Kalp Fonksiyonu ve Enerji Kullanımı İzole Fare Kalpler Değerlendirilmesi 31 P NMR Spektroskopisi
31 Ağustos 2010
Langendorff-mode ile birlikte izole kalp perfüzyon 31 P NMR spektroskopisi bir deney, biyokimya ve fizyoloji alanlarında birleştirir. Protokol dinamik ölçümü için yüksek enerjili fosfat içeriği ve fizyolojik fonksiyonu aynı anda izlerken kalp ciro sağlar. Doğru yapıldığında, bu kalp enerji değerlendirilmesinde değerli bir tekniktir.
Aşağıdaki deneyin genel amacı, izole perfüze edilmiş bir fare kalbinde kardiyak fonksiyonu ve enerjetiği gözlemlemektir. Bu, fare kalbinin LOR modunda perfüze edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak glukoz ve piruvat ile zenginleştirilmiş Krebs tamponu kullanılarak, deney boyunca kardiyak fonksiyonun sürekli izlenmesine olanak tanıyan su dolu bir balon sol ventriküle veya lv'ye yerleştirilir.
Ardından, kalp 10 milimetrelik bir NMR tüpüne yerleştirilir ve kalp enerjetiğini TP'nin fosfokreatin fosfat rezonanslarını gözlemleyerek değerlendirmek amacıyla mıknatısa yerleştirilir; LV basınç dalgaları, P 31 ve kütle spektroskopi p'ye dayalı olarak kalp fonksiyonunu ve enerjetiğini gösteren inorganik fosfat sonuçları elde edilir. Merhaba, ben Washington Üniversitesi Anesteziyoloji Bölümü'ndeki MIT Cadre Metabolizma Merkezi'nden Steve Kitz. Bugün size 31 PNMR spektroskopisi ile kombine edilmiş izole kalp perfüzyonu prosedürünü göstereceğim.
Bu prosedürü, biyomühendislik ürünü fare modellerimizde kalp fonksiyonlarını ve enerjetiğini değerlendirmek için laboratuvarımızda kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu protokole başlamak için bir litre Krebs-Henseleit veya KH tamponu hazırlayın.
Karışıma 10 ila 15 dakika boyunca %5 karbon dioksit ve %95 oksijen kabarcıkları verin. Ardından iki milimolar kalsiyum klorür ve sonrasında substratlar olan 10 milimolar glikoz ile 0,5 milimolar piruvat ekleyin. Bu deneyler için, her P 31 Spektra alımında iki ayrı sistem eş zamanlı olarak kullanılır.
Kardiyak fonksiyon değerlendirmesi için bir BRUER 14 T mıknatıs, gelişmiş üç konsola ve top spin V 2.1 yazılımı yüklü bir bilgisayara bağlanmıştır. Özel yapım bir kalp perfüzyon sistemi, power lab ile entegre edilmiştir. Dört 30 veri talebi.
Veri analizi için lab chart PRO six yazılımı ile donatılmıştır. Kalp perfüzyon düzeneği, KH tampon çözeltisini kalbe perfüze etmek için kullanılan ve bir STH pompa kontrolörü tarafından yönetilen mini pulse three peristaltik pompayı içerir. NMR deneyi sırasında sıcaklık regülasyonu kritik öneme sahiptir. Kalp mıknatıs içerisindeyken sıcaklığı 37,0 ile 37,5 degrees Celsius arasında tutmak için ısıtmalı sirkülatörler kullanılır ve deney süresince sıcaklık, fiber optik bir sıcaklık probu ile izlenir.
Deney boyunca, LV basıncı ve perfüzyon basıncı, bir veri toplama sistemine bağlı basınç dönüştürücüleri aracılığıyla izlenir ve beraberindeki yazılım kullanılarak görüntülenir. LV basıncını izlemek için fizyolojik bir dönüştürücü, perfüzyon basıncını izlemek için ise tek kullanımlık bir kan basıncı dönüştürücüsü kullanılır. Son olarak, ısıtılmış oksijenli tampon çözeltiyi kalbe iletmek için bir göbek kordonu kullanılır.
Deney başlamadan önce, mıknatıs içerisine girdikten sonra, önce basınç dönüştürücülerini standart fig moment manometresi ile kalibre edin; kalibrasyonu sıfırlamak için dönüştürücüye hiç basınç uygulamayın. Ardından, bu fig mod manometresini daha yüksek bir basınca kadar şişirin. Bu değeri bilgisayar programına girin.
Ardından, bu fig moment manometresini bilinen basınçlara kadar şişirip bunları bilgisayar ekranından doğrulayarak basınç dönüştürücülerin yeterince kalibre edildiğini onaylayın. Basınç dönüştürücüler kalibre edildikten sonra, NMR probunu 150 millimolar sodyum fosfat içeren standart bir numuneli 10 milimetrelik bir NMR tüpü ile kalibre edin. Kalibrasyonu top spin yazılım programını kullanarak gerçekleştirin.
Öncelikle, fosfor rezonansının frekansını ayarlamak için numuneyi akort edin. Ardından, homojen bir manyetik alan oluşturmak için numunenin shim ayarını yapın. Bu başlangıç kalibrasyonu sinyali kolaylaştırır ve veri toplama dönemini başlatmak için gereken süreyi azaltır.
Fare kalp ekstraksiyonuna başlamak için kalp probun içine yerleştirildiğinde, koagülasyonu azaltmak için fareye intraperitonal olarak 200 ünite heparin enjekte edin. Beş dakika sonra, intraperitonal olarak kilogram başına 175 miligram sodyum Pentobarbital uygulayın. Fare anestezi altına alındığında, hayvanı sırt üstü yatırın ve göğüs bölgesini açığa çıkarmak için kollarını ve bacaklarını bantla sabitleyin.
Fareyle tam olarak anestezi altında olduğundan emin olmak için ayak parmağı sıkıştırma testi yapın. Periton boşluğunu ve göğüs kafesini makasla açın; kaburga kafesini geriye çekmek ve toraks boşluğunu açığa çıkarmak için pens kullanın. Akciğer dokusunu tutun ve kalbi kavisli makasla nazikçe kaldırın.
Kalbin arkasındaki büyük damarları kesin ve kalp serbest kalana kadar yavaşça farenin başına doğru ilerleyin. Kalbi hemen buz gibi soğuk KH tamponu içinde durdurun. Organları buz üzerinde tutun ve akciğerleri hızla çıkarın.
Timus loblarını belirleyin ve aortu açığa çıkarmak için bunları nazikçe geriye doğru soyun. Ardından timusu çıkarın. Son olarak, etraftaki tüm dokuları dikkatlice temizleyerek aortu izole edin.
Mikro sütür forsepi kullanarak, lümeni açığa çıkarmak için genellikle aortun her iki duvarını da tutun. Ardından aortu dikkatlice kanülün üzerine yerleştirin. Kanül, 0.965 millimeter dış çaplı polietilen tüpten yapılmıştır.
Aortayı bir mikro damar klempiyle sabit tutun ve aortanın etrafına hızlıca sütürler bağlayın. Sütürler bağlandıktan sonra klempi çıkarın. Kanülün aort kökünün üzerinde olduğunu dikkatlice kontrol etmek için pens kullanın.
Kalbi sabit tutmak için gerekli olan ek bağları ekleyin. Pens ve mikro makas kullanarak fazla dokuları temizleyin. Ardından, sol aurikula küçük bir insizyon yapın.
Kalbi nazikçe tutun ve 0.61 millimeter od polietilen tüpü sol atriumdan, sol ventrikül boşluğundan geçirerek apeks üzerinden dışarı çıkaracak şekilde dikkatlice yerleştirin. Fazla tüp kısmını kesin. Ardından, sönük ve suyla dolu bir balonu atrium üzerinden sol ventriküle yerleştirin.
Balonu yapışkan bant kullanarak sabitleyin. Ardından, kalbe yeterli akış sağlamak için peristaltik pompanın hızını kademeli olarak artırın. Kalp NMR probuna yerleştirilene kadar, dakikada yaklaşık iki mililitreye eşdeğer sabit bir akış kullanarak kalbi KH tamponu ile perfüze etmeye devam edin.
NMR spektroskopisi için LV basınç transduserinin çalıştığını doğrulamak amacıyla, bir mikrometre şırınga kullanarak LV balonunu küçük bir hacimle şişirin. İlk olarak, kalbi dikkatlice 10 milimetrelik bir NMR tüpüne yerleştirin. Tüpün doğru konuma yerleştirilmesine yardımcı olmak için NMR tüpünün etrafına geniş ağızlı bir spinner yerleştirilir.
Probun içinde, tüm düzeneği yapışkan bantla göbek kordonuna sıkıca sabitleyin. Ardından, kalp içeren NMR tüpü 10 milimetrelik NMR probunun bobininin içine girene kadar göbek kordonunu mıknatısın üst borusuna yavaşça indirin. Kalp probun içinde uygun konuma geldiğinde, 80 milimetre cıva perfüzyon basınacına ulaşmak için parazit pompa akışını ayarlayın.
Pompa kontrolöründeki tutma mekanizmasını etkinleştirerek perfüzyon basıncını koruyun. Kalp için 15 ila 20 dakikalık bir dengeleme süresi tanıyın. Dengeleme süresi boyunca, sekiz ila 10 mmHg'lik bir end diyastolik basınç elde etmek için LV balonunun hacmini ayarlayın.
Ardından, mümkün olan en iyi fosfor sinyalini elde etmek için spektrometre parametrelerini optimize edin. NMR cihazını, fosfor çekirdeğinin rezonansa girdiği frekans olan radyo darbesini ayarlayarak optimize edin. Daha sonra, dengeleme süresinden sonra manyetik alanı homojen hale getirmek için numuneye shim işlemi uygulayın.
Birden fazla P 31 NMR Spektra alımına başlayın. Her bir spektrum için alım süresi; mıknatısın alan şiddetine, numunenin boyutuna ve belirli bir deney için gereken sinyal-gürültü oranına bağlıdır. Burada spektrumlar, 14 Tesla'lık bir mıknatıs kullanılarak, 60 derecelik çevirme açısına ve 2.0 saniyelik gecikmelere sahip 20 mikrosaniyelik 256 radyo frekans pulsundan elde edilen sinyallerin ortalaması alınarak elde edilir.
Bu deney yaklaşık 10 dakika sürecektir. Kardiyak fonksiyonun tipik bir ölçümü olan LV gelişen basınç, sistolik basınçtan end diyastolik basıncın veya EDP'nin çıkarılmasıyla elde edilir. Normal bir C 57 black six faresinde, kalp LV gelişen basıncı, 8 ila 10 mmHg sabit end diyastolik basınçta genellikle 100 ila 110 mmHg arasındadır.
Kontrol ve aortik bantlı farelerden elde edilen temsili stilleme eğrileri gösterilmektedir. Sistolik fonksiyon, LV balon hacmi ile belirlenen artan LV hacimleri üzerindeki LV gelişen basıncı ile temsil edilir. Diyastolik fonksiyon ise artan LV hacimleri üzerindeki EDP ile temsil edilir.
İzole perifüze fare kalbinin P 31 NMR spektrumları, PHOSPHOCREATINE veya PCR, bir TP'den gelen üç fosfat ve inorganik fosfat veya pi sinyalleri sağlar. Burada, PI piki nispeten küçüktür. Bu durum, piruvat veya yağ asitleri ile beslenen aerobik olarak perifüze bir kalp için tipiktir.
İskemi dönemlerinde glikoza ek olarak, bu pik artarken PCR piki azalır. Deney sırasında hem kalp fonksiyonlarının hem de enerjetiğin eş zamanlı olarak ölçülebilmesi için fare kalbinin perfüzyona nasıl hazırlanacağını az önce gösterdim. Kalbin yeterli düzeyde perfüze edildiğinden emin olmak önemlidir.
Aksi takdirde, NMR verileriniz güvenilir olmayacaktır. İşte bu kadar. Teşekkür ederiz, deneylerinizde başarılar dileriz.
Genel Bakış
Bu makale, kardiyak enerjetiklerin dinamik ölçümüne olanak tanıyan, 31P NMR spektroskopisi ile kombine edilmiş Langendorff modunda izole kalp perfüzyonuna yönelik bir protokolü detaylandırmaktadır. Bu yöntem, izole bir fare kalbinde yüksek enerjili fosfat içeriğinin ve kalp fonksiyonunun eş zamanlı olarak izlenmesine imkan tanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kardiyak fizyoloji
- Biyokimya
- NMR spektroskopisi
Arka Plan
- Langendorff perfüzyonu, kalp fonksiyonlarını incelemek için kullanılan bir tekniktir.
- 31P NMR spektroskopisi, kalp dokularındaki enerji metabolizmasına dair bilgiler sağlar.
- Bu yöntem, kalp enerjetiğinin gerçek zamanlı olarak değerlendirilmesine olanak tanır.
- Kalp enerjetiğinin anlaşılması, kalp sağlığının ve hastalıklarının değerlendirilmesi için kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- İzole bir fare kalbinde kardiyak fonksiyonu ve energetiği gözlemlemek.
- Çeşitli substratların kardiyak performans üzerindeki etkisini değerlendirmek.
- Gelecekteki kardiyak energetik çalışmaları için güvenilir bir protokol geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Glukoz ve piruvat içeren Krebs-Henseleit tamponunun hazırlanması.
- Basınç izleme amacıyla sol ventriküle su dolu bir balon yerleştirilmesi.
- Kardiyak energetik değerlendirmesi için 10 mm NMR tüpünün kullanımı.
- Hassas ölçümler için basınç transdüserlerinin ve NMR problarının kalibrasyonu.
Temel Sonuçlar
- Fare kalbinin başarılı bir şekilde izole edilmesi ve perfüzyonu.
- Sol ventrikül basıncının ve perfüzyon basıncının gerçek zamanlı izlenmesi.
- Deney sırasında yüksek enerjili fosfatların dinamik ölçümü.
- Sübstrat mevcudiyeti ile kalp fonksiyonu arasındaki ilişkiye dair öngörüler.
Sonuçlar
- Protokol, fizyolojik ve biyokimyasal değerlendirmeleri etkili bir şekilde birleştirir.
- Araştırma ortamlarında kalp enerjetiğinin incelenmesi için değerli bir araç sunar.
- Gelecekteki çalışmalar, kalp sağlığını araştırmak için bu metodolojiyi temel alabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Değeri
Bu protokol, izole fare kalplerinde kardiyak fonksiyonun ve enerjetiğin eş zamanlı değerlendirilmesine olanak tanıyarak, kardiyovasküler hastalık modellerindeki moleküler modifikasyonların değerlendirilmesi için fizyolojik olarak uygun bir sistem sağlar. Langendorff perfüzyonunu 31P NMR spektroskopisi ile entegre ederek araştırmacılar, hemodinamik parametrelerin yanı sıra yüksek enerjili fosfat metabolitlerinin gerçek zamanlı, kantitatif okumalarını elde edebilirler; bu da hedef doğrulama ve preklinik tarama iş akışlarında mekanistik risk azaltma süreçlerini destekler. Bu yaklaşım, moleküler değişiklikleri hastalıkla ilişkili bir sistemdeki fonksiyonel ve metabolik fenotiplere bağlayarak öngörüsel güvenilirliği artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Genetik veya farmakolojik müdahalelerin, sağlam ve atan kalplerde kardiyak enerji metabolizmasını ve fonksiyonunu nasıl etkilediğini ölçerek terapötik hipotezleri sorgular.
- Operasyonel Değer: Fizyolojik veya patolojik stres altında LV gelişen basıncı ile fosfokreatin/ATP seviyelerinin eş zamanlı izlenmesi yoluyla fonksiyonel hedef doğrulamasını sağlar.
- Öngörücü Değer: İskemi/reperfüzyon veya yüksek iş yükü zorlamaları sırasında enerjetik homeostazı koruyan bileşikleri veya genetik modifikasyonları belirleyerek portföy seçimine destek olur.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Tekrarlanabilir, Langendorff perfüzyon formatında temel kardiyak fonksiyonu ve metabolit seviyelerini belirleyerek, valide edilmiş biyolojik sistemleri sonraki bileşik taramaları için hazırlar.
- Kantitatif Çıktılar: Çok parametreli analiz geliştirme için hemodinamik fonksiyonun (LV basıncı) ve biyokimyasal enerjetiğin (PCr, ATP, Pi) eş zamanlı, gerçek zamanlı ölçümlerini oluşturur.
- Ölçeklenebilirlik ve Yeniden Kullanım: İzole kalp platformu, kardiyak güvenlik ve etkinlik sinyallerinin projeler arası tutarlı değerlendirmesini sağlamak amacıyla farklı hastalık modellerine (örneğin, aortik bantlama, transgenik modeller) uyarlanabilir.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlgisi: Kardiyak patoloji transgenik modellerinde moleküler modifikasyonların fonksiyonel ve enerjik önemini doğrudan değerlendirerek translasyonel biyobelirteç uyumluluğunu destekler.
- Preklinik Süreklilik: Kardiyak sağlığın kantitatif ve fizyolojik olarak temellenmiş bir okumasını sağlayarak, keşif aşamasındaki hedef doğrulama ile preklinik değerlendirme arasında köprü kurar.
- Risk Ayarlı Kararlar: Kardiyovasküler programlarda geç evre klinik başarısızlığı öngörebilecek erken enerjik disfonksiyonu tespit ederek git/gitme (go/no-go) kriterlerini bilgilendirir.
Pipeline ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntem; hedef doğrulamasından öncü bileşik optimizasyonuna ve preklinik değerlendirmeye kadar uzanan keşif sürecine uyum sağlayarak, hastalıkla ilgili sistemlerde kardiyak risk ve hedef etkileşiminin değerlendirilmesi için yeniden kullanılabilir bir platform sunmaktadır.
- Keşif Biyolojisi: Genetik veya farmakolojik pertürbasyonları, kardiyak enerjetikteki ve kontraktil fonksiyondaki ölçülebilir değişikliklerle ilişkilendirerek hipotez testlerini ve yolak aydınlatmasını destekler.
- Tarama: Kontrollü perfüzyon koşulları, gerçek zamanlı basınç izleme ve tutarlı NMR spektral kazanımı yoluyla assay standardizasyonu ve tekrarlanabilirliği sağlar.
- Analitikler: Deneysel koşullar ve bileşik tedavileri arasında objektif karşılaştırmaya olanak tanıyan kantitatif, çok parametrik okumalar (LV gelişen basınç, end-diyastolik basınç, PCr/ATP oranları, Pi kaymaları) sunar.
- Translasyonel Araştırma: Bütün kalplerdeki metabolik yolakların biyokimyasal sorgulanmasına olanak tanırken fizyolojik uygunluğu koruyarak, erken keşif aşamasını preklinik validasyona bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla terapötik alan genelinde kardiyovasküler, metabolik ve mitokondriyal toksisite programlarına uygulanabilir, ölçeklenebilir ve çapraz fonksiyonel bir yetkinliği temsil eder.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Moleküler değişiklikleri, kalp fonksiyonlarının ve yüksek enerjili fosfat metabolizmasının doğrudan ölçümleriyle ilişkilendirerek mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış tampon hazırlama, sıcaklık kontrolü, basınç dönüştürücü kalibrasyonu ve NMR shimleme prosedürleri aracılığıyla tekrarlanabilirliği sağlar.
- Stratejik Değer: Kardiyotoksik veya metabolik olarak bozucu bileşikleri erkenden tanımlayarak, kardiyovasküler ilaç geliştirme süreçlerindeki geç aşama kayıplarını azaltır ve sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Hastalık modellerinde enerjik rezerv ve strese dayanıklılık hakkında erken içgörü sağlayarak, hedeflerin ve öncü bileşiklerin risk tabanlı önceliklendirilmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- İzole kalp perfüzyonu, NMR spektroskopisi ve basınç dönüştürücü kalibrasyonu konularında uzmanlık gerektirir.
- Yüksek alanlı NMR spektrometrelerine (örneğin, 14T) ve mıknatıs boşluğu kısıtlamalarıyla uyumlu özel perfüzyon donanımlarına erişime bağlıdır.
- Tutarlı veri toplama ve yorumlama için fizyoloji, farmakoloji ve NMR analiz ekipleri arasında ekipler arası standardizasyon gerektirir.
- Adaptasyon değerlendirmeleri; hastalık fenotipine veya genetik arka plana bağlı olarak perfüzyon basıncı, balon hacmi ve substrat bileşimine yönelik modele özgü ayarlamaları içerir.
- Pratik kısıtlamalar arasında, düşük bolluktaki metabolitlerin tespitindeki sinyal-gürültü oran kısıtlamaları ve kurulum sırasında iskemik artefaktların titizlikle dışlanması gerekliliği yer alır.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:00
Title
0:59
Introduction
1:25
Experimental Set-up
4:33
Isolated Heart Preparation
9:43
Representative Results of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy
7:41
Assessment of Cardiac Function and Energetics Using 31P NMR Spectroscopy
11:09
Conclusion
![Hiperpolarize [1-13 C] Piruvat ve13 C/31P NMR Spektroskopisi ile İzole Perfüze Fare Kalbinde Kardiyak Metabolizmanın İncelenmesi](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F63188.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A22.534Z&w=384&q=75)
