Name: Transüretral İndüksiyon Fare İdrar Yolu Enfeksiyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-05T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Öğrenin farelerde transüretral idrar yolu enfeksiyonu indüksiyonu ve kantitatif analiz yöntemlerini. Bu protokol bakteriyel suş hazırlama, mesane inokülasyonu ve doku örnekleme adımlarını kapsar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, uzman teknik yardım için Shelly Xie ve Jennifer Payne, kabul etmek istiyorum. Bu çalışma Pediatrik Üroloji Derneği ve Stanford Pediatrik Araştırma Fonu hibe yoluyla mümkün olmuştur.

Üretral kateterler I. Hazırlık <ol><li> Numune alınacak her bir fare mesane ve böbrek için, sırasıyla, bir cryovial tüp içinde 5-6 paslanmaz çelik boncuk (mesane, 1.6 mm boyutlarında veya 0,9-2,0 mm karışımı) veya zirkonyum oksit boncuk (böbrek, 0.5 mm boyutlarında) yerleştirin. Boncuk içeren tüplere Otoklav. </li><li> Ortam sıcaklığına kadar soğumasını tüpleri sonra, her paslanmaz çelik boncuk içeren tüp ve her zirkonyum oksit boncuk içeren tüp steril PBS 400 mikrolitre 200 mikrolitre steril PBS ekleyin. </li><li> Biz, Hung ve Hultgren 13 tarafından açıklandığı gibi üretral kateterler hazırlar . Temiz bir çifti düz başlı forseps ve ince makas (iris veya benzer tipte) Otoklav ve aletlerin ortam sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. % 70 etanol ile laminer akış kaput yüzeyleri silin. Kaput, polietilen boru, 30 cm (yaklaşık) segmentinde kesti. Aseptik olarak steril bir 3 cc şırınga, steril bir 30 iğne (1 / 2 inç uzun bir iğne) yerleştirin. Otoklavlanmış forseps ile kesilen polietilen boru bir ucunu Pick up ve hub karşılar kadar iğne üzerine boru slayt. Yaklaşık 2 cm iğne ucu ötesine uzanan boru böylece kesin. Kateter steril bir petri şırınga ve yerden çıkarın. </li><li> Çapraz bulaşma olasılığını azaltmak için, biz her fare için bir kateter olun. Tüm kateterler yapıldıktan sonra, onları en az 30 dakika süreyle UV radyasyona maruz kalma ile ortaya bir petri sterilize edin. UV lambaları ile doğrudan veya lambaları aktif iken kaputu vücudun herhangi bir parçası maruz bırakmayın. UV ışınlarına maruz kalan, kateter petri uzun vadeli saklı olabilir. Biz kısırlık korumaya yardımcı olmak için Parafilm çanak sızdırmazlık öneririz. </li></ol> II. Hayvan Aşılama <ol><li> Fare, strese bağlı karıştırıcı faktörlerin önlemek için haftada en az bir deneysel manipülasyon önce gelmelisiniz. Erkek fare üretra catheterize son derece zor, çünkü dişi fareler kullanılır. CBA / J yaygın olarak kullanılan, idrar yolu enfeksiyonu duyarlı kendilenmiş fare suşu. Bu immünolojik olgunluk, yaşlılık önce pencere olduğundan, Fare, 8 ile 12 hafta arasında yaş kullanılmalıdır. Deneyin ilk gününde, donmuş bakteriyel stok bir şişeye steril bir aşılama döngünün sonuna batırın. Uygun bir agar plaka üzerine küçük bir inokulum ve çizgi dışı Toplayıp. Genellikle, üropatojenik E. coli (UPEC) ve diğer suşları 37 Luria-Bertani (LB) agar gecede büyüdü ° C, havadaki. UPEC suşları LB agar katı, sarımsı-beyaz saydam koloniler olarak büyür. Hemen bakteriyel stok dondurucu dönmek. Üropatojenik bakteri suşlarının tekrarlanan, seri kültürleri ile zamanla daha az öldürücü olabilir. Dolayısıyla, her bir deney için taze bir agar plaka şeritli tavsiye ederiz. </li><li> Deney 2 gün, uygun koloni morfolojisi onayladıktan sonra, bir gecede en az 5 cc suyu kültür agar plakları ve yerden tek koloniler almak. LB suyu en üropatojenik bakteri suşları için kullanılabilir (37 ° C, havadaki 200 rpm). Havalandırma izin suyu kültür tüpleri kapakları gevşek tutun. </li><li> Deney 3 gün, tip I pili ifade artırmak için (genellikle 37 ° C ve 200 rpm) bir gecede% 10 suyu ilk suyu kültür ve kültür. Tip I pili in vivo 1 üropatojenler için kritik bir virülans faktörü olduğu gösterilmiştir beri Seri suyu bakteri kültürleri, uropathogenicity optimize etmek için yardımcı olur. Havalandırma izin suyu kültür tüpleri kapakları gevşek tutun. </li><li> Deney 4 gün, 3 gün suyu kültürü OD 600 ölçer. Test edilen bakteri suşu için zaten bilinen değilse, OD 600 ve kob arasındaki ilişkiyi belirlemek için en az 7 günlükler (PBS ile yapılan dilüsyonları, LB agar üzerinde yapılan kültürler, 37 ° C de inkübasyon gecede) üzerinden on kat seri seyreltme kaplama yapmak / ml. Genel bir kural olarak, 0,4-0,5 bir OD 600 50 mikrolitre başına 1-2x10 7 kob yaygın karşılık gelir. OD 600 ve kob / ml arasında bir ilişki tespit edildikten sonra, bir OD 600 PBS 50 mikrolitre fare başına istenen kob karşılık gelen suyu kültürü ayarlayabilirsiniz. Bazı iş yerine 50 den 10 mikrolitre, aşılama, kidneys6 içine az reflü yol açtığını öne sürmüştü. Ancak, çoğu yayınlar ortalama 50 mikrolitre fare kullanımı bildirdin. Genel olarak, 10 6 ve 108 kob / fare, ama her bakteriyel / fare suşu kombinasyonu in vivo deneysel olarak test edilmesi gerekmektedir arasında istenen kob aralıkları. </li><li> Bu inocula instilasyon hemen sonra işeme değildir sağlamaya yardımcı olmak için, fare genel anestezi indüksiyonu öncesinde en az 30 dakika süreyle su yoksun olmalıdır. Bir diğer önemli manevra scruffing fareler anestezi indüksiyonu öncesinde işeme neden ve yavaşça alt abdom basaraktr. Iki ila% 2,5 'izofluran% 1,8-2 izofluran ile bakım anestezi ile 8-12 haftalık kadın CBA fareler için güvenli bir indüksiyon dozu,. </li><li> Anestezi sağlandıktan sonra, farelerin izofluran içeren oksijen bağlı bir roket ucu konisi takılı kafası ile yatar pozisyonda yerleştirilir. Alt karın mesaneden idrar tahliye için masaj yapılır. Mesane nispeten boş ise, bu manevra idrar verim olmayabilir. Alt karın ve perine% 70 etanol ile ıslatılır. </li><li> Olmayan bir steril bir iğne 1 cc şırınga istenilen bakteriyel inokulum çekmek için kullanılır. Sonra steril bir üretral kateter aseptik şırınga yerleştirilir. Sadece 1-2 milimetre boru iğne ucu distal kalır, böylece aşırı boru bir makas ile kateter kesilir. Sonra, şırınga vurdu ve piston tüm kabarcıklar dik kaldırmak için şırınga ile depresif. Bakteriyostatik yağlayan bir topak sütü steril bir petri veya steril enjektör sarmalayıcı iç üzerine etmedik. Kateterin ucu (ekli şırınga ile), jöle batırılmış. Birden fazla bakteri suşlarının aynı deneyi test ediliyor, farklı suşları içeren kateterler yağlamak için aynı damla jöle kullanmamaya dikkat edin. </li><li> Anestezi fare için bir stereo mikroskop büyütme (5x optik zum aralığı 0.8x) kullanarak, klitoral başlık nazik, ince dişli forseps bir çift ile non-dominant el kavradı ve derin pembe üretral meatus (maruz sefalad kaldırdı Şekil 1). Bağlı kateter) şırınga (bir kalem kavrama ile dominant el kavradı ve kateterin ucu 45 derecelik bir açıyla üretral meatus ile uğraşmaktadır. Klitoral kaput şırınga uzun ekseni boyunca gergin, kateterin üzerine etkili üretra "yükleme". Bu manevra, fare üretra gereksiz olduğundan çok önemlidir. Kateter mesane (hub, Şekil 2) kolayca slayt, ve yavaşça üretra gereksiz kıvrımları gezinmenize yardımcı twirled olabilir. Kateter hubbed sonra fare uzun eksenine paralel olana kadar, şırınga düşürülebilir. Baskın olmayan el inokulum (en az 5 saniye) yavaş yavaş enjekte etmekte kullanılan dominant el olarak kateter ve şırınga konumunu istikrara kavuşturmak için forseps bırakabilirsiniz. Sıvı enjeksiyon sırasında kateter etrafında akan görülürse, mesane ya tam veya kateter vajina (üretra sadece kaudal). Enjeksiyon hemen durdurulur ve kateter pozisyonu dikkatle incelenmelidir. Kateter üretra ise, verilen fare deneyinde yer olmamalıdır. Öte yandan, vajina içinde yanlış bir kateter yerleştirilmesine ve enjeksiyon yeniden girişimi. Enjeksiyondan sonra, kateter ve şırınga fare yavaş yavaş geri çekilir. </li><li> Uygulanan bakteri tahliye ve böylece değişken enfeksiyon düzeylerine yol açabilir erken aşılama sonrası işeme olasılığını azaltmak için, bazı araştırmacılar anestezi altında transüretral inoculation10 sonra 30 dakika süreyle fareler korumak. Ameliyattan sonra, farelerin normal nefes desen ve faaliyet dönüş onaylamak için sürekli gözlem ile temiz bir ısınma battaniye kurtarmak olmalıdır. Bir kez hayvanlar tam tarama yeteneği iyileşti, onlar çarşaf içeren kafeslerde iade edilebilir. </li></ol> III. Enfekte Doku Ölçü CFU <ol><li> Çeşitli fare İYE yayınlar 6 saat, bir hafta veya daha uzun bir post-aşılama kültür sonuçları bildirdin. En uygun zaman her bakteriyel / fare suşu kombinasyonu için ampirik olarak tespit edilmesi gerekir. Iflenen idrar kültürü için steril bir Petri kabı üzerine fare scruffing elde edilir. Toplanan idrar, her zaman buz üzerinde tutulmalıdır. Işeme idrar kaç saat içinde elde etmek için birden çok deneme fare işeme, sık, düşük hacimli (geçersiz ortalama 30-100 mikrolitre) olduğundan, gerekli ve strese bağlı olabilir. </li><li> Işeme idrar örnekleri alındıktan sonra, izofluran ve servikal dislokasyon kullanarak fareleri kurban. Karın aseptik açıldı. Işeme idrar örneği başarıyla daha önce elde değilse, küçük bir idrar miktarı genellikle 30 gauge iğne ve şırınga kullanılarak mesane duvarının üzerinden aspire edilebilir. </li><li> Bir veya iki böbreğin kaldırılır steril bir petri üzerinde en az 4 adet (her parça en az 50 mikrogram olmalıdır) içine kıyılmış ve yerleştirilir zirkonyum boncuk / PBS içeren buz üzerinde cryovials. Mesane, kaldırılır, en az 4 adet içine kıyılmış ve paslanmaz çelik boncuk / yerleştirilir PBS içeren buz üzerinde cryovials. Doku / boncuk / PBS içeren cryovials Bullet Blender homojenizatör yerleştirilir ve dokuları, bir dakika süreyle "8" hız ayarı kullanarak homojenize edilir. Bazı doku parçaları homojenizasyon sonra kalması için yaygındır. Sıvı Homojenat 50-100 mikrolitre pipetlenebilir sürece, katı parçalarımutlaka bir sorun değildir. Homojenizasyon zaman bazı örnekler arttırılabilir ise, homojenizasyon tutarlılığı korumak için bütün dokular için bunu yapmak için kritik öneme sahiptir. Bullet Blender homojenizatör, çapraz bulaşma olasılığını ortadan kaldırır, bireysel örnekler standart bir Homojenizatör kullanarak tek bir işlem daha hızlı ve örnekleri homojenize önemli ölçüde ısı değildir çünkü kullanmaktadır. </li><li> En az iki ya da üç kez toplanan idrar ve doku homojenatlarında on kat dilüsyonları mikrotiter plate yapılmalıdır. Ön deneyler için en az yedi on kat dilüsyonları yapmak için ihtiyatlı olabilir. 100'e kadar uygun agar Kültür idrar mikrolitre, mesane ve / veya böbrek homojenatlarında. Idrar örnekleri hacmi sınırlı olabilir bu yana, on kat dilüsyonları gerçekleştirmeden önce 100 mikrolitre birimleri getirmek için gerekli olabilir. Eğer bu talep ediliyorsa, ilk seyreltme (on kat seyreltme önce) bakteriyel verimi son hesaplamalarına dahil çarpanlarına gerekecektir. Bu medya Gram negatif organizmalar için seçici olduğundan, eozin metilen mavisi veya MacConkey agar (37 gecelik inkübasyon ° C) kültür UPEC tercih. MacConkey agar UPEC suşları laktoz fermente yeteneği nedeniyle merkezi umblike, kırmızı-pembe koloniler olarak büyür. </li><li> Gece kültürden sonra, her plaka için kob sayılır. 50-100 koloni içeren plaka seyreltme seri seyreltilmiş numuneler için en doğru sayısı olarak kabul edilir. "Geri" doku miligram başına, doku başına kob hesaplamak veya ml'de. </li></ol> IV. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 forseps (fotoğraf üst ötesinde) ile sefalad klitoral kaput kaldırma maruz Üretral meatus (koyu pembe doku) . <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 üretra kateterize. Bifid klitoris kateter hemen üstünde görülebilir. <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 Mesane kob üropatojenik E. ile 8 hafta yaşında kadın CBA / J fareler transüretral enfeksiyonu 2 gün sonra sayılır coli. Mesanesi MacConkey agar seri seyreltme kaplama homojen ve kob / ml tespit edildi. Elmas bireysel fareler için kob / ml gösterir, yatay çubuk medyan kob / ml gösterir.

<ol><li>Schaeffer, A. J., Schwan, W. R., Hultgren, S. J., Duncan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+type+1+pilus+expression+in+Escherichia+coli+to+ascending+urinary+tract+infections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Relationship of type 1 pilus expression in Escherichia coli to ascending urinary tract infections in mice.</a> Infect Immun. 55, 373-380 (1987).</li>
<li>Rouschop, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urothelial+CD44+facilitates+Escherichia+coli+infection+of+the+murine+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Urothelial CD44 facilitates Escherichia coli infection of the murine urinary tract.</a> J Immunol. 177, 7225-7232 (2006).</li>
<li>Malaviya, R., Ikeda, T., Abraham, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+mast+cells+to+bacterial+clearance+and+their+proliferation+during+experimental+cystitis+induced+by+type+1+fimbriated+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+LettM%22%5BJournal%5D)">Contribution of mast cells to bacterial clearance and their proliferation during experimental cystitis induced by type 1 fimbriated E. coli.</a> Immunol LettM. 91, 103-111 (2004).</li>
<li>Lane, M. C., Alteri, C. J., Smith, S. N., Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+flagella+is+coincident+with+uropathogenic+Escherichia+coli+ascension+to+the+upper+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16669-16674 (2007).</li>
<li>Hvidberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+long-term+ascending+urinary+tract+infection+mouse+model+for+antibiotic+treatment+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Development of a long-term ascending urinary tract infection mouse model for antibiotic treatment studies.</a> Antimicrob Agents Chemother. 44, 156-163 (2000).</li>
<li>Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+urinary+tract+infection+by+intraurethral+inoculation+with+Escherichia+coli%3A+refining+the+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model.</a> J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).</li>
<li>Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+and+host+responses+to+Escherichia+coli+urinary+tract+infection+in+genetically+distinct+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains.</a> Infect Immun. 66, 2798-2802 (1998).</li>
<li>Gunther, N. W. t, Lockatell, V., Johnson, D. E., Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamics+of+type+1+fimbria+regulation+in+uropathogenic+Escherichia+coli+during+experimental+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamics of type 1 fimbria regulation in uropathogenic Escherichia coli during experimental urinary tract infection.</a> Infect Immun. 69, 2838-2846 (2001).</li>
<li>Bishop, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP-regulated+exocytosis+of+Escherichia+coli+from+infected+bladder+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP-regulated exocytosis of Escherichia coli from infected bladder epithelial cells.</a> Nat Med. 13, 625-630 (2007).</li>
<li>Thumbikat, P., Waltenbaugh, C., Schaeffer, A. J., Klumpp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-specific+responses+accelerate+bacterial+clearance+in+the+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen-specific responses accelerate bacterial clearance in the bladder.</a> J Immunol. 176, 3080-3086 (2006).</li>
<li>Hagberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascending%2C+unobstructed+urinary+tract+infection+in+mice+caused+by+pyelonephritogenic+Escherichia+coli+of+human+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin.</a> Infect Immun. 40, 273-283 (1983).</li>
<li>Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+urinary+tract+infection+by+intraurethral+inoculation+with+Escherichia+coli%3A+refining+the+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model.</a> J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).</li>
<li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A murine model of urinary tract infection.</a> Nat Protoc. 4, 1230-1243 (2009).</li>
</ol>

İndüksiyon fare idrar yolu enfeksiyonu, bakteri transüretral aşılama köklü ama teknik olarak zor bir işlemdir 11. Hung ve Hultgren fare idrar yolu enfeksiyonu 13 transüretral teknikler son zamanlarda mükemmel bir inceleme yayınladı. Bu çalışmada, biz bu deneysel yaklaşım daha ince göstermek için çalışırlar. Yeni başlayanlar, mesane ortaya çıkarmak için bir orta hat laparotomi yapmak, Hindistan mürekkep (PBS içinde% 1) bir çözelti enjekte ve mesane mavi rengi gözlemleyer...

<table><tbody><tr><td>Kriyoviyal tüpler, 2.0 ml polipropilen (kapaksız)</td><td>E&amp;amp;K Scientific</td><td>640201</td><td></td></tr><tr><td>Kriyoviyal tüp kapakları, O&amp;rsquo; halkalı&amp;rsquo;</td><td>E&amp;amp;K Scientific</td><td>440011-N</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender</td><td>Next Advance</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>Zirkonyum Oksit Boncuklar (0.5mm)</td><td>Next Advance</td><td>ZROB05</td><td></td></tr><tr><td>Paslanmaz Çelik Boncuklar (1.6mm)</td><td>Next Advance</td><td>SSB16</td><td></td></tr><tr><td>Paslanmaz Çelik Boncuk Karışımı (0.9-2.0mm)</td><td>Next Advance</td><td>SSB14B</td><td></td></tr><tr><td>CBA/J Fareler, 8-12 haftalık dişi</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000656</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 4.3mM, KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 1.4mM)</td><td>EMD Millipore</td><td>EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;) EM-5108-1 (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td></td></tr><tr><td>LB agar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB besiyeri</td><td>EMD Millipore</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran (Aerrane)</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>NDC 10019-773-60</td><td></td></tr><tr><td>Öze döngüleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-601</td><td></td></tr><tr><td>Eozin-metilen mavisi (EMB) agar tozu</td><td>Himedia Laboratories</td><td>MM022-500G</td><td></td></tr><tr><td>MacConkey agar tozu</td><td>Difco Laboratories</td><td>212123</td><td></td></tr><tr><td>LB agar tozu</td><td>Difco Laboratories</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>Intramedic radyopak olmayan polietilen tüp, PE10 [iç çap 0.28 mm (0.011 inç); dış çap 0.61 mm (0.024 inç)]</td><td>BD Biosciences</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>30 gauge iğneler, 1/2 inç</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>1 ml tüberkülin Slip-Tip şırınga</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Luer-Lock şırınga</td><td>BD Biosciences</td><td>309585</td><td></td></tr></tbody></table>

transüretral İndüksiyon fare İdrar yolu enfeksiyonu

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Ilgi üropatojenik bakteri suşlarının agar yetiştirilmektedir. Genellikle, üropatojenik<em&gt; E. coli</em&gt; (UPEC) ve diğer suşların 37 gece Luria-Bertani agar (LB) yetiştirilebilir ° C, havadaki. UPEC suşları LB agar sarımsı-beyaz saydam koloniler olarak büyür. Uygun koloni morfolojisi onayı takiben, tek koloniler, daha sonra suyu olarak yetiştirilebilir toplanır. LB suyu en üropatojenik bakteri suşları için kullanılabilir. İki seri, bir gecede LB suyu kültürleri, tip I pili, üropatojenik bakteriler için iyi tanımlanmış bir virülans faktörü ifade artırmak için istihdam edilebilirler. Broth kültürler istenen konsantrasyona fosfat tamponlu salin (PBS) seyreltilir. Sekiz-12 haftalık dişi farelerde izofluran anestezi altında yerleştirilir ve transüretral 30 göstergesi şırınga boru kaplı polietilen kullanılarak bakteri inoküle. Ampirik / fare her bakteri suşu kombinasyonu için tespit edilmelidir tipik inocula, 10<sup&gt; 6</sup&gt; 10<sup&gt; 8</sup&gt; 10 ila 50 mikrolitre PBS kob başına fare. İstenen enfeksiyon döneminden sonra (birkaç hafta gün), idrar örnekleri ve mesane ve her ikisi de böbrek hasat edilir. Her organ, kıyılmış PBS içinde yer ve Mavi Bullet Homojenizatör homojenize. Idrar ve doku homojenatlarında seri PBS içinde seyreltilmesi ve uygun bir agar kültüre. Ertesi gün, koloni oluşturan birim sayılır.

Bu video transüretral fare idrar yolu enfeksiyonlarına neden ve enfeksiyonların sonucunda dereceye ölçmek için yöntemler gösterecektir.

Transüretral İndüksiyon Fare İdrar Yolu Enfeksiyonu

İlgilenilen üropatojenik bakteriyel suşlar agar üzerinde büyütülür. Genellikle, üropatojenik E. coli (UPEC) ve diğer suşlar gece boyunca ... üzerinde büyütülebilir.

Bu prosedürün genel amacı, farelerde transüretral yolla idrar yolu enfeksiyonu oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle ilgilenilen bakteriyel suşların büyütülmesi ve kültürlerin istenen konsantrasyona seyreltilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, fare mesanesinin ilgilenilen bakteriyel suşlarla transüretral olarak inoküle edilmesidir.Prosedürün üçüncü adımı, idrar örneklerinin toplanması ve böbrek ile mesanelerin hasat edilmesidir. Prosedürün son adımı, agar plaklarının idrar ile homojenize edilmiş böbrek ve mesane örnekleriyle ekilmesidir. Sonuç olarak, plaklanmış örneklerdeki bakteriyel kolonilerin varlığına dayanarak idrar yollarının başarılı bir şekilde enfekte olduğunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.Merhaba, ben Michael Shea; Stanford Üniversitesi Tıp Fakültesi Üroloji Bölümü'ndeki laboratuvarıma hoş geldiniz. Ben de Shea laboratuvarından Annu. Bugün size farelerde transüretral kateterizasyon prosedürünü göstereceğiz.Laboratuvarımızda, farelerde idrar yolu enfeksiyonu indüksiyonunu incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Laminer akışlı kabinde, 30 santimetre uzunluğunda polietilen tüp kesin ve steril 3 cm³'lük bir şırıngaya 30 gauge iğne sabitleyin.Kesilmiş tüpün bir ucunu steril penset ile tutun ve göbekle buluşana kadar iğnenin üzerine kaydırın. Tüpü, iğnenin ucundan yaklaşık iki santimetre dışarı çıkacak şekilde kesin. Bu işlem, kateterizasyon sırasında farelerin zarar görmesini önlemeye yardımcı olur.Kateteri şırıngadan çıkarın ve steril bir petri kabına yerleştirin. Enfekte edilecek her fare için bir kateter hazırlayın. Kateterleri en az 30 dakika boyunca ultraviyole ışınlama ile sterilize edin.Kateterin uzun süreli saklama sırasında steril kalmasını sağlamak için kabı parafilm ile mühürleyin. İlgilenilen bakteriyel suşun dondurulmuş stokundan alınan bir inokülümü uygun agar plakasına ekim yapın. Burada, üropatojenik E coli veya UPEC inokülümü, 37 °C'de gece boyunca büyütülmek üzere ekilmektedir.Uygun morfolojiye sahip tek kolonileri seçin; UPEC durumunda bunlar LB agar üzerindeki katı sarımsı, yarı saydam kolonilerdir ve 37 °C'de, dakikada 200 devir hızında ajitasyonla gece boyu kültürleme için en az beş mililitre sıvı besiyerine yerleştirin. İlk besiyeri kültürünün %10'unu taze besiyerine ekleyin ve gece boyu büyütün. İn vivo üropatojenite ile ilişkili olan tip 1 pili ekspresyonunu artırmak için, koloni oluşturan birim sayısını belirlemek amacıyla kültürün OD 600 değerini ölçün.Kültür başına mililitredeki CFU'nun kısaltılmış hali. İnokülasyonun hemen ardından boşaltım gerçekleşmemesini sağlamak için, nihai konsantrasyon 10 µL ile 50 µL arasında 10⁶ ile 10⁸ CFU olacak şekilde kültürü steril 1xPBS ile seyreltin. Uygulama sonrası, fareleri anestezi öncesinde 30 dakika boyunca susuz bırakın, fareyi ensesinden kavrayın ve boşaltımı teşvik etmek için alt karın bölgesine nazikçe bastırın.Anestezize edilmiş fareyi, başı izofloran içeren oksijene bağlı bir burun konisine yerleştirilmiş şekilde sırtüstü pozisyona getirin. Mesanedeki kalan idrarı boşaltmak için abdomen bölgesine masaj yapın. Alt abdomen ve perine bölgesini %70 etanol ile ıslatmak için bir sprey şişesi kullanın.Ardından, bakteriyel inokülumu çekmek için steril bir bir mililitrelik şırınga kullanın. Şırıngaya hazırlanmış steril bir kateter takın. Tüpü, iğne ucundan sadece bir ila iki milimetre dışarı taşacak şekilde kesmek için makas kullanın.Bu, kateterizasyon sırasında farelerin zarar görmesini önlemeye yardımcı olur, şırıngaya vurun ve pistonu bastırın. Hava kabarcıklarını gidermek için kateteri, bakteri statik kaydırıcı jelin bir miktarının içine daldırarak yağlayın. Diseksiyon stereo mikroskobu altında test edilecek her bir bakteri suşu için farklı bir miktar jel kullandığınızdan emin olun.Baskın olmayan elinizle ince dişli forseps kullanarak klitoral başlığı nazikçe kavrayın ve baskın elinizle derin pembe renkli üretra ATU'sunu ortaya çıkaracak şekilde yukarı kaldırın. Ucu katetere bağlı şırıngayı kavrayın. Bir kalem tutuşuyla, kateterin ucunu farenin karnına göre 45 derecelik bir açıyla üretra ATU'sunun içine yerleştirin.Median sagittal düzlemde. Klitoral hood'u şırınganın uzun ekseni boyunca gerin. Üretranın katetere etkili bir şekilde yerleştirilmesini sağlayın.Gerektiğinde kateter mesaneye kolayca kaymalıdır. Üretranın fazla katlantıları arasında ilerlemeye yardımcı olmak için kateteri hafifçe döndürün. Kateter göbeğe kadar yerleştiğinde, şırıngayı farenin karnına paralel olacak şekilde indirin.Penseti bırakın ve kateter ile şırıngayı sabitlemek için baskın olmayan elinizi kullanın. İnokülümü en az beş saniye boyunca yavaşça enjekte edin. Enjeksiyon sırasında kateterin etrafından sıvı aktığı görülürse, mesane doludur veya kateter vajinadadır.Enjeksiyonu durdurun ve kateter konumunu inceleyin. Gerekiyorsa kateteri üretra içinde yeniden konumlandırın. Enjeksiyondan sonra kateteri yavaşça geri çekin.İnokülasyondan sonra fareyi yarım saat boyunca anestezi altında tutun. Ameliyat sonrası boşaltım riskini azaltmak için, normal solunum düzeninin ve aktivitenin geri döndüğünü onaylamak amacıyla fareyi sürekli gözlem altında, temiz bir ısıtıcı battaniye üzerinde iyileşmeye bırakın. Fare tamamen iyileştiğinde ve sürünme yeteneği kazandığında, onu içinde altlığın bulunduğu kafese geri yerleştirin.Bakteriyel suş ve fare suşlarının kombinasyonuna bağlı olarak, tam bir enfeksiyonun gelişmesi altı saat ile bir hafta arasında sürebilir. Gelişim sürecinde, birkaç saat boyunca her enfekte fare için steril bir Petri kabını buza yerleştirin. Kültür için idrar toplamak amacıyla fareyi kabın üzerinde ensesinden tutarak sabitleyin.50 µL idrar yeterli olacaktır. İdrarı bir mikro santrifüj tüpüne pipetleyin, tüpü kapatın ve idrarı buz üzerinde muhafaza edin. Diseksiyon mikroskobu altında, ötanazi uygulanmış bir fareyi sırt üstü olacak şekilde bir diseksiyon tepsisine yerleştirin.Karın bölgesini %70 etanol ile püskürtün. Ciltte ve alttaki karın duvarında üç ila dört santimetrelik bir insizyon yapmak için makas kullanın. Gerekirse, karın duvarını karın içeriğinden uzaklaştırmak için raptiye kullanın.Önceki idrar toplama girişimleri başarısız olduysa, mesane duvarından doğrudan idrar aspire etmek için 30 gauge iğne ve şırınga kullanın. Böbrekleri çıkarmak için pens ve makas kullanın. Böbrekleri steril bir Petri kabına aktarın ve her birini, her biri yaklaşık iki ila üç milimetre boyutunda olacak şekilde en az dört parçaya bölün.Her bir böbrek fragmanını, beş ila altı adet steril 0,5 milimetre zirkonyum oksit boncuk ve 400 mikrolitre steril PBS içeren bir kriyoviyale aktarın. Böbrek örneklerini buz üzerinde tutun. Mesaneyi çıkarmak için pens ve makas kullanın.Mesaneyi, böbrekler için uygulanan yöntemle aynı şekilde ince parçalara ayırın. Her bir mesane parçasını, 1,6 millimeter paslanmaz çelik boncuklar ve 200 microliters steril PBS içeren bir kriyotüpe aktarın ve tüpleri buz üzerinde tutun. Tüpleri bir bullet blender homojenizatöre yerleştirin ve dokuyu sekiz hız ayarında en az bir dakika boyunca homojenize edin.Homojenizasyon sonrası bazı doku fragmanlarının kalması yaygın bir durumdur. Tüm örnekler bir mikrotitre plakasında aynı süre boyunca homojenize edilmelidir. Toplanan idrar ve doku homojenatının buz üzerinde ardışık on kat seyrelmesini yapın.Soğuk PBS yayma işlemi. Dilüsyon tamamlandı. Uygun agar plakaları 37 °C'de gece boyunca inkübe edilir.Organ başına, doku miligramı başına veya mililitre idrar başına düşen CFU değeri, her plaktaki koloni sayısından geriye dönük olarak hesaplanabilir. Bakteriyel stres yanıtlarındaki mutasyonların, UPEC'in in vivo ortamda İYE oluşturma yeteneğini ve enfekte farelere verilen antibiyotiklere karşı direncini nasıl etkilediğini incelemek için bu teknikleri kullanmaktayız. Bu tablo, transüretral inokülasyon sonrası vahşi tip UPEC'in fare mesanesini enfekte etme yeteneğini göstermektedir.Farelerde idrar yolu enfeksiyonlarının transvers olarak nasıl indükleneceğini size göstermiş olduk. Bu prosedür uygulanırken, farelerin nazikçe kateterize edilmesi önemlidir. Doğru teknik kolay kateterizasyon sağlar ancak pratik gerektirebilir.İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

transurethral-induction-of-mouse-urinary-tract-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Luyts, N. ve diğerleri. Biyolüminesans görüntüleme ile farelerde idrar yolu enfeksiyonlarının uzunlamasına takibi ve tedavisi. J. Vis. Exp. (2021).Bu video, bakteriyel yapışma, invaziya ve hücre içi çoğaltmanın gerçekleştiği mesane içine enjekte edilen biyolüminesan E. coli kullanılarak fare modelinde idrar yolu enfeksiyonunun indüksiyonu ve izini göstermektedir. Biyolüminesans operondan yayılan ışık, enfeksiyon ilerlemesi sırasında bakteri yükünün gerçek zamanlı göstergesi olarak...

Biyolüminesans kullanarak fare modelinde idrar yolu enfeksiyonunun görselleştirilmesi

Kaynak: Conover, M. S. ve diğerleri, J. Fare Modelinde İYİS ve KAUTI'nin Kuruluşu ve Karakterizasyonu. J. Vis. Exp. (2015)Bu video, dişi bir farede transüretral kateter montajı ve implantasyonunu, ardından kateterle ilişkili idrar yolu enfeksiyonunu belirlemek ve biyofilm aracılı konak-patojen etkileşimlerini araştırmak için bakteriyel aşılama prosedürünü göstermektedir.

Fare modelinde kateterle ilişkili idrar yolu enfeksiyonu

Kaynak: Conover, M. S. ve ark., Fare Modelinde İYİS ve CAUTI'nin Kuruluşu ve Karakterizasyonu. J. Vis. Exp. (2015)Bu video, β-galaktosidaz eksprese eden Escherichia coli ile enfekte olan fare mesane dokusunda hücre içi bakteri topluluklarının (IBC) tespit edilmesini göstermektedir. Doku fiksasyonu, permeabilizasyon ve X-gal ile boyama sonrası, IBC'ler diseksiyon mikroskopu altında mavi nokta olarak görülür ve idrar yolu enfeksiyonu sırasında bakteriyel invaziyanı doğrular.

Enfekte Bir Fare Mesanesindeki Hücre İçi Bakteri Topluluklarının Görselleştirilmesi

Bu videoda, farelerde idrar yolu enfeksiyonu modeli oluşturmak için üropatojenik bakterilerin intravezikal uygulama tekniğini açıklıyoruz. Bu model, üropatojenik bakteriyel enfeksiyonun üriner sistem içindeki yayılımını ve İYE duyarlılığını belirleyen mekanizmaları anlamak için kullanılabilir.

İdrar Yolu Enfeksiyonu Modelinin Oluşturulması: İdrar Yolu Enfeksiyonu Modeli Geliştirmek İçin Farede Üropatojenik Bakterilerin Uygulanması İçin Bir Teknik

Bu video, transüretral kateter damlatma yoluyla bir dişi fare mesanesinde üropatojenik Escherichia coli enfeksiyonunun oluşumunu göstermektedir. Enjekte edilen bakteriler, mesane içinde başarılı bir idrar yolu enfeksiyonu oluşturur ve idrar yolu ile ilgili sağlıkla ilişkili hastalıkları incelemek için değerli bir platform sağlar.

Erkek Farelerde İdrar Yolu Enfeksiyonu Modeli Oluşturmak için Transüretral Kateterizasyon ve Bakteriyel Aşılama

Dişi Farelerde İdrar Yolu Enfeksiyonu Modelinin Oluşturulması

Üriner sistem enfeksiyonlarını (İYE) modelleme yeteneği, bakteriyel patogenezi anlayabilmek ve yeni terapötiklerin geliştirilmesini sağlayabilmek için çok önemlidir. Bu çalışmanın amacı, insanlarda görülen bulguları özetleyen ve tahmin eden deneysel İYE ve kateterle ilişkili İYE'nin fare modellerini göstermektir.

Fare Modelinde Kuruluş ve İYE ve CAUTI Karakterizasyonu

Farelerin transüretral Kateterizasyon kurulan modeli mesane patolojiler, idrar yolu enfeksiyonu, dahil olmak üzere çalışma sağlar ancak yalnızca dişi içinde gerçekleştirilebilir. Burada anlatılan erkek transüretral korumak yeni bir model araştırma cinsiyetler arasında güçlü klinik ve epidemiyolojik farklarına iaretlenmi bir alanı sağlayacaktır.

İdrar yolu enfeksiyonu küçük bir hayvan modeli: erkek ve dişi farelerin transüretral Kateterizasyon

Transüretral korumak zor bir işlemdir ve de literatürde açıklanmayan. Bu yazının amacı transüretral mesane ve/veya yetişkin erkek farelerde prostat içine aktif maddeler ile sıvı İntravezikal teslim etmek için bir kateter yerleştirilmesi için bir tekniği tarif etmektir.

Yetişkin erkek fare yordamda transüretral korumak

Gizli hücre içi mesane rezervuarları oluşturmak için üropatojenik E. coli (UPEC) transüretral aşılamasının bir fare modeli ve tekrarlayan UPEC İYE'yi indüklemek için G. vajinalis'e mesane maruziyeti gösterilmiştir.  Ayrıca bakterilerin sayımı, idrar sitolojisi ve in situ mesane fiksasyonu ve taramalı elektron mikroskobu için işlenmesi de gösterilmiştir.

Farelerde Gardnerella vaginalis Mesane Maruziyeti Tarafından Tetiklenen Tekrarlayan Escherichia coli İdrar Yolu Enfeksiyonu

Bu makalede, farelerde idrar yolu enfeksiyonuna neden olacak lüks bir operon ile üropatojenik bakterilerin intravesik yönetimi ve daha sonra biyolüminesans görüntüleme kullanılarak bakteri yükünün uzunlamasına in vivo analizi açıklanmaktadır.

Biyolüminesans Görüntüleme Kullanan Farelerde İdrar Yolu Enfeksiyonlarının Boyuna Takibi ve Tedavileri

Öğrenin farelerde transüretral idrar yolu enfeksiyonu indüksiyonu ve kantitatif analiz yöntemlerini. Bu protokol bakteriyel suş hazırlama, mesane inokülasyonu ve doku örnekleme adımlarını kapsar.

Transüretral İndüksiyon Fare İdrar Yolu Enfeksiyonu

Daha fazla video keşfet