Name: Plazmid DNA Rekombinant Grip Virüsü Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-03T17:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Öğrenin, plazmid DNA kullanarak rekombinant grip virüsü üretme yöntemini. 293T ve MDCK hücrelerine transfeksiyon yaparak virüsü çoğaltın ve hemaglütinasyon testiyle doğrulayın. Bu teknik, aşı geliştirme ve viral vektör çalışmaları için kritik öneme sahiptir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar grip ters genetik teknikler ve plazmid gelişimi için Adolfo Garcia Sastre ve Peter Palese laboratuvarlar geçmişteki ve şimdiki üyelerine teşekkür etmek istiyorum. AG-S laboratuarlar Araştırma Crip, Grip Araştırma ve Gözetim Mükemmellik NIAID tarafından finanse edilen Merkezi (HHSN266200700010C) ve NIAD hibe R01AI046954, U01AI070469 ve P01AI058113 tarafından kısmen finanse edilmektedir. LM-S laboratuvar Araştırma kısmen NIAID hibe RO1AI077719 tarafından finanse edilmektedir.

1. İnfluenza virüs kurtarma transfeksiyon İnfluenza A virüsü negatif iplikli RNA zarflı virüs Orthomyxoviridae ailesine aittir. Influenza A virüs genomunun en az 11 viral proteinler (Şekil 1) 4, kodlamak negatif polarite sekiz farklı RNA genleri oluşur. (8 grip A/PR/8/34 viral segmentleri içeren ambisense plazmid (pDZ) kullanarak en sık rastlanan laboratuvar suşu, grip A/PR/8/34, 5 kurtarma, bu raporda, durulacak Şekil 2). Plazmid DNA rekombinant influenza virüslerinin kurtarılması için, biz her rekombinant virüs başına 3 bağımsız transfections tavsiye ederiz. Birden fazla rekombinant virüs kurtarma girişimi ise, kurtarılan virüslerin sayısı accordantly aşağıdaki adımları ölçekli. 6-iyi-plakalar için aşağıdaki transfeksiyon ve enfeksiyon protokolü ile kurulmuştur. Protokol şematik Şekil 3'te gösterilmiştir. <ol><li> OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) karışımı: 250 ul OptiMEM medya ve LPF2000 başına transfeksiyon 6-8 ul hazırlayın. Oda sıcaklığında (RT) 5-10 dakika inkübe edin. Bu arada, plazmid transfeksiyon karışımı hazırlar. </li><li> Plazmid transfeksiyon karışımı: OptiMEM medya 50 ul plazmid transfeksiyon kokteyl hazırlayın. Biz genellikle 1 mg kurtarma ortalama plazmid her influenza DNA kullanın. 50 ul OptiMEM medya içeren bir tüp, 1 pDZ plazmid ul (1 mcg / ml) PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, K, ve NS ekleyin. </li><li> OptiMEM-LPF2000 DNA plazmid karışımı: grip DNA plazmid transfeksiyon karışımı (adım 1.2) içine adım 1.1 'den 250 ul ekleyin. Bu karışımı 20-30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Bu arada, transfeksiyon için 293T ve MDCK hücre süspansiyonları hazırlayın. </li><li> 293T/MDCK ko-kültür hazırlanması: Başlamadan önce, 37 PBS 1X, DMEM% 10 FBS% 1 PS medya ve EDTA-tripsin karışımı getirmek ° C Hücrelerin yoğunluğu% 80-90 izdiham transfeksiyon günü olmalıdır. Genellikle, 293T ve MDCK hücreleri konfluent 100 mm çanak biri konfluent 100 mm çanak kurtarır 10-12 için kullanılan olabilir. Biz de her hücre 250 ul kullanmaya devam etmektedir. Her iki hücre hatları DMEM% 10 FBS% 1 PS 3 ml toplam yeniden süspanse olacaktır. <ul><li> Dikkatlice DMEM% 10 FBS% 1 PS 10 ml, 15 ml santrifüj tüpüne her hücre hattı tekrar süspansiyon haline getirin. MDCK hücreleri için 293T hücreleri ve bir tüp bir tüp var. </li><li> DMEM% 10 FBS% 1 PS 3 ml 293T hücrelerinin yeniden süspanse edin ve yeniden süspanse zaman, bu hücrelerin tekrar süspansiyon MDCK hücreleri 3 ml sunmak. Bu ko-kültür için kullanılacak 293T ve MDCK hücrelerin karışımı verecektir. </li><li> De başına 293T/MDCK hücreleri (10-12 Haziran iyi kuyuları) 250 ul ekleyin. </li></ul></li><li> 20-30 dakika RT inkübasyon (adım 1.3) sonra, DMEM% 10 FBS% 1 PS 1 ml OptiMEM-LPF2000-influenza DNA plazmid karışımı ekleyin. </li><li> 250 ul 293T/MDCK hücrelerinin (adım 1.4) ile kuyuların içine 1.3 ml (1.5 adım) ekleyin. </li><li> 37 ° 6-iyi-plate yavaşça sallamak ve inkübatör (ON) gecede transfeksiyon inkübe izin ° C ve% 5 CO 2. </li><li> Ertesi gün, yaklaşık 16-24 saat sonrası transfeksiyon, transfeksiyon medya ve 48 saat için 1 mcg / ml TPCK-tripsin içeren PS DMEM% 0.3 BA% 1 transfekte hücreler kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Değişen medya 48 saat sonra, bir mikrosantrifüj tüp içine transfekte hücrelerden süpernatantı aktarın. </li><li> 1-2 dakika, 13.000 rpm mikrosantrifüj doku kültürü süpernatant Santrifüj. </li><li> 6-kuyu levhalar (bir gün önce kaplama) veya 10 günlük civciv adım 1.10 'dan santrifüj doku kültürü süpernatantlar 200 ul embriyolu yumurta taze MDCK hücreleri enfekte. 2-3 gün boyunca 37 ° hücreleri ve / veya yumurta ° C'de inkübe edin. <ol><li> Enfeksiyon: 10 günlük civciv embriyolu yumurta tavuk embriyolu yumurta bulaştırmak için tüm işlemler, steril koşullar altında yapılmaktadır. <ol><li> Hava kesesi arasındaki arayüz ve allantoik boşluğuna görmek için bir ışık candling kutusunu kullanarak 10 günlük yumurta Mum. Arayüz sınırında bir kalem işareti olun. </li><li> 5 ml şırınga iğne ile bir delik kabuğu olun. </li><li> 1 ml şırınga ile, her adım 1.10 'dan doku kültürü süpernatantlar 200 ul yumurta bozar. </li><li> Bir pamuklu çubukla kullanarak erimiş balmumu ile kabuğu delik kapağı. </li><li> 2-3 gün, 37οC enfekte yumurta inkübe edin. </li></ol></li><li> Enfeksiyon: taze MDCK hücreleri geçit önceki gün öncesi, ortak kültürlerin 293T/MDCK doku kültürü süpernatantMDCK hücreleri ile pare 6-plaka yemekleri ertesi gün% 80-90 izdiham ulaşmak için. Genellikle, bir konfluent 100 mm doku kültürü plakası 6-8 kuyu ayrılabilir. Hücreleri yıkayın, iki kez PBS 1X trypsinize ve 6-iyi plakaları hazırlamak. Hücrelerin üniformalı bir dağılıma sahip olduğu için, yavaşça elle plakalar sallayın. Kültür hücreler, ON, 37 ° C inkübatör,% 5 CO 2. Enfeksiyon önce, bir tek tabaka onaylamak için hücrelerin mikroskop altında kontrol edin; ardından, enfeksiyon ile devam edin: <ul><li> 1 ml PBS 1X, iki kez, hücre yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat süreyle santrifüje doku kültürü süpernatantlar 200 ul bulaştırabilir. Hücreler kuru izin vermeyin. 6-iyi-plate her 10 dakikada Rock. </li><li> 1 saat sonra viral emilmesi, MDCK hücreleri enfeksiyon medyayı çıkartın ve DMEM 0.3% BA% 1, 1 mcg / ml TPCK-tripsin içeren PS 2 ml ekleyin. </li><li> 48-72 saat geçtikten sonra, sitopatik etki (CPE) MDCK enfekte olmuş hücreleri gözlenen transfeksiyon verimlilik ve virüs yükü bağlı. CPE başarılı bir kurtarma göstermektedir. Ancak, bir HA assay (2. bölüm) hala doku kültürü Süpernatantları virüsün varlığını tespit etmek için yapılan olmalıdır. </li></ul></li></ol></li><li> Hasat allantoik sıvı enfekte tavuk embriyolu yumurta: allantoik sıvı enfekte yumurta hasat Tüm işlemler steril koşullar altında yapılmaktadır. Allantoik sıvı yaklaşık 8-12 ml, her 10 günlük eski enfekte yumurta hasat edilebilir. Allantoik sıvı hasat önce az 2 saat, 4 tavuk yumurtası (veya ON) inkübe ° C tavuk embriyo öldürmek ve kan pıhtılaşmasını. <ul><li> Steril koşullar kurmak için% 70 etanol ile yumurta kabuklarını yıkayın. </li><li> Bir kaşık ile dokunarak hava boşluğuna üzerine, dikkatlice, yumurta açın. Forseps yardımı ile kırık kabuğu çıkarın. </li><li> 1 ml iğne ile yumurta sarısı kırılma olmadan allantoik membranından çıkarın. </li><li> Allantoik sıvı içine 10 ml lik bir pipet rehber olarak bir spatula ile tavuk embriyo sabitleyin. Yumurta sarısı, herhangi bir kırılma ya da toplama olmayan bir buz kovası buz 15 ml santrifüj tüpü içine mümkün olduğu kadar çok allantoik sıvı olarak toplayın. Her yumurta için 15 ml santrifüj tüpüne kullanın. </li><li> 4 5 dakika santrifüj ° C ve 15 ml taze bir santrifüj tüplerine allantoik sıvı (pelet kırmızı kan hücreleri almadan) aktarın. </li><li> 4 santrifüje allantoik sıvı içeren tüpler Mağaza ° C kadar onlar kurtarıldı virüsün varlığı için bir hemaglütinasyon (HA) testi ile kontrol edilir. </li></ul></li></ol> 2. HA tahlil rekombinant influenza virüslerinin kurtarma onaylamak için Hemaglütinasyon deneyi (HA), rutin doku kültürü süpernatantlar MDCK ve / veya hasat yumurta allantoik sıvı kurtarıldı virüsün varlığını tespit etmek için kullanılır. Alternatif olarak, immünofloresan testleri (IFA) de yapılabilir. Bir test kurtarıldı virüsün varlığını tanımlayan sonra, virüs, plak saflaştırılmış ve virüsün genetik kompozisyonu, RT-PCR ve sıralama ile teyit edilecek olmalıdır. Makroskopik tavuk HA (ya da başka bir kaynaktan), kırmızı kan hücreleri (RBC) kullanarak MDCK doku kültürü süpernatantlar ve / veya enfekte yumurta allantoik sıvı virüsün varlığı tespit edilebilir. Virüs yokluğunda kuyunun altındaki kırmızı bir pelet (Şekil 4) oluşumunu sağlar virüsün varlığı, eritrosit hemaglütinasyon neden olur. İnfluenza virüsünün durumda, yaklaşık 10 3 -10 4 plak oluşturan birim (PFU) HA testi pozitif bir sinyal vermek için gerekli olduğu düşünülüyor; bu nedenle, onaylamak için bir IFA HA testi ile paralel olarak yapılabilir. gerçek negatif sonuç. Daha az 103-104 virüsler Bu tekniği ile tespit edilebilir, çünkü birincil anti-influenza antikorları IFA HA testinin daha duyarlı. , IFA pozitif HA-negatif süpernatantlar veya allantoik sıvıları daha mümkündür. Bu durumda, virüs MDCK hücreleri veya yumurta, tekrar Pasajlanması tarafından amplifiye edilmelidir. Alantoyik sıvı ve / veya ikinci pasaj doku kültürü süpernatantlar artık açıkça HA testi pozitif olmalıdır. 96-V-alt kuyucuğu HA testleri yapılmaktadır. Negatif (örneğin, PBS 1X) ve pozitif (doku kültürü süpernatantlar ve / veya bir grip virüsü enfeksiyonu allantoik sıvı) kontrol örnekleri her zaman bunu doğrulamak için herhangi bir HA tayininde dahil edilmelidir. <ul><li> 1X PBS ul 50 V-bottom her iyi 96 plaka içine koyun. </li><li> 50 ul ekleMDCK ilk sıra enfekte yumurta ve doku kültürü süpernatantlar ve / veya allantoik sıvı aşağıdaki kuyuları için 2 kat seri dilüsyonları olun. Son kuyudan ekstra 50 ul atın. </li><li> % 0.5 'her bir kuyunun% -1.0 tavuk, kırmızı kan hücreleri (1X PBS içinde hazırlanan) 50 ul ekleyin. </li><li> V-alt 96-iyi plaka (kırmızı bir nokta, bir negatif kontrol PBS örnek altında görünür oluncaya kadar) 30-45 dakika buz üzerinde inkübe edin. Şekil 4'te gösterildiği gibi sonuçları okuyun ve interpretate. </li></ul> 3. Doku kültürü süpernatantlar geçmesi HA testi negatif bir sonuç, doku kültürü süpernatantlar ve / veya allantoik sıvı virüs mevcut düşük seviyelerde düşük transfeksiyon verimlilik bir sonucu olabilir. Bu örneklerin, taze MDCK ve / veya embriyolu yumurta Passage Enfeksiyonlar, daha önce bölümünde 1.11.2 açıklandığı gibi yapılır (Şekil 3'te gösterildiği gibi) virüs amplifikasyon sağlayacaktır. 4. Temsilcisi Sonuçlar Başarılı grip virüsü kurtarma olumlu bir HA assay (Şekil 4) varlığı ile teyit edilecektir. Ayrıca, doku kültürü süpernatantlar ya da yumurtadan allantoik sıvı ile enfekte hücrelerde CPE varlığı olumlu bir viral kurtarma önerecektir. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. İnfluenza Virüs yapısı: Grip virüsü iki viral glikoproteinler (HA, NA) ve çift katlı lipid içeren bir çevrilidir ayrıca, iyon kanalı protein, M2. HA, viral eki protein, sialik bağlanarak asit içeren reseptörleri sorumludur. NA, ev sahibi hücrelerin viral serbest bırakılması için sorumludur. Çift katlı lipid altında, virion montaj ve tomurcuklanma ve viral ribonucleocapsids nükleer ihracat için gerekli nükleer ihracat proteini (NEP), önemli bir rol oynar iç yüzeyi zarf matriks protein 1, M1, oluşan bir protein tabakası. Çekirdek virüs, viral nükleoprotein, NP encapsidated 8 tek iplikli negatif RNA viral genler oluşan bir ribonükleoprotein (RNP) kompleks yapılır. RNP kompleksi ile ilişkili viral RNA bağımlı RNA polimeraz altbirimden PA, PB1 ve PB2. Tarafından kodlanan RNA segmentlerinde sırasıyla NS ve PB1, yapısal olmayan proteinleri NS1 ve PB1-F2, virion yapısının bir parçası değildir. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. İnfluenza virüs kurtarma plazmid: ambisense plazmid pDZ klonlanmış sekiz influenza virüsünün genleri gösterilir. plazmid pCAGGs 7 protein ekspresyonu türetilen plazmid pDZ 6, bir insan RNA polimeraz I organizatörü ve negatif anlamda genomik RNA kodlayan bir fare terminatör dizisi ile iki yönlü bir plazmid vektörü, ters yönde birleştirmek polimeraz, polimeraz II. transkripsiyon kaset (tavuk β-aktin organizatörü ve Polya) aynı viral gen viral proteinleri kodlar. Her viral segmentinden cDNAs SAPI kısıtlama endonükleaz site ve her segmentin (viral genlerin sonunda kara kutu) noncoding bölgeleri içeren ileri ve geri primerler ile RT-PCR ile üretilir. PCR ürünü Sap-I ile sindirilir pDZ klonlanmış. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Sekiz plazmid tabanlı influenza kurtarma sistemi: 8 influenza virüs genleri içeren pDZ plazmid ko-kültür (1. gün) 293T-MDCK hücreleri, süspansiyon, co-transfekte vardır. Yirmi dört saat FBS olmadan post-transfeksiyon, medya ama TPCK / tripsin içeren (2 gün) değiştirilmiştir. Kırk sekiz saat medya değiştirdikten sonra, doku kültürü süpernatant hasat ve MDCK veya 10 günlük embriyolu tavuk yumurtası (4 gün) bulaştırmak için kullanılır. 48-72 saat sonrası amplifikasyon, yumurtadan MDCK enfekte hücreleri veya allantoik sıvı doku kültürü süpernatantlar HA (Günde 6) hasat ve virüsün varlığı için test edilir. Herhangi bir virüs tespit edilirse, aynı süpernatantlar ve / veya allantoik sıvıları taze MDCK hücreleri ve / veya embriyolu yumurta içine yeniden geçişli olabilir. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. Hemaglutinin assay (HA): virüs parçacığın eritrosit Hemaglutinasyon makroskopik olarak görünür ve doku kültürü süpernatantlar ve / veya allantoik sıvıları viral parçacıkların algılamak için temelidir. HA testi, viral enfeksiyon olan parçacıklar ve bozulmuş ve hücreleri enfekte etmek artık mümkün parçacıklar arasında ayrım olmamasına rağmen, tahlil örneklerinde virüsün varlığının iyi bir gösterge. A) (alt) biyolojik örnekler virüs varlığı yokluğu (üst) alt plaka ya da onların yokluğunda veya eritrosit varlığı ile belirlenir.ectively. B) saptanabilir virüs seviyeleri (üst) ya da virüs varlığı (altta) ile HA testte bir temsilci sonucu gösterilmiştir.

<ol><li>Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+influenza+A+viruses+entirely+from+cloned+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9345-9350 (1999).</li>
<li>Fodor, E., Devenish, L., Engelhardt, O. G., Palese, P., Brownlee, G. G., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+influenza+A+virus+from+recombinant+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Rescue of influenza A virus from recombinant DNA.</a> J Virol. 73, 9679-9682 (1999).</li>
<li>Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+influenza+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Virology%22%5BJournal%5D)">Recombinant influenza virus vectors.</a> Future Virology. 2, 401-416 (2007).</li>
<li>Palese, P., Shaw, M. L. Orthomyxoviridae. The viruses and their replication. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalese%2C+P+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. H. , 5th Edition, Lippincott Williams & Wilkins. PA, USA. 1647-1689 (2006).</li>
<li>Schickli, J. H., Flandorfer, A., Nakaya, T., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid-only+rescue+of+influenza+A+virus+vaccine+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356, 1965-1973 (2001).</li>
<li>Quinlivan, M., Zamarin, D., Garcia-Sastre, A., Cullinane, A., Chambers, T., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+equine+influenza+viruses+through+truncations+of+the+NS1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the NS1 protein.</a> J Virol. 79, 8431-8439 (2005).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
</ol>

Mount Sinai Tıp Fakültesi, rekombinant influenza virüslerinin alanda fikri mülkiyet hakları, ve AG-S, bu fikri mülkiyet bir mucit.

Plazmid DNA rekombinant influenza virüslerinin Kurtarma sonra protokol rutin laboratuarda gerçekleştirilen basit ve kolay bir süreç, ama başında, birden fazla şeyler ters gidebilir. Virüs oluşturmak için iyi bir plazmid hazırlanması zorunludur. (293T ve MDCK) hücre hatları doğru bakım başarılı bir viral kurtarılması için çok önemlidir. Geleneksel olarak, genetik bir etiket sessiz mutagenez, bir grip plazmid gen kodlama içine eklenir. Bu sessiz mutasyon (lar) ve örneğin, yaratılış giriş, bir roman restriksiyon enzimi sit...

Hücre dizileri 293T (katalog numarası CRL-11268) ve MDCK (katalog numarası CCL-34) hücre hatları DMEM% 10 FBS,% 1 PS% 5 CO 2 ile 37 ° C inkübatör tutulur. Hücreler American Type Culture Collection (ATCC 10801 Üniversitesi Bulvarı, Manassas, VA 20.110-2209 ABD) bulunan bir biçimidir. Embriyolu tavuk yumurtası Charles River Laboratuvarları, Özel Patojen Ücreti Kuş Kaynağı (SPAFAS) Kuş Ürünler ve Hizmetler embriyolu 10 günlük civciv yumurta elde edilebilir. Franklin Commons, 106 Route 32, Kuzey Franklin, CT 06.254 ABD. Yumurtalar 37 ° C önceki ve viral enfeksiyondan sonra inkübe edilir. Viral enfeksiyon önce ve sonra, yumurta, embriyo canlılığını belirlemek için candled vardır. Bu viral enfeksiyon öncesi ve sonrasında ölü yumurta bakmak için çok önemlidir. Önce ölü bir yumurta bulaşmış kan damarlarının olmaması yanı sıra embriyo hareketlilik olmaması tespit edilebilir. Candled, canlı embriyolarının hareket eder. Viral enfeksiyondan sonra ölü bir yumurta (muhtemelen influenza virüs enfeksiyonu ile ilgili) kolayca allantoik sıvı hacmi küçük ve kanlı görüldüğü gibi yumurtanın kötü görünüşü fark olacaktır. Etkilenmiş-yumurta çift otoklav torbaları atılır ve standart prosedürler takip otoklavlanırlar. Tavuk kırmızı kan hücreleri (eritrosit) Tavuk RBC Truslow Çiftlikleri, 201 Valley Road, Chestertown, Md 21620 satın alınabilir. 4 ° C saklayınız HA deneyleri için tavuk RBC 5 ml, 45 ml, 50 ml santrifüj tüpüne PBS 1X yıkayın. 1000 rpms, RT az 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı dikkatle atın ve PBS 1X pelet RBC 1:1000 dilüsyon (0.5-1.0% RBC final konsantrasyon) kullanabilirsiniz. Doku kültürü süpernatantlar ve allantoik sıvıları , Doku kültürü süpernatantlar ve allantoik sıvıları, 4 ° C, kısa bir süre için saklanabilir. Virüs kurtarma onayladıktan sonra, hücre süpernatantlar virüs veya allantoik sıvı -80 ° C&#39;de saklanır. Plazmidler Plazmid plazmid maxi kiti aşağıdaki üretici öneriler kullanılarak hazırlanmıştır. Tüm plazmid GKD 2 O 1 mcg / ml konsantrasyonlarda kısım ve -20 ° C&#39;de saklanan Kısa süreli depolama için, 4 tutmak plazmid olabilir ° C Plazmid saflaştırılmış DNA konsantrasyonu, saflığı 260:280 nm oranı kullanılarak tahmin, 260 nm&#39;de spektrofotometre tarafından belirlenir. 1,8-2,0 260:280 nm oranları ile hazırlıklar virüs kurtarma amaçlı tahsis kabul edilir. Ayrıca, plazmid konsantrasyonu ve saflık agaroz jel kromatografisi ile teyit edilmelidir. Ambisense pDZ plazmid (6), sekiz grip A/PR/8/34 viral genler (7) içeren Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. Virüsler Grip A/PR/8/34 kurtarmak için açıklanan protokol biyogüvenlik düzeyi (BSL) 2 koşulları altında yapılabilir. Doku kültürü süpernatantlar ve embriyolu yumurta da dahil olmak üzere kontamine malzeme, atmadan önce sterilize edilmelidir. Diğer grip virüsü Kurtarma yüksek BSL koşulları ve bu nedenle, özel koşullar / güvenlik ölçümleri takip gerekecektir gerekebilir. Doku kültürü medya ve çözümler DMEM% 10 FBS% 1 PS: 445 ml Dulbecco&#39;nun modifiye Eagle orta (DMEM), fetal sığır serumu (FBS) 50 ml ve 5 ml 100X Penisilin / Streptomisin (PS). 4 ° C saklayınız Bu ortam transfections 293T ve MDCK hücreleri gibi korumak için kullanılır. DMEM% 0.3 BA% 1 Not: DMEM 495,7 ml, 4.3 ml% 35 Bovine Albumin (BA). 4 ° C saklayınız Kullanmadan önce, son bir 1 mg / ml konsantrasyonu TPCK tedavi tripsin ekleyin. Enfeksiyon medya. 80 g NaCl, 2 g KCl, Na 2 HPO 4 .7 H 2 O, 2 g KH 2 PO 4 11,5 g: 10X fosfat tamponlu salin (PBS). 1 litre kadar GKD 2 O ekleyin. PH 7.3 &#39;e ayarlayın. Otoklav ile sterilize edin. Oda sıcaklığında saklayın. 1X PBS: GKD 2 O. ile seyreltin 10X PBS 01:10 Oda sıcaklığında ve mağaza otoklav ile sterilize edin.

plazmid dna rekombinant grip virüsü Üretimi

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Grip araştırma grupları bir takım çabalar, influenza A virüsünün ters genetik geliştirme ve iyileştirme kilit edilmiştir. 1999 yılında kurulmuş.<sup&gt; 1,2</supSpesifik sorular, genetik mühendisliği, enfeksiyon, rekombinant influenza virüsleri ile cevap çünkü rekombinant virüsler üretmek için plazmid tabanlı ters genetik teknikleri influenza araştırma alanında devrim yarattı. Bu tür çalışmalar, virüs replikasyonu, virüs proteinleri işlevi, viral replikasyon ve / veya patogenezinde viral proteinlerin belirli mutasyonlar katkısı ve ayrıca, viral vektörlerin, yabancı proteinler ifade rekombinant influenza virüslerinin kullanarak<sup&gt; 3</sup&gt;.

Plazmid DNA influenza A virüsleri Kurtarma grip araştırmacılar grip virüsünün biyoloji çeşitli yönlerini incelemek amacıyla rekombinant virüsler üretmek için, ve potansiyel vektörler veya aşı olarak kullanılmak üzere izin veren bir temel ve temel deneysel bir tekniktir.

Plazmid DNA Rekombinant Grip Virüsü Üretimi

Bir dizi influenza araştırma grubunun çalışmaları, influenza A virüsü ters genetiğinin geliştirilmesinde ve iyileştirilmesinde belirleyici olmuştur. Başlangıçta...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, plazmit DNA'sından rekombinant influenza virüsü üretmektir. Bu, ikinci bir adım olarak Lipofektamin 2000 kullanarak sekiz influenza genini kodlayan DNA plazmitlerinin 2 9 3 t ve MDCK hücrelerinin bir ko-kültürüne transfekte edilmesiyle gerçekleştirilir. Doku kültürü süpernatantı, taze MDCK hücrelerini ve/veya 10 günlük tavuk embriyonlu yumurtalarını enfekte etmek için kullanılacak olup, bu işlem transfekte edilmiş hücrelerin süpernatantında bulunan virüsü amplifiye edecektir.Sırada, enfekte edilmiş tavuk embriyonik yumurtalarından doku kültürü süpernatantlarını ve allantoik sıvıyı hasat edeceğiz. Bir HA testi kullanarak virüsün varlığını doğrulamak amacıyla, aglütinasyonun varlığına dayanarak virüsün mevcut olduğunu gösteren sonuçlar elde edilir. Merhaba, ben Rochester Üniversitesi Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölümü'nden Luis Martinez Rito.Bugün size rekombinant influenza virüslerinin plazmid DNA'dan nasıl kurtarılabileceğini göstereceğim. Laboratuvarımızda influenza virüsü biyolojisinin birçok yönünü incelemek ve potansiyel vektörler ile aşılar geliştirmek için bu tekniği kullanıyoruz. Hadi başlayalım.Transfeksiyona başlamadan önce hücre kültürü reaktiflerini 37 °C'ye ısıtın: bir katı fosfat tamponlu salin, P-B-S-E-D-T-A, tripsin ve %10 fetal bovin serum FBS ile %1 penisilin streptomisin PS içeren KO modifiyeli eagles ortamı DMEM. Ardından, her bir transfeksiyon için 250 µL Opti-MEM ortamı ve 6 ila 8 µL LPF 2000 hazırlayın ve oda sıcaklığında 5 ila 10 dakika inkübe edin. 50 µL Opti-MEM ortamı içeren bir tüpe 1 µg plazmid DNA ekleyerek plazmid transfeksiyon karışımını hazırlayın. Viral segmentler içeren sekiz PDZ plazmidinin her birinden birer mikrogram ekleyin.PB iki PB bir pa ha np na m ve N MS. İnfluenza DNA plazmid transfeksiyon karışımına oda sıcaklığında 250 µL Opti-MEM™ ekleyin ve oda sıcaklığında 20 ila 30 dakika inkübe edin. Bu sırada, transfeksiyon için 293T ve MDCK hücre süspansiyonlarını hazırlayın. 293T ve MDCK hücrelerinin yoğunluğu %80 ila %90 konfluens seviyesinde olmalıdır.Transfeksiyon gününde, 100 milimetrelik kap başına yaklaşık 5 × 10⁶ hücre olacak şekilde; hücreleri yıkayın, ayırın ve standart hücre kültürü tekniklerini kullanarak santrifüjleyin. 293T hücrelerini 3 mL DMEM-FBS-PS içinde resüspande edin. Resüspandasyon işlemi tamamlandığında, 3 mL'lik karışımı resüspansiyon için MDCK hücrelerine aktarın.Bu işlem, ko-kültür olarak kullanılacak 2 9 3 T ve MDCK hücre karışımını oluşturacaktır. Altı kuyucuklu bir plakadaki her kuyucuğa 250 mililitre 2 9 3 T-M-D-C-K hücresi ekleyin. 20 ila 30 dakika sonra, her bir opti M-E-M-L-P-F 2000 influenza DNA plazmit karışımına bir mililitre DMEM %10 FBS %1 PS ekleyin.Ardından, 250 mililitre 2 9 3 T-M-D-C-K hücresi içeren kuyucuklara ekleyin. Altı kuyucuklu plakayı hafifçe sallayın ve transfeksiyona 37 °C ve %5 karbondioksit içeren inkübatörde gece boyunca izin verin. Ertesi gün, transfeksiyondan 16 ila 24 saat sonra, transfeksiyon medyasını değiştirin ve transfekte edilen hücreleri, mililitre başına bir mikrogram L tosil lado iki fenol etil klor metil keton veya TPCK işlem görmüş tripsin içeren DMEM %0,3 Bovine albumin veya BA %1 PS içerisinde 48 saat boyunca inkübe edin.MDCK enfeksiyonu isteniyorsa, enfeksiyondan bir gün önce veya ilk viral transfeksiyondan iki gün sonra taze MDCK hücreleri ekilmelidir; ardından besiyeri değişiminden 48 saat sonra, transfekte edilen hücrelerden alınan SUP natant bir mikro santrifüj tüpüne aktarılmalıdır. Doku kültürü sup natantı, MDCK hücreleri enfekte edilmeden önce 13.000 RPM'de bir ila iki dakika boyunca mikro santrifüjde santrifüjlenmelidir. Monolayer oluşumunu onaylamak için hücreler mikroskop altında kontrol edilmeli, ardından enfeksiyon işlemine geçilmelidir. Hücreler, 1 ml 1x PBS ile iki kez yıkanmalıdır.Önceki adımlardan elde edilen santrifüj edilmiş doku kültürü süpernatantlarından 200 microliters ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Viral absorbsiyonun bir saatlik süresi boyunca hücrelerin kurumasını önlemek için plakayı her 10 dakikada bir sallayın. MDCK hücrelerindeki enfeksiyon medyasını uzaklaştırın ve mililitre başına bir microgram TPCK trypsin içeren iki milliliters DMEM 0.3%BA 1%PS ekleyin.Pasajdan 48 ila 72 saat sonra MDCK enfekte hücrelerinde sitopatik etki gözlemlenecektir. Transfeksiyon verimliliğine ve virüs yüküne bağlı olarak sitopatik etkiler; hücrelerin yuvarlaklaşması, ölümü ve yüzeyden ayrılması vb. durumlardan oluşur. Ardından, doku kültüründeki virüs varlığını doğrulamak için analiz amacıyla MDCK hücrelerinden snat izole edin.Hücre kalıntılarını uzaklaştırmak için süpernatantları 13.000 RPM'de bir ila iki dakika boyunca mikro santrifüjleyin ve tavuk embriyonik yumurtalarını enfekte etmek için yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. Hava kesesi ile allantoik boşluk arasındaki ara yüzeyi görmek için 10 günlük yumurtaları bir ışıklı candling kutusu kullanarak inceleyin. Beş mililitrelik bir şırınga iğnesi ile ara yüzey sınırına kurşun kalemle bir işaret koyun.Bir mililitrelik şırınga ile yumurta kabuğunda bir delik açın. Her bir yumurtayı, daha önce hazırlanan doku kültürü süpernatantlarının 200 µL'si ile enfekte edin. Yumurta kabuğundaki deliği, bir pamuklu çubuk kullanarak eritilmiş mumla kapatın.Allantois sıvısını hasat etmeden önce enfekte yumurtaları 37 °C'de iki ila üç gün inkübe edin. Ardından, tavuk embriyosunu öldürmek ve kanı pıhtılaştırmak için tavuk yumurtalarını dört °C'de iki saat veya gece boyunca inkübe edin. Steril koşullar oluşturmak için yumurta kabuklarını %70 etanol ile yıkayın.Kaşıkla hafifçe vurarak yumurtayı hava boşluğu üzerinden dikkatlice açın. Kırılan yumurta kabuklarını, bir mililitrelik iğneye sahip pensler kullanarak temizleyin. Yumurta sarısını çatlatmadan Alantoin membranını çıkarın.Tavuk embriyosunu bir spatula ile sabitleyin ve 10 mililitrelik bir pipeti allantois sıvısına yönlendirin. Mümkün olduğunca fazla allantois sıvısı toplayın. Her yumurta için 8 ila 12 mililitreyi buz üzerindeki 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.Yumurta sarısını kırmadan veya toplamadıktan sonra, beş dakika boyunca dört derece Celsius'ta santrifüjleyin ve Alantoin sıvısını buz üzerinde taze 15 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın. Tüpleri, HA testi ile kurtarılmış virüs varlığı kontrol edilene kadar dört derece Celsius'ta bekletin. HA testi, VBO 96 kuyucuklu plakalar kullanılarak; negatif kontroller için PBS 1X ve pozitif kontroller için doku kültürü kullanılarak gerçekleştirilir.Süpinasyon ve veya Alantoik sıvı, non-res influenza virüs enfeksiyonundan elde edilmeli ve her zaman NAHA analizine dahil edilmelidir. V tabanlı 96 kuyucuklu plakadaki her bir kuyucuğa 50 µL 1X PBS dağıtın; ilk kuyucuğa 50 µL MDCK doku kültürü süpernatantı ve veya enfekte yumurtalardan alınan alantoik sıvıyı ekleyin ve sonraki kuyucuklar için iki katlı seri dilüsyonlar hazırlayın.Son kuyucuktaki fazla 50 µL'yi atın. Her kuyucuğa 50 µL %0,5 ile %1'lik tavuk kırmızı kan hücreleri ekleyin; V tabanlı 96 kuyucuklu plakayı buz üzerinde 30 ila 45 dakika veya kuyucuk tabanında bir kırmızı çökelti görünene kadar inkübe edin. MDCK doku kültürü süpernatanlarındaki ve/veya enfekte yumurtalardan alınan allantoik sıvıdaki virüs varlığı, tavuk kırmızı kan hücrelerinin hemaglütinasyon özelliği kullanılarak makroskobik olarak belirlenebilir.Virüsün varlığı hemaglütinasyonu indüklerken, virüsün yokluğu kuyucuğun dibinde kırmızı bir çökelek oluşumuna izin verir. Ek olarak, doku kültürü süpernatantları veya yumurtalardan elde edilen alantoik sıvı ile enfekte edilen hücrelerde CPE, hücre yuvarlaklaşması, ölüm, yüzeyden kopma vb. durumların görülmesi, influenza virüsü durumunda viral kurtarmanın pozitif olduğunu gösterir; HA analizinde pozitif sinyal alabilmek için yaklaşık 10³ ila 10⁴ plak oluşturan birim (pfu) gereklidir. Bu nedenle, gerçek bir negatif sonucu teyit etmek için HA analizi ile paralel olarak bir immünofloresan analiz gerçekleştirilebilir.Bireysel viral partiküllerin varlığı, enfekte hücrelerin floresan işaretli antikorlarla boyanmasıyla tespit edilebildiği için, immünofloresan analizler kullanıldığında HA negatif süpernatantlar veya allantoik sıvılar pozitif sonuç verebilir. Bu durumda, virüs MDCK hücrelerinde veya yumurtalarda tekrar paketlenerek amplifiye edilmelidir. İkinci pasajdan elde edilen allantoik sıvı ve/veya doku kültürü süpernatantları artık HA analizinde açıkça pozitif olmalıdır.Böylece, plazmit DNA'dan influenza virüslerinin nasıl kurtarılacağını gördük. Plazmit DNA'dan influenza virüslerinin kurtarılması basit ve doğrudan bir işlemdir. Bu protokol, plazmit DNA'dan rekombinant influenza virüslerinin kurtarılması için orijinal olarak laboratuvarda gerçekleştirilmiştir.Rekombinant virüs başına üç bağımsız transfeksiyon öneriyoruz. Birden fazla rekombinant influenza virüsü kurtarma işlemi deneniyorsa, adımları kurtarılacak virüs sayısına göre ölçeklendirin. Plazmid DNA'dan rekombinant influenza virüslerini kurtarmak için kullanılan aşağıdaki transfeksiyon ve enfeksiyon protokolü, altılı kuyucuklu plaklar için uygun bir yöntemdir.Enfekte yumurtalardan LAN toik sıvılarını toplamak için yapılan tüm prosedürler steril koşullar altında gerçekleştirilir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

generation-of-recombinant-influenza-virus-from-plasmid-dna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Source: Philip, A. A., et al. Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the recovery of recombinant rotavirus by transfecting plasmids encoding viral genome segments into hamster kidney cells, followed by amplification in monkey epithelial cells, enabling studies of rotavirus biology, replication, and vaccine development.

Plasmid-Mediated Generation of Recombinant Rotavirus in Cultured Cells

Bu video, bir memeli sisteminde grip virüsü benzeri parçacıkların (VLP'ler) oluşumunu göstermektedir. Uygun memeli konakçı hücrelerinde farklı viral yapısal proteinleri kodlayan üç ökaryotik ekspresyon vektörünün eksprese edilmesinin ardından, eksprese edilen viral proteinler, konakçı plazma zarı üzerinde VLP'lere kendi kendine birleşir ve hücre yüzeyinden tomurcuklanma yoluyla salınır.

Bir memeli sistemi aracılığıyla influenza virüsü benzeri parçacıkların üretilmesi için bir teknik

Video, soğuğa uyarlanmış rekombinant influenza virüsleri oluşturmak için bir yöntem gösteriyor. İnsan hücrelerinin çift yönlü plazmitlerle transfekte edilmesini, ardından daha sıcak koşullarda azaltılmış replikasyon ile karakterize edilen aşı üretimine uygun virüsler elde etmek için daha düşük sıcaklıkta inkübasyonun inkübasyonunu içerir.

Aşılar için Rekombinant Canlı Zayıflatılmış İnfluenza Virüslerinin Üretilmesi

Burada böcek hücrelerinde yeni Çin H7N9 virüsünden türetilen doğru katlanmış ve işlevsel bir influenza virüsü yüzey antijenlerini eksprese etmek için bir yol tarif eder. Bu teknik, bir viral veya hücre yüzey proteinlerinin ektoalanlarının ifade etmek için uyarlanabilir.

Bakülovirüs İfade Sistemi ile Novel H7N9 influenza virüs hemaglutinin Fonksiyonel rekombinant ve Neuraminidase Proteinlerin İfadesi

Geçici baskın seçim yöntemini kullanarak floresan etiketli proteinleri aynı anda ifade eden rekombinant vaksinia virüslerinin üretimi için hızlı ve modüler bir protokol burada açıklanmıştır.

Floresan Etiketli Vaksinia Virüs Proteinlerinin Verimli Üretimi için Metodoloji

Aşıların nasıl çalıştığı hakkında genel bir bilgi eksikliği var. Burada, dendritik hücrelere ve T hücresi bağışıklığına özel olarak odaklanarak, aşılara karşı erken konak bağışıklık tepkileri hakkında fikir edinmek için ters genetik ve kemik iliği kimerik farelerin birlikte kullanılmasını öneriyoruz.

Kimerik fare modellerinde Rekombinant Grip aşıların burun içinde yoluyla mukozal bağışıklık Okumak

Burada, bakulovirüs ya da memeli sentezleme sistemleri ve ultrasantrifügasyon arıtma kullanarak virüs benzeri partiküller sentezlenmesi için bir protokol mevcut. Bu son derece özelleştirilebilir yaklaşım, güvenli ve esnek bir şekilde aşı hedefleri olarak viral antijenleri tanımlamak için kullanılır.

İfade ve Aşılama için Virüs benzeri Parçacıkların saflaştırılması

Biz bir yöntem tarafından grip A virüs viral hemagglutinin hedef insan veya fare monoklonal antikorlar bağlama için gerekli kritik artıkları tanımlamak açıklar. İletişim kuralı diğer virüs yüzey glikoproteinlerin ve onların karşılık gelen nötralize antikorlar için adapte edilebilir.

Grip virüsü monoklonal antikorları nötralize kaçış türevleri üretimi

Bu protokol, iki influenza A suşlarından zarf glikoproteinleri ile yüksek titreyen enfeksiyöz viral psödotipli parçacıklar (pp) üretmek için deneysel bir süreci ve bunların enfekteliğini nasıl belirleyeceklerini açıklamaktadır. Bu protokol, farklı zarf glikoproteinleri ile zarflı virüslerin herhangi bir tür pps geliştirmek için son derece uyarlanabilir.

Yüksek Patojenik H5N1 ve Kuş H7N9 Virüslerinden Zarf Glikoproteinleri Ile Yüksek Titer Enfeksiyöz İnfluenza Pseudotyped Partiküllerin Üretimi

Plazmid DNA'sından rekombinant rotavirüslerin üretimi, rotavirüs replikasyonu ve patogenezinin incelenmesi, rotavirüs ekspresyonu vektörleri ve aşılarının geliştirilmesi için gerekli bir araçtır. Burada, floresan muhabir proteinleri ifade eden suşlar da dahil olmak üzere rekombinant rotavirüsler imal etmek için basitleştirilmiş bir ters genetik yaklaşımını tanımlıyoruz.

Rekombinant Rotavirüsleri İyileştirmek Için Basitleştirilmiş Ters Genetik Yöntemi Muhabir Proteinleri İfade Ediyor

Bu konak aralığı seçimi ve rekombinant virüslerin görsel kimlik kullanarak "scarless" rekombinant vaccinia virüsler oluşturmak için bir yöntemdir.

Host Aralığı ve Görsel Seçimi Kullanarak Rekombinant Poxviruses Hızlı, Sorunsuz Nesil

Öğrenin, plazmid DNA kullanarak rekombinant grip virüsü üretme yöntemini. 293T ve MDCK hücrelerine transfeksiyon yaparak virüsü çoğaltın ve hemaglütinasyon testiyle doğrulayın. Bu teknik, aşı geliştirme ve viral vektör çalışmaları için kritik öneme sahiptir.

Plazmid DNA Rekombinant Grip Virüsü Üretimi

Daha fazla video keşfet