İlaçlar, Viral Vektörler, veya Hücre Transplantasyon teslimi için Microinjections Derin Beyin Yapıları Hedefleme

Bu prosedürün genel amacı, ilaçların, viral vektörlerin veya hücre transplantlarının iletimi için derin beyin yapılarına yüksek hassasiyetle mikro enjeksiyonlar gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle 50 µm lümene sahip cam kapiler iğnelerin üretilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, iğnenin %50'sinin kapiler etkiyle mineral yağ ile doldurulması ve pistonun tüpün en geniş ucundan yerleştirilmesidir.

Prosedürün üçüncü adımı, iğneyi enjekte etmek istediğiniz madde veya hücre süspansiyonu ile doldurmaktır. Prosedürün son adımı ise iğne ucunu yerleştirmek ve maddeyi çok düşük bir akış hızıyla derin beyin yapısına enjekte etmektir. Sonuç olarak, cam kılcal tüp kullanılarak yapılan mikro enjeksiyonlar aracılığıyla maddelerin beyne çok hassas bir şekilde hedeflendiğini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Merhaba, ben Meksika'daki Colima Üniversitesi Psikoloji Fakültesi Nörobilim Laboratuvarı'ndan Oscar Gonzalez. Bugün sizlere, fare beynine ilaç iletmek için cam kılcal tüp ile mikroenjeksiyon uygulama prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedürü, yetişkin nöral kök hücreleri incelemek amacıyla laboratuvarımızda kullanmaktayız.

Öyleyse başlayalım. Beyne yapılan mikro enjeksiyonlarda 50 mikrometre lümenli cam kapiler iğnelerin kullanımı, beyin hasarını önemli ölçüde azaltır, ilaçların pasif difüzyonunu minimize eder ve kemirgen beyninde hassas hedefleme yapılmasına olanak tanır. Mikro enjeksiyonlar gerçekleştirilmeden önce, cam iğnelerin hazırlanması gerekir.

Kılcal cam tüpü bir mikro pipet çekicinin yüksek dirençli çekme elektroduna yerleştirerek başlayın. Ardından, mikro pipet çekicinin elektrodunu açın. Cam tüpün orta kısmını ısıtıp yerel olarak yumuşatmak için, cam tüpü boyuna ekseni boyunca, yerel bölgedeki cam tüp çapında azalmaya neden olacak kadar üç ila beş milimetrelik bir başlangıç mesafesinde gerin.

Cam tüpü, kırılana kadar germeye devam edin. İki adet özdeş tek gövdeli iğne oluşturmak için bu adımları tekrarlayın. Şimdi cam iğneleri bir mikro fırına yerleştirin.

Ucu eğimli hale getirmek için 30 derecelik bir açı yeterlidir. Son olarak, iğneleri mikroskop altına yerleştirin ve her ikisinin de doğru iç çapta olduğunu kontrol edin. İmal edilen iğneler için çoğu hidrofilik ilaçta 30 ila 50 mikrometre iç çap idealdir.

Bunların mikroenjeksiyonlar için nasıl kullanılacağını görelim. Başlamak için, hazırlanmış iğneyi en geniş ucundan mineral yağı ile doldurun. Mineral yağının, kılcal tüp uzunluğunun yaklaşık %50'sine ulaşana kadar kılcallık yoluyla girmesini bekleyin.

İğnenin en geniş ucuna yüksek vakumlu gres sürün ve pistonu içinden geçirin. Cam iğnenin ucundan küçük bir damla çıkana kadar mineral yağı nazikçe itin. Şimdi iğneyi mikroenjektör tutucusuna sabitleyin ve hayvanı enjeksiyon için hazırlamaya başlayın.

Öncelikle, hayvanın vücut sıcaklığını korumak için stereotaktik hayvan tutucuya bir ısıtıcı ped yerleştirin. 37 °C sıcaklıkta, anestezi altındaki farenin başını tıraş edin, ardından hayvanı stereotaktik cihaza yerleştirip sabitleyin. Kulak barları ve diş tutucu kullanarak, cerrahi bir bistüri ile deriyi kulaklardan kafatasındaki Lambda hattına kadar kesin.

Kafatası, kurutulması için bir pamuklu çubukla silinmeli ve deri cerrahi alandan dışarı çekilmelidir. Ardından, cam iğnenin ucuyla bgma dikişinin tepe noktası işaretlenmeli ve ilk enjeksiyon konumu buraya ayarlanmalıdır. Şimdi, stereotaktik cihazın x ve Y eksenleri kafatası üzerinde hareket ettirilerek delinecek nokta belirlenmelidir.

Bir araştırma mikro matkabı kullanarak, seçilen koordinatlarda ince forsepsler yardımıyla dikkatlice delikler açın. Kemik tabakasının en derin kısmını dikkatlice çıkarın ve dura mater membranını delin. Dışarı sızan bir miktar serebrospinal sıvı göreceksiniz.

İğnenin delinmiş boşluklardan geçebildiğini doğrulamak için, stereotaktik cihazın Z eksenini kullanarak cam iğneyi yavaşça indirin. Şimdi, enjekte edilecek ilaçtan 1 µL pipetleyin ve küçük bir parça parafin üzerine yerleştirin. Parafini kafatasının üzerine yerleştirin.

Sıvının cam iğnenin içine doğru yükseldiğini mikroskop altında kontrol ederken, mikro enjektör tekerleğini döndürerek ilacı çekin. Parafilm'i çıkarın ve sıfır koordinatını yeniden ayarlayın. Şimdi iğneyi seçilen koordinatlara taşıyın ve cam iğnenin ucu beyin yüzeyine hafifçe değene kadar tutucuyu indirin, ardından Z.Coordinate değerini sıfır olarak ayarlayın.

Cam iğneyi beyin parankiminin istenen derinliğine yerleştirin. İlacı saniyede yaklaşık bir nanolitre hızla yavaşça enjekte edin. İstenen hacim enjekte edildiğinde, ilacın parankime yayılması için iki dakika bekleyin ve ardından iğneyi yavaşça ve pürüzsüz bir şekilde çıkarın.

Son olarak cerrahi yarayı yapıştırın ve hayvanı stereotaktik cihazdan çıkarın. Hayvanı, anesteziden ayılması için önceden ısıtılmış bir kafese yerleştirin. Şimdi bazı mikroenjeksiyon sonuçlarını göstereceğiz.

Cam iğnenin neden olduğu beyin hasarını minimize etmek amacıyla, beyaz cevher yollarında demiyelinizasyon meydana getiren lizofosfatidilkolin veya lyin, corpus callosum'a enjekte edildi. Sadece 20 litrelik lyin enjekte edildi. Demiyelinizasyon, beyaz cevher yollarında miyelin temel protein ekspresyonunun yokluğu ile temsil edilir; çok hassas bir enjeksiyon sağlanmış olup oldukça dar bir iğne yolu beyin hasarını minimize etmektedir.

Derin beyin yapılarına mikroenjeksiyonlar yapmak için cam iğnelerin nasıl hazırlanacağını size gösterdik. Bu prosedürü gerçekleştirirken, tüm ekipman ve malzemelerin cerrahi odada kullanıma hazır olduğundan emin olmak önemlidir. Şimdilik bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.