın.Şimdi iğneyi alıcı embriyonun ilgili bölgesine nazikçe yerleştirin ve donör hücreleri yavaşça boşaltın. Hücre kesesi sınırını bozmayın. Embriyoları daldırmak ve metil selülozdan ayırmak için Petri kabını yaklaşık 30 milliliters steril 1x BSS ile dikkatlice doldurun.Embriyoları rahatsız etmemek için sıvıyı kabın kenarından dökün. Yaklaşık %0,3 konsantrasyon sağlamak için kaba 100 µL penisilin streptomisin ekleyin. Kabın kapağını kapatın. Gerektiğinde embriyoları periyodik olarak gözlemleyin.Zaman geçirmeli görüntüleme ve detaylı gözlemler gibi daha uzun süreli görüntüleme çalışmaları için, canlı kaplanmış embriyoları agar içine gömün; embriyoların hareketini önlemek için, embriyoların bulunduğu ortama uygun bir anestezik ekleyerek canlı embriyoları anestezi altına alın. Yaklaşık 1 mL %3'lük düşük erime noktalı agarı 1x BSS içinde eriterek 37 °C'de tutun. Gerekirse, seğirmeleri önlemek için agara uygun miktarda anestezik ekleyin. Katılaşmayı önlemek için hızlı çalışarak, geniş ağızlı bir pastör pipeti yardımıyla bir mikrosantrifüj tüpünün kapağındaki çöküntüyü agar ile doldurun.Kapaktaki arosun içine, kaplanmış ve anestezi uygulanmış bir embriyoyu taşımak için geniş ağızlı bir pipet kullanın. Embriyoyla birlikte mümkün olduğunca az besiyeri aktarın. Aros ve embriyoyu hemen güncelleyin ve 3,5 centimeter cam tabanlı bir Petri kabına taşıyın.Kabı, üçte biri buz ve su karışımıyla doldurulmuş 14 santimetrelik bir kaba aktarın. Bir diseksiyon stereo mikroskobu altında, küçük kabı büyük kabın tabanına sıkıca bastırın. Embriyoyu istenilen şekilde hızlıca yönlendirmek için bir saç döngüsü (hair loop) kullanın.Agar katılaşana kadar embriyoyu sabit tutun. Embriyo artık görüntülenmeye hazırdır. Görüntü A, transplantasyonun hemen ardından bir donör ve bir alıcı embriyoyu göstermektedir.Donör embriyo, sağda tamamen kırmızı etiketli bir blastoderm ile gösterilmiştir. Reseptör embriyo solda gösterilmiştir ve blastoderm görüntüsünde görünen küçük kırmızı transplantasyon hücresi kütlesinden kolayca ayırt edilebilir. B görüntüsü, transplantasyondan yaklaşık yedi saat sonraki iki reseptör embriyoyu göstermektedir. Transplant edilen hücrelerin transplantasyon bölgesinden göç ettiğine ve artık blastoderm boyunca dağıldığına dikkat ediniz.Derm görüntü C, 29. evredeki bir alıcı embriyosunu göstermektedir. Gözdeki pigmentasyona ve gövde ile beyin bölgesindeki mefor varlığına dikkat edin. Rod domine işaretli hücrelerin, embriyonik yapıların çoğuna kolonize olduğu görülmekte olup bu durum bir kimeranın başarıyla üretildiğini göstermektedir.Meca balığı embriyolarının nasıl hazırlanacağını ve erken embriyonik aşamada hücre transplantasyonunun nasıl gerçekleştirileceğini az önce gösterdik. Bu prosedürü uygularken, donör hücrelerinizi alıcı blastula evresindeki embriyonun doğru bölgesine transplant etmeyi hatırlamanız önemlidir. Bu, donör hücrelerinizin doğru hücre tipine farklılaşmasını sağlayacaktır.İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

dechorionation-medaka-embryos-cell-transplantation-for-generation

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Nakli ile blastula veya gastrula aşamada hedef kimerik zebrafish embriyolar üretmek için bir adım-adım rehber.

Transplantasyon Kimerik Zebra balığı Embriyolar Yaratma

Zebra balığı hücre nakli, doku spesifik kimeralar üretmek için genetik ve embriyoloji kombinasyonu sağlar. Bu video gastrula laboratuarımızda önbeyin komissür oluşumu sırasında, Astroglial nüfus ve özel rehberlik ipuçları rollerini araştırmak için izin hücre transplantasyon sahnelenen göstermektedir.

Doku Hedeflenen Embriyonik Chimeras: Zebra balığı Gastrula Hücre Nakli

Biz embriyogenez sırasında canlı görüntüleme hücresel davranışı için kimerik zebrafish embriyolar üretmek için bir protokol ortaya koymaktadır.

Transplantasyon GFP of-Kimerik Zebra balığı Embriyolar Retina ve Beyin Gelişimi Canlı Görüntüleme blastomer ifade

Medaka ve zebrafish omurgalı genomu fonksiyonları genetik diseksiyon için tamamlayıcı niteliktedir. Bu protokol, Medaka embriyolara başarılı mikroenjeksiyon, bir laboratuvarda Medaka ve zebrafish kullanarak embriyolojik ve genetik analiz için önemli bir tekniktir için kilit noktaları vurgulamaktadır.

Model Genetik Organizma olarak kullanmak için Medaka Embriyolar, Mikroenjeksiyon

Bıldırcın-chick kimerik embriyo kuş nöral krest hücrelerinin göç ve nihai kaderi analiz etmek için bir yaklaşım tarif edilmiştir. Bu yöntem, aksi ayarlanmamış bir civciv embriyo içinde ayırt etmek zor göç ve farklılaşma sırasında nöral krest hücrelerinden izlemek için basit ve kolay bir tekniktir.

Çapraz türler Nakli Sinir Crest Göç ve Farklılaşma Analiz

Küçük laboratuvar balıkları, insan kemik bozukluklarının altında yatan mekanizmalar üzerine kemik araştırmaları ve kemik modüle edici ilaçların taranması için popüler modeller haline gelmiştir. Bu yazıda, osteoporotik lezyonları olan medaka larvalarında alendronatın kemik hücreleri üzerindeki etkisini değerlendirmek için bir protokol tanımlanmıştır.

İlaç Tedavi ve<em&gt; İn Vivo</em&gt; Bir Medaka Balık Osteoporoz Modelinde Osteoblast-Osteoklast Etkileşimler Görüntüleme

farklı genetik kökenden bireysel WT retina atalarıdır Canlı izleme nöron sırasında hücre özerk olmayan sinyalizasyon katkısı değerlendirilmesi için izin verir. Burada, embriyo transplantasyonu yoluyla ve in vivo time-lapse konfokal görüntüleme gen demonte, kimera nesil bir arada bu amaçla kullanılmıştır.

Kimerik Zebra balığı Embriyolar Bireysel Retina progenitörlerin Transgenik Gen İfade Vivo Görüntüleme Hücre otonom olmayan Etkiler Eğitim için

Burada yeni ekipman kullanmanıza gerek kalmadan chimera üretimi artırmak için bir iletişim kuralı mevcut. Enjeksiyon için embriyo basit yönlendirme değişikliği üretilen embriyo sayısını artırmak ve potansiyel olarak zaman çizelgesi germline iletim için azaltmak.

Trans-iç hücre embriyonik kök hücrelerin kitle enjeksiyon daha yüksek Chimerism oranları için yol açar.

Bu protokolün amacı, embriyonik doku aşılama teknikleri kullanılarak Cas9-mutajenize donör dokusundan elde edilen haploid forelimbs ile şimerik axolotls üretmektir.

Embriyonik Greftleme Yoluyla Mutant Haploid Ekstremiteler ile Şemerik Axolotls Üretimi

Hücrelerin ekstirpasyonu ve nakli gibi embriyolojik manipülasyonlar erken gelişimi incelemek için önemli araçlardır. Bu protokol, zebra balığı embriyolarında bu manipülasyonları gerçekleştirmek için basit ve etkili bir transplantasyon cihazını tanımlar.

Zebra Balığı Embriyoları İçin Basit ve Etkili Bir Transplantasyon Cihazı

Öğrenin medaka embriyolarında dekoriyonasyon ve hücre nakli teknikleriyle kimerik üretim yöntemini. Bu prosedür gen fonksiyonlarını ve otonomisini gelişim biyolojisinde incelemek için kullanılır.

Chimeras Üretim Medaka Embriyolar ve Hücre Nakli Dechorionation

Daha fazla video keşfet