Name: Nöronal Sakatlık incelenmesi için Organotipik Hipokampal Dilim Kültür Modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-28T17:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Öğrenin, organotipik hipokampal dilim kültürleri oluşturarak nöronal hasarı incelemeyi. Bu yöntemle CA1, CA3 ve dentat bölgelerindeki hücre ölümünü propidyum iyodür boyama ve immünofloresan mikroskopi ile nicelendirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

NINDS tarafından finanse edilen, Amerikan Kalp Derneği, Amerikan Yaşlanma Araştırma Federasyonu, March of Dimes

1. Hazırlık Başlamadan önce, gerekli cerrahi aletler, diseksiyon ve kültür ortamı, ve 7 gün eski sıçan veya fare yavrular monte edin. Protokol, fare ve sıçan hazırlıkları için aynıdır. (I) Malzeme ve ekipman <ul><li> İşletim makas (düz uzunluğu 6 ", kedi # RS6818 Roboz, Gaithersburg, MD) </li><li> Micro makas, diseksiyon (uzunluk 4 ", kedi # RS5910. Roboz, Gaithersburg, MD) </li><li> Karbon Çelik Dumont Cımbız (kedi # RS-5045.Roboz, Gaithersburg, MD) </li><li> Modifiye cam "transfer" pipetler (kaldırıldı Pasteur pipeti alt ve kenar düzeltti) </li><li> Aclar plastik film meydanlarda (Honeywell, # 812.071, Pottsville, PA) "x 2" 2 kesilmiş </li><li> Kapak 3 sünger 4 (Kendall, kedi # 3157, Mansfield, MA) </li><li> 30 mm Millicell membran ekler (0.4 mikron; Millipore, Bedford, MA) </li><li> Iki ucu keskin bir jilet (McILwain doku kıyıcı, Vibratome Şirket, St Louis, MO) Mcllwain Doku kıyıcı </li><li> CCD kamera ve görüntü analiz yazılımları ile inverted mikroskop </li></ul> (Ii) Diseksiyon Orta (DM; pH 7,3 az 1 litre) <table border="0"><tbody><tr><td> Hank Kullanıcı Dengeli Tuz </td><td> 1 şişe (95.2 g/1L) (Sigma: H2387) </td></tr><tr><td> NHCO 3 (4.2 mM) </td><td> 350 mg </td></tr><tr><td> Hepes (10 mM) </td><td> 2.83 g </td></tr><tr><td> Glikoz (33.3 mM) </td><td> 6.0 g </td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin (100x) </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> BSA (% 0.3) </td><td> 300 mg </td></tr><tr><td> MgSO 4-7H 2 O </td><td> 1,44 g </td></tr></tbody></table> (Iii) Kültür ve orta (400 ml) <table border="0"><tbody><tr><td> MEM (Invitrogen 11.575-032) </td><td> 200 mL </td></tr><tr><td> *** Hank Dengesi Tuz (Invitrogen 24.020-117) </td><td> 100 mL </td></tr><tr><td> At serumu (Invitrogen 26.050-070) </td><td> 100 mL </td></tr><tr><td> HEPES tamponu (1 M Invitrogen 15.630-080) </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin (100x) </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td colspan="2"> *** Kültür ortamı vermeden önce 12.8 gr glukoz 500 ml Hank Dengesi Salt ekle </td></tr></tbody></table> (Iv) Hayvanlar 7 gün eski sıçan veya fare postnatal yavrular, genellikle Deneme başına bir çöp. 2. Kültür Günü <ol><li> Tüm diseksiyon aletleri ve Aclar film başlamadan önce 30 dakika boyunca% 70 ETOH batırılmış olmalıdır. Diseksiyonu kaput, bıçak ve doku kıyıcı yüzey etanol ile dezenfekte edilmelidir. </li><li> (3-4) birkaç 6 sıra doku kültürü plakaları hazırlamak; ortalama 1 ml kültür ortamı ekleyin ve her kuyuda bir Millipore geçirgen zar takın. 37 koyun 6-kuyucuğu ° inkübatör dilim aktarmak için hazır olana kadar. </li><li> DM ve buz üzerinde yer ile birkaç (4-6) 60 mm tabak hazırlayın. </li><li> Hızla başını kesmek makas ile ve% 70 ETOH daldırma ve beyin, kafatasının bir saggital kesi ile hızlı bir şekilde ortaya çıkarmak. Dikkatle soğuk DM beyin yeri ve hemen çıkarın. Iki yarımküresinin içine ayırın ve 2-3 saniye için bir kapak sünger üzerinde, her yarımkürede medial yerde. </li><li> Yarıkürede doku kıyıcı Aclar film kare yer ve üzerine yavaşça kaldırın ve yeri; 350 mikron bölümlerde koronal beyin kesmek. Bittiğinde, yavaşça ALCAR kare kesitli soğuk DM yarımkürede ve batığın alır. </li><li> Diseksiyon mikroskop kullanarak, hipokampal bölümlere ayırın. Sıçan için, kaudal hipokampus rostral kapsayan 5 bölümden olmalıdır ve fare için 3-4 bölüm olması gerekir. </li><li> 37 ° doku kültürü inkübatör membran ekler ile 6-kuyucuğu çıkartın. Hipokampal dilimleri ayrı ayrı cam transferi pipet kullanarak geçirgen membranlar üzerine aktarın. Çok DM membran üzerine bırakılırsa, Pasteur pipeti ile DM fazla çıkarın. Her membran beş hipokampal dilimleri yerleştirin. Başına en az 3 kuyu, durum ya da 15 dilim izin verin. </li><li> Toksisite deney başlamadan önce 12-14 gün için% 5 CO nemlendirilmiş inkübatör 37 ° kültür plakaları inkübe edin. Kültür ortamı haftada iki kez değiştirilebilir. </li></ol> 3. Dilim Kültür Hipokampal Nöronal Yaralanma uyaran ve miktarının <ol><li> Kültür 12-14 gün sonra 5 mg / ml propidium iyodür (PI), kültür ortamı ekleyin. Bu adım, görselleştirme ve bazal hücre ölümü ölçümü sağlayacaktır. </li><li> Ertesi gün, PI ölçmekher hipokampal dilim CA1 subregion (ve / veya CA3 veya dentat istenirse) floresans ve elde PI floresans ölçümleri bazal hücre ölümü (zaman olarak adlandırılır = 0 saat, ya da T 0) temsil eden anlamına gelir. Görüntü elde etme ve ölçülmesi için, biz openlabın yazılımı (Doğaçlama, Birleşik Krallık), ancak diğer görüntü toplama ve analiz yazılımı floresan yoğunluğunu ölçmek için kullanılabilir. </li><li> T 0 PI floresan görüntü elde etme hemen sonra, seçtiğiniz yöntem (biz nöronal toksisite 2,5 ikna etmek için bir saat 10 mcM NMDA, oksijen-glikoz yoksunluk, veya LPS) nöronal hasara yol. Toksik uyaran sonra, 5 mg / ml PI içeren taze orta orta yerine ve geceleme dilim korumak. </li><li> 3 gün, ortalama PI 24 saat deneysel durumun floresan veya T 24 belirlenir. </li><li> Bu görüntü alımından sonra hemen orta değiştirmek ve 10 mcM NMDA ve 5 mg / ml PI ve maksimal nöron ölümü elde etmek için gece boyunca inkübe dilimleri eklemek. </li><li> 4 gün, ortalama Tmax olarak tanımlanan maksimum nöronal ölüm PI floresan ölçmek. Aşağıdaki gibi yüzde hücre ölümü hesaplayın: (T 24 - T 0) / (T max-T 0). </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2106/2106fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 (A) Zaman deneysel yaralanma ve görüntü alımı, hipokampus ve sonraki nesil için. (B) hipokampal dorsalde dilimleri (T 0), 24 saat 10 mcM NMDA (T 24) 1 saat maruz kalma ve NMDA maksimum nöronal hasarı (T max) elde etmek için daha ileri bir 24 saat ya da 10 mcM. Temsilcisi görüntüleri

<ol><li>Stoppin, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37 (2), 173-173 (1991).</li>
<li>McCullough, L., Wu, L., Haughey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+Function+of+the+PGE2+EP2+Receptor+in+Cerebral+Ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective Function of the PGE2 EP2 Receptor in Cerebral Ischemia.</a> J Neurosci. 24 (1), 257-257 (2004).</li>
<li>Czapiga, M., Colton, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+microglia+in+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Function of microglia in organotypic slice cultures.</a> J Neurosci Res. 56, 644-644 (1999).</li>
<li>Newell, D. W., Barth, A., Papermaster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+and+non-glutamate+receptor+mediated+toxicity+caused+by+oxygen+and+glucose+deprivation+in+organotypic+hippocampal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate and non-glutamate receptor mediated toxicity caused by oxygen and glucose deprivation in organotypic hippocampal cultures.</a> J Neurosci. 15, 7702-7702 (1995).</li>
<li>Wu, L., Wang, Q., Liang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+Effects+of+prostaglandin+recetor+signaling+on+neuronal+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+letter%22%5BJournal%5D)">Divergent Effects of prostaglandin recetor signaling on neuronal survival.</a> Neuroscience letter. 421, 253-253 (2007).</li>
<li>Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R., R, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+in+vitro%3A+Analysis+of+morphology+and+adhesion+molecule+expression+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells in vitro: Analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Glia. 18, 319-319 (1996).</li>
</ol>

Deneyler kopyalayan tekrarlanabilir ve tutarlı sonuçları elde etmek için izlemeniz gereken iki önemli nokta vardır. İlk olarak, 12-14 gün önce deney için hipokampal dilim yaş izin vermek önemlidir. Dilim yalıtımı sayesinde, önemli bir mikrogliyal yanıt vardır ve mikroglia in vitro 3,6 10 günde meydana gelen bir dinlenme dallanmış devlet bir dönüş, bir süre aktif kalır . İkincisi, PI floresan yoğunluğu, yaralı hücrelerinin sayısı 4 ile orantılıdır anlamına gelir . Sıralı floresan üç zaman n...

nöronal sakatlık incelenmesi için organotipik hipokampal dilim kültür modeli

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotipik hipokampal kesit kültürü, temel mimari ve hipokampus bileşimi nispeten 1 korunduğu nöronal yaralanma mekanizmaları incelemek için bir in vitro yöntemdir . Organotipik kültür sistemi, nöronal astrositik ve mikroglia etkilerinin incelenmesi için izin verir, ama bir ex vivo hazırlama olarak, periferik inflamatuar hücrelerin kan akışı, ya da işe etkileri hitap etmez . Bu amaçla, bu kültür yöntemi hipokampus piramidal nöronlar eksitotoksik ve hipoksik hasarı incelemek için sık sık kullanılır, ama aynı zamanda inflamatuvar yanıt incelemek için kullanılan olmuştur. Bu yazıda, doğum sonrası kemirgen beyin hipokampal dilim kültürleri, nöronal hasara yol toksik uyaranlara yönetmek ve assaying hipokampal nöron ölümü ve miktarının belirlenmesi için yöntemler açıklanmaktadır.

Organoptypic hipokampal kesit kültürü modeli<em&gt; In vitro</em&gt; Model paradigmaların çeşitli nöronal hasarı incelemek için kullanılır. Bu makalede, biz dilim kültürler oluşturma ve nöronal yaralanma miktarının belirlenmesi için yöntemler açıklanmaktadır.

Nöronal Sakatlık incelenmesi için Organotipik Hipokampal Dilim Kültür Modeli

Organotipik hipokampal kesit kültürü, temel mimarinin ve bileşimin korunduğu, nöronal hasar mekanizmalarını incelemek için kullanılan bir in vitro yöntemdir...

Bu prosedürün genel amacı; NMDA, eksitotoksisite, oksijen veya glikoz yoksunluğu ya da lipopolisakkarit veya amiloid beta peptidi gibi inflamatuar uyaranlar da dahil olmak üzere çeşitli uyaranlara yanıt olarak gelişen nöronal hasarı modellemek için kullanılabilecek organotipik hipokampal dilim kültürleri oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle postnatal beynin izole edilmesi ve koronal kesitler oluşturmak için her bir hemisferin dilimlenmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, hipokampal bölgelerin izole edilmesi ve altı kuyucuklu plakalardaki membran insertler üzerinde kültüre edilmesidir. Kesitlerin kültüre edilmesinin ardından, bu kesitler propidyum iyodür ile boyanır ve spontan nöronal ölüm düzeyi hesaplanır.Son olarak, dilimler bir nörotoksik ajanla işleme tabi tutulur ve tedaviye karşı toksisite yanıtını ölçmek için yeniden boyanır. Nihayetinde, immunfloresans mikroskobu kullanılarak propidyum iyodür floresansının kantifikasyonu yoluyla, farklı deneysel koşullarda hipokampusun CA1, CA3 ve dentat bölgelerindeki nöronal ölüm yüzdesini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin primer nöronal kültür gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, nöronal hasar mekanizmasını

the-organotypic-hippocampal-slice-culture-model-for-examining

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz diğer beyin bölgelerine kolayca adapte edilebilir Organotipik hipokampal dilim hazırlamak için bir yöntem açıklanmaktadır. Beyin dilimlerini bir arayüz oluşturmak için izin gözenekli membranlar ve kültür ortamı üzerine koydu. Bu yöntem, kültür 2 hafta kadar hipokampus brüt mimarisi korur.

Organotipik Hipokampal Dilim Kültürler

Bu video, bir sıçan yavrusunun beyninden organotipik hipokampal dilim kültürleri hazırlamak için bir yöntem göstermektedir. Hipokampal dilimlerde hücre canlılığını ve büyümesini teşvik etmek için gerekli olan hipokampusun diseksiyonu, dilimleme ve kültür koşullarında yer alan adımları ana hatlarıyla belirtir ve sonuçta organotipik dilim kültürleri oluşturur.

Bir Sıçan Yavrusunun Hipokampusundan Organotipik Dilim Kültürlerinin Hazırlanması

Karsinom hücreleri ile Organotipik beyin kesit kokültürü beyin dokusu karsinoma hücre istilası sürecinde floresan gibi parlak saha (video) mikroskopisi ile görselleştirme morfolojik değişiklikler sağlar. Bu model sistem ayrıca hücre değişimi ve ikmal yaklaşımlar sağlar ve manipülasyonlar ve analizlerin bir yelpazede sunuyor.

Bir Organotipik Beyin Dilim ve kanser hücrelerinin 3D Sferoid ile Coculture Sistemi

Biz eksitotoksisite kaynaklı beyin hasarı dahil moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılabilecek bir beyin kesit modeli geliştirdik. Bu teknik açıdan olgun beyin dokusunu oluşturur ve kısmen sağlam nöronal devreleri, hücresel etkileşimleri ve postsinaptik bölmeleri korurken, deney için gerekli olan hayvan sayısı azalır.

Bir olarak Beyin Microslices arasında excitotoxic uyarılması<em&gt; In vitro</em&gt; İnme Model

Ön beyin ve beyincik dilim kültür sistemini kullanarak NG2 hücrelerini ve oligodendrositleri incelemek için bir teknik açıklanmıştır.  Bu yöntem, doku sitomimarisini korurken hücre dışı ortamın kolayca manipüle edilebildiği oligodendrosit soyu içindeki hücrelerin çoğalma ve farklılaşma dinamiklerinin incelenmesine izin verir.

Organotipik Dilim Kültürler Oligodendrosit Dinamikler ve miyelinasyonun incelemek için

Iskemik beyin hasarı birçok açıdan üreyen veriyor entorhino-hipokampal organotipik dilim kültürleri için bir protokol, sunulmuştur. Nöronlarda değişikliklere ek olarak neurovasculature değişiklikleri inceleyerek, bu protokol yaralanma sonrası nöral dokuda plastik değişiklikleri incelemek için çok yönlü bir araçtır.

Içinde Neurovascular Yaptırma Analizi Entorhino-hipokampal Organotipik Dilim Kültürler

Burada organotipik dilim kültür tekniği kullanılarak hipokampal doğum sonrası nöron incelemek için bir teknik tarif. Bu yöntem, yetişkin nöron in vitro müdahale edilebilmesini sağlar ve kültürlenmiş hipokampus farmakolojik maddelerin doğrudan uygulama için izin verir.

POSTNATAL nöron Çalışmaları için organotipik Dilim Kültürler

Organotypic Hipokampal dilim kültürler (OHSC) vivo durumu çok iyi taklit bir vitro modeli temsil. Burada biz vibratome tabanlı açıklar yüksek kaliteli dilimleri tümör hücreleri biyolojik davranışını veya yeni maddeler nöroprotektif potansiyelini değerlendirmek amacıyla elde etmek için iletişim kuralı Dilimleme geliştirilmiş.

Organotypic Hipokampal dilim kültürler çalışma Neuroprotection ve tümör hücrelerinin Invasiveness Model olarak

Yetişkin insan beyninden serbest yüzen dilim kültürleri hazırlamak için bir protokol sunulmaktadır. Protokol membran ekler kullanarak yaygın olarak kullanılan dilim kültür yönteminin bir varyasyonudur. Bu basit, maliyet-etkin, ve yaşilişkili beyin hastalıkları arkasında nörodejenerasyon mekanizmaları çözmek için amaçlayan kısa vadeli tahliller çalıştırmak için önerilir.

Yetişkin İnsan Beyninden Kısa Süreli Serbest Kayan Dilim Kültürleri

Burada, renal korteks-hipokampus organotipik dilimlerin hazırlanmasını anlatıyoruz. Serumun kademeli ve kontrollü yoksunluğu altında, bu dilimler gelişen epileptik benzeri olayları tasvir eder ve epileptogenezin ex vivo modeli olarak kabul edilebilir. Bu sistem, spontan aktivitenin dinamiklerini izlemek ve epileptogenez boyunca nöroinflamatuar özelliklerin ilerlemesini değerlendirmek için mükemmel bir aracı temsil eder.

Renal Korteks-Hipokampus Organotipik Dilim Kültürlerinde Epileptogenez Modeli

Bu makale, farelerde yatay hipokampal beyin dilimleri elde etmek için sistematik bir protokolü tanımlamayı amaçlamaktadır. Bu metodolojinin amacı, dentat girus ile ilgili nörolojik süreçleri değerlendirmek için perforant yol ve yosunlu lif yolu gibi hipokampal lif yollarının bütünlüğünü korumaktır.

Fare Beyninin Yatay Hipokampal Dilimleri

Öğrenin, organotipik hipokampal dilim kültürleri oluşturarak nöronal hasarı incelemeyi. Bu yöntemle CA1, CA3 ve dentat bölgelerindeki hücre ölümünü propidyum iyodür boyama ve immünofloresan mikroskopi ile nicelendirin.

Nöronal Sakatlık incelenmesi için Organotipik Hipokampal Dilim Kültür Modeli

Daha fazla video keşfet