Tümleşik Optik ve Atomik Kuvvet Mikroskobu eğitimi Mekanik Uyarım Canlı Hücre Tepki

Mekanik stimülasyona gerçek zamanlı hücre tepkisinin incelenmesi, 24 saat boyunca cam tabanlı tabaklarda GFP füzyon proteinlerini eksprese eden ilk büyüyen hücreler tarafından gerçekleştirilir. İkinci adım, A FM ucunu biyotinile fibronektin ile kaplamaktır. Daha sonra işlevselleştirilmiş bir FM ucu, A FM ucu etrafında güçlü bir fokal yapışmanın oluşmasına izin vermek için hücre yüzeyi ile temas ettirilir ve fibronektin kaplı uç ile hücre arasındaki bir matris integrin aktin bağlantısı yoluyla hareket hücre iskeletinin doğrudan manipülasyonuna izin verir.

Son adım, A FM ucunun kontrollü yukarı doğru hareketi ile canlı hücreyi mekanik olarak uyarmaktır, öyle ki güçlü fokal yapışmayı bozmadan hücre temas noktasında dikey kuvvet uygulanır. Sonuç olarak, sonuçlar, hücrelerin substrata bağlanmalarını güçlendirerek ve gerçek zamanlı floresan optik görüntüleme ile kaydedildiği gibi aktin hücre iskeletinin yeniden düzenlenmesini indükleyerek mekanik stimülasyona yanıt verdiğini göstermektedir. Merhaba, ben Andrea Trake, Texas a ve m Sağlık Bilimleri Merkezi'nde Sistem Biyolojisi ve Translasyonel Tıp Bölümü'nde yardımcı doçentim.

Merhaba, ben Sum Lim. Texas a and m Sağlık Bilimleri Merkezi'nde Sistem Biyolojisi ve Translasyonel Tıp Bölümü'nde doktora sonrası araştırmacıyım. Bugün size mekanik stimülasyona uyarlanabilir hücresel yeniden şekillenmeyi incelemek için bir prosedür göstereceğiz.

Laboratuvarımızda bu prosedürü canlı vasküler düz kas hücrelerinde gerçek zamanlı hücre iskeleti yeniden şekillenmesini araştırmak için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu çalışmalar için, bir CSU 22 Yokogawa tarama kafası ile birleştirilmiş toplam iç yansıma floresan veya çim bağlantısına sahip ters çevrilmiş bir Olympus IX 81 mikroskobu kullanılır.

Ters çevrilmiş optik mikroskobun üzerine bir biyo kapsam SZ atomik kuvvet mikroskobu monte edilmiştir. Tüm sistem araştırma sınıfı bir optik tabla üzerine monte edilmiştir ve daha önce ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu entegre mikroskop, iki niceliksel EM elektron çarpımı şarj bağlantılı cihaz veya EMCD kameraları kullanır.

Biri çim görüntüleme, diğeri ise konfokal görüntüleme içindir. Dönen disk tarayıcı, harici filtre tekerleği ve bir E-M-C-C-D kameradan oluşan konfokal düzenek, titreşim sönümleme için gerekli olan bir silikon pedin üzerine yerleştirilmiş bir alüminyum taban plakasına monte edilmiştir. Tüm konfokal düzenek, dişli bir bileziğe sahip bir flanş aracılığıyla mikroskopla bağlanır.

Böylece, dönen disk tarayıcıdan gelen titreşimi önlemek için atomik kuvvet mikroskobu veya bir FM ölçümleri sırasında düzenek mikroskoptan ayrılabilir. Bir argon kripton lazeri, hem çim hem de konfokal görüntüleme modları için bir uyarma kaynağı olarak kullanılır. Lazer, lazeri çim ekine veya konfokal tarama kafasına ileten iki optik fiberden birine bağlanabilir.

İki, bilgisayarlar sistemi kontrol eder. Biri optik görüntülemeyi kontrol eden slayt kitabı yazılımını ve diğeri mekanik stimülasyon deneyinden 24 saat önce A FM'yi kontrol eden nano kapsam yazılımını kullanır, bu da bir cam alt hücre kültürü kabında spesifik proteinlere karşı hedeflenen GFP yapılarını ifade eden canlı hücreleri yerleştirir. Deney gününde, hücre kültürü ortamını fenol kırmızısı içermeyen ortamla değiştirin.

FM deneyi gürültüye çok duyarlı olduğundan, gürültüyü en aza indirmek için deney sırasında optik masaya veya mikroskoba konuşmaktan veya dokunmaktan kaçının. A FM ölçümlerinde, dönen diski mikroskoptan konfokal olarak ayırın. Deney, hücre kültürü çanağının, çanağı manyetik mikroskop aşamasına sabitlemek için manyetik bir bilezik ile bir FM aşamasına monte edilmesiyle başlar.

A FM probu üzerindeki V şeklindeki konsol, iki mikron biyotinile cam boncuk ile özelleştirilmiştir. Konsol mikroskop kullanılarak kolayca görülebilir. Boncuk, konsolun en ucuna yapıştırılır ve kaplama çözeltisinin damla damla uygulanması gereken yer burasıdır.

Bir FM probunu deneye hazırlamak için önce ucu cam tutucuya monte edin ve ardından ucu kaplamak için cam tutucuyu masa yuvasına yerleştirin. Ucun en ucuna 10 mikrolitre docos fosfat tamponlu salin veya DPBS'yi dikkatlice damlatarak ucu yıkayın ve ardından ucu kurutmak için bir kim'lik mendil kullanın. DPBS ile mililitre başına bir miligramda yıkadıktan sonra bu işlemi beş kez tekrarlayın.

Çözümde hevesli. Ucun üzerine damla damla in. Avadon kaplamayı takiben ucun beş dakika inkübe etmesine izin verin.

Ucu DPBS ile beş kez daha yıkayın. Daha sonra, mililitrelik çözelti başına bir miligram ekleyerek biyotinile fibronektini avadon üzerine çapraz bağlayın. Ucun üzerine damla damla ve beş dakika inkübe edin.

Son olarak, ucu DPBS ile tekrar beş kez yıkayın ve son damlayı uçta bırakın. Uç hazırlandıktan sonra, ucu bir FM tarayıcıya monte edin. Bir FM ucunu monte ettikten sonra, tutucunun etrafına koruyucu bir silikon etek yerleştirin.

Ardından video görüntüleme mikroskobunu kurun. Ardından, bir FM ucunu görüş alanının ortasına hizalayın. Lazer ışınını konsolun en ucuna yerleştirerek optik kolu ayarlayın.

Ardından, hedefi tek hücreli görüntüleme için uygun yüksek büyütme hedefine değiştirin. Daha sonra mekanik olarak uyarılacak olan hücreyi görüş alanına getirin ve A FM ucunun hücre yüzeyine inmesi gereken bir yer seçin. Son olarak, bir FM ucunu söz konusu hücreye değene kadar indirin.

Ucu hücre ile temas ettirdikten sonra yaklaşık 20 dakika bekleyin. Bu, hücre yüzeyindeki bir FM temas noktasında güçlü bir fokal yapışmanın oluşmasına izin verir. Bekleme süresinin ardından, mekanik stimülasyon prosedürü mekanik stimülasyon deneyine hazırlanmaya başlayabilir.

Görüntüleme için floresan hücrelerin görüntülenmesine izin vermek için video kameradan EMCD kameraya geçin. Daha sonra dinlenen hücrenin ilk görüntüsünü elde edin. Hücre gövdesi boyunca hücre iskeletindeki eylemin görselleştirilmesi için dönen disk ve ses mikroskobu kullanın.

Tersine, hücreyi uyarmak için fokal yapışmaları görselleştirmek için çim kullanın. Her üç ila beş dakikada bir ayrı adımlarla kontrollü bir yukarı doğru hareket uygulamak için konsolu kullanın. A FM verilerini alırken, dikey kutup için uygun zamanlamayı belirlemek için operatörün Z piso konumunun voltajını sürekli olarak izlemesi önemlidir.

Bir FM veri toplama ile eş zamanlı olarak, slayt kitabı yazılımını kullanarak her dikey çekmeden sonra hücrenin konfokal veya çim görüntüsünü kaydedin. Son olarak, stimülasyon deneyinin tamamlanmasının ardından bir FM ucunu hücreden çekin. Aktin, MRFP ve vcul ile bir vasküler düz kas hücresi transfekti.

GFP, apikal hücre yüzeyinde bir FM kullanılarak görüntülendi. Aynı hücre, bazal hücre yüzeyinde çim kullanılarak görüntülendi. Burada iki görüntü üst üste biniyor.

Aynı hücrenin bir görüntüsü, hücre gövdesi boyunca konfokal dönen disk kullanılarak da elde edildi ve bir 3D yığınının maksimum izdüşümü olarak gösterildi. A FM ve dönen disk arasında iyi örtüşmeler Konfokal görüntüler gösterilir. Aktin MRFP ile transfekte edilen vasküler düz kas hücresi A FM tarafından mekanik olarak uyarıldı ve dönen disk konfokal mikroskobu ile görüntülendi.

Hatalar, bir FM stimülasyonu üzerine kayda değer bir yeniden yapılanma gösteren etkili lifleri gösterir. Bazı hareket lifleri polimerize olurken diğerleri mekanik stimülasyon nedeniyle depolimerize olur, diğer etkili lifler bir araya toplanır. Eylemin yeniden yapılandırılması nedeniyle, optik görüntüleme yöntemlerini kullanarak CY yeniden düzenlemesini kaydederken aynı anda EFM kullanarak bir hayat satan kültürü mekanik olarak nasıl canlandıracağınızı size gösterdik.

Bu prosedürü yaparken, bir FM deneyinin son derece gürültülü ve hassas olduğunu hatırlamak önemlidir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve açıklamalarınızda iyi şanslar.