Name: Etkinlik Ölçüm Bir Testi Escherichia coli Lizin Decarboxyase Đndüklenebilir (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Öğrenin, E. coli indüklenbilir lizin dekarboksilaz aktivitesini kolorimetrik analizle ölçme yöntemini. Bu teknik, enzim kinetiği ve bakteri metabolizması araştırmalarında kadavarin üretimini nicelendirmek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz bize bakteri suşlarının plazmid ve gerekli protokolleri göndermek için Dr. Michael Cashel (Sağlık, Bethesda, MA, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri) teşekkür ederim. Biz SpecraMax plaka okuyucu kullanımı için Dr. John Glover (Biyokimya Anabilim Dalı, Toronto Üniversitesi) teşekkür ederim. İngiltere, Kanada Ulusal Bilimler ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Lisansüstü Bursu, Hastalıklara Bağlı Membran Proteinlerin Yapısal Biyoloji, Kanada Sağlık Araştırma Stratejik Eğitim Programı Enstitüleri ve Toronto Açık Bursu Üniversitesi alıcı. Bu çalışma WAH Kanada Sağlık Araştırma Enstitüsü (MOP-67.210) bir hibe ile desteklenmiştir.

1) Reaktifler ve Ekipmanları <ol><li> İlk olarak, aşağıdaki üç çözümleri hazırlamak: Çözüm 1 ml 8 mM L-lizin, 100 mM sodyum 2 yapıldığı A - (N-morfolino) ethanesulphonic asit (MES), pH 6.5, nükleotid nükleotid 0.2 mM, ya: guanozin difosfat (GSYİH), guanozin trifosfat (GTP), guanozin 5'-difosfat, 3'-difosfat (ppGpp), ya da guanozin 5'-trifosfat, 3'-difosfat (pppGpp), 0.1 mM piridoksal 5'-fosfat (PLP) ve 1 mM β-mercaptoethanol / (β-ME). 100 mM sodyum (MES), pH 6.5, 0.1 mM PLP, 1 mM β-ME ve 50 nM LdcI oluşur Çözüm B 1 ml. Snider ve ark açıklandığı gibi LdcI saflaştırılmış 6 ve Kanjee ve ark. 14. Çözüm B aynıdır ama LdcI içermez Çözüm C 1 ml. </li><li> 100 ml, 96-iyi polistiren plaka çok kanallı pipet kullanarak her bir kuyunun içine 1 M sodyum karbonat (10,6 g/100 mL) ve 50 mcL kısım oluşan stop bir çözüm hazırlayın. Plaka 30 mcL su ekleyin ve sonra da kapsayacak. Su hacmi toplamına eklenir ve enzim reaksiyon sırasında çıkarılan örnek hacmi 50 mcL eşit olduğunu unutmayın. Bu durumda, 20 enzim reaksiyon örnek mcL silinecektir. </li><li> 294 mcL% 5 (w / v) TNBS stok, alüminyum folyo 4706 mcL su, şal ile seyreltilmesi ile 5 ml 10 mM TNBS çözüm hazırlayın ve buz üzerinde tutmak. </li><li> Eppendorf ThermoStat dengeye Plus 37 ° C ThermoStat Plus, 6 sütun 24 kuyu vardır. Şematik için Bkz: Şekil 2. (Başına bir sütun) test edilecek nükleotid kimliğini belirten Etiket 1.5 ml Eppendorf tüpleri: GTP (sütun A), GSYH (sütun B), ppGpp (C sütunu), pppGpp (D sütunu), herhangi bir nükleotid (E sütununda ), ve protein örnekleri (sütun F). </li><li> Raf her bir alternatif satır toplam dört satır ipuçları veren ihmal olduğu gibi 200 mcL ipuçları birkaç kutuları. Bu enzim tahlil sırasında ThermoStat Plus heatblock ile çok kanallı pipet kullanımı için gereklidir. </li><li> 42 Dijital Heatblock (VWR) dengelenmesi ° C. </li><li> Soğutmak için buz üzerinde 96-de 2.0 ml polipropilen levha yerleştirin. </li></ol> 2) LdcI Testi <ol><li> Çözüm kısım 50 mcL Eppendorf ThermoStat beş sütunların her biri 1.5 mL Eppendorf tüpleri için uygun nükleotid. </li><li> F sütunundaki üç tüp Çözüm B 330 mcL ekleyin ve sütun F. nihai tüp Çözüm C (protein kontrol) 330 mcL ekleyin </li><li> 37 çözümler dengeye ° C beş dakika boyunca. İpucu: 5 dakika sonra, sonraki kullanılmak üzere çok kanallı pipet ile müdahale bunları önlemek için, merkezi ısıtma-blok tüplerin kapakları kesilmiş. </li><li> F sütunundaki tüpleri, sütunların AE tüpleri her birine bir 5-50 mcL VWR çok kanallı pipet, transfer 50 mcL kullanma. En kısa sürede ilk tüp karışık olarak Sayacı başlat. </li><li> 2, 4 ve 6 dakika 20 mcL çok kanallı pipet kullanarak örnek çıkarın ve stop çözüm ekleyin. </li><li> Not: durak çözüm örnekleri, plastik ambalaj malzemesi ile kaplanmış ve daha sonraki işlem için -20 ° C'de dondurulmuş olabilir. Plakalar TNBS ile reaksiyona önce oda sıcaklığında çözdürülmelidir. </li></ol> 3) TNBS Reaksiyon ve Renk Geliştirme <ol><li> 6 dakika sonra çok kanallı pipet ve 42 inkübe ° C kullanarak stop çözüm için 10 mM TNBS çözümü 50 mcL ekleyin. TNBS lizin ve cadaverine ile reaksiyona girerek çözüm, koyu sarı / turuncu renk dönecek. </li><li> 6 dakika sonra, tepki yavaşlaması, buz üzerinde plaka soğutun. </li><li> Örnek bir VWR 20-200 mcL çok kanallı pipet ve yer buz üzerinde soğutulur 2 mL derin kuyu plaka kullanarak 100 mcL çıkarın. Fumehood buz kovası aktarın. </li><li> HandyStep (Marka) tekrar pipet ve 12.5 ml pipet (Plastibrand) kullanarak her toluen 500 mcL ekleyin. </li><li> Bir kimwipe kullanarak herhangi bir aşırı toluen siliniz ve ambalaj bant şeritler ile plaka kapsayacak. Iyi bir sızdırmazlık elde etmek için sıkıca bastırın emin olun. 96-plaka düz bir kapak ile örtün ve sonra 1 dakika ve 30 saniye boyunca kuvvetlice çalkalanır. </li><li> Çözümleri 5 dakika dinlendiriniz bırakın. EGM-cadaverine EGM-lizin su (bkz. Şekil 1) çözünür kalırken, üst toluen faz şimdi. </li><li> Toluen okumak için 96-iyi bir plaka haline 20-200 mcL çok kanallı pipet kullanarak 200 mcL çıkarın. Not: Her numune kaldırılıyor açıktır ve herhangi bir alt sulu faz bulunmamış kontrol etmek için emin olun. Not: çok kanallı pipet toluen tarafından zarar görmesini önlemek için kullanılan bariyer ipuçları. </li><li> SPECTRAmax 340 plaka okuyucu 340 nm'de absorbans okuyun. </li><li> Kuvars plağı temizlemek için, toluen su ile yıkayın ve büyük bir kuvars plakadavlumbaz cam tepsi. 100 mL% 70 (v / v) nitrik asit 07:03 karışımı üzerine dökün:% 95 (v / v) etanol ve ikinci bir cam tepsi ile kuvars tabak kapağı. Uyarı: reaksiyon çok ekzotermik ve bazen patlayıcı aşınma uygun koruma ve davlumbaz kanat alt 6 "düzeyi ayarlanmış olduğundan emin olunuz Soğuduktan sonra nitrik asit, su ile yıkayın ve ardından% 95 etanol. </li></ol> 4) Temsilcisi Sonuçlar 1) Cadaverine Standart Eğrisi (Şekil 3) Herhangi bir L-lizin veya LdcI olmadan açıklanan, ancak tahlil yapıldı ve cadaverine yerine çeşitli konsantrasyonlarda ampirik testinin doğrusal aralığı belirlemek için kullanılır. Testin ~ 22 nmoles cadaverine (Şekil 3) karşılık gelen 0.25 OD 340 doğrusal oldu. LdcI, 2) Etkinlik (Şekil 4) Yalnız LdcI faaliyet 153.5 (± 18.1) nmoles cadaverine min-1 pH değeri 6.5 mg LdcI-1 olarak tespit edilmiştir LdcI faaliyet 100 mcM GTP veya GDP varlığı etkilenmez ama güçlü pppGpp ve ppGpp (Şekil 4) varlığı (&gt; 10 kat) inhibe edilir. <img src="/files/ftp_upload/2094/2094fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. LdcI reaksiyon şematik diyagramı, CO 2 ve cadaverine oluşturmak için L-lizin dekarboksilasyon reaksiyon, N, N'-bistrinitrophenylcadaverine (EGM-cadaverine) ve N, N oluşturmak için de yüksek pH TNBS ile sonraki tepki olarak gösterilir '-bistrinitrophenyllysine (EGM-lisin). Phan et al.11 <img src="/files/ftp_upload/2094/2094fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Eppendorf Termostat Kurulumu iyi 24-Eppendorf ThermoStat örnekleri düzen testinin adımları açıklamasına (kalın olarak gösterilir) ile birlikte gösterilmiştir. Oklar reaksiyon çözümleri protokole göre transfer gösterir. 96-plaka durak çözüm tepki çözüm kaldırılması da belirtilir. <img src="/files/ftp_upload/2094/2094fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Cadaverine Standart Eğrisi. Cadaverine, nmoles karşı 340 nm'de absorbans bir arsa verilmiştir. Hata çubukları, en az üç bağımsız ölçümleri standart sapmasını temsil eder. En uygun hat da gösterilir ve 0,996 bir R2 sahiptir. <img src="/files/ftp_upload/2094/2094fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. LdcI tahlil sonuçları LdcI aktivite oranı arsa 100 mcM GTP, GSYİH, pppGpp, ppGpp varlığı ve yokluğu nükleotid gösterilmiştir (nmoles cadaverine min-1 mg-1 LdcI üretilen). Sıkı yanıt nükleotidler (p) ppGpp LdcI aktivite önemli ölçüde inhibe yeteneğine sahiptir. Hata çubukları, en az altı bağımsız ölçümleri standart sapmasını temsil eder.

<ol><li>Gale, E. F., Epps, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+the+pH+of+the+medium+during+growth+on+the+enzymic+activities+of+bacteria+%28Escherichia+coli+and+Micrococcus+lysodeikticus%29+and+the+biological+significance+of+the+changes+produced%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">The effect of the pH of the medium during growth on the enzymic activities of bacteria (Escherichia coli and Micrococcus lysodeikticus) and the biological significance of the changes produced.</a> Biochem J. 36, 600-618 (1942).</li>
<li>Foster, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+acid+resistance%3A+tales+of+an+amateur+acidophile%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli acid resistance: tales of an amateur acidophile.</a> Nat Rev Microbiol. 2, 898-907 (2004).</li>
<li>Castanie-Cornet, M. P., Penfound, T. A., Smith, D., Elliott, J. F., Foster, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+acid+resistance+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Control of acid resistance in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 181, 3525-3535 (1999).</li>
<li>Iyer, R., Williams, C., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine-agmatine+antiporter+in+extreme+acid+resistance+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Arginine-agmatine antiporter in extreme acid resistance in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 185, 6556-6561 (2003).</li>
<li>Sabo, D. L., Boeker, E. A., Byers, B., Waron, H., Fischer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+physical+properties+of+inducible+Escherichia+coli+lysine+decarboxylase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and physical properties of inducible Escherichia coli lysine decarboxylase.</a> Biochemistry. 13, 662-670 (1974).</li>
<li>Snider, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+a+distinctive+complex+between+the+inducible+bacterial+lysine+decarboxylase+and+a+novel+AAA%2B+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Formation of a distinctive complex between the inducible bacterial lysine decarboxylase and a novel AAA+ ATPase.</a> J Biol Chem. 281, 1532-1546 (2006).</li>
<li>Kashiwagi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexistence+of+the+genes+for+putrescine+transport+protein+and+ornithine+decarboxylase+at+16+min+on+Escherichia+coli+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Coexistence of the genes for putrescine transport protein and ornithine decarboxylase at 16 min on Escherichia coli chromosome.</a> J Biol Chem. 266, 20922-20927 (1991).</li>
<li>Schneider, G., Kack, H., Lindqvist, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+manifold+of+vitamin+B6+dependent+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">The manifold of vitamin B6 dependent enzymes.</a> Structure. 8, 1-6 (2000).</li>
<li>Cashel, M., Gentry, D. R., Hernandez, V. J., Vinella, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCashel%2C+M+%22Escherichia+coli+and+Salmonella+%3A+cellular+and+molecular+biology%22">Escherichia coli and Salmonella : cellular and molecular biology</a>. Curtiss, R., Neidhardt, F. C. , ASM Press. Washington, D.C. 1458-1496 (1996).</li>
<li>Magnusson, L. U., Farewell, A., Nystrom, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ppGpp%3A+a+global+regulator+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">ppGpp: a global regulator in Escherichia coli.</a> Trends in Microbiology. 13, 236-242 (2005).</li>
<li>Phan, A. P., Ngo, T. T., Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometric+assay+for+lysine+decarboxylase%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometric assay for lysine decarboxylase.</a> Anal Biochem. 120, 193-197 (1982).</li>
<li>Park, Y. K., Bearson, B., Bang, S. H., Bang, I. S., Foster, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+pH+crisis%2C+lysine+decarboxylase+and+the+acid+tolerance+response+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Internal pH crisis, lysine decarboxylase and the acid tolerance response of Salmonella typhimurium.</a> Mol Microbiol. 20, 605-611 (1996).</li>
<li>Merrell, D. S., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cadA+gene+of+Vibrio+cholerae+is+induced+during+infection+and+plays+a+role+in+acid+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The cadA gene of Vibrio cholerae is induced during infection and plays a role in acid tolerance.</a> Mol Microbiol. 34, 836-849 (1999).</li>
<li>Kanjee, U., Gutsche, I., Alexopoulos, E., Zhao, B., Bakkouri, M. E. l, Thibault, G., Liu, K., Ramachandran, S., Snider, J., Pai, E. F., Houry, W. A., A, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linkage+between+the+Bacterial+Acid+Stress+and+Stringent+Responses+Revealed+by+the+Structure+of+the+Inducible+Lysine+Decarboxylase%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Linkage between the Bacterial Acid Stress and Stringent Responses Revealed by the Structure of the Inducible Lysine Decarboxylase.</a> EMBO Journal. 30, 931-944 (2011).</li>
</ol>

Lisin dekarboksilaz tayininde, TNBS EGM-lizin ve EGM-cadaverine adducts (Şekil 1) oluşturmak için L-lizin ve cadaverine birincil aminler ile reaksiyona girer. Karboksilik asit grubu eksik EGM-cadaverine, toluen 11 bölünme yeteneğine sahip iken, EGM-lizin karboksilik asit grubun varlığı nedeniyle, bu adduct suda çözünür kalır. Bu tip testin bir karboksilik asit grubu kaybı reaksiyon sırasında ortaya çıkan amino asitler diğer türleri hakkında daha geniş kullanılabilir. Bu indüklenebilir ornitin dekarboksilaz Sp...

<table><tbody><tr><td>2,4,6-trinitrobenzensülfonik asit </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2297</td><td></td></tr><tr><td>0.1 mM piridoksal 5&amp;rsquo;-fosfat (PLP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9255</td><td></td></tr><tr><td>Kadaverin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D22606</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyucuklu polistiren plakalar</td><td>Sarstedt Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 kuyucuklu kuvars plaka</td><td>Hellma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VWR Dijital Isıtıcı Blok</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ThermoStat Plus</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL 96 kuyucuklu polipropilen plakalar</td><td>Axygen Scientific</td><td>P-DW-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Handy Step Tekrarlayıcı Pipet</td><td>Brand GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>12.5 mL Tekrarlayıcı Pipet Uçları</td><td>Brand GmbH</td><td>702378</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax 340PC Plaka Okuyucu</td><td>SpectraMax</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

etkinlik Ölçüm bir testi escherichia coli lizin decarboxyase Đndüklenebilir

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

1 ve inanılmaz derecede düşük pH düşebilir memeli mide geçişi de dahil olmak üzere aşırı asit vurguluyor hayatta kalmak için - Escherichia coli, pH değerleri (9 pH 5) geniş bir yelpazede üzerinde büyüyen yetenekli bir enterik bakteridir pH 1 - 2 2. Asidik pH hayatta kalma, E. gibi geniş bir yelpazede etkinleştirmek için coli, bir proton-bağımlı bir şekilde decarboxylate kendi substrat amino asitler dolayısıyla iç pH yükselterek dört farklı indüklenebilir amino asit dekarboksilaz sahiptir . Dekarboksilaz glutamik asit dekarboksilaz GADA ve GadB 3, arginin dekarboksilaz adia 4, lisin dekarboksilaz LdcI 5, 6 ve ornitin dekarboksilaz SpeF 7 içerir. Tüm bu enzimlerin piridoksal-5&#39;-fosfat, co-faktör 8 olarak kullanmaktadır ve dış ortama taze substrat karşılığında 2 dekarboksilasyon ürünleri kaldırın iç membran substrat ürün antiporters birlikte işlev görür. LdcI durumunda, lizin-cadaverine antiporter CadB denir. Son zamanlarda, 2.0 Å LdcI X-ray kristal yapısı belirlenir ve LdcI sıkı yanıt regülatör guanozin 5&#39;-difosfat, 3&#39;-difosfat (ppGpp) 14 bağlı bir roman küçük molekül keşfetti. Katlanarak büyüyen hücrelerin besin yoksunluğu ya da diğer stresler 9 bir dizi deneyim sıkı bir tepki oluşur. Sonuç olarak, hücreler, üstel büyüme, sabit faz büyüme 10 vardiya sonuçlanan bir sinyal kaskad yol açar ppGpp üretirler . Biz ppGpp LdcI 14 spesifik bir inhibitörü olduğunu göstermiştir. Burada Phan ve arkadaşları tarafından geliştirilen testin modifiye lisin dekarboksilaz deneyi açıklar. 11, LdcI faaliyeti ve bu faaliyetin pppGpp / ppGpp etkisini belirlemek için kullanmış olduğunuz. LdcI dekarboksilasyon tepki L-lizin α-karboksi grubu kaldırır ve karbon dioksit ve poliamin cadaverine (1,5-diaminopentane) 5 üretir. L-lizin ve cadaverine sırasıyla, N, N&#39;-bistrinitrophenylcadaverine (EGM-cadaverine) ve N, N&#39;-bistrinitrophenyllysine (EGM-lisin) oluşturmak için yüksek pH 2,4,6-trinitrobenzensulfonic asit (TNBS) ile reaksiyona girer. 11. EGM-cadaverine, ikincisi ise (Bakınız Şekil 1) eski, toluen gibi organik çözücülerde çözünür olarak EGM-lizin ayrılabilir. Testin doğrusal aralığı, ampirik olarak saflaştırılmış cadaverine kullanarak tespit edildi.

Indüklenebilir lizin dekarboksilaz aktivitesi toluen diferansiyel çözünürlüğü adducts oluşturmak için substrat L-lizin ve ürün cadaverine 2,4,6-trinitrobenzensulfonic asit ile reaksiyona girerek izlenir.

Etkinlik Ölçüm Bir Testi Escherichia coli Lizin Decarboxyase Đndüklenebilir

Escherichia coli, geniş bir pH aralığında (pH 5 - 9) büyüyebilen enterik bir bakteridir ve inanılmaz bir şekilde ekstrem ... koşullarda hayatta kalabilmektedir.

Bu prosedürün genel amacı, kolormetrik bir analiz kullanarak e coli indüklenebilir lizin dekarboksilaz aktivitesini ölçmektir. Bu işlem, önce substrat L lizin'in bir EOR tüpü içinde LDCI enzimi ile reaksiyona sokulması ve ardından üç farklı zaman noktasında numunelerin bir durdurma çözeltisine alınmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, durdurma çözeltisindeki numunelerin 2 4 6 TRI nitro benzen SUL asit veya T-M-B-S-T-M-B-S ile reaksiyona sokulmasıdır; T-M-B-S substratın primer grubuyla reaksiyona girerek sırasıyla TMP lizin ve TMP kadaver ürünlerini oluşturur.Prosedürün üçüncü adımı, TMP kadaverin toluene ekstrakte edilmesiyle suda çözünen TMP lizin ile suda çözünmeyen TMP kadaverin birbirinden ayrılmasıdır. Prosedürün son adımı, toluen fazındaki TMP kadaverin 340 nanometredeki absorbansının ölçülmesidir. Nihayetinde, sonuçlar elde edilebilir.CHO LDCI aktivitesinin, stringent yanıt sinyal molekülleri olan pppGpp ve ppGpp tarafından modüle edildiği görülmektedir. Merhaba, ben Toronto Üniversitesi Biyokimya Bölümü'nden Dr. Wali'nin laboratuvarından Hir.Bugün size ish e coli indüklenebilir lizin dekarboksilazı LDCI'nın aktivitesini ölçmeye yönelik bir prosedür göstereceğiz

an-assay-for-measuring-activity-escherichia-coli-inducible-lysine

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz mantar endoglucanase faaliyet için ekran için düşük maliyetli, yüksek verim yöntemi...

Mantar Endoglucanase Faaliyet Yüksek Verimli Tarama Escherichia coli</em

Biz son zamanlarda basit bir bakteriyel tespiti için floresan assay "mix-ve-okuma" kurmak için uygulanabilir Flourogenik DNAzyme probları üretmek için yeni bir yaklaşım bildirdin. Bu özel DNA sondaları böylece floresans sinyali kuşağa bakteriyel algılama çevirme belirli bakteri tarafından üretilen ham hücre dışı karışımı (CEM) varlığında, bir kromofor-değiştirilmiş-DNA RNA kimerik substratın bölünme katalize. Bu yazıda, "RFD-EC1" ifade belirli bir DNAzyme prob modeli bakterinin tespiti için...

Flourogenik DNAzymes kullanarak Bakterilerin Tespiti

Petrol kirliliğinin iyileştirilmesi için bakteriyel sistemini düzenleyen sürdürülebilir bir otomatik standart değiştirilebilir DNA parçalarının (BioBricks) kullanılarak tasarlanmıştır. Bir...

Sulu Ortamlarda Hidrokarbon Dönüşüm Enable A Toolkit

Bu video, kemilüminesans tabanlı bir yöntemle bir tam kan örneğindeki endotoksin aktivitesini araştırmak için hızlı bir biyo-testi göstermektedir. Bu test, endotoksin aracılı sepsisin erken evre tanısı için hızlı ve hassas bir biyobelirteç testidir.

Endotoksin Aktivite Testi: Kan Örneğindeki Endotoksin Aktivitesini Araştırmak İçin Kemilüminesans Bazlı Bir Biyo-Test

Biz aracılık bakteriyel rekabet izlemek için kalitatif bir testtir...

T6SS aracılı Bakteriyel Rekabet Monitör A Görsel Assay

Yeşil floresan proteini füzyon göre, Escherichia coli içinde rekombinant zar proteinlerinin ifadesi için tarama için bir aerodinamik bir yaklaşım sunulmuştur.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

Bu konuda, insan bütün kan örneklerinin endotoksin aktivitesinin başında ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Endotoksin aktivite tahlil gerçekleştirmek için basit bir test ve sepsis ile eleştirel hasta hastalarda yararlı bir biyomarker olabilir.

Eleştirel hasta hastalarda tam kan endotoksemi tespiti için endotoksin aktivite assay

Burada, ligaz, nükleaz ve polimeraz enzimlerinin örnekleri kullanılarak nükleik asit metabolize edici enzimlerin tahlili için bir protokol sunulmaktadır. Test, enzim davranışının karakterizasyonuna izin veren, RNA ve/veya DNA hasarlarını veya yol ara ürünlerini taklit eden dupleksler oluşturmak için birleştirilebilen floresan etiketli ve etiketsiz oligonükleotidleri kullanır.

Nükleik asit metabolize edici enzimleri test etmek için modifiye sentetik oligonükleotidlerin kullanılması

Bu çalışma, Escherichia coli ve memeli hücrelerinde insan enolaza-1'in (hENO1) belirli bölgelerinde laktil-lizin (Klac) ve süper klasör GFP'nin (sfGFP) belirli bölgelerinde genetik kod genişlemesini kullanan bir yöntem geliştirdi.

E. coli ve memeli hücrelerinde genetik kod genişletmesiyle siteye özgü lizin laktilasyonu

Biz lisin metilasyon değişiklikleri ölçmek için MALDI kütle spektrometresi ve indirgeyici metilasyon kimya kullanmak için bir yöntem sunuyoruz.

Lizin demetilaz Faaliyet Kantitatif Ölçümler MassSQUIRM Uygulaması

Öğrenin, E. coli indüklenbilir lizin dekarboksilaz aktivitesini kolorimetrik analizle ölçme yöntemini. Bu teknik, enzim kinetiği ve bakteri metabolizması araştırmalarında kadavarin üretimini nicelendirmek için kullanılır.

Etkinlik Ölçüm Bir Testi Escherichia coli Lizin Decarboxyase Đndüklenebilir

Daha fazla video keşfet