Kalp Fonksiyonu ve Enerji Kullanımı İzole Fare Kalpler Değerlendirilmesi 31 P NMR Spektroskopisi
August 31st, 2010
Langendorff-mode ile birlikte izole kalp perfüzyon 31 P NMR spektroskopisi bir deney, biyokimya ve fizyoloji alanlarında birleştirir. Protokol dinamik ölçümü için yüksek enerjili fosfat içeriği ve fizyolojik fonksiyonu aynı anda izlerken kalp ciro sağlar. Doğru yapıldığında, bu kalp enerji değerlendirilmesinde değerli bir tekniktir.
Aşağıdaki deneyin genel amacı, izole edilmiş perfüze edilmiş bir fare kalbinde kardiyak fonksiyonu ve enerjiyi gözlemlemektir. Bu, LOR modunda bir fare kalbinin perfüze edilmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak glikoz ve piruvat ile zenginleştirilmiş Krebs el seçimi tamponu ile sol ventriküle veya lv'ye su dolu bir balon yerleştirilir, bu da deney sırasında kardiyak fonksiyonun sürekli izlenmesini sağlar.
Daha sonra, kalp 10 milimetrelik bir NMR tüpüne yerleştirilir ve bir TP'nin fosfokreatin fosfatlarının rezonanslarını gözlemleyerek kardiyak enerjiyi değerlendirmek için mıknatısa yerleştirilir ve LV basınç dalgalarına ve P 31'e ve bir kütle spektroskopisine dayalı kardiyak fonksiyon ve enerjileri gösteren inorganik fosfat sonuçları elde edilir. Merhaba, Ben Washington Üniversitesi Anesteziyoloji Bölümü'ndeki MIT Kadro Metabolizma Merkezi'nden Steve Kitz. Bugün size 31 PNMR spektroskopisi ile birlikte izole kalp perfüzyonu için bir prosedür göstereceğim.
Laboratuvarımızda, biyomühendislik ürünü fare modellerimizde kardiyak fonksiyonu ve enerjiyi değerlendirmek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu protokole başlamak için bir litre kre, dolayısıyla hafif veya KH tamponu hazırlayın.
Karışıma 10 ila 15 dakika boyunca %5 karbondioksit ve %95 oksijen kabarcıkları ekleyin. Daha sonra iki milimolar kalsiyum klorür, ardından substratlar, 10 milimolar glikoz ve 0.5 milimolar piruvat ekleyin. Bu deneyler için, P 31 Spectra'nın elde edilmesi başına aynı anda iki ayrı sistem kullanılır.
Bir BRUER 14 T mıknatıs, kardiyak fonksiyonun değerlendirilmesi için gelişmiş üç konsol ve top spin V 2.1 yazılımı ile donatılmış bir bilgisayar ile arayüzlenir. Özel olarak üretilmiş bir kalp perfüzyon sistemi, güç laboratuvarı ile arayüzlenir. Dört adet 30 veri talebi.
Veri analizi için laboratuvar şeması PRO altı yazılımı ile donatılmıştır. Kalp perfüzyon aparatı, NMR deneyi sırasında KH tamponunu kalp sıcaklığına perfüze etmek için kullanılan bir STH pompa kontrolörü tarafından kontrol edilen bir mini darbeli üç peristaltik pompa içerir, düzenleme kritiktir. Isıtmalı sirkülatörler, kalp mıknatısın içindeyken sıcaklığı 37.0 ila 37.5 santigrat derece arasında tutmak için kullanılır ve sıcaklık, bir fiber optik sıcaklık probu kullanılarak deney süresince izlenir.
Deney boyunca, AG basıncı ve perfüzyon basıncı, bir veri toplama sistemine bağlı olan ve birlikte verilen yazılım kullanılarak görüntülenen basınç transdüserleri aracılığıyla izlenir. LV basıncını izlemek için fizyolojik bir dönüştürücü kullanılır ve perfüzyon basıncını izlemek için tek kullanımlık bir kan basıncı dönüştürücü kullanılır. Son olarak, ısıtılmış oksijenli tamponu kalbe sağlamak için bir göbek kordonu kullanılır.
Mıknatısın içine girdikten sonra, deneyin başlamasından önce, kalibrasyonu sıfırlamak için basınç transdüserlerini standart incir moment manometresi ilk etapta kalibre edin, dönüştürücüye basınç uygulamayın. Ardından bu incir modu manometresini daha yüksek bir basınca şişirin. Bu değeri bilgisayar programına girin.
Ardından, bu incir moment manometresini bilinen basınçlara şişirerek ve bunları bilgisayar ekranında doğrulayarak basınç transdüserlerinin yeterince kalibre edildiğini onaylayın. Basınç transdüserleri kalibre edildikten sonra, NMR probunu standart bir 150 milimolar sodyum fosfat numunesi içeren 10 milimetrelik bir NMR tüpü ile kalibre edin. Top spin yazılım programını kullanarak kalibrasyonu gerçekleştirin.
İlk olarak, fosfor rezonansının frekansını ayarlamak için numuneyi ayarlayın. Daha sonra homojen bir manyetik alan oluşturmak için numuneyi şimleyin. Bu ilk kalibrasyon, sinyali kolaylaştırır ve alım periyoduna başlamak için gereken süreyi azaltır.
Kalp, fare kalbi ekstraksiyonunu başlatmak için probun içine yerleştirildikten sonra, pıhtılaşmayı azaltmak için fareye 200 ünite intraperitoneal heparin enjekte edin. Beş dakika sonra, kilogram sodyum Penta barbital intraperitoneal başına 175 miligram uygulayın. Fare uyuşturulduktan sonra, sırt üstü yatırın ve göğüs bölgesini ortaya çıkarmak için kolları ve bacakları bantlayın.
Farenin tamamen uyuşturulduğundan emin olmak için ayak parmağınızı kıstırın. Kesmek. Periton boşluğunu ve göğsü makasla açın ve göğüs kafesini soymak için forseps kullanın ve forseps ile göğüs boşluğunu ortaya çıkarın. Akciğer dokusunu tutun ve kalbi kavisli makasla nazikçe kaldırın.
Kalbin arkasındaki büyük damarları kesin ve kalp serbest kalana kadar farenin başına doğru yavaşça devam edin. Kalbi hemen buz gibi soğuk KH tamponunda tutuklayın. Organları buz üzerinde tutun ve akciğerleri hızla çıkarın.
Timusun loblarını tanımlayın ve aortu ortaya çıkarmak için nazikçe soyun. Sonra timusu çıkarın. Son olarak, çevredeki dokuyu dikkatlice çıkararak aortu izole edin.
Mikro dikiş forsepsleri kullanarak, lümeni ortaya çıkarmak için genellikle aortun her iki duvarını da tutun. Daha sonra aortu dikkatlice kanülün üzerine yerleştirin. 0.965 milimetre dış çaplı polietilen borudan yapılmıştır.
Aortu bir mikro damar kelepçesi ile yerinde tutun ve aortun etrafına hızlı bir şekilde dikişler atın. Dikişler bağlandıktan sonra kelepçeyi çıkarın. Kanülün aort kökünün üzerinde olup olmadığını dikkatlice kontrol etmek için forsepsleri kullanın.
Kalbi yerinde tutmak için gerekli olan ek bağları ekleyin. Forseps ve mikro makas kullanarak fazla dokuyu çıkarın. Ardından sol kehanete küçük bir kesi yapın.
Kalbi nazikçe tutun ve 0.61 milimetre od polietilen boruyu sol atriyumdan, sol ventrikül boşluğundan ve apeksten dikkatlice yerleştirin. Fazla boruyu kesin. Ardından, atriyumdan sol ventriküle sönmüş su dolu bir balon yerleştirin.
Yapışkan bant kullanarak balonu yerinde tutun. Daha sonra kalbe yeterli akış sağlamak için peristaltik pompa hızını kademeli olarak artırın. Kalp NMR probuna yerleştirilene kadar dakikada yaklaşık iki mililitreye eşdeğer sabit bir akış kullanarak kalbi KH tamponu ile perfüze etmeye devam edin.
LV basınç dönüştürücüsünün NMR spektroskopisi için çalıştığını doğrulamak için bir mikrometre şırınga kullanarak LV balonunu küçük bir hacimle şişirin. İlk olarak, kalbi dikkatlice 10 milimetrelik bir NMR tüpüne yerleştirin. Tüpü uygun konuma yönlendirmeye yardımcı olmak için NMR tüpünün etrafına geniş bir yaban domuzu döndürücü yerleştirilmiştir.
Prob içinde, tüm aparatı yapışkan bantla göbek kordonuna sıkıca tutturun. Daha sonra, kalbi içeren NMR tüpü 10 milimetre NMR probunun bobininin içine girene kadar göbek kordonunu yavaşça mıknatısın üst deliğine indirin. Kalp prob içinde uygun konuma geldiğinde, 80 milimetre cıvalık bir perfüzyon basıncı elde etmek için parazitik pompa akışını ayarlayın.
Pompa kontrol cihazındaki tutma mekanizmasını etkinleştirerek perfüzyon basıncını koruyun. Kalp için 15 ila 20 dakikalık bir e dengeleme periyoduna izin verin. Denge periyodu boyunca, sekiz ila 10 milimetre cıvalık bir diyastolik basınç elde etmek için LV balonunun hacmini ayarlayın.
Ardından, mümkün olan en iyi fosfor sinyalini elde etmek için spektrometre parametrelerini optimize edin. Radyo darbesini, fosfor çekirdeğinin rezonansa girdiği frekansı ayarlayarak NMR cihazını ayarlayın. Ardından, dengeleme süresinden sonra manyetik alanı homojen hale getirmek için numuneyi şim yapın.
Birden fazla P 31 NMR Spectra edinimine başlayın. Her spektrum için edinme süresi, mıknatısın alan gücüne, numunenin boyutuna ve belirli bir deney için gereken sinyal-gürültü oranına bağlıdır. Burada spektrumlar, 14 Tesla mıknatısı kullanılarak, 60 derecelik bir çevirme açısı ve 2.0 saniyelik gecikmelerle 20 mikrosaniyelik 256 radyo frekansı darbesinden elde edilen sinyalin ortalaması alınarak elde edilir.
Bu deney yaklaşık 10 dakika sürecektir. Kardiyak fonksiyonun tipik bir ölçüsü olan LV tarafından geliştirilen basınç, diyastol sonu basıncının veya EDP'nin sistolik basınçtan çıkarılmasıyla elde edilir. Normal bir C 57 siyah altı farede, kalp LV geliştirilen basınç tipik olarak sekiz ila 10 milimetre cıvanın sabit uç diyastolik basıncında 100 ila 110 milimetre cıva arasındadır.
Temsili stil eğrileri, kontrol ve aort bantlı farelerden gösterilir. Sistolik fonksiyon, LV balonunun hacmi tarafından belirlendiği gibi, artan LV hacimleri üzerinde LV tarafından geliştirilen basınç ile temsil edilir. Diyastolik fonksiyon, artan LV hacimleri üzerinde EDP ile temsil edilir.
İzole edilmiş perfüze bir fare kalbinin P 31 NMR spektrumu, bir TP ve inorganik fosfat veya pi'den gelen üç fosfat olan FOSFOKREATİN veya PCR sinyallerini sağlar. Burada, PI zirvesi nispeten küçüktür. Bu, piruvat veya yağ asitleri ile beslenen aerobik olarak bol miktarda bulunan bir kalbin tipik bir örneğidir.
İskemi dönemlerinde glikoza ek olarak, PCR zirvesi azalırken bu tepe artar. Az önce size bir fare kalbini perfüzyon için nasıl hazırlayacağınızı gösterdim, böylece deney sırasında hem kardiyak fonksiyon hem de enerji aynı anda ölçülebilir. Kalbin yeterince perfüze edildiğinden emin olmak önemlidir.
Aksi takdirde, NMR verileriniz güvenilir olmayacaktır. İşte bu kadar. Teşekkür ederim ve deneylerinizde iyi şanslar.
Genel Bakış
Bu makale, 31P NMR spektroskopisi ile birleştirilmiş Langendorff modu izole kalp perfüzyonu için bir protokolü ayrıntılandırmaktadır ve bu yöntem, kardiyak enerjetiğin dinamik ölçümünü sağlar. Yöntem, izole bir fare kalbindeki yüksek enerji fosfat içeriği ve kardiyak fonksiyonun eşzamanlı izlenmesini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kardiyak fizyoloji
- Biyokimya
- NMR spektroskopisi
Arka Plan
- Langendorff perfüzyonu, kalp fonksiyonunu incelemek için kullanılan bir tekniktir.
- 31P NMR spektroskopisi, kardiyak dokulardaki enerji metabolizması hakkında bilgi sağlar.
- Bu yöntem, kardiyak enerjetiğin gerçek zamanlı değerlendirilmesini sağlar.
- Kardiyak enerjetiğin anlaşılması, kalp sağlığı ve hastalığının değerlendirilmesi için kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- İzole bir fare kalbindeki kardiyak fonksiyon ve enerjetiğini gözlemlemek.
- Çeşitli substratların kardiyak performansa etkisini değerlendirmek.
- Gelecekteki kardiyak enerjetik çalışmalar için güvenilir bir protokol geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Glukoz ve pirüvat ile Krebs-Henseleit tamponunun hazırlanması.
- Basınç izleme için sol ventriküle su dolu balonun yerleştirilmesi.
- Kardiyak enerjetiği değerlendirmek için 10 mm NMR tüpünün kullanımı.
- Doğru ölçümler için basınç transdüserlerinin ve NMR problarının kalibrasyonu.
Ana Sonuçlar
- Fare kalbinin başarılı bir şekilde izole edilmesi ve perfüzyonu.
- Sol ventrikül basıncı ve perfüzyon basıncının gerçek zamanlı izlenmesi.
- Deney sırasında yüksek enerji fosfatlarının dinamik ölçümü.
- Substrat kullanılabilirliği ve kardiyak fonksiyon arasındaki ilişkiye dair bilgiler.
Sonuçlar
- Protokol, fizyolojik ve biyokimyasal değerlendirmeleri etkili bir şekilde birleştirir.
- Araştırma ortamlarında kardiyak enerjetiği incelemek için değerli bir araç sağlar.
- Gelecek çalışmalar bu metodoloji üzerine inşa ederek kardiyak sağlığı araştırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables simultaneous assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts, providing a physiologically relevant system for evaluating molecular modifications in cardiovascular disease models. By integrating Langendorff perfusion with 31P NMR spectroscopy, researchers can obtain real-time, quantitative readouts of high-energy phosphate metabolites alongside hemodynamic parameters, supporting mechanistic de-risking in target validation and preclinical screening workflows. The approach enhances predictive confidence by linking molecular alterations to functional and metabolic phenotypes in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring how genetic or pharmacological interventions affect cardiac energetics and function in intact, beating hearts.
- Operational Value: Enables functional target validation through simultaneous monitoring of LV developed pressure and phosphocreatine/ATP levels under physiological or pathologic stress.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds or genetic modifications that preserve energetic homeostasis during ischemia/reperfusion or high-workload challenges.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline cardiac function and metabolite levels in a reproducible, Langendorff-perfused format.
- Quantitative Outputs: Generates simultaneous, real-time measurements of hemodynamic function (LV pressure) and biochemical energetics (PCr, ATP, Pi) for multi-parametric assay development.
- Scalability & Reuse: The isolated heart platform can be adapted across disease models (e.g., aortic banding, transgenic models) to enable consistent, cross-project evaluation of cardiac safety and efficacy signals.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly assesses the functional and energetic significance of molecular modifications in transgenic models of cardiac pathology, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery-phase target validation with preclinical evaluation by providing a quantitative, physiologically anchored readout of cardiac health.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs go/no-go criteria by detecting early energetic dysfunction that may predict late-stage clinical failure in cardiovascular programs.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization to preclinical assessment, offering a reusable platform for evaluating cardiac liability and target engagement in disease-relevant systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by linking genetic or pharmacological perturbations to measurable changes in cardiac energetics and contractile function.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility through controlled perfusion conditions, real-time pressure monitoring, and consistent NMR spectral acquisition.
- Analytics: Delivers quantitative, multi-parametric readouts (LV developed pressure, end-diastolic pressure, PCr/ATP ratios, Pi shifts) that allow objective comparison across experimental conditions and compound treatments.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical validation by maintaining physiological relevance while enabling biochemical interrogation of metabolic pathways in intact hearts.
- Enterprise Reuse: Represents a scalable, cross-functional capability applicable to cardiovascular, metabolic, and mitochondrial toxicity programs across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by correlating molecular changes with direct measurements of cardiac function and high-energy phosphate metabolism.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized buffer preparation, temperature control, pressure transducer calibration, and NMR shimming procedures.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by identifying cardiotoxic or metabolically disruptive compounds early, reducing late-stage attrition in cardiovascular drug development.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of targets and leads by providing early insight into energetic reserve and stress resilience in disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in isolated heart perfusion, NMR spectroscopy, and pressure transducer calibration.
- Dependent on access to high-field NMR spectrometers (e.g., 14T) and specialized perfusion hardware compatible with magnet bore constraints.
- Necessitates cross-team standardization between physiology, pharmacology, and NMR analytics teams for consistent data acquisition and interpretation.
- Adaptation considerations include model-specific adjustments to perfusion pressure, balloon volume, and substrate composition based on disease phenotype or genetic background.
- Practical limitations include signal-to-noise constraints in low-abundance metabolite detection and the need for rigorous exclusion of ischemic artifacts during setup.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:59
Introduction
1:25
Experimental Set-up
4:33
Isolated Heart Preparation
9:43
Representative Results of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy
7:41
Assessment of Cardiac Function and Energetics Using 31P NMR Spectroscopy
11:09
Conclusion
![Hiperpolarize [1-13 C] Piruvat ve13 C/31P NMR Spektroskopisi ile İzole Perfüze Fare Kalbinde Kardiyak Metabolizmanın İncelenmesi](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F63188.jpg%3Fv%3D2026-07-08T02%253A46%253A50.867Z&w=384&q=75)
