Name: Atmosferik basınç Moleküler Görüntüleme LAESI Kütle Spektrometresi Biyolojik Dokular ve Biyofilmler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Keşfedin atmosferik basınç LAESI kütle spektrometresi ile biyolojik dokuların ve biyofilmlerin moleküler görüntüleme yöntemini. Bu teknik doğal koşullarda doğrudan analiz sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, bu çalışmanın, ABD Enerji Departmanı (DEFG02-01ER15129) Hibe No 0.719.232 altında ABD Ulusal Bilim Vakfı tarafından finansal destek için minnettarız ve Protea Biosciences, Inc (Morgantown, WV). Yazarlar ayrıca, protokol videoya sırasında ona yardım Jessica A. Stolee teşekkür etmek istiyorum.

Aşağıdaki protokol lazer ablasyon elektrosprey iyonizasyon (LAESI) deneyi en önemli adımları açıklar ve hayvan ve bitki doku örnekleri için lateral ve üç boyutlu (3B) görüntüleme için temsilcisi örnekler sunar. Ek deneysel ve teknik detayları başka bir yerden temin edilebilir. 1-6 1. Doku Hazırlık ve Montaj <ol><li> Kesit gerekiyorsa, doku -20 -10 10-100 mikron kalınlığında dilimler halinde bölümüne cryomicrotome kullanmak ° C aksi takdirde belirli bir doku tipi için önerilir sürece. </li><li> Bölümleri kimyasal değiştiriciler olmadan doğrudan düz bir yüzeye (örneğin, kimyasal olarak önceden temizlenmiş cam slayt) üzerine monte edin. Kesitli dokular için, çözülme montaj, her zaman dondurulmuş doku analizi sırasında tutmak için üzerine bölümlerde çözülme-montaj ve hemen Peltier soğutma aşamasında numune tutucu güvenli. Bu adım bölümünde moleküler göçü en aza indirmek / önlemek için gereklidir. </li><li> Gerekirse, doku dondurulmuş korumak için Peltier aşamalı ısı kaldırılmasını kolaylaştırmak için düşük bir güç fan ile donatılmış bir ısı emici kullanın. </li><li> Süre (1-2 saat) uzun bir süre nemli bir ortamda, su veya doku yüzeyinin buz yoğuşma için kontrol edin. Doku üzerinde su yoğuşması detrimentally LAESI deneyler, görüntüleme performansını etkiler. 1 </li><li> Gerekirse, bir oda nem alıcı veya yoğuşmayı önlemek için, bir inert gaz (örneğin, kuru azot gazı) ile dolu bir çevre odasında soğutmalı örnek bir yer. 1 </li></ol> 2. LAESI İyon Kaynak optimizasyonu LAESI iyon kaynağı, orta-kızılötesi lazer, ışık direksiyon optik elemanlar bir dizi ve odaklama yanı sıra ek örnek sahipleri, soğutma bileşenler, çeviri aşamaları ve çözücü bir dağıtım sistemi oluşur. Şekil 1, bu unsurların, bir kütle spektrometre atmosferik basınçlı iyon kaynağı girişinde açısından tipik bir düzenleme göstermektedir. <ol><li> Şekil 1, konumu, kütle spektrometresi örnekleme konisi (d OR-FP) orifis aşağıdaki örnek 15-20 mm gösterildiği gibi . </li><li> 2.94 mikron dalga boyu ve 10 Hz tekrarlama oranı orta-kızılötesi lazer çalıştırın. ~ 100 μJ / pulse enerji lazer çıktı zayıflatır. </li><li> Çift, normal insidansı numunenin içine lazer darbe enerjisi (örnek yüzeyine göre doğru insidansı açısını görmek için lazer dalga boyu (örneğin, bir yüzü düz diğeri dışbükey CaF 2 veya ZnSe lens) saydam altın aynalar ve odaklama lens kombinasyonunu kullanın Şekil 1). </li><li> Kütle spektrometresi örnekleme koni delikli ön orta-kızılötesi ışın ekseni 5-8 mm yerleştirin. </li><li> Odaklı lens pozisyonu ve odak noktası doku çıkarılması elde etmek için lazer ışınının darbe enerji ayarlayın. Ablasyon hacim ölçüleri görüntüleme uygulaması için (ya da üç boyutlu görüntüleme voksel) piksel boyutunu belirlemek. </li><li> Nanospray yayıcı bir kütle spektrometresi giriş ekseni doğrultusunda ve yaklaşık 10 mm'lik bir delik-emiter ucu mesafesi (bkz. Şekil 1) yerleştirin. </li><li> Elektrosprey için, sırasıyla,% 0.1 asetik asit veya% 0.1 pozitif ya da negatif iyon modu için amonyum asetat katkı,% 50 metanol çözeltisi hazırlamak. Asetonitril, isopropanol, vb gibi diğer organik çözücüler, örnek bağlı olarak, analitik bir görev için uygun konsantrasyonlarda metanol yerini alabilir. Elektrosprey istikrar başarılı görüntüleme için çok önemlidir. Solvent seçimi bağlı olarak, akış hızı ve püskürtme voltaj istikrarlı sprey ulaşmak için ayarlanması gerekir. </li><li> Reaktif LAESI 6 için görüntüleme uygulamaları, electrosprayed çözüm reaktanları içerebilir. </li><li> ~ 300 nL / dak akış hızında elektrosprey yayıcı ile elektrosprey çözüm sunmak için bir şırınga pompası kullanın. </li><li> Eğer kütle spektrometresi orifis düşük voltaj (&lt;500 V zemin karşı ölçülen) tutulur, yüksek voltaj uygulayarak elektrosprey emitör (örneğin, 3000 V) doğrudan ya da metal bir sendika aracılığıyla elektrosprey oluşturur. Aksi takdirde, elektrosprey kurmak için doğrudan elektrosprey yayıcı veya metal sendikası aracılığıyla zemin. </li><li> Koni jet elektrosprey kaynak LAESI tarafından en verimli iyon üretimi için püskürtme modunda çalıştırın. Kütle spektrumları püskürtme modları ve etkileri işletim değişkenlerin etkisi, başka yerde tartışmalar görüyorum. 5,7,8 </li><li> Dikkatle LAESI iyon verim için optimize etmek için, lazer ışını, yayıcı ve delik eksenleri aynı düzlemde tutarken LAESI kurulum izafi mesafeleri ayarlayın. Başka bir yerde ayrıntılı talimatlar bulabilirsiniz. 5 </li><li> Optik bir mikroskop ile, örnek ablasyon kraterin lateral boyutlarını belirlemek. </li><li> LAESI üç boyutlu görüntüleme deneyleri için, bireysel darbeleri ile ablasyon gerçekleştirmek ve örneğin kullanarak voksel derinliğini belirler, optik mikroskop z yığın modu 3 </li></ol> 3. Moleküler Görüntüleme ve Veri Analizi Görüntüleme deneyde, doku örneği lazer ablasyon spot boyutları eşit veya daha büyük adım boyutları ile X ve Y yönlerinde odak düzlemli taşınır. Mekansal çözünürlükte olay lazer ışını odaklanarak sınırlıdır. <ol><li> Numune yüzeyinden ilgi alanı seçin ve (X, Y) ilgili sınırların koordinatları elde edilir. </li><li> Görüntülenecek alana her pikselin bekleme süresi seçilen örnek yüzey tarama ile gridding algoritma (örneğin, adaptif ızgara, seçili bölgeyi görüntüleme, dikdörtgen bir ızgara, spiral desen, Z tarama, vb.) Seçti. </li><li> Üç eksenli bir çeviri aşamasında ve önceden belirlenmiş ızgaraya göre örnek rastering yeteneğine sahip bir yazılım kullanın. </li><li> Görüntüleme için gerekli olan toplam süreyi hesaplayın. </li><li> Kütle spektrometresi veri toplama zaman sınırı devre dışı bırakın. Bu mümkün değilse, veri toplama zaman sınırı hesaplanan görüntüleme zaman değeri ayarlayın. </li><li> LAESI lateral görüntüleme deney gerçekleştirmek için her piksel, bekleme süresi içinde kütle spektrumu yeterli sinyal-gürültü oranı üretmek için uygun bir tekrarlama oranı orta-kızılötesi lazer kaynağı başlayın. 3 boyutlu moleküler görüntüleme için, başarılı bir şekilde tek bir lazer darbe içinde üretilen iyonlar kütlelerine analiz etmek için lazer kaynağı tekrarlama oranı daha yüksek bir spektrum alma hızı kullanın. Ablasyon dizisi başlatmak için START sinyali bekleyin. </li><li> Elektrosprey kaynağı açın. Görüntüleme için gerekli olan tam zamanlı için yeterli bir çözüm olduğundan emin olun. </li><li> Aynı zamanda kitle spektrumlarının satın alma, orta-IR lazer ablasyon, ve yüzey tarama BAŞLAT. </li><li> Görüntüleme çalışması tamamlandığında, STOP yüzey tarama, orta-IR lazer uygulaması ve veri toplama. </li><li> Lazer kaynağı devre dışı bırakın. </li><li> Yüksek gerilim kapatın. </li><li> Şırınga pompası kapatın. </li><li> STANDBY kütle spektrometresi ayarlayın. </li><li> Peltier soğutma elektroniği kapatın. </li><li> Kullanılan inert gaz akışı kapatın. </li><li> Ilgili spektrumları ile 3D analiz lateral görüntüleme veya vokseller piksel mutlak koordinatları ilişkilendirmek için bir yazılım kullanın. </li><li> Lateral ve 3 boyutlu moleküler görüntüler elde etmek için analiz mutlak koordinatları karşı seçilen m / z değeri için iyon yoğunluğu sinyal çizilir . </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 2, bazı önemli doku tipleri ve görüntüleme yöntemleri için temsili sonuçlar verir. Panel A, deney sırasında su kaybını önlemek için dondurulmuş hayvan doku bölümü için bir durumda gösteriyor. Buna ek olarak 1, örnek numune yüzeyinden yoğuşmasız ortam su buharları önlemek için kuru azot gazı ortamında yer oldu . Sıçan beyin 100 mikron kalınlığında koronal bölümünde (Rattus norvegicus) yanal LAESI ile görüntülendi. Anatomik bölgelerde (beyin panelinde optik görüntü A) moleküler plasmalogens PC için elde edilen görüntü (O-33: 3) ile iyi bir korelasyon gösterir ve / veya PE (O-36: 3) m / z 728,559 . B Paneli Zebra bitki (Aphelandra squarrosa) yaprak doku 3D LAESI görüntüleme gösterir. Yaprakları dehidratasyon karşı doğal bir savunma mekanizmasına sahip oldukları için, örnek ortamda sorgulanabilir. 3 elde edilen 3 boyutlu moleküler görüntüleri, birincil ve ikincil metabolitleri bir dağıtım desen çeşitliliği ortaya . Diğerlerinin arasında, m / z 285,076 acacetin diğerleri homojen bir dağılım ile ikinci ve üçüncü katlar sarı sektörlerde yüksek iyon sayıları tespit edildi. Bu dağılım deseni ile optik görüntü görülen renklilikte kabul etti. <img src="/files/ftp_upload/2097/2097fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. LAESI sistemi şematik (ES, elektrosprey emiter ucu; OR, kütle spektrometresi örnekleme koni orifis; FL, objektif odaklama, FP, odak noktası; P, Peltier soğutma aşamasında; HS, soğutucu). Örnek moleküller ve iyonlar (yeşil noktalar) numaralı seribaşı yüklü damlacıklar verim elektrosprey ile orta-IR ablasyon (kırmızı nokta) pekişen sırasında sınırdışı partikül madde bir kısmı. Bu damlacıklar serbest iyonlar kütle spektrometresi ile analiz edilir ve kaydedilir. <img src="/files/ftp_upload/2097/2097fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Lateral ve 3D hayal gücüyle Temsilcisi sonuçlarya da PE (O-36 ve / ng LAESI kütle spektrometresi ile (A) üst panelde sıçan beyin (Rattus norvegicus) koronal bölümünde ve plasmalogens PC için elde edilen moleküler görüntü optik görüntü gösteriyor (3 O-33) : 3) m / z 728,559. 1 mm beyaz ölçek çubuğu için karşılık gelir. (Referans 1) izni ile uyarlanmıştır. Copyright 2010 American Chemical Society. (B) alt panel, rengârenk Zebra bitki (Aphelandra squarrosa) bir yaprak 3D görüntüleme gösterir . M / z 285,076 Acacetin diğerleri homojen bir dağılım ile ikinci ve üçüncü katlar sarı sektörlerde yüksek iyon sayıları tespit edildi. (Referans 3) izni ile yayımlanmaktadır. Copyright 2009 American Chemical Society.

<ol><li>Nemes, P., Woods, A. S., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Imaging+of+Small+Metabolites+and+Lipids+in+Rat+Brain+Tissues+at+Atmospheric-Pressure+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Imaging of Small Metabolites and Lipids in Rat Brain Tissues at Atmospheric-Pressure by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal Chem. 82, 982-988 (2010).</li>
<li>Nemes, P., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+ablation+electrospray+ionization+for+atmospheric-pressure%2C+in+vivo%2C+and+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Laser ablation electrospray ionization for atmospheric-pressure, in vivo, and imaging mass spectrometry.</a> Anal Chem. 79, 8098-8106 (2007).</li>
<li>Nemes, P., Barton, A. A., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+metabolites+in+tissues+under+ambient+conditions+by+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of metabolites in tissues under ambient conditions by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 81, 6668-6675 (2009).</li>
<li>Nemes, P., Barton, A. A., Li, Y., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ambient+molecular+imaging+and+depth+profiling+of+live+tissue+by+infrared+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Ambient molecular imaging and depth profiling of live tissue by infrared laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 80, 4575-4582 (2008).</li>
<li>Nemes, P., Vertes, A. Laser ablation electrospray ionization for atmospheric-pressure molecular imaging mass spectrometry. Mass Spectrometry Imaging. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNemes%2C+P+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Nemes, S. S., Rubakhin, J. V. , Springer. Volume 656 (2010).</li>
<li>Shrestha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+analysis+of+lipids+and+small+metabolites+in+mouse+brain+tissue+by+AP+IR-MALDI+and+reactive+LAESI+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Direct analysis of lipids and small metabolites in mouse brain tissue by AP IR-MALDI and reactive LAESI mass spectrometry.</a> Analyst. 135, 751-758 (2010).</li>
<li>Nemes, P., Marginean, I., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spraying+mode+effect+on+droplet+formation+and+ion+chemistry+in+electrosprays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Spraying mode effect on droplet formation and ion chemistry in electrosprays.</a> Anal Chem. 79, 3105-3116 (2007).</li>
<li>Nemes, P., Goyal, S., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+and+noncovalent+complexation+changes+in+proteins+during+electrospray+ionization%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Conformational and noncovalent complexation changes in proteins during electrospray ionization.</a> Anal Chem. 80, 387-395 (2008).</li>
<li>Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+by+Mid-IR+laser+ablation+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+A-Mater+Sci+Process%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging by Mid-IR laser ablation mass spectrometry.</a> Appl Phys A-Mater Sci Process. 93, 885-891 (2008).</li>
<li>Shrestha, B., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+metabolic+profiling+of+single+cells+by+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">In situ metabolic profiling of single cells by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 81, 8265-8271 (2009).</li>
<li>Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ambient+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ambient mass spectrometry.</a> Science. 311, 1566-1570 (2006).</li>
</ol>

Farklı doku tiplerinin bu etkileri azaltmak için, sırayla, numunelerin ablasyon özellikleri etkileyebilir su içeriği ve çekme gücü, 9 farklı sergi, lazer akıcılık, numune işleme ve analiz protokolleri arasında değişen yaparken revize edilmesi istenen büyük doku tiplerinin. 10 seçili hücrelerin doku yakınlığı içinde, fiber ucunun konumlandırma, tek bir hücre ya da daha yüksek çözünürlüklü incelemeler için, orta-kızılötesi ışık yerine odaklama lens ucu sivriltilmiş bir fiber optik içine birleştiğinde olabilir. LAESI analiz yapılabilir . bir tek hücre düzeyinde. Ortam iyonizasyon kütle spektrometresi için bir etiket-iyon kaynağı olarak, 11 LAESI dokularda biyokimyasal süreçlerin incelenmesi için büyük bir potansiyel göstermiştir. LAESI katma faydaları ile doğrudan analizi, yan ve 3D görüntüleme, profil yanı sıra görüntüleme uygulamaları için gelişmekte olan bir biyoanalitik araçtır.

<table><tbody><tr><td>Kütle spektrometresi</td><td>Waters</td><td>Q-TOF Premier</td><td></td></tr><tr><td>Orta-IR lazer</td><td>Opotek Inc. (Carlsbad, CA)</td><td>Vibrant IR</td><td></td></tr></tbody></table>

atmosferik basınç moleküler görüntüleme laesi kütle spektrometresi biyolojik dokular ve biyofilmler

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Kütle spektrometresi Ortam iyonizasyon yöntemleri analitik incelemeler anadili gibi deneysel koşullar altında bir doku ya da biyofilm doğrudan yapılmasına izin verir. Lazer ablasyon elektrosprey iyonizasyon (LAESI) böyle bir gelişme ve özellikle su içeren örneklerin soruşturma için çok uygundur. LAESI numune su moleküllerini harekete geçirerek bir orta-kızılötesi lazer ışını (2.94 mikron dalga boyu) kullanır. Ablasyon fluens eşik aşıldığında, örnek malzeme, partiküler madde şeklinde ihraç ve bu mermiler milimetre onlarca örnek yüzey üzerinde yolculuk. LAESI, bu ablasyon tüy çıkarılır örnek malzemenin bir kısmını yakalama ve gaz faz iyonları içine kimyasal maddelerin dönüştürmek için yüksek ücret damlacıkları tarafından durdurulur. Atmosferik bir iyon kaynağı arayüzü ile donatılmış bir kütle spektrometresi örnek probed alanı (piksel) kaynaklanan serbest iyonların kompozisyon analiz ve kayıt için kullanılmaktadır. Piksel bir dizi üzerinden sistematik bir sorgulama mikroprobu analiz modunda moleküler görüntüleme için bir yol açılır. LAESI kitle spektrometrik görüntüleme benzersiz bir yönü, lateral görüntüleme ile birlikte, üç boyutlu (3D) moleküler görüntüleme sağlayan, derinlik profil. ~ 100 mikron ve sırasıyla ~ 40 mm, lateral ve derinlik kararları, LAESI kitle spektrometrik görüntüleme, moleküler biyolojik dokuların yapısını keşfetmek için yardımcı olur. Burada, bir LAESI sistemin en önemli unsurları gözden geçirmek ve başarılı bir görüntüleme deney için yönergeler sağlamak.

Lazer ablasyon elektrosprey iyonizasyon (LAESI) kütle spektrometresi bir atmosferik basınçlı iyon kaynağı. Görüntüleme modunda, orta-kızılötesi lazer probları bir doku bölüm veya bir biyofilm boyunca moleküllerin dağılımları. Bu teknik, doğal deneysel koşullar altında yürütülen çeşitli biyoanalitik çalışmalar için yeni bir yaklaşım sunuyor.

Atmosferik basınç Moleküler Görüntüleme LAESI Kütle Spektrometresi Biyolojik Dokular ve Biyofilmler

Kütle spektrometrisindeki ortam iyonizasyon yöntemleri, analizlerin doğal benzeri koşullar altındaki bir doku veya biyofilm üzerinde doğrudan gerçekleştirilmesine olanak tanır...

Biyolojik bir doku veya biyofilm üzerinde lazy kütle spektrometrisi görüntüleme deneyi gerçekleştirmek için, lazy düzeneği sağlam çalışma için hazırlanır. Bir sonraki adım, örneğin bir örnek tablasına yerleştirilmesi ve incelenen örnek için gerekli deneysel koşulların belirlenmesidir. Ardından, lateral lazy moleküler görüntüleme deneyi başlatılır ve gerekli veriler, konumsal moleküler dağılımları elde etmek için kullanılır.Sonuçlar, biyolojik dokuların ve biyofilmlerin moleküler mimarisini göstermektedir. Ben George Washington Üniversitesi'ndeki Vertus Araştırma Laboratuvarı'ndan Dr. Peter Nemes. Lazy tekniğinin konfokal, optik ve Maldi ile sims gibi kütle spektrometrisi görüntüleme yöntemleri dahil olmak üzere diğer yöntemlere karşı temel avantajı, numune analizinin atmosferik basınç koşulları altında doğrudan doku üzerinde gerçekleştirilebilmesi ve herhangi bir numune hazırlama işleminin gerekli olmamasıdır.İlgilenilen doku kesitlerini, kimyasal modifikatör içermeyen ve kimyasal olarak önceden temizlenmiş cam lam gibi düz bir yüzeye doğrudan monte edin. Gerekiyorsa, montaj işleminin hemen ardından örneği bir pelt soğutma tablasına sabitleyin; pelt tablasından ısı tahliyesini kolaylaştırmak için düşük güçlü bir fanla donatılmış bir ısı emici kullanın. Ardından, yaklaşık bir ila iki saat boyunca nemli bir ortamda çalışılıyorsa, doku yüzeyinde su veya buz yoğunlaşması olup olmadığını kontrol edin.Doku üzerindeki su yoğunlaşması, LAESI deneylerinde görüntüleme performansını olumsuz etkiler. Gerektiğinde, yoğunlaşmayı önlemek için bir oda nem alıcı kullanın veya çağrılan örneği kuru azot gazı gibi inert bir gazla doldurulmuş bir çevreleme odasına yerleştirin. Örneği muhafaza etme koşullarını optimize ettikten sonra, lazer ablasyon, elektrospray iyonizasyon veya orta kızılötesi lazer (kısaca mid-IR) ve ışık yönlendirme ile odaklama için bir dizi optik elementten oluşan LAESI iyon kaynağının kullanımını optimize etmek için çalışın.Kurulum ayrıca ek numune tutucular, soğutma bileşenleri, translasyon aşamaları ve bir elektro sprey sistemi içermektedir. Orta IR ablasyonu sırasında dışarı atılan partikül maddelerin bir kısmı, numunenin molekülleri ve iyonları ile ekilmiş yüklü damlacıklar oluşturmak için elektro sprey ile birleşir. Bu damlacıklardan salınan iyonlar, orifisi burada gösterilen kütle spektrometresi tarafından analiz edilir ve kaydedilir.Lazer düzeneği deney başlamadan önce yapılandırılır. İyon kaynağını optimize etmek için seçilen örneğe uygun deneysel parametrelerin hassas ayarlamaları gereklidir. Örneği, kütle spektrometresi örnekleme konisinin orifisinden 15 ila 20 milimetre aşağıya konumlandırarak başlayın.Orta IR lazeri 2,94 mikrometre dalga boyunda ve 10 hertz tekrarlama hızında çalıştırın. Lazer çıkışını darbe başına yaklaşık 100 mikro joule enerjiye kadar azaltın. Lazer ışık enerjisini numuneye kuplamak için altın aynalar ve lazer dalga boyunda şeffaf bir odaklama lensi kombinasyonu kullanın.Normal geliş açısında, orta kızılötesi B eksenini, kütle spektrometresi örnekleme konisinin açıklığının beş ila sekiz milimetre önüne konumlandırın. Odak noktasındaki doku uzaklaştırmasını istenen derinliğe ulaştırmak için odaklama lensinin konumunu ve lazer darbe enerjisini ayarlayın. Ablasyonla uzaklaştırılan hacmin boyutları.Görüntüleme uygulaması için piksel boyutunu belirleyin. Bir nanos sprey emiterini, kütle spektrometresinin giriş ekseniyle aynı hizaya ve yaklaşık 10 milimetrelik bir uç mesafe yayacak bir orifise yerleştirin. Elektrosprey için, pozitif iyon modu için %50 metanol çözeltisini %0,1 asetik asit ile veya %0,1 amonyum asetat ile hazırlayın.Negatif iyon modu için. Başarılı bir görüntüleme için elektrospray stabilitesi kritik öneme sahiptir. Seçilen çözücüye bağlı olarak, stabil bir sprey elde etmek için akış hızı ve püskürtme voltajının ayarlanması gerekir.Reaktif, tembel ve görüntüleme uygulamaları için elektrospray çözeltisi reaktifler içerebilir. Elektrospray çözeltisini, elektrospray yayıcı üzerinden dakikada yaklaşık 300 nanolitrelik bir akış hızıyla iletmek için bir şırınga pompası kullanın. Kütle spektrometresi orifisi düşük bir voltajda, örneğin toprağa göre ölçüldüğünde yaklaşık 500 voltun altında tutuluyorsa, yüksek voltajı (örneğin 3000 volt) doğrudan elektrospray yayıcıya veya metal bir birleştirici aracılığıyla uygulayarak elektrospray oluşturun.En verimli iyon üretimi için elektro sprey kaynağını kon jet püskürtme modunda çalıştırın; lazer ışını, yayıcı ve orifis eksenlerini bir optik mikroskop yardımıyla aynı düzlemde tutarak, iyon verimini optimize etmek için lazer düzeneğinin göreceli mesafelerini dikkatlice ayarlayın. Üç boyutlu lazer görüntüleme deneyleri için numune üzerindeki ablasyon kraterinin yatay boyutlarını belirleyin. Ablasyonu tekil darbelerle gerçekleştirin ve bir vokselin derinliğini, örneğin optik mikroskopideki Z yığın (Z stack) modunu kullanarak belirleyin.Doku montaj koşulları ve iyonizasyon kaynağı optimize edildiğine göre, görüntüleme deneyinde moleküler görüntülemeye geçiniz. Doku örneği, lazerin odak düzleminde x ve y yönlerinde, ablasyon noktası boyutlarına eşit veya ondan daha büyük adım boyutlarıyla hareket ettirilir. Uzamsal çözünürlük, gelen lazer ışınının odaklanması ile sınırlıdır.Numune yüzeyinde ilgilenilen bir alan seçin ve ilgili sınırların XY koordinatlarını elde edin. Görüntülenecek alan üzerindeki her piksel için seçilen bekleme süresiyle numune yüzeyini rasterlemek için bir ızgaralama algoritması seçin. Üç eksenli bir çeviri tablası ve numuneyi önceden belirlenmiş ızgaraya göre hareket ettirebilen bir yazılım kullanın.Ardından görüntüleme için gereken toplam süreyi hesaplayın. Orta kızılötesi lazer kaynağını, her pikseldeki kalma süresi içinde kütle spektrumundaki seçilen iyonlar için yeterli sinyal-gürültü oranı üretecek uygun bir tekrarlama hızında başlatın. Tembel lateral görüntüleme deneyi gerçekleştirmek için elektrospray kaynağını açın.Görüntüleme için gereken toplam süre boyunca yeterli çözelti olduğundan emin olun. Şimdi eş zamanlı olarak kütle spektrumlarının alınmasını, orta IR lazer ablasyonunu ve yüzey taramasını başlatarak verileri toplayın. Görüntüleme işlemi tamamlandığında; yüzey taramasını, orta IR lazerini ve veri toplama işlemini durdurun.Lazer kaynağını devre dışı bırakın, yüksek voltajı kapatın, şırınga pompasını kapatın ve kütle spektrometresini bekleme moduna alın. Ayrıca, eğer kullanılıyorsa, plaka soğutma elektroniğini kapatın ve inert gaz akışını kesin.Son olarak, lateral veya 3D moleküler görüntüler elde etmek için seçilen bir MZ değeri için iyon yoğunluk sinyalini analizin mutlak koordinatlarına karşı grafikleyin. Bunlar, 100 mikrometre kalınlığındaki bir sıçan beyni koronal kesitinin lateral lazy görüntülemesine ait temsili görüntülerdir. Kesit, deney sırasında dondurulmuş ve kuru azot gazı ortamında tutulmuştur.Beynin anatomik bölgeleri, MZ 2 78 0,59 değerine sahip iki plazmid için elde edilen moleküler görüntü ile iyi bir korelasyon göstermektedir. Bu, diğer primer ve sekonder metabolitler arasında, ortam koşullarında incelenen zebra bitkisi yaprak dokusunun kullanıldığı 3B bir moleküler görüntüleme deneyidir. MZ 2 85 0,076 değerine sahip ASCE, üstten ikinci ve üçüncü katmanların sarı sektörlerinde, homojen bir dağılımla daha yüksek iyon sayılarında tespit edilmiştir.Diğerlerinde bu dağılım, optik görüntüde görülen varyasyon paterniyle uyumluydu. H Geliştirilmesinin ardından. Bu yöntem, analitik ve B kimyası alanındaki araştırmacıların, önemli miktarda su içeriğine sahip dokuların ve biyofilmlerin moleküler kompozisyonunu ve uzamsal organizasyonunu incelemelerinin yolunu açmıştır.Orta kızılötesi bir lazer ve elektrikli bir püskürtme kaynağı ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu prosedür sırasında her zaman standart lazer güvenlik protokollerini izleyin ve tüm elektrik bağlantılarına uygun yalıtım uygulayın.

atmospheric-pressure-molecular-imaging-biological-tissues-biofilms

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Lazer ablasyon elektrosprey iyonizasyon (LAESI) kütle spektrometresi hücreleri örnek bilenmiş bir fiber optik kablo kullanılarak, atmosferik basınç, bitki ve hayvan hücreleri üzerinde kütle spektrometresi ile tek bir hücre analizi yapılır.

Doğrudan Atmosferik Basınç Kütle Spektrometresi Tek Hücre Analizi

İkincil elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi (Sesi-MS), uçucu organik bileşikler (VOC) tespiti gerek kalmadan herhangi bir numune ön işlemesi için olanak sağlar. Bu protokol Sesi-MS kullanılarak bakteriyel VOC (dakikalar içinde) hızlı karakterizasyonu için yönergeler sağlar.

İkincil Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometresi (Sesi-MS) ile karakterize Bakteriyel uçucu

Desorpsiyon elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi (DESI-MS) biyolojik dokular dahil olmak üzere örnekler, minimum numune hazırlama ile görüntülenebilir hangi bir ortam yöntemdir. Iyonizasyon probu aşağıdaki örnek rastering tarafından, bu sprey tabanlı teknik doku bölümleri içinde ilgi moleküler özellikleri ayırt etmek yeterli uzaysal çözünürlüğü sağlar.

Desorpsiyon Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometresi ile Biyolojik Dokuların Görüntüleme

Ince organ ve tümör dokusu üzerinde yapılan lazer kaynaklı arıza spektroskopi başarıyla Gd-tabanlı nanopartikülleri çıkarılacak doğal unsurlar ve yapay enjekte gadolinyum (Gd), tespit. Kimyasal elementlerin Görüntüler 100 mikron ve kantitatif alt mM hassasiyet çözünürlüğü ulaştı. Standart optik mikroskop ile kurulum uyumluluğu aynı biyolojik doku birden fazla görüntü sağlama potansiyelini vurguluyor.

Lazer kaynaklı Arıza Spektroskopisi: Organ Doku Nanopartikülün en Mapping ve Nicelik için Yeni Bir Yaklaşım

Burada, MS analizi için minyatür çok işlevli bir cihaz olan tek probu kullanarak hem dokuların ortam kütle spektrometresi görüntülemesini (MSI) hem de yerinde canlı tek hücreli MS (SCMS) analizini gerçekleştirmek için protokoller sunuyoruz.

Tek prob Uygulamalar: Ortam Koşullarında Kütle Spektrometre Görüntüleme ve Tek Hücre Analizi

Atmosferik basınçta çalıştırılan bir kütle spektrometresi görüntüleme (MSI) kaynağı, orta kızılötesi lazer desorpsiyonu ve elektrosprey post-iyonizasyonun birleştirilmesiyle geliştirilmiştir. Doku ile ilgili materyalin rezonans desorpsiyonunu kolaylaştırmak için enerji emici matris olarak eksojen buz matrisi kullanıldı. Bu makale, tüm vücut yenidoğan faresinin IR-MALDESI MSI'sini gerçekleştirmek için adım adım bir protokol sağlar.

Kızılötesi Matriks destekli lazer desorpsiyon Elektrosprey İyonizasyon tarafından tüm vücut Kütle Spektrometre Görüntüleme (IR-MALDESI)

İkincil nanoelectrospray iyonlaşma kullanarak gerçek zamanlı dışarı solunan nefes kimyasal bileşimi karakterize bir protokol kütle spektrometresi gösterdi yüksek çözünürlüklü birleştiğinde.

İkincil Nanoelectrospray iyonlaşma kullanarak gerçek zamanlı nefes analiz için yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi birleştiğinde

Bu iletişim kuralı için görüntüleme kütle spektrometresi mukadder doku sabit formalin süblimasyon tabanlı hazırlanması için tekrarlanabilir ve güvenilir bir yöntem açıklanır.

Örnekleri için matris peptit esaslı tamir Formalin en iyi hazırlık lazer desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi iş akışlarını görüntüleme destekli

Numune hazırlama bir roman yöntemi görüntüleme kütle spektrometresi kullanılarak küçük molekül alışverişte algılamak için hücre ve doku coculture karşılamak için geliştirilmiştir.

Doku ve kütle spektrometresi Imaging kullanarak hücreleri arasında küçük molekül iletişim yakalama

Bu protokolün amacı, biyolojik örneklerde metabolik ve moleküler tespiti en üst düzeye çıkarmak için MALDI MSI kullanarak deneyler planlarken numune hazırlama konusunda ayrıntılı rehberlik sağlamaktır.

MALDI Kütle Spektrometresi Görüntüleme Kullanarak Metabolik Profilleme için Örnek Hazırlama

Keşfedin atmosferik basınç LAESI kütle spektrometresi ile biyolojik dokuların ve biyofilmlerin moleküler görüntüleme yöntemini. Bu teknik doğal koşullarda doğrudan analiz sağlar.

Atmosferik basınç Moleküler Görüntüleme LAESI Kütle Spektrometresi Biyolojik Dokular ve Biyofilmler

Daha fazla video keşfet