Nöronal Sakatlık incelenmesi için Organotipik Hipokampal Dilim Kültür Modeli

Bu prosedürün genel amacı, NMDA, eksitotoksisite oksijen, glikoz yoksunluğu veya lipopolisakkarit veya amiloid beta peptit gibi enflamatuar uyaranlar dahil olmak üzere çeşitli uyaranlara yanıt olarak nöronal hasarı modellemek için kullanılabilecek organotipik hipokampal dilim kültürleri oluşturmaktır. Bu, önce doğum sonrası beynin izole edilmesi ve koronal sucs oluşturmak için her yarım kürenin dilimlenmesiyle gerçekleştirilir. İşlemin ikinci adımı, hipokampal bölgelerin izole edilmesi ve altı kuyucuklu plakalarda membran ekleri üzerinde kültürlenmesidir Kesitler kültürlendikten sonra, kesitler propidyum iyodür ile boyanır ve spontan nöronal ölüm seviyesi hesaplanır.

Son olarak, dilimler nörotoksik bir ajan ile muamele edilir ve tedaviye toksisite yanıtını ölçmek için yeniden boyanır. Sonuç olarak, immünofloresan mikroskobu kullanılarak propidyum iyodür floresansının nicelleştirilmesi yoluyla deneysel koşullar boyunca hipokampusun CA bir, CA üç ve dentat bölgelerindeki nöronal ölüm yüzdesini gösteren sonuçlar elde edilebilir. En az tekniğin, birincil nöronal kültür gibi, mevcut cimri üzerindeki ana avantajı, hipokampusun temel mimarisinin nispeten sağlam olduğu preparasyonun incelendiği nöronal yaralanma mekanizmasıdır.

Ve üçüncü tip egzersizi içerir. Diseksiyona başlamadan önce mikroglia ve ROY korunur. Her birine milipor geçirgen bir zar yerleştirin.

Birkaç kuyucuğun her birine bir mililitre kültür ortamı ekleyin. Altı kuyucuklu doku kültürü plakası. Plakaları bir inkübatörde 37 santigrat derecede ısıtın.

Bir günün başı kesilmiş başını, yedi sıçan yavrusunu% 70 etanole kısaca batırın. Dezenfekte etmek için, beyni açığa çıkarmak için kafatasından sagital bir kesi yapmak için mikro diseksiyon makası kullanın. Beyni hızlı bir şekilde çıkarmak için forseps kullanın ve buz üzerinde 60 milimetrelik bir diseksiyon ortamı kabına aktarın.

Beyni iki yarım küreye ayırmak için forseps kullanın. Fazla nemi toplamak için her yarım küre medial tarafı aşağı bakacak şekilde iki ila üç saniye kuru bir örtü süngeri üzerine yerleştirin. Beyni bir clarlar filmin bir karesine aktarın ve rosland'dan başlayarak 350 mikronluk kesitler halinde bir doku doğrayıcı dilim koronal platformuna yerleştirin.

Ve cüretkar bir şekilde devam ediyor. A clar karesini yavaşça kaldırın ve dilimleri taze bir buz gibi soğuk diseksiyon ortamına daldırın. Diseksiyon mikroskobu altında, serebral korteksin altında yer alan ve striatuma yapışmış CS şeklinde bir yapı olan hipokampusu tanımlayın.

Hipokampusu her koronal bölümden ayırmak için forseps kullanın. Her zara beş hipokampal dilim aktarmak için metinde açıklandığı gibi modifiye edilmiş bir Pasteur pipeti kullanın. Hazırlanan ılık altı kuyucuklu plakaya yerleştirin.

Membranın yüzeyindeki fazla ortamı çıkarın. Plakaları 12 ila 14 gün boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Kültürde 12 ila 14 gün sonra ekteki metinde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi ortamı değiştirmek, ortamı değiştirin ve bazal hücre ölümünün görselleştirilmesini ve nicelleştirilmesini sağlamak için pi olarak kısaltılan pum iyodür başına mililitre başına beş mikrogram ekleyin.

Dilimleri gece boyunca 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte, bir CCD kameraya bağlı ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu altında inkübe edin Bu sefer dilimin görüntülerini 40 x büyütmede yakalayın. Nokta, görüntülemeden hemen sonra sıfır saat veya T sıfıra eşit olan bazal hücre ölümü seviyelerine karşılık gelen PI floresansını yakalar. Dilimler, mevcut deney için tercih edilen yöntemle nöronal hasara neden olur.

Burada dilimler, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir saat boyunca 10 mikromolar NMDA içeren taze ortam ile inkübe edilir. Nörotoksik tedaviden sonra. Ortamı, mililitre pi başına beş mikrogram içeren taze kültür ortamıyla değiştirin.

Dilimleri gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin ve nörotoksik tedaviden sonra PI floresansının %5 karbondioksit görüntüsü. Bu zaman noktası için ortalama floresan ölçümleri, hücre ölümü seviyelerini temsil eder. 24 saatlik deneysel yaralanmadan veya T 24 saatten sonra, ortamı hemen 10 mikromolar NMDA ve mililitre başına beş mikrogram içeren taze kültür ortamı ile değiştirin.

PI, maksimum nöronal ölüm elde etmek için dilimleri gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe eder. Bu zaman noktası için ortalama floresan ölçümleri olan PI floresansının son görüntü setini elde edin. Maksimum hücre ölümü veya Tmax seviyelerini temsil eder.

Ekteki metinde açıklandığı gibi görüntü analiz yazılımını kullanarak ilgilenilen bölgedeki PI floresansını ölçün. Bu, hipokampusun yaklaşık bir bölgesindeki bazal nöronal ölümün PI boyamasının temsili bir görüntüsüdür. İşte PI lekeli nöronal ölümün temsili bir görüntüsü.

10 mikromolar NMDA'nın bir saatlik tedavisinden 24 saat sonra, daha yüksek derecede hücre ölümüne işaret eden daha yoğun lekelenmeye dikkat edin. Bu görüntü, 10 mikromolar NMDA ile bir gece inkübasyondan sonra maksimum PI boyamasını göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, organik hipokampus diliminin nasıl oluşturulacağını ve bir nöronal yaralanmanın ölçüm seviyesini iyi anlamış olmalısınız.