Chimeras Üretim Medaka Embriyolar ve Hücre Nakli Dechorionation

, Sert koryon ve yumuşak embriyolar, Medaka embriyo manipülasyonu nedeniyle daha zebrafish içinde daha fazla yer almaktadır. Bu video görüntüleme ve kuruntulardan üretimi için hücre nakli için agaroz dechorionation montaj Medaka embriyolar işlemek için nasıl adım adım yordamlar, gösterir. Bu prosedürler, omurgalı genomu fonksiyonları genetik diseksiyon için tamamlayıcı özellikleri tam olarak yararlanmak için bir laboratuvar Medaka ve zebrafish kullanmak için gereklidir.

Bu prosedürün genel amacı, ilgilenilen bir genin veya proteinin özerkliğini incelemek amacıyla bir embriyoda klonlar üretmektir. Bu, donör embriyoların, bu videoya eşlik eden Maka embriyolarının mikroenjeksiyonunda gösterildiği gibi bir hücre aşamasında mikro enjeksiyon yoluyla Rod Domine dekstran ile etiketlenmesiyle gerçekleştirilir. İşlemin ikinci adımı, hem donör hem de alıcı embriyoları doğru aşamaya getirmektir.

İşlemin üçüncü adımı, hem donör hem de alıcının embriyolarını kaplamaktır. Prosedürün son adımı, etiketli donör embriyolarından hücrelerin alıcının embriyolarına nakledilmesidir. Sonuç olarak, klonların, nakledilen hücrelerin dağılımının, çoğalmasının ve farklılaşmasının analiz edilmesiyle, nakledilen hücrelerin floresan veya soy izleyicileri tarafından tespit edilmesiyle sonuçlar elde edilebilir.

Merhaba, ben Bath Üniversitesi Biyoloji ve Biyokimya Bölümü'nden Dr.Makoto Fki'nin laboratuvarından Sean Brazinski. Ben de Zeki laboratuvarından geliyorum. Bugün size kara balık embriyolarında hücre nakli için bir prosedür göstereceğiz.

Bu prosedürü laboratuvarımızda, ilgilenilen bir gen veya mutasyon ile çalışmak için kullanıyoruz, bir hücre veya hücre olmayan özerk bir işlevi var. Öyleyse başlayalım. Maka yumurtalarını kaplarken, uzun süreli gözlem ve kültürün başarısını artırmak için steril solüsyonlar ve aletler kullanın.

Dokuz santimetrelik yapışmayan bir Petri kabının kapağına bir parça P 2000 kumlu su geçirmez zımpara kağıdı yerleştirin. Bir tabak yumurtadan 10 adede kadar taze kümelenmemiş, temizlenmiş ve etiketlenmiş yumurtayı aktarmak için geniş ağızlı cilalı makarna pipeti kullanın. Zımpara kağıdına orta.

Fazla ortamı çıkarın, yumurtaların kurumasını önlemek için tabakta yeterince bırakın. Eldivenli bir parmak ucu kullanarak her seferinde 10 yumurtayı zımpara kağıdı üzerinde 45 ila 60 saniye boyunca nazikçe yuvarlayın. Dış yüzeydeki tüyleri çıkarmak ve Corian yüzeyini çentiklemek için minimum basınç uygulayın ve parmak ucunu zımpara kağıdına paralel tutun.

Yumurtaları orijinal orta boy tabağına aktarın. Ortamı çıkarın, yumurtaları mililitre yüzüstü başına 20 miligramlık bir çözelti ile örtün. Çanağı örtün ve 27 santigrat derecede 60 dakika inkübe edin.

Çanağı belirli bir açıyla yerleştirdiğinizden emin olun, böylece embriyolar enzime yeterince daldırılır. Gerekli enzimi en aza indirmek için, pronazı yeniden kullanım üzere geri kazanmak için plastik bir transfer pipeti kullanın ve buzun üzerine yerleştirin. Kuluçka enzimini sindirmesini önlemek için tüm eğilimli izleri gidermek için yumurtaları bir embriyo ortamında beş kez yıkayın.

Yıkanmış yumurtaları kaplayacak kadar kuluçka enzimi ekleyin. Corian çözülürken ezilmeyi önlemek için yumurtaların tabağın dibinde tek bir tabaka halinde kaldığından emin olun. Yumurtaları 27 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.

Çanağı belirli bir açıyla yerleştirdiğinizden emin olun, böylece embriyolar enzime yeterince daldırılır. Diseksiyon stereo mikroskobu altında enzim gerekli kontrol ilerlemesini en aza indirmek için, Corian'ın iç tabakasında tamamen çözünmeden önce benzer delikler görünecektir. İşlem enzim aktivitesine bağlı olarak 60 dakika kadar sürebilir.

Corian'ın küçük bir kısmı çözüldüğünde, embriyonun kuluçka enzimi tarafından sindirilmesini önlemek için hemen tek tek yumurtayı bir pipetle emdirin. Pipetin ucunu bir kez BSS'lik temiz bir tabağa hafifçe dokundurarak ve kuluçka enziminin aktarılmasını en aza indirmek için yumurtanın yuvarlanmasına izin vererek bir kez BSS'lik temiz bir tabağa aktarın. Tüm yumurtalar kuluçka enziminden aktarıldığında Corian'ın geri kalanını çıkarmak için forseps kullanın.

Bir kez BBSS'nin yeni bir yemeğine son bir transfer yapın. Embriyolar embriyonik gelişimin daha sonraki bir aşamasına getirilecekse antibiyotik ekleyin Bu prosedür için süslemeden sonra, transplantasyondan 1.5 saat önce 12. aşama embriyoları kaplamaya başlayın. Boşluk mikroskobunun merkezine az miktarda %3 metil selüloz eklemek için bir pipet ucu kullanın.

Dokuz santimetrelik bir petri kabında kaydırın. Sıvıyı çöküntü yüzeyine ince bir şekilde yayın. Metil selülozu iki dakika kurutun.

Slayt çöküntüsünü diseksiyon mikroskobu altında 350 mikrolitre steril bir kez BSS ile doldurun. Bir donörü ve en fazla dört alıcı embriyoyu slayta aktarmak için geniş ağızlı ateşle parlatılmış bir cam pipet kullanın. Embriyoları, blaster derm yukarı bakacak şekilde yönlendirmek için bir saç halkası kullanın.

Gerekirse stabilite için embriyoları birbirine yaslayın. Donör blaster'a nazikçe bir mikro iğne sokun. Derm. Yavaşça 10 ila 20 hücre alın.

Şimdi iğneyi nazikçe alıcının ilgili alanına sokun, embriyo blaster derm donör hücreleri yavaşça dışarı atın. Çello kesesi sınırını bozmayınız. Embriyoları daldırmak ve embriyoları metil selülozdan gevşetmek için Petri kabını yaklaşık 30 mililitre steril bir kez BSS ile dikkatlice doldurun.

Embriyoları bozmamak için yemeğin kenarına dökün. Yaklaşık% 0.3'lük bir konsantrasyon için tabağa 100 mikrolitre penisilin streptomisin ekleyin. Embriyoları gerektiği gibi periyodik olarak gözlemleyin.

Time-lapse ve detaylı gözlemler gibi daha uzun görüntüleme çalışmaları için, canlı kaplanmış embriyoları aros anestezisine gömün, embriyoları içeren ortama aşama uygun bir anestezik ekleyerek hareketi önlemek için canlı embriyoları anestezize edin, yaklaşık bir mililitre %3 oranında erir, düşük erime noktası bir kez BSS'de ortaya çıkar ve 37 santigrat derecede tutar. Gerekirse, seğirmeyi önlemek için aroslara uygun miktarda anestezik ekleyin, katılaşmayı önlemek için hızlı çalışın, kapağı doldurmak için geniş ağızlı bir makarna pipeti kullanın. Aros ile bir mikro santrifüj tüpünün depresyonu.

Kaplanmış ve uyuşturulmuş bir embriyoyu kapaktaki arosun içine taşımak için geniş ağızlı bir pipet kullanın. Embriyo ile mümkün olduğunca az ortam aktarın. Aros ve embriyoyu hemen güncelleyin ve 3,5 santimetrelik cam tabanlı bir Petri kabına taşıyın.

Çanağı, üçte biri buz ve su karışımıyla doldurulmuş 14 santimetrelik bir tabağa aktarın. Küçük tabağı, diseksiyon stereo mikroskobu altında büyük tabağın dibine sıkıca tutun. Embriyoyu istediğiniz gibi hızlı bir şekilde yönlendirmek için bir saç halkası kullanın.

Agro katılaşana kadar embriyoyu sabit tutun. Embriyo artık görüntülenebilir. Resim A, transplantasyondan hemen sonra bir donör ve alıcı embriyoyu göstermektedir.

Donör embriyo sağda tamamen kırmızı etiketli bir alçı derm ile gösterilmiştir. Alıcı embriyo solda gösterilmiştir ve blaster derminde görülebilen küçük kırmızı nakledilen hücre kütlesi ile kolayca tanımlanır, görüntü B, transplantasyondan yaklaşık yedi saat sonra iki alıcı embriyosunu göstermektedir. Nakledilen hücrelerin nakil bölgesinden göç ettiğine ve şimdi blaster boyunca dağıldığına dikkat edin.

Derm görüntüsü C, bir alıcının embriyosunu evre 29'da gösterir. Gözdeki pigmentasyona ve gövde ve beyin bölgesinde mefor'un varlığına dikkat edin. Çubuk domin etiketli hücrelerin, bir kimeranın başarılı bir şekilde üretildiğini gösteren embriyonik yapıların çoğunu kolonize ettiği görülebilir.

Az önce size meca balığı embriyolarını nasıl yiyeceğinizi ve erken embriyonik aşamada hücre naklini nasıl yapacağınızı gösterdik. Bu prosedürü yaparken, donör hücrelerinizi patlatılan alıcının doğru bölgesine nakletmeyi unutmamak önemlidir. Bu, donör hücrelerinizin doğru hücre tipine farklılaşmasını sağlayacaktır.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.