Çift Floresans In situ Taze Beyin Bölüm Hibridizasyon

Merhaba, ben Rochester Üniversitesi'ndeki AL yardımcı laboratuvarında doktora sonrası araştırma görevlisi JA. Bu videoda, tek hücre çözünürlüğünde iki MRN transkriptini eş zamanlı olarak saptamak için taze dondurulmuş beyin kesitlerinde uygulanan Proses Enstitüsü hibrit sindirim yöntemini göstereceğiz. Bu yöntem, beyin devresinin anatomik, fonksiyonel, moleküler ve nörokimyasal organizasyonuna ilişkin uygulamalar gibi nörobilim alanındaki sorularınıza yanıt bulmanıza yardımcı olabilir.

Bu yöntem, AV beynindeki nöronlarda gen koagülasyonuna dair bilgiler sağlayabilse de kemirgenler gibi diğer sistemlerin yanı sıra çeşitli sinir dokularına da uygulanabilir. Bu prosedüre başlamak için, yeterli miktarda SDX G 50 tozunu su aracılığıyla RNA'lar ile hidrate edin.

Çözeltiyi kısa bir süre karıştırın ve oda sıcaklığında iki ila beş dakika bekletin. Bu adım, Sedex G 50 çöktürmesini takiben, ticari sedex tozunda bulunan dekstrozun SDX boncuklarından ayrılmasını sağlar. Süpernatantı uzaklaştırın ve işlemi üç ila beş kez tekrarlayın; son yıkamadan sonra SX G 50 çözeltisini, bir-bir tampon/boncuk hacim oranında TE tamponu ile yeniden süspande edin ve kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.

Ardından, kolonları hazırlayın. Otoklavlanmış cam yününü steril bir mililitrelik şırıngaya yerleştirin ve alt kısımda sıkı bir tabaka oluşturmak için pistonla sıkıştırın. Daha sonra şırıngayı 15 mililitrelik bir falcon tüpüne yerleştirin.

C 0 6 5 0 sabit açılı rotorla donatılmış bir Beckman santrifüj kullanarak, 1000 devir/dakika hızında 30 saniye boyunca santrifüj ederek kolonları Sedex G 50 çözeltisi ile doldurun. Santrifüjlemeden sonra, her kolona 200 µL kolon yıkama tamponu uygulayıp 1000 devir/dakika hızında iki dakika boyunca santrifüj ederek her birini yıkayın.

Önceki adımlarda olduğu gibi. Son olarak, her kolona 200 µL kolon bloklama tamponu uygulayın ve dakikada 1000 devirde iki dakika boyunca santrifüjleyin. Kolonu dengelemek için bu adımı dört ila beş kez tekrarlayın.

Hazırlanan kolonları, RIBA probu işaretlenene ve burada gösterilen çift floresan in situ hibridizasyon (CISH) veya D FISH prosedürü için saflaştırmaya hazır hale gelene kadar 4 °C'de saklayın. Biri digoksin veya DIG-enzimi ile, diğeri ise biyotin ile işaretlenmiş iki RNA probu hazırlanır. Ribo prob işaretleme çözeltilerini hazırlayarak ve işaretleme reaksiyonlarını bir benmari banyosunda 37 °C'de iki saat boyunca inkübe ederek probların işaretlenmesine başlayın. İki saatlik inkübasyonun sonunda, her bir işaretleme reaksiyonuna 1 µL 20 µg/µL tRNA ve 39 µL kolon bloklama tamponu ekleyin.

Ardından, her bir kolona 50 µL bloklama tamponu ekleyip 2000 rpm hızda üç dakika santrifüj ederek EDEX G 50 kolonlarını prob saflaştırması için hazırlayın. Kolonları dengelemek için bu adımı iki ila üç kez tekrarlayın. Kolonlar hazır olduğunda, kolonun altına yeni bir EEND orph tüpü yerleştirin.

Prob çözeltisini Sedex G 50 kolonuna uygulayın ve dakikada 2000 devirde üç dakika boyunca santrifüjleyin. Saflaştırılmış 50 µL Ribo prob çözeltisi elde etmek için, işaretlenmiş ve saflaştırılmış ribo probun kalitesini ve verimini değerlendirin. Kriyostat kullanarak hibridizasyona geçmeden önce, iki veya üç beyin kesitini charge super frost plus lamlar üzerine toplayın.

Kesit kalınlığı 10 ila 12 mikron olmalıdır. Lamlar, kullanıma kadar -80 °C'de saklanabilir. Kesitleri beş dakika boyunca soğuk ve yeni hazırlanmış %3 paraformaldehit çözeltisi içinde inkübe edin.

Ardından kesitleri PBS ile iki kez kısaca durulayın. Sonrasında, kesitleri %70, %95 ve %100'lük etanol çözeltilerinden oluşan standart bir alkol serisi ile her bir çözeltide iki dakika boyuncadehidre edin. Kesitleri dehidre ettikten sonra, taze hazırlanmış asetilasyon çözeltisi içerisinde 10 dakika boyunca inkübe edin.

Ardından kesitleri iki katı SSPE ile üç kez durulayın; asetilleme işleminin ardından kesitleri az önce gösterilen standart alkol serisiyle tekrarye hidrate edin. Şimdi ribo probu ile hibridizasyona başlayın. Dokuya yeterli miktarda hibridizasyon çözeltisi uygulayın, lamları lamellerle kapatın ve lamları metal bir lam tutucuya yerleştirin.

Tutucuyu, 65 °C'ye ayarlanmış bir mineral yağ banyosuna daldırarak gece boyu bekletin. Ertesi gün, lam tutucuyu mineral yağ banyosundan dikkatlice çıkarın ve lamlar üzerindeki fazla yağı temizlemek için kısa süreliğine kloroform ile durulayın.

Lamları, lamelleri çıkarmak için 5 ila 10 dakika boyunca 2X SSPE çözeltisine yerleştirin. Lameller çıkarıldıktan sonra, lamları yeni 2X SSPE çözeltisine aktarın ve oda sıcaklığında bir saat boyunca bekletin; bu inkübasyon adımının başlangıcında, 2X SSPE artı %50 formamid çözeltisini hibridizasyon adımıyla aynı sıcaklığa kadar önceden ısıtın. Bir saatlik inkübasyonun sonunda.

Slaytları önceden ısıtılmış 2x SSPE çözeltisine aktarın ve 1,5 saat boyunca inkübe edin. Bu inkübasyon adımının başlangıcında, 0,1x SSPE çözeltisini hibridizasyon adımındakiyle aynı sıcaklığa kadar önceden ısıtın. Slaytları önceden ısıtılmış 0,1x SSPE çözeltisine aktarıp 30 dakika inkübe ederek hibridizasyon sonrası yıkamaları tamamlayın.

Bu yıkama işlemini bir kez daha tekrarlayın. Beyin kesitleri artık hibritlenmiş ribo probların saptanması ve görüntülenmesi için hazırdır; TNT tamponuna %0,3 hidrojen peroksit ekleyin ve lamları bu çözeltide 10 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, bir dekopen kullanarak lamları TNT tamponu ile her biri 10 dakika sürecek şekilde üç kez yıkayın.

Beyin kesitlerini içeren alanın etrafına bir kuyucuk çizin. Her slayta 150 µL TNB tamponu uygulayın ve kesitleri bu çözeltide 30 dakika boyunca inkübe edin. Bu adım sırasında kesitlerin kurumadığından emin olun.

Ardından, peroksidaz konjuge anti DIG antikoru içeren 150 µL TT NB solüsyonu uygulayın ve lamları iki saat boyunca nemli bir haznede bekletin. İki saatlik inkübasyonun sonunda, kesitleri TNT tamponu ile üç kez 10 dakika boyunca yıkayın. Her seferinde, her bir lama 150 µL Alexa 5 9 4 konjuge T IDE çalışma solüsyonu uygulayın ve lamları bir saat boyunca nemli bir haznede bekletin.

Bir saatin sonunda, kesitleri üç kez 10 dakika boyunca TNT tamponu ile yıkayın. Her seferinde kesitleri, TNT tamponu çözeltisindeki %0,3'lük hidrojen peroksitte 10 ila 30 dakika inkübe edin. Hidrojen peroksit çözeltisindeki inkübasyon süresi mRNA bolluğuna bağlıdır ve D fish işleminden önce test edilmelidir.

Ardından, bölümleri TNT tamponu ile üç kez, her seferinde 10 dakika boyunca yıkayın. Her slayta 150 µL TMB tamponu uygulayın ve slaytları 30 dakika boyunca nemli bir bölmede bekletin. Slaytları eğerek fazla TMB çözeltisini uzaklaştırın.

Peroksidaz konjuge anin antikoru içeren 150 µL TMB çözeltisi ekleyin ve lamları iki saat boyunca nemli bir bölmede saklayın. Ardından, kesitleri TNT tamponu ile 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. Her seferinde lamlara 150 µL Alexa 488 konjuge mite çalışma çözeltisi uygulayın ve kesitleri bir saat boyunca inkübe edin.

Ardından kesitleri, her biri 10 dakika sürecek şekilde üç kez TNT tamponu ile yıkayın. Her iki ribo probu da antikorlarla işaretlendiğine göre, kesitleri 150 µL konak çözeltisi içinde iki dakika boyunca inkübe edin. Sonra kesitleri, her biri beş dakika sürecek şekilde üç kez TNT tamponu ile yıkayın; kesitlere Vector Shield veya Prolong Antifade gibi floresanla uyumlu bir kapatma medyumu ekleyin, üzerini lamınerle kapatın ve floresan mikroskobu altında inceleyin.

Bu temsili fotomikrograflar, zebra ispinozu beyin kesitleri, özellikle de memelilerin işitsel korteksinin şarkı kuşlarındaki analoğu olan NCM bölgesini içeren bir D balık Deneyi'nden alınmıştır. Beyin kesitleri iki prob ile hibridize edilmiştir: inhibitör nöronların bir alt popülasyonu için bir belirteç olan par albüminine karşı yöneltilmiş biyotinize bir ribo prob ve şarkı güdümlü nöronlar için güvenilir bir belirteç olan aktiviteye bağımlı gen çinkosuna karşı yöneltilmiş DIG etiketli bir ribo prob. İki görüntünün üst üste bindirilmiş hali, işitsel deneyimle aktive olan inhibitör nöronlardan oluşan bir hücre popülasyonunu göstermektedir.

Ok uçları, yalnızca par ribo probu ile işaretlenmiş hücreleri göstermektedir. Albumin okları, yalnızca çinko RIBA probu ile işaretlenmiş temsilci nöronları göstermektedir. Her iki ilgili transkripti de koeksprese eden nöronlar yıldız ile işaretlenmiştir. Bu prosedürü uygularken, tezgahınızı temiz tutmanız ve kontaminasyon içermeyen çözeltiler, plastikler ve cam malzemeler kullanmanız gerektiğini unutmamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, fare beynindeki gen ko-regülasyonunu incelemek amacıyla, taze dondurulmuş beyin kesitlerinde tek hücre çözünürlüğünde iki MA türünün nasıl eş zamanlı olarak tespit edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Videoyu izlediğiniz için teşekkür ederiz. Deneylerinizde başarılar dileriz.