Name: Kalp Fonksiyonu ve Enerji Kullanımı İzole Fare Kalpler Değerlendirilmesi 31 P NMR Spektroskopisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-31T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Öğrenin, izole fare kalplerinde 31P NMR spektroskopisi ile kardiyak fonksiyon ve enerji metabolizmasını nasıl değerlendirebilirsiniz. Bu yöntem, yüksek enerjili fosfatları gerçek zamanlı izleyerek kalp sağlığı araştırmalarında kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar Lynne Spencer NMR spektroskopisi kısmı deney sırasında ona destek için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Ulusal Sağlık fon R01 HL059246 Enstitüleri, R01 HL067970, R01 HL088634 (Dr Tian) ve HL096284 F32 (Dr Kolwicz) hibe ile desteklendi.

<ol><li> Bu deneyler için, aynı anda iki ayrı sistem kullanılmaktadır. 31 P spektrumları edinimi için Bruker 14T mıknatıs Avance III konsol ve topspin V2.1 yazılımı ile donatılmış bir bilgisayar arayüzü. Kalp fonksiyonunun değerlendirilmesi için, özel bir kalp perfüzyon sistemi, veri analizi için LabChartPro 6 yazılımı ile donatılmış, PowerLab 4 / 30 veri toplama ile arabirim. </li><li> 0.5mm EDTA, 5.3mM KCl, 1.2mm MgSO 4, 118mm NaCl, ve 25mm NaHCO 3: Deney günü, Krebs-Henseleit tampon 1 litre şu şekilde hazırlanır. Bu karışım daha sonra% 5 CO 2 / O 2 2mm CaCl 2 ek olarak 10-15 dakika önce için% 95 ile kabarmış . Son olarak, yüzeylerde, 10 mM glukoz ve 0.5mm piruvat şeklinde eklenir. </li><li> Deney sırasında sıcaklık düzenleme kritik öneme sahiptir. Isıtmalı sirkülatörler 37.0 arasındaki sıcaklık korumak için kullanılır - 37.5 ° C kalp mıknatıs içinde iken. Sıcaklık, bir fiber optik sıcaklık probu kullanarak deney boyunca izlenir. </li><li> Perfüzyon basıncı ve sol ventrikül basıncı basınç dönüştürücüleri bir veri toplama sistemi ve verilen yazılım kullanılarak görüntülenir üzerinden takip edilmektedir. Bu deneyde önce standart bir tansiyon aleti ile kalibre edilir. Buna ek olarak, basınç hatları tüm hava kabarcıklarını çıkarmak için yeterince kızardı. </li><li> 150 mM sodyum fosfat (KH tamponun iyonik gücüne eşdeğer olduğu) standart bir örnek, önce kalp ekleme prob "kalibre" için kullanılır. Bu sinyal kolaylaştırır ve kalp prob içinde konumlandırılmış bir kez satın dönemi başlamak için gereken süreyi azaltır. </li><li> Koagülasyon azaltmak için, fare, 5 dakika sonra heparin IP 200 Üniteleri, sodyum pentobarbital (175 mg / kg) IP verilir enjekte edilir. </li><li> Kalp hızla eksize (sağlam akciğerler ve timus ile) ve buz KH tampon tutuklandı. </li><li> Buz üzerinde tutarken, akciğerleri hızla kaldırılır. Timus lobları tanımlanır ve aort yavaşça ortaya çıkarmak için geri soyulmuş. Timus kaldırılır. Aort sonra herhangi bir çevre doku dikkatlice kaldırarak izole edilmiştir. </li><li> Mikro dikiş forseps yavaşça aort hem de duvarları lümen maruz tutmak için kullanılır. Aort 0,965 mm OD polietilen boru (PE50) yapılan kanül dikkatlice yerleştirilir. Sütür aort etrafında hızla bağlı aort mikro damar kıskacı ile yerinde tutulur. Klip kaldırılır ve forseps dikkatle kanül aort kökü üzerinde olduğunu kontrol etmek için kullanılır. Ek bağları kalp yerinde tutmak için gerekli olarak eklenir. </li><li> Herhangi bir ekstra doku forseps ve microscissors kullanarak kaldırılır. Sol kulak kepçesi içine küçük bir kesi yapılır. Yavaşça kalp tutarken A 0.61 mm OD polietilen boru (PI10), apeks ile sol atriyum, sol ventrikül kavite ve dışarı ile dikkatlice eklenir. Aşırı boru kesilir. </li><li> Deflate bir su dolu balon, AG içine atrium sokulur ve yapışkan bant veya sütür kullanılarak yerinde tutulur. Peristaltik pompa hızı yavaş yavaş kalp için yeterli akışını sağlamak için artar. Kalp NMR prob içine yerine kadar, yaklaşık 2 ml / dk eşdeğer sürekli akışı ile kalp perfüze olmaya devam edecektir. LV basınç dönüştürücü çalışıp çalışmadığını doğrulamak için bir mikrometre şırınga kullanarak küçük bir hacmi ile AG balon şişirilir. </li><li> Kalp dikkatlice 10 mm NMR tüpe eklenir. Geniş bir delik "spinner", prob içinde uygun pozisyona tüp yardımcı olmak için kullanılır. Tüm aparatları sonra yapışkan bant ile sıkıca "göbek kordonu" eklenir. </li><li> Kalp / NMR tüpü, 10 mm NMR prob bobin içinde kadar göbek kordonu mıknatıs üst delik içine yavaş yavaş indirilir. </li><li> Kalp prob içinde uygun pozisyonda sonra, peristaltik pompa akış 80mmHg bir perfüzyon basıncı elde etmek için ayarlanır. (Bu noktaya kadar sürekli bir akış ile yaklaşık 2 ml / dak kalp perfüze olduğunu unutmayın). Perfüzyon basıncı sonra pompa kontrol "hold" mekanizması sağlayarak devam eder. Kalp, 15-20 dakika sonra bir dengeleme dönemi izin verilir. Bu süre zarfında, LV balonun hacmi 8-10 mmHg diyastol sonu basıncı elde etmek için ayarlanır. </li><li> Dengeleme dönemde, mümkün olan en iyi fosfor sinyal elde etmek için spektrometre parametrelerini optimize etmek için gereklidir. Bu radyo darbe ayarı ve fosfor çekirdeği rezonansa hangi frekansta ("ayar") ("layneri") manyetik alan homojen hale tarafından gerçekleştirilir. </li><li> Dengelenme periyodundan sonra, birden fazla 31 P NMR spektrumları elde edilebilir. Her spektrum için satın alma süresi t bağlıdır.alan mıknatısın gücü, örnek boyutu ve sinyal gürültü oranı belirli bir deney için gerekli. Spectra, 2.0 saniyede bir 60 derece çevirme açısı ve gecikmeler ile 20 ms'den 256 radyo frekans darbeleri elde sinyal ortalama 14 Telsa mıknatıs kullanarak elde edilir. Bu deney, yaklaşık 10 dakika gerekecektir. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar Veri toplama ve donanım, LabChart yazılım, kalp fonksiyonu çeşitli parametreler deney protokolünde boyunca ölçülebilir. Kalp fonksiyonu tipik ölçüsü, sol ventrikül gelişmiş basıncı (LVDevP), (Şekil 1) sistolik basınç, diyastol sonu basıncı (EDP) çıkarılarak elde edilir. Bu tedbir, fare zorlanma ve kalp (yani, basınç yükü) durumuna bağlı olarak değişebilir. Ancak, tipik olarak 8-10 mmHg sabit diyastol sonu basıncı 100-110 mmHg arasında normal bir C57BL6 fare kalp LVDevP. Buna ek olarak, LabChart programı LV basınç dalgaları döngüsel ölçümlere göre kalp hızı ölçümü için izin verir. Yine, bu ölçü değişebilir ama kalpleri içsel fiyatla yenmek için izin verildiğinde tipik değerler 350-400 dak. Ancak, kalp, kalp hızı 420 bpm tutulur bir pacing sistemi kullanılarak standardize edilebilir. Buna ek olarak, kontraktilite (+ dP / dt) ve gevşeme (-dP/dt) önlemleri LV basınç dalgası ilk türevi kullanılarak tahmin edilebilir. Deneysel protokol sırasında, bir basınç-hacim ilişkileri dahil ederek Starling mekanizması değerlendirmek için kolaydır. Bu AG balon hacmi yavaş yavaş artar ve LVDevP yanı sıra EDP belirterek tarafından gerçekleştirilir. Bu değerler daha sonra Şekil 2'de gösterilmiştir çizilebilir. Starling eğrisinin 8-10 mmHg bir EDP ulaşmak için gerekli hacim AG kamara boyut dolaylı bir fikir verebilir belirterek, en uygunudur. Bu kontroller ile karşılaştırıldığında daha büyük bir hacim genişlemiş kalpleri ihtiyaç duyarken, genellikle küçük bir balonun hacmi gerektirir hipertrofik kalpleri bantlama aort modelleri kullanılabilir. Tablo 1, perfüzyon protokolü sırasında edinilen temsilcisi kalp fonksiyonu verileri görüntüler. 31 P NMR spektrometresi phosphocreatine sinyalleri (PCR) ve ATP (γ-ATP, α-ATP, β-ATP) yanı sıra inorganik fosfat (Pi) Şekil 2'de gösterildiği gibi üç fosfat sağlayacaktır. Bu zirveleri her Analizi eğri altında kalan alan için bir değer sağlar. ATP miktarı γ-ATP ve β-ATP bölgelerde ortalama tahmin edilmektedir. (Α-ATP NAD molekülleri toplam sinyal bilinmeyen bir kısmı katkıda çünkü kullanılmaz). Kalp enerjik durum PCr ve ATP alanlarda (ATP oranı PCr) katsayısı ile belirlenir. 1.7 birincil substrat olarak glikoz ile birlikte bir fare kalp - Bu değer genellikle 1,5 'tir. 31 P NMR ATP veya PCr doğrudan tedbirler sağlamamakla birlikte, zirvelerin alanda örnek bileşikler içeren fosfor miktarı ile doğru orantılıdır. Bu sinyaller için değerler, diğer yöntemler kullanılarak tahmin edilebilir. Örneğin, kalplerin bir kohort yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) ile ATP doğrudan önlemler, ortalama bir konsantrasyon verim alınabilir. Bu değer daha sonra spektrumları gözlenen ortalama ATP alanlarda kalibre etmek için kullanılabilir. PCr konsantrasyonu ATP alana göre PCr alana göre hesaplanır. PCr sinyali göreceli inorganik fosfat kimyasal kayma (Pi) sinyali analiz ederek pH tahmin etmek de mümkündür. 1 farklı radyo sinyali dizileri, kreatin kinaz reaksiyon hızı veya ATP sentezi reaksiyon hızı da ölçülebilir. 2 <img src="/files/ftp_upload/2069/2069tab1.jpg" alt="Tablo 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tablo 1"> Tablo 1: İzole perfüze kalbinden Temel kalp fonksiyonu. LVDevP: sol ventrikül basıncı; LVEDP: sol ventrikül diyastol sonu basıncı; İK: kalp hızı; CHP oranı: basınç ürünü; + dP / dt: ilk türev LV basınç pozitif; -dP/dt: ilk türev LV basınç negatif, PP : perfüzyon basıncı; CF: koroner akım. <img src="/files/ftp_upload/2069/2069fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> LabChart Pro yazılımı Şekil 1. Temsilcisi LV basınç dalgaları. <img src="/files/ftp_upload/2069/2069fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 kontrolü (düz çizgi) ve aort bantlı (noktalı çizgi) farelerde Temsilcisi Starling eğrileri. A) Sistolik fonksiyonu olarak artan LV hacimleri üzerinden LVDevP tarafından temsil LV balon birim tarafından belirlenir. B) LV balonun hacmi ile artan LV hacimleri üzerinden EDP tarafından temsil Diyastolik fonksiyonu olarak belirlenir. LVDevP: sol ventrikül basıncı (sistolik eksi diyastolik pressure); EDP: end-diastolik basınç. <img src="/files/ftp_upload/2069/2069fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. İzole perfüze fare kalp Temsilcisi 31 P NMR spektrumları. Nispeten küçük Pi zirve dikkat edin. Glikoz pirüvat veya yağ asitleri ile birlikte bir aerobik perfüze kalp, bu zirve düzeyde olmalıdır. Iskemi dönemlerde, bu pik artar PCr zirve azalır. Α-ATP zirve sağ omuz dikkat edin. Bu NAD moleküllerin katkıdır. Pi: inorganik fosfat; PCr: fosfokreatin; ATP: Adenozin trifosfat.

<ol><li>Nascimben, L., Ingwall, J. S., Lorell, B. H., Pinz, I., Schultz, V., Tornheim, K., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+for+increased+glycolysis+in+the+hypertrophied+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Mechanisms for increased glycolysis in the hypertrophied rat heart.</a> Hypertension. 44, 662-667 (2004).</li>
<li>Spindler, M., Saupe, K. W., Tian, R., Ahmed, S., Matlib, M. A., Ingwall, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+creatine+kinase+enzyme+kinetics+in+diabetic+cardiomyopathy.+A%2831%29P+NMR+magnetization+transfer+study+of+the+intact+beating+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Altered creatine kinase enzyme kinetics in diabetic cardiomyopathy. A(31)P NMR magnetization transfer study of the intact beating rat heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 31, 2175-2189 (1999).</li>
<li>Ingwall, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorus+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy+of+cardiac+and+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phosphorus nuclear magnetic resonance spectroscopy of cardiac and skeletal muscles.</a> Am J Physiol. 242, H729-H744 (1982).</li>
<li>Ingwall, J. S., Javadpour, M. M., Miao, W. 31P NMR spectroscopy of the mouse heart. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIngwall%2C+JS+%22Cardiovascular+physiology+in+the+genetically+engineered%22">Cardiovascular physiology in the genetically engineered</a>. Hoit, B. D., Walsh, R. A. , Kluwer. Boston. 151-163 (2002).</li>
<li>Luptak, I., Balschi, J. A., Xing, Y., Leone, T. C., Kelly, D. P., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+contractile+and+metabolic+reserve+in+peroxisome+proliferator-activated+receptor-alpha-null+hearts+can+be+rescued+by+increasing+glucose+transport+and+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Decreased contractile and metabolic reserve in peroxisome proliferator-activated receptor-alpha-null hearts can be rescued by increasing glucose transport and utilization.</a> Circulation. 112, 2339-2346 (2005).</li>
<li>Yan, J., Young, M. E., Cui, L., Lopaschuk, G. D., Liao, R., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+glucose+uptake+and+oxidation+in+mouse+hearts+prevent+high+fatty+acid+oxidation+but+cause+cardiac+dysfunction+in+diet-induced+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Increased glucose uptake and oxidation in mouse hearts prevent high fatty acid oxidation but cause cardiac dysfunction in diet-induced obesity.</a> Circulation. 119, 2818-2828 (2009).</li>
<li>Luptak, I., Shen, M., He, H., Hirshman, M. F., Musi, N., Goodyear, L. J., Yan, J., Wakimoto, H., Morita, H., Arad, M., Seidman, C. E., Seidman, J. G., Ingwall, J. S., Balschi, J. A., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+activation+of+AMP-activated+protein+kinase+remodels+metabolic+network+in+favor+of+cardiac+glycogen+storage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Aberrant activation of AMP-activated protein kinase remodels metabolic network in favor of cardiac glycogen storage.</a> J Clin Invest. 117, 1432-1439 (2007).</li>
<li>Xing, Y., Musi, N., Fujii, N., Zou, L., Luptak, I., Hirshman, M. F., Goodyear, L. J., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+metabolism+and+energy+homeostasis+in+mouse+hearts+overexpressing+dominant+negative+alpha2+subunit+of+AMP-activated+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Glucose metabolism and energy homeostasis in mouse hearts overexpressing dominant negative alpha2 subunit of AMP-activated protein kinase.</a> J Biol Chem. 278, 28372-28377 (2003).</li>
<li>Luptak, I., Yan, J., Cui, L., Jain, M., Liao, R., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+effects+of+increased+glucose+entry+on+mouse+hearts+during+normal+aging+and+ischemic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Long-term effects of increased glucose entry on mouse hearts during normal aging and ischemic stress.</a> Circulation. 116, 901-909 (2007).</li>
<li>Tian, R., Abel, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+GLUT4-deficient+hearts+to+ischemia+underscore+the+importance+of+glycolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Responses of GLUT4-deficient hearts to ischemia underscore the importance of glycolysis.</a> Circulation. 103, 2961-2966 (2001).</li>
<li>Liao, R., Jain, M., Cui, L., D'Agostino, J., Aiello, F., Luptak, I., Ngoy, S., Mortensen, R. M., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac-specific+overexpression+of+GLUT1+prevents+the+development+of+heart+failure+attributable+to+pressure+overload+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cardiac-specific overexpression of GLUT1 prevents the development of heart failure attributable to pressure overload in mice.</a> Circulation. 106, 2125-2131 (2002).</li>
<li>Tian, R., Musi, N., D'Agostino, J., Hirshman, M. F., Goodyear, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+adenosine+monophosphate-activated+protein+kinase+activity+in+rat+hearts+with+pressure-overload+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Increased adenosine monophosphate-activated protein kinase activity in rat hearts with pressure-overload hypertrophy.</a> Circulation. 104, 1664-1669 (2001).</li>
</ol>

Langendorff perfüze izole fare kalbinde 31 P NMR spektroskopisi güvenilir ve tekrarlanabilir bir veri sağlar. 3, 4 Ancak, LV balon aort ve ekleme kanülasyon Stabil kardiyak performans izin düzgün şekilde yapılması zorunludur NMR içinde iken tüp. Buna ek olarak, sıcaklık düzenlemesi uygun temel işlevleri yerine getirmek için her şeyden önemlidir. Sinyal gürültü oranı iyi analiz NMR spektrumları elde edilmesinde önemli bir faktör artmaktadır. Bu, optimal &quot;ayar&quot; sağlanması ve örnek &quot;layneri&quot; elde edilebilir. Protokol metninde belirtildiği gibi, kalbin takılması için önce standart bir örnek kullanımı kolaylaştırabilir. Yeterli büyüklükte bir &quot;örnek&quot; de yararlı olur. Az 100 mg ağırlığında Kalpler genellikle düşük PCr ve ATP sinyalleri bu nedenle alma süresi artar iyi fosfor spektrumları elde etmek için gerekli olacak sağlar. Kardiyak fonksiyon ve enerji ile ilgili ek bilgi toplamak için mevcut protokolü değiştirmek için çeşitli yollar vardır. Laboratuvarımızda, yağ asitlerinin farklı kombinasyonları (düşük ve yüksek konsantrasyonlarda), laktat, ketonlar, ve insülin varlığında içerebilir karışık substrat tamponlar ile kalpleri perfüze var. Perfüzyon tampon kararlı izotopların kullanılması (yani, 13 C yüzeylerde etiketli), TCA döngüsü etiketli asetil CoA göreceli katkısı substrat kullanımını tahmin etmek yeteneğine sahip bu uygulama için 5-7, biz gerçekleştirmek isotopomer 13 C3-ve 13 C4-glutamat 13 C NMR spektroskopisi ile analiz. Bu perfüzyon protokol sonunda kalp donma-sıkma ve dondurulmuş doku çıkarma performans gerektirir. Bu analiz, ayrı bir kurulum parametreleri ile farklı bir prob kullanımı gerektirdiği gibi ek bir deney olacak. Zamana bağımlı olarak, 31 P-NMR spektroskopisi kullanarak kalp 2-deoksiglukoz fosfat birikimi izleme sırasında diğer uygulamaları ikame tampon deoksiglukoz glikoz içerir . Bu yöntem, miyokard glukoz alımı ölçümü için sağlar. Buna ek olarak 7, 8, 6, kardiyak iskemi / reperfüzyon ve yüksek iş yükü zorluk oluşan perfüzyon protokolleri fonksiyonu ve enerji laboratuarımızda analiz etti. 8-10 Özet olarak, izole fare kalplerinde 31 P NMR spektroskopisi sofistike ekipman kullanımını gerektiren teknik olarak oldukça zor bir işlemdir . Ancak, verimi verileri kaldırılmıs fare modelleri fonksiyonu ve enerji analiz etmek isteyen araştırmacı için çok değerli. Laboratuvarımızda, bu tekniklerin, kalp fonksiyonu, enerji ve metabolizma streslerinin çeşitli sonuçları anlayışımız hayati edilmiştir 1, 11, 12

<table><tbody><tr><td>Magnezyum Sülfat</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E164</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4505</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür dihidrat</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukoz</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Piruvat</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P256</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Ultrashield 600WB Plus</td><td>Ekipman</td><td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML86/" target="_blank"&gt;PowerLab 4/30&lt;/a&gt;</td><td>Ekipman</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML86/" target="_blank"&gt;ML86/P&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/software/research/LabChart-Software/" target="_blank"&gt;LabChart 6 Pro&lt;/a&gt;</td><td>Ekipmanlar</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/software/research/LabChart-Software/" target="_blank"&gt;MLS260/6&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/FE24/" target="_blank"&gt;Dört Köprülü Amplifikatör&lt;/a&gt;</td><td>Ekipman</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/FE24/" target="_blank"&gt;ML24&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/research/product/ML175/" target="_blank"&gt;STH Pompa Kontrol Cihazı&lt;/a&gt;</td><td>Ekipmanlar</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/research/product/ML175/" target="_blank"&gt;ML175&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML172/" target="_blank"&gt;Minipuls 3 Peristaltik Pompa&lt;/a&gt;</td><td>Ekipman</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML172/" target="_blank"&gt;ML172&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT069/" target="_blank"&gt;Tek Kullanımlık Kan Basıncı Transdüseri&lt;/a&gt;</td><td>Ekipmanlar</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT069/" target="_blank"&gt;MLT069&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>10 mm NMR Numune Tüpü</td><td>Ekipman</td><td>Wilmad LabGlass</td><td>513-7PP-7</td><td></td></tr><tr><td>Polietilen boru PE10</td><td>Ekipman</td><td>BD Biosciences</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT84/" target="_blank"&gt;Fizyolojik Basınç Transduseri&lt;/a&gt;</td><td>Ekipman</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT84/" target="_blank"&gt;MLT84&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Polietilen boru PE50</td><td>Ekipman</td><td>BD Biosciences</td><td>427411</td><td></td></tr><tr><td>Mikrometre şırınga</td><td>Ekipman</td><td>Gilmont Instruments</td><td>GS-101</td><td></td></tr><tr><td>McPherson Pensleri</td><td>Ekipman</td><td>Miltex Inc.</td><td>18-949</td><td></td></tr><tr><td>Castraviejo mikromakası</td><td>Ekipmanlar</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5650</td><td></td></tr><tr><td>Neoptix Sinyal Şartlandırıcı</td><td>Ekipman</td><td>Neoptix, Inc.</td><td>Refleks - 1</td><td></td></tr></tbody></table>

kalp fonksiyonu ve enerji kullanımı İzole fare kalpler değerlendirilmesi 31 p nmr spektroskopisi

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Kaldırılmıs fare modelleri, kardiyovasküler hastalık moleküler değişiklikler ve modeller arasında nedensel ilişkileri belirleyen güçlü araştırma araçları haline gelmiştir. Moleküler biyoloji sinyal yolağı önemli değişikliklerin tanımlanması gerekli olmasına rağmen, fonksiyonel önemi bir göstergesi değildir. Fizyolojisi fizyolojisi sağlam metabolitleri biyokimyasal değerlendirme ile birleştirerek, fonksiyon soru cevaplar sağlayabilir yenerek, kalp, kalp fonksiyonu ve enerji tam bir resim sağlar. Laboratuvarımızda yıl boyunca, bu görevi başarmak için nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi ile birlikte izole kalp perfüzyonları kullanmıştır. Sol ventrikül fonksiyonu, kalp enerji yaparak ölçülür Langendorff modu izole kalp perfüzyonları tarafından değerlendirilir<sup&gt; 31</sup&gt; P perfüze kalplerinin manyetik rezonans spektroskopisi. Bu tekniklerin, phosphocreatine ve ATP düzeyleri ile birlikte kardiyak fonksiyon göstergeleri aynı anda kalpleri yenerek ölçülebilir yapabilirsiniz. Ayrıca, fizyolojik veya patolojik streslerinin tesis ise bu parametreler izlenebilir. Örneğin, iskemi / reperfüzyon veya yüksek iş yükü meydan protokoller kabul edilebilir. Bantlama aort veya kardiyak patolojisi diğer modelleri de apt. Varyantları protokol içinde ne olursa olsun, transgenik fare modelleri moleküler değişiklikler fonksiyonel ve enerjik önemi yeterince ilişkili enzim ve metabolik yollar yeni bakış açıları yol tarif edilebilir. Bu nedenle,<sup&gt; 31</sup&gt; P NMR spektroskopisi izole perfüze kalp kardiyovasküler hastalık hayvan modellerinde değerli bir araştırma tekniğidir.

Langendorff-mode ile birlikte izole kalp perfüzyon<sup&gt; 31</sup&gt; P NMR spektroskopisi bir deney, biyokimya ve fizyoloji alanlarında birleştirir. Protokol dinamik ölçümü için yüksek enerjili fosfat içeriği ve fizyolojik fonksiyonu aynı anda izlerken kalp ciro sağlar. Doğru yapıldığında, bu kalp enerji değerlendirilmesinde değerli bir tekniktir.

Kalp Fonksiyonu ve Enerji Kullanımı İzole Fare Kalpler Değerlendirilmesi 31 P NMR Spektroskopisi

Biyomühendislik ürünü fare modelleri, moleküler değişiklikler ile ... modelleri arasındaki nedensel ilişkilerin belirlenmesinde güçlü araştırma araçları haline gelmiştir.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, izole perfüze edilmiş bir fare kalbinde kardiyak fonksiyonu ve enerjetiği gözlemlemektir. Bu, fare kalbinin LOR modunda perfüze edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak glukoz ve piruvat ile zenginleştirilmiş Krebs tamponu kullanılarak, deney boyunca kardiyak fonksiyonun sürekli izlenmesine olanak tanıyan su dolu bir balon sol ventriküle veya lv'ye yerleştirilir.Ardından, kalp 10 milimetrelik bir NMR tüpüne yerleştirilir ve kalp enerjetiğini TP'nin fosfokreatin fosfat rezonanslarını gözlemleyerek değerlendirmek amacıyla mıknatısa yerleştirilir; LV basınç dalgaları, P 31 ve kütle spektroskopi p'ye dayalı olarak kalp fonksiyonunu ve enerjetiğini gösteren inorganik fosfat sonuçları elde edilir. Merhaba, ben Washington Üniversitesi Anesteziyoloji Bölümü'ndeki MIT Cadre Metabolizma Merkezi'nden Steve Kitz. Bugün size 31 PNMR spektroskopisi ile kombine edilmiş izole kalp perfüzyonu prosedürünü göstereceğim.Bu prosedürü, biyomühendislik ürünü fare modellerimizde kalp fonksiyonlarını ve enerjetiğini değerlendirmek için laboratuvarımızda kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu protokole başlamak için bir litre Krebs-Henseleit veya KH tamponu hazırlayın.Karışıma 10 ila 15 dakika boyunca %5 karbon dioksit ve %95 oksijen kabarcıkları verin. Ardından iki milimolar kalsiyum klorür ve sonrasında substratlar olan 10 milimolar glikoz ile 0,5 milimolar piruvat ekleyin. Bu deneyler için, her P 31 Spektra alımında iki ayrı sistem eş zamanlı olarak kullanılır.Kardiyak fonksiyon değerlendirmesi için bir BRUER 14 T mıknatıs, gelişmiş üç konsola ve top spin V 2.1 yazılımı yüklü bir bilgisayara bağlanmıştır. Özel yapım bir kalp perfüzyon sistemi, power lab ile entegre edilmiştir. Dört 30 veri talebi.Veri analizi için lab chart PRO six yazılımı ile donatılmıştır. Kalp perfüzyon düzeneği, KH tampon çözeltisini kalbe perfüze etmek için kullanılan ve bir STH pompa kontrolörü tarafından yönetilen mini pulse three peristaltik pompayı içerir. NMR deneyi sırasında sıcaklık regülasyonu kritik öneme sahiptir. Kalp mıknatıs içerisindeyken sıcaklığı 37,0 ile 37,5 degrees Celsius arasında tutmak için ısıtmalı sirkülatörler kullanılır ve deney süresince sıcaklık, fiber optik bir sıcaklık probu ile izlenir.Deney boyunca, LV basıncı ve perfüzyon basıncı, bir veri toplama sistemine bağlı basınç dönüştürücüleri aracılığıyla izlenir ve beraberindeki yazılım kullanılarak görüntülenir. LV basıncını izlemek için fizyolojik bir dönüştürücü, perfüzyon basıncını izlemek için ise tek kullanımlık bir kan basıncı dönüştürücüsü kullanılır. Son olarak, ısıtılmış oksijenli tampon çözeltiyi kalbe iletmek için bir göbek kordonu kullanılır.Deney başlamadan önce, mıknatıs içerisine girdikten sonra, önce basınç dönüştürücülerini standart fig moment manometresi ile kalibre edin; kalibrasyonu sıfırlamak için dönüştürücüye hiç basınç uygulamayın. Ardından, bu fig mod manometresini daha yüksek bir basınca kadar şişirin. Bu değeri bilgisayar programına girin.Ardından, bu fig moment manometresini bilinen basınçlara kadar şişirip bunları bilgisayar ekranından doğrulayarak basınç dönüştürücülerin yeterince kalibre edildiğini onaylayın. Basınç dönüştürücüler kalibre edildikten sonra, NMR probunu 150 millimolar sodyum fosfat içeren standart bir numuneli 10 milimetrelik bir NMR tüpü ile kalibre edin. Kalibrasyonu top spin yazılım programını kullanarak gerçekleştirin.Öncelikle, fosfor rezonansının frekansını ayarlamak için numuneyi akort edin. Ardından, homojen bir manyetik alan oluşturmak için numunenin shim ayarını yapın. Bu başlangıç kalibrasyonu sinyali kolaylaştırır ve veri toplama dönemini başlatmak için gereken süreyi azaltır.Fare kalp ekstraksiyonuna başlamak için kalp probun içine yerleştirildiğinde, koagülasyonu azaltmak için fareye intraperitonal olarak 200 ünite heparin enjekte edin. Beş dakika sonra, intraperitonal olarak kilogram başına 175 miligram sodyum Pentobarbital uygulayın. Fare anestezi altına alındığında, hayvanı sırt üstü yatırın ve göğüs bölgesini açığa çıkarmak için kollarını ve bacaklarını bantla sabitleyin.Fareyle tam olarak anestezi altında olduğundan emin olmak için ayak parmağı sıkıştırma testi yapın. Periton boşluğunu ve göğüs kafesini makasla açın; kaburga kafesini geriye çekmek ve toraks boşluğunu açığa çıkarmak için pens kullanın. Akciğer dokusunu tutun ve kalbi kavisli makasla nazikçe kaldırın.Kalbin arkasındaki büyük damarları kesin ve kalp serbest kalana kadar yavaşça farenin başına doğru ilerleyin. Kalbi hemen buz gibi soğuk KH tamponu içinde durdurun. Organları buz üzerinde tutun ve akciğerleri hızla çıkarın.Timus loblarını belirleyin ve aortu açığa çıkarmak için bunları nazikçe geriye doğru soyun. Ardından timusu çıkarın. Son olarak, etraftaki tüm dokuları dikkatlice temizleyerek aortu izole edin.Mikro sütür forsepi kullanarak, lümeni açığa çıkarmak için genellikle aortun her iki duvarını da tutun. Ardından aortu dikkatlice kanülün üzerine yerleştirin. Kanül, 0.965 millimeter dış çaplı polietilen tüpten yapılmıştır.Aortayı bir mikro damar klempiyle sabit tutun ve aortanın etrafına hızlıca sütürler bağlayın. Sütürler bağlandıktan sonra klempi çıkarın. Kanülün aort kökünün üzerinde olduğunu dikkatlice kontrol etmek için pens kullanın.Kalbi sabit tutmak için gerekli olan ek bağları ekleyin. Pens ve mikro makas kullanarak fazla dokuları temizleyin. Ardından, sol aurikula küçük bir insizyon yapın.Kalbi nazikçe tutun ve 0.61 millimeter od polietilen tüpü sol atriumdan, sol ventrikül boşluğundan geçirerek apeks üzerinden dışarı çıkaracak şekilde dikkatlice yerleştirin. Fazla tüp kısmını kesin. Ardından, sönük ve suyla dolu bir balonu atrium üzerinden sol ventriküle yerleştirin.Balonu yapışkan bant kullanarak sabitleyin. Ardından, kalbe yeterli akış sağlamak için peristaltik pompanın hızını kademeli olarak artırın. Kalp NMR probuna yerleştirilene kadar, dakikada yaklaşık iki mililitreye eşdeğer sabit bir akış kullanarak kalbi KH tamponu ile perfüze etmeye devam edin.NMR spektroskopisi için LV basınç transduserinin çalıştığını doğrulamak amacıyla, bir mikrometre şırınga kullanarak LV balonunu küçük bir hacimle şişirin. İlk olarak, kalbi dikkatlice 10 milimetrelik bir NMR tüpüne yerleştirin. Tüpün doğru konuma yerleştirilmesine yardımcı olmak için NMR tüpünün etrafına geniş ağızlı bir spinner yerleştirilir.Probun içinde, tüm düzeneği yapışkan bantla göbek kordonuna sıkıca sabitleyin. Ardından, kalp içeren NMR tüpü 10 milimetrelik NMR probunun bobininin içine girene kadar göbek kordonunu mıknatısın üst borusuna yavaşça indirin. Kalp probun içinde uygun konuma geldiğinde, 80 milimetre cıva perfüzyon basınacına ulaşmak için parazit pompa akışını ayarlayın.Pompa kontrolöründeki tutma mekanizmasını etkinleştirerek perfüzyon basıncını koruyun. Kalp için 15 ila 20 dakikalık bir dengeleme süresi tanıyın. Dengeleme süresi boyunca, sekiz ila 10 mmHg'lik bir end diyastolik basınç elde etmek için LV balonunun hacmini ayarlayın.Ardından, mümkün olan en iyi fosfor sinyalini elde etmek için spektrometre parametrelerini optimize edin. NMR cihazını, fosfor çekirdeğinin rezonansa girdiği frekans olan radyo darbesini ayarlayarak optimize edin. Daha sonra, dengeleme süresinden sonra manyetik alanı homojen hale getirmek için numuneye shim işlemi uygulayın.Birden fazla P 31 NMR Spektra alımına başlayın. Her bir spektrum için alım süresi; mıknatısın alan şiddetine, numunenin boyutuna ve belirli bir deney için gereken sinyal-gürültü oranına bağlıdır. Burada spektrumlar, 14 Tesla'lık bir mıknatıs kullanılarak, 60 derecelik çevirme açısına ve 2.0 saniyelik gecikmelere sahip 20 mikrosaniyelik 256 radyo frekans pulsundan elde edilen sinyallerin ortalaması alınarak elde edilir.Bu deney yaklaşık 10 dakika sürecektir. Kardiyak fonksiyonun tipik bir ölçümü olan LV gelişen basınç, sistolik basınçtan end diyastolik basıncın veya EDP'nin çıkarılmasıyla elde edilir. Normal bir C 57 black six faresinde, kalp LV gelişen basıncı, 8 ila 10 mmHg sabit end diyastolik basınçta genellikle 100 ila 110 mmHg arasındadır.Kontrol ve aortik bantlı farelerden elde edilen temsili stilleme eğrileri gösterilmektedir. Sistolik fonksiyon, LV balon hacmi ile belirlenen artan LV hacimleri üzerindeki LV gelişen basıncı ile temsil edilir. Diyastolik fonksiyon ise artan LV hacimleri üzerindeki EDP ile temsil edilir.İzole perifüze fare kalbinin P 31 NMR spektrumları, PHOSPHOCREATINE veya PCR, bir TP'den gelen üç fosfat ve inorganik fosfat veya pi sinyalleri sağlar. Burada, PI piki nispeten küçüktür. Bu durum, piruvat veya yağ asitleri ile beslenen aerobik olarak perifüze bir kalp için tipiktir.İskemi dönemlerinde glikoza ek olarak, bu pik artarken PCR piki azalır. Deney sırasında hem kalp fonksiyonlarının hem de enerjetiğin eş zamanlı olarak ölçülebilmesi için fare kalbinin perfüzyona nasıl hazırlanacağını az önce gösterdim. Kalbin yeterli düzeyde perfüze edildiğinden emin olmak önemlidir.Aksi takdirde, NMR verileriniz güvenilir olmayacaktır. İşte bu kadar. Teşekkür ederiz, deneylerinizde başarılar dileriz.

assessment-cardiac-function-energetics-isolated-mouse-hearts-using

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu çalışma, noninvaziv küçük hayvan MRG ve MRS temel prosedürler açıklanmaktadır.

Noninvaziv In Vivo Küçük Hayvan MRG ve MRS: Temel Deneysel Prosedürler

Objektif fizyolojik preload ve afterload baskıların kapsamında izole kalplerin mitokondriyal redoks izlemektir. Bir biventriküler çalışma tavşan kalp modeli sunulmuştur. NADH, yüksek çözünürlükte zamanmekansal floresans görüntüleme epikardiyal doku mitokondriyal redoks izlemek için kullanılır.

İzole Biventriküler ve NADH Floresans Görüntüleme Tavşan Kalpler Çalışma

Bu yöntem, deneysel olarak indüklenen miyokard iskemisi olan farelerde kardiyak morfolojiyi, fonksiyonu, perfüzyonu, metabolizmayı ve iyotlu kontrast madde ile canlılığı değerlendirmek için Kuantum Mikro Bilgisayarlı Tomografi (MikroBT) kullanımını ana hatlarıyla belirtir. Teknik, insan kalbi hastalığının çeşitli hayvan modellerinin tahribatsız, yüksek verimli uzunlamasına in vivo görüntülenmesi için uygulanabilir.

Miyokard Yapı, Fonksiyon Vivo Kantitatif Değerlendirilmesi yılında Perfüzyon ve Canlılık Kardiyak Mikro-bilgisayarlı Tomografi ile

Burada, kalp duvarında emici spektroskopisi gerçekleştirmek için perfkullanılmış kalplerinde intra ventrikül optik kateter kullanmanın bir yöntemini tanıtıyoruz. Elde edilen veriler, doku oksijen geriliminin yanı sıra substrat kullanımı ve membran potansiyeli ile aynı anda bu her yerde yapılan hazırlıkta kardiyak performans önlemleri ile ilgili güçlü bilgiler sağlar.

Perfkullanılmış Mammalin kalpleri transmural absorbance spektroskopisi kullanarak hücresel metabolizmayı Izleme için kalp içi yan ateş ışık kateter

Bu çalışmada, fare kalbinin sol ventrikül fonksiyonel parametrelerini ölçmek için kapsamlı bir kardiyovasküler manyetik rezonans görüntüleme (CMR) protokolü açıklanmaktadır. Protokol, CMR görüntülerinin alımını, işlenmesini ve analizini ve farklı kardiyak fonksiyonel parametrelerin değerlendirilmesini açıklar.

Kardiyovasküler Manyetik Rezonans Görüntüleme ile Fare Kalbi Sol Ventrikül fonksiyonu, Miyokard Zorlanması ve Hemodinamik Kuvvetlerin Nicelemesi

Sürekli perfüzyon modunda hiperpolarize 13C etiketli metabolitin izole perfüze edilmiş bir fare kalbine uygulanması için deneysel bir kurulum tanımladık. Özel bir 13C-NMR edinme yaklaşımı, metabolik enzim aktivitesinin gerçek zamanlı olarak nicelleştirilmesini sağladı ve multiparametrik 31P-NMR analizi, doku ATP içeriğinin ve pH'ının belirlenmesini sağladı.

Hiperpolarize [1-13 C] Piruvat ve13 C/31P NMR Spektroskopisi ile İzole Perfüze Fare Kalbinde Kardiyak Metabolizmanın İncelenmesi

Mevcut protokol, kalp yetmezliğinin fare modellerinde diyastolik fonksiyonun değerlendirilmesinde değerli bir araç olarak hizmet eden transözofageal pacing yoluyla basınç-hacim ilişkisinin elde edilmesini açıklamaktadır.

Murin Kalp Yetmezliği Modellerinde Kalp Hızına Bağlı Diyastolik Fonksiyonların Değerlendirilmesi için Pacing Kontrollü Bir Prosedür

Bu makale kalpleri başarısız ve sol ventrikül duvar stresi ve fonksiyonları üzerine etkisi miktarının bir roman hidrojel implante prosedürleri anlatılmaktadır. Bu prosedürler, başarılı bir köpek ve insan uygulanmıştır.

Algisyl-LVR kullanarak Hearts başarısız Fonksiyon Sol Ventrikül Duvar Stres ve İyileştirme azalma

Kontrastlı kardiyak manyetik rezonans (CMR) görüntüleme kapsamlı...

Küçük Hayvan Bak-soyunma Ters Kurtarma (SALLI) Sıçanlarda MRI kullanarak Kalp Fonksiyonu ve Miyokard Morfoloji Değerlendirilmesi

Sağ ventrikül (RV) işlev bozukluğu, kardiyovasküler hastalığın patojenezine önemli olan, ancak sınırlı yöntemler ile değerlendirilmesi için kullanılabilir. Ultrason görüntülemede son gelişmeler boyuna RV çalışmada non-invaziv bir ve doğru bir seçenek sunar. Bu yazıda, detay RV basıncı aşırı bir fare modeli kullanılarak bir adım-adım ekokardiyografi yöntemi.

Transtorasik Ekokardiyografi ile Pulmoner Arter Konstrüksiyon Fare Modeli sağ ventrikül yapı ve fonksiyonlarının değerlendirilmesi

Öğrenin, izole fare kalplerinde 31P NMR spektroskopisi ile kardiyak fonksiyon ve enerji metabolizmasını nasıl değerlendirebilirsiniz. Bu yöntem, yüksek enerjili fosfatları gerçek zamanlı izleyerek kalp sağlığı araştırmalarında kullanılır.

Kalp Fonksiyonu ve Enerji Kullanımı İzole Fare Kalpler Değerlendirilmesi³¹ P NMR Spektroskopisi

Daha fazla video keşfet