Name: RhoC GTPaz Etkinleştirme Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Keşfedin: Pull down assay ile hücrelerde aktif RhoC GTPaz seviyelerini ölçme yöntemi. Bu güvenilir teknik, hücre sinyalizasyonu ve GTPaz fonksiyonlarının anlaşılmasına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Savunma Bölümü W81XWH-05-1-0005, W81XWH-06-1-0495, W81XWH-08-1-0029 ve W81XWH-08-1-0356

1. Hazırlayın ve GST-füzyon protein <ol><li> BamH1/EcoR1 pGEX3x vektör içine subcloned rhotekin Rho bağlayıcı etki alanı (RBD) ilk 90 N-terminal amino asitleri içeren JM109 yetkili bakterilerin Gliserol stokları yapılır. Yüksek verim sağlamak için aşağıdaki adımları, her bir deney için yapılmalıdır. Deneyimlerimize göre, taze GST-RBD sağlam ve doğru bir GTPaz aktivasyon tahlil için anahtar hazırlanmıştır. </li><li> Gliserol stokunun LB amp 50 ml (yaklaşık, Çözülme yok) 50 mcL ekleyin ve titreme ile 37 ° C gecede büyümek. </li><li> 500 ml LB-amp 01:10 seyreltilir ve 1 saat boyunca büyümek </li><li> 2 saat için 0.1 mM IPTG GST-protein üretimini uyarır. </li><li> 5000 santrifüj şişe ve santrifüj, Sorval GSA3 rotor içine eşit olarak dağıtın RPM 4 ° C 20 dak. </li><li> Santrifüj şişe içinde süspanse edin pelet, 10 ml lizis tampon *. * Bakteriyel Lizis Tamponu:% 20 Sakkaroz,% 10 gliserol, 50 mM Tris, pH 8.0, 0.2 mM 2 S 2 O 5, 2 mM MgCl 2, 2 mM DTT, Na, taze PMSF benzamid, aprotinin ve leupeptin ekleyin. </li><li> 2-3 dk (sonikatör türüne bağlıdır. Işareti 6 ayarlanmış bir Fischer Sonic Dismembranator Model 500,% 50 döngüsü) sonikasyon. </li><li> 4 Santrifüj, Sorvall SS34 20 dakika 10.000 rpm ° C Bu noktada küçük bir kısım alınması ve SDS-PAGE ile çalışır. Jel Coomassie boyanmış olabilir ve bir grup 46 kDa belirgin olmalıdır. </li><li> Süpernatantı ve 1 ml% 50 glutatione-sepharose 4B bulamaç ekleyin. </li><li> 30 dakika 4 ° C'de rotasyon ile. Lizis tamponu ile 3 kere yıkayın. </li><li> GST-balık tamponu ile (yaklaşık 1 ml)% 50 bulamaç GST-RBD/glutatione-Sepharose boncuk yeniden süspanse **. ** GST-Balık Tampon:% 10 Gliserol, 50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl,% 1 NP-4, 2 mM MgCl 2, taze PMSF benzamid, aprotinin ve leupeptin </li></ol> 2. GST-fusion tahlil aşağı çekme <ol><li> 5-10 x 10 6 hücre / tahlil kullanın . </li><li> Kez, buz PBS, buz üzerinde plakaları tutmak (buz dolu bir düz cam tabak kullanın) ve 0.5 mL GST-balık tampon lyse hücreleri yıkayın. </li><li> 5 dakika buz üzerinde inkübe, hasat hücreleri kullanarak lastik bir polis ya da düz dozajlama, tüp mikrofuge'de transferi ve 4 20,000 rpm 5 dakika santrifüj ° C </li><li> Süpernatant taze bir mikrofuge'de tüpüne aktarın. Toplam Rho (yani GSYİH + GTP sınır) belirlemek için 50 mcL alın. </li><li> 0.5 mL GST-RBD/glutatione-Sepharose boncuk ekleyin ve 4 geceleme rotasyon ile ° C inkübe. </li><li> GST-balık tampon 6x yıkayın. </li><li> 40 mcL 2x-Laemelli örnek tampon yeniden süspanse boncuk Bu noktada 2.4 'te alınan toplam Rho protein kısım konsantrasyonu belirlenir ve 30 mikrogram karşılık gelen aktivasyon örnek jel üzerinde çalıştırmak için hazırlanmalıdır. </li><li> Kaynatın örnekleri 90 ° C, 5 dakika için, kısaca santrifüj ve 12% 4-20 degrade SDS-PAGE jel supernatant (yani boncuk önlemek) yük almak ve çalıştırmak. </li><li> 100 W Towbin tampon ve sabit akım kullanılarak membran transferi, daha yüksek 150 volt jel çalıştırın </li><li> RhoC specfic antikor% 5 süt / TBST çözüm ve prob ile membran engelleyin. </li></ol> 3. Temsilcisi Sonuçlar Iyi sonuçlar tek bir grup yaklaşık 22 kDa üretmek gerekir. Kötü sonuçlar, çoklu bantları ya da yüksek arka plan üretir. Bu protein bozulması, örneklerin eksik yıkama veya eski GST-RBD göstergesidir. <img src="/files/ftp_upload/2083/2083fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Üç ayrı hücre hatları RhoC GTPaz farklı düzeylerde ifade aktif ve toplam RhoC, yüksek düzeyde aktif ve toplam RhoC ya da hiç RhoC düşük seviyelerini göstermek için gösterilmiştir. Blot sonra elimden ve ev tutmak gen aktin bir antikor ile toplam RhoC protein yükleme kontrol olarak hizmet reprobed oldu. <img src="/files/ftp_upload/2083/2083fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Çoklu bantlar veya yüksek protein bozulması, örnekleri eksik yıkama veya eski GST-RBD arka plan .

<ol><li>van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L. W., Merajver, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase%2C+a+novel+transforming+oncogene+for+human+mammary+epithelial+cells+that+partially+recapitulates+the+inflammatory+breast+cancer+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase, a novel transforming oncogene for human mammary epithelial cells that partially recapitulates the inflammatory breast cancer phenotype.</a> Cancer Res. 60 (20), 5832-5838 (2000).</li>
<li>van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L., Merajver, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase+overexpression+modulates+induction+of+angiogenic+factors+in+breast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase overexpression modulates induction of angiogenic factors in breast cells.</a> Neoplasia. 2 (5), 418-425 (2000).</li>
<li>Golen, K. L. van <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversion+of+RhoC+GTPase-induced+inflammatory+breast+cancer+phenotype+by+treatment+with+a+farnesyl+transferase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Reversion of RhoC GTPase-induced inflammatory breast cancer phenotype by treatment with a farnesyl transferase inhibitor.</a> Mol Cancer Ther. 1 (8), 575-583 (2002).</li>
<li>Golen, K. L. van <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogen+activated+protein+kinase+pathway+is+involved+in+RhoC+GTPase+induced+motility%2C+invasion+and+angiogenesis+in+inflammatory+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Mitogen activated protein kinase pathway is involved in RhoC GTPase induced motility, invasion and angiogenesis in inflammatory breast cancer.</a> Clin Exp Metastasis. 19 (4), 301-311 (2002).</li>
<li>Yao, H., Dashner, E. J., van Golen, C. M., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase+is+required+for+PC-3+prostate+cancer+cell+invasion+but+not+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase is required for PC-3 prostate cancer cell invasion but not motility.</a> Oncogene. 25 (16), 2285-2296 (2006).</li>
<li>Hall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+Collagen+receptor+%28alpha2beta1%29+signaling+promotes+prostate+cancer+cell+invasion+through+RhoC+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Type I Collagen receptor (alpha2beta1) signaling promotes prostate cancer cell invasion through RhoC GTPase.</a> Neoplasia. 10 (8), 797-803 (2008).</li>
<li>Sequeira, L., Dubyk, C. W., Riesenberger, T. A., Cooper, C. R., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+GTPases+in+PC-3+prostate+cancer+cell+morphology%2C+invasion+and+tumor+cell+diapadesis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Rho GTPases in PC-3 prostate cancer cell morphology, invasion and tumor cell diapadesis.</a> Clin Exp Metastasis. 25, 569-579 (2008).</li>
<li>van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL2+Induces+Prostate+Cancer+Transendothelial+Cell+Migration+via+Activation+of+the+Small+GTPase+Rac%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">CCL2 Induces Prostate Cancer Transendothelial Cell Migration via Activation of the Small GTPase Rac.</a> J Cell Biochem. 104, 1587-1597 (2008).</li>
<li>Chatterjee, M., van Golen, K. L. Int J Cancer. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Sander, E. E., ten Klooster, J. P., van Delft, S., van der Kammen, R. A., Collard, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac+downregulates+Rho+activity%3A+reciprocal+balance+between+both+GTPases+determines+cellular+morphology+and+migratory+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rac downregulates Rho activity: reciprocal balance between both GTPases determines cellular morphology and migratory behavior.</a> J Cell Biol. 147 (5), 1009-1022 (1999).</li>
</ol>

Prosedürün en kritik adım, taze GST-RBD nesil. Bu adımı yakın ilgi ödenmemesi başarısızlığın ana nedeni budur. GST-RBD (1.2) üretimi hücre lizatı (2.5) ile gecelik inkübasyon tüm adımları tek bir gün içinde yapılmalıdır. Bir diğer önemli adım, hücre lizatları üretmek için yeterli hücre vardır emin olun. RhoC GTPaz, hücre düşük seviyelerde bulunan olma eğilimindedir bakarken özel bir önem taşımaktadır.

<table><tbody><tr><td>Glutatyon-sefaroz 4B boncukları</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0756-01</td><td></td></tr><tr><td>Criterion %4-20 Tris-HCl jelleri</td><td>Bio-Rad</td><td>345-0032</td><td></td></tr></tbody></table>

rhoc gtpaz etkinleştirme testi

RhoC GTPase Activation Assay

RhoC GTPaz RhoA GTPaz% 91 homoloji vardır. Çünkü hücreleri yaygınlığı, RhoA GTPaz için birçok reaktifler ve teknikleri geliştirilmiştir. Ancak, RhoC GTPaz nispeten düşük seviyelerde metastatik kanser hücrelerinin ifade edilir. Bu nedenle, birkaç RhoC özel reaktifler geliştirilmiştir. Biz RhoC GTPaz tespit etmek için bir Rho aktivasyon tahlil adapte var. Bu teknik aktif RhoC GTPaz çekin bir GST-Rho bağlayıcı etki alanı füzyon proteini kullanır. Buna ek olarak, toplam düzeyleri (GTP ve GSYİH bağlı) RhoC GTPaz belirlemek için testin başında total protein hasat. Bu hücre aktif karşı toplam RhoC GTPaz belirlenmesi için sağlar. Ancak, bu prosedürün birçok ticari sürümleri geliştirilmiştir, ticari kitleri RhoA GTPaz için optimize edilmiştir ve genellikle RhoC GTPaz için iyi bir sonuç vermez. Testinin parçaları RhoC-spesifik antikor gelişimi yanı sıra modifiye edilmiştir.

Bu protokol, hücre içinde aktif RhoC GTPaz düzeylerini belirlemek için tahlil aşağı çekme kullanır.

RhoC GTPaz Etkinleştirme Testi

RhoC GTPaz, RhoA GTPaz ile %91 homolojiye sahiptir. Hücrelerdeki yaygınlığı nedeniyle, RhoA GTPaz için birçok reaktif ve teknik geliştirilmiştir. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada anlatılan yöntem aktive gefs için yüksek afinitesi olan bir mutantı RhoA GST füzyon proteini yararlanarak kültürlenmiş hücrelerde RhoA spesifik GDP / GTP Değişim Faktörleri (gefs) aktivasyonu takip etmek için bir ölçüm açıklanmaktadır. GEFS Western blot ve dansitometreyi miktarı tespit hücre lizatları, çöktürülmesi ile elde edilir.

Epitel Hücre lizatları bir GST-etiketli Mutant Rho Protein (GST-RhoA (G17A)) Kullanarak Active Rho-gefs ve Affinity Yağış

Bu video, GTPaz bağlayıcı protein ortaklarını incelemek için bir rekabet testini göstermektedir. Manyetik boncuklar üzerinde hareketsiz hale getirilmiş nükleotid bağlı GTPaz proteini kullanılarak, GTPaz üzerindeki aynı bağlanma bölgesi için etkileşen iki protein ortağı arasındaki rekabetçi bağlanma, protein ortaklarının bağlanma afinitelerini değerlendirmek için incelenebilir.

Rakip GTPaz Bağlayıcı Protein Ortaklarını İncelemek için Rekabet Bağlayıcı Test

Burada açıklanan flüoresan bazlı kalsiyum mobilizasyon tahlil yetim G-protein bağlı reseptörler (GPCR'ler) fonksiyonel olarak aktive edici ligandın (ler) in belirlenmesi için, bir orta-throughput ters farmakoloji tarama sistemidir.

Bir floresan bazlı Kalsiyum Mobilizasyon Deneyi G proteini ile birleştirilmiş alıcıların karakterizasyonu

Bu protokol, Rac1 dahil olmak üzere Rho ailesi GTPazları için bağlayıcı ortakların göreli afinitelerini karşılaştırır. İn vivo, Rac1 bağlayıcı proteinler, konformasyonu bağlı bir nükleotid tarafından belirlenen tek bir bağlanma arayüzü için rekabet eder. Nükleotid, yüksek hidroliz hızı nedeniyle hem önemlidir hem de deneysel olarak kontrol edilmesi zordur.

Rekabet tahlilleri kullanılarak GTPaz bağlayıcı proteinlerin afinitesini

Guanozin trifosfat (GTP) bağlanması, G-Protein-Çiftleşmiş Reseptör (GPCR) aktivasyonundaki en erken olaylardan biridir. Bu protokol, radyo-etiketli GTP analoğu, [35S] guanozin-5'-O- (3-tio) trifosfatın ([35S] GTPyS) bağlanmasını izleyerek spesifik GPCR-ligand etkileşimlerinin farmakolojik olarak nasıl karakterize edildiğini açıklamaktadır. Ilginin bir ligandına cevap.

Radyo-etiketli GTP Bağlanması vasıtasıyla G-protein ile birleşmiş Reseptör Sinyalizasyonunun Ölçümü

Burada tarif biz prenilasyon ve guanozin-5'-trifosfat (GTP) araştırmak için bir protokol-Rho GTPazlar yükleme. Bu protokol iki detaylı yöntemi oluşur, yani membran ayırma ve GTPazlar bağlı immunosorbent assay. Protokolü prenilasyon ve GTP ölçmek için kullanılabilir diğer küçük GTPases'den başka bir yükleme.

Küçük GTPazlar prenilasyon ve bağlayıcı kullanarak membran ayırma ve GTPazlar bağlı Immunosorbent Assay GTP tespiti

Bu rapor, görsel GPCR, rodopsin ve mini-Goile karmaşık hazırlamak için farklı deterjanların tarama açıklar. Arınma sırasında kompleksin farklı aşamalarında kalitesini karakterize eden biyokimyasal yöntemler gösterilmiştir. Bu protokol gelecekteki yapısal çalışmaları için diğer membran protein komplekslerine genelleştirilebilir.

Başarılı Kristalizasyon Için Görsel GPCR-mini-G Protein Sinyal Kompleksi Stratejik Tarama ve Karakterizasyonu

Bu çalışmada, rekombinant G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler) üzerindeki küçük molekül kütüphanelerini taramak için 384 kuyucuklu plakalar için yüksek verimli, hücre içi kalsiyum floresan testi açıklanmaktadır. Hedef, sığır ateşi kenesinden kinin reseptörü, Rhipicephalus microplus, CHO-K1 hücrelerinde eksprese edilir. Bu tahlil, aynı hücreleri tek bir "çift eklemeli" tahlilde kullanarak agonistleri ve antagonistleri tanımlar.

Rekombinant G Proteinine Bağlı Reseptörlerin Yüksek Verimli Taraması için "Çift İlaveli" Bir Kalsiyum Floresan Testi

Canlı hücrelerde endoplazmik retikulum-mitokondri temaslarını izlemek için bölünmüş lusiferaz yeniden birleştirme testi oluşturduk. Bu tahlili kullanarak, kimyasal işlem koşulu altında HEK293T hücrelerdeki bu organeller arası eşleşmelerin seviyesini kantitatif olarak ölçmek için bir protokol açıklıyoruz.

Canlı Hücrelerde Endoplazmik Retikulum-Mitokondri Temaslarını Ölçmek için Split-Luciferase Yeniden Birleştirme Testi

Çalışma, hücresel bir siliogenez modelinde SHH agonisti kullanılarak primer kirpi aracılı Sonic Hedgehog (SHH) sinyal yolu aktivasyonu için kantitatif PCR tabanlı bir testi göstermektedir.

Hücresel Siliyogenez Modelinde Sonik Kirpi Sinyalini Ölçmek için Kantitatif PCR Tabanlı Test

Keşfedin: Pull down assay ile hücrelerde aktif RhoC GTPaz seviyelerini ölçme yöntemi. Bu güvenilir teknik, hücre sinyalizasyonu ve GTPaz fonksiyonlarının anlaşılmasına katkı sağlar.

RhoC GTPaz Etkinleştirme Testi

Daha fazla video keşfet