Miyokard Doku Mühendisliği Biyolojik Türetilmiş Enjektabl Malzeme imalatı

Deselülarize edilmiş perikardiyal ve miyokardiyal dokulardan üretilen matriks jeller; çeşitli proteinler, peptitler ve glikozaminoglikanlar dahil olmak üzere doğal hücre dışı matriks bileşenlerini korur. Bu doku matriksleri doku mühendisliği için kullanılabilir. Bu videoda, aselüler hücre dışı matriks elde etmek amacıyla perikardiyal dokunun deselülarize edilmesiyle matriks jeller hazırlanmaktadır.

Hücre dışı matris, daha sonra çözünür sıvı bir versiyon oluşturmak için işlenir. Ardından, çözünür matrisin enjekte edilebilir bir iskele olarak uygulanabilirliğini belirlemek amacıyla küçük bir hayvan modelinde testi yapılır. Histolojik ve immünohistokimyasal analizler, in vivo ortamda enjekte edilen materyalin, vasküler hücre infiltrasyonuna izin veren gözenekli lifli bir iskele oluşturduğunu göstermektedir.

Merhaba, benim adım Sonia Zeki. California Üniversitesi San Diego'da Dr. Karen Chrisman'ın laboratuvarında lisansüstü öğrencisiyim. Bugün, deselülarize edilmiş dokudan Solubilize edilmiş ECM üreteceğiz ve kalp dokusu mühendisliği uygulamaları için in vivo testleri göstereceğiz.

Bu teknikler, kalp yetmezliği tedavisine yönelik enjekte edilebilir bir biyomalzeme terapisinin geliştirilmesi için önemlidir. Miyokard enfarktüsü sonrası cerrahi prosedürü laboratuvarımızdaki veteriner nörocerrah Pam shoot McGuffin gösterecek. Hadi başlayalım.

Bu protokole, dokuyu hücreden arındırarak yalnızca hücre dışı matrisin (ECM) kalmasını sağlayarak başlayın; öncelikle porcine perikardiyumu deiyonize su içeren bir behere yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca karıştırarak yıkayın. Yıkama işleminden sonra dokuyu, %1 SDS ve %1 penisilin streptomisin içeren 1x PBS içine yerleştirin ve oda sıcaklığında 24 saat boyunca sürekli karıştırın. Ertesi gün dokuyu tekrar deiyonize suya aktarın ve beş saat boyunca sürekli karıştırın, tüm köpükler gidene kadar 50 mL'lik bir tüp içerisinde çalkalayın.

Hematin ve eozin boyaması, deselülarize edilmiş dokuda çekirdeklerin olmadığını göstermelidir. Deselülarize edilmiş dokunun geri kalanını 15 ila 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin. Ardından dokuyu -80 °C dondurucuya koyun.

Dondurulmuş numuneleri, tamamen kuruyana kadar çok düşük basınç ve çok düşük sıcaklık altında dondurarak kurutun (liyofilize edin). Kullanılan sisteme ve numunelerin su içeriğine bağlı olarak bu işlem 12 ila 72 saat arasında sürebilir. Deselülarize doku tamamen kuruduğunda, dokuyu bir Wiley Minim değirmene aktarın.

40 gauge mesh ile hazırlanan düzenekte, dokuyu ince bir toz haline gelene kadar öğütün. Numunenin büyük çoğunluğu filtreden geçtikten sonra toplama kavanozunu çıkarın. Bu numune artık hücre dışı matris veya ECM tozu olarak adlandırılır.

Eğer bir sonraki adıma hemen geçilmeyecekse, bu aşamada ikinci bir liyofilizasyon adımı gerçekleştirilebilir. Bu işlem, ECM'yi çözmek için kaydedilen ağırlığın doğruluğunu sağlar. İstenilen miktarda ECM tozunu steril bir tartım şişesine tartın.

ECM tozunun bulunduğu sintilasyon şişesine, ECM konsantrasyonu 10 mg/mL olacak şekilde mililitre başına bir miligram içeren steril filtrelenmiş hidroklorik asit çözeltisi ekleyin. Bir manyetik karıştırıcı çubuk ekleyin ve şişeyi karıştırıcı plaka üzerine yerleştirin.

Steril bir WHE kaşığı veya spatula ile şişenin kenarlarını periyodik olarak sıyırarak 48 ila 60 saat boyunca sürekli karıştırın. Bu işlem tüm ECM tozunun sindirildiğinden emin olmak içindir. ECM sindirildikçe çözelti haline gelecektir.

ECM çözündürüldükten sonra, örneği buza yerleştirin ve sodyum hidroksit ile hidroklorik asit kullanarak pH değerini 7.4'e ayarlayın. pH ayarlandıktan sonra, çözeltinin nihai konsantrasyonu 1x PBS olacak şekilde 10x PBS ekleyin. Örneğin, 900 µL ECM çözeltisine, pH ayarlamalarının ardından 100 µL 10x PBS eklenmelidir.

Nötralizasyon için eklenen hacimleri ve pH testi için alınan hacimleri hesaplayarak çözünür hale getirilmiş ECM çözeltisinin konsantrasyonunu belirleyin. Ardından, istenen nihai konsantrasyona ulaşmak için buraya bir katı PBS ekleyin. Mililitre başına altı miligram.

Cerrahi gününde, 30 gauge iğne uçlu 0.1 mililitrelik bir şırınga içerisinde çözünmüş ECM'den 75 µL'lik bir enjeksiyon hazırlayın. Entübe edilmiş dişi bir Harlan dolly sıçağın anestezi durumunu %2.5 izofluran ile sürdürün. Gözü ekleyin, ardından ayak parmağı sıkıştırma testi yaparak anestezinin etkili olduğunu doğrulayın.

Hidrasyon için alt karın bölgesinden subkütan enjeksiyon yoluyla üç mililitre laktatlı ringer solüsyonu uygulayın. Ardından, hayvanı cerrahi masa üzerinde sırt üstü pozisyona getirin ve ekstremitelerini nazikçe bantla sabitleyin. Karın bölgesindeki tüyleri temizlemek için tıraş makinesi kullanın ve serbest tüyleri vakumla çekin.

Ksifoid çıkıntıdan karnın sağ alt tarafına doğru diyagonal bir hat boyunca 50 µL'lik %2 lidokain enjeksiyonlarından oluşan bir seri yapın. Ardından, merkezden başlayıp dışarıya doğru hareket ederek üç kez Betadine ile ovalama yapın. Ovalama işlemini izopropil alkol ile tekrarlayın.

Ardından, hayvanı önceden hazırlanmış dairesel pencereli bir cerrahi örtü ile örtün. Cerrahi örtü ile sabitleyin. 10 numara neşter kullanın.

Ksifoid çıkıntıdan karnın sağ alt tarafına doğru üç ila dört santimetrelik bir insizyon yapın. Ksifoid çıkıntıyı bulun ve sağ taraftaki büyük damara zarar vermemeye dikkat ederek kas boyunca dikey olarak aşağıya, sağa doğru diseke edin. Ardından, diyaframı açığa çıkarmak için makas kullanarak kası lateral olarak kesin.

36 inç uzunluğunda 3-0 Vicryl sütür ve bir çift hemostat kullanarak karaciğere zarar vermemeye dikkat edin. Bir iğneyi xiphoid process üzerinden geçirin ve sütürü yarıya kadar çekin. Sütür uçlarını birbirine bantlayın ve hayvanın üst ve arka tarafındaki bir noktaya sabitleyerek xiphoid process'i yukarı kaldırın ve başka bir 36 inç uzunluğunda 3-0 Vicryl sütür ile diyaframı açığa çıkarın.

Xifoid çıkıntıya en yakın kastan bir iğne geçirin ve ardından iğneyi çekip ucunu cerrahi masanın sağındaki başka bir noktaya sabitleyerek cerrahi boşluğu tamamen açın. Daha sonra, küçük bir sıçan dişi mikro forseps kullanarak diyaframın merkezini tutun, dışarı çekin ve küt uçlu makasla çok küçük bir insizyon yapın. Bu delik açıldığında, akciğerler geri çekilecektir.

Kalbi görüntülemek için diyafram boyunca dikey olarak iki ila üç santimetrelik bir insizyon yapın. Ardından, boşluğun soluna üç inçlik bir pamuklu çubuk yerleştirin ve akciğerleri kenara itin. Pamuklu çubuğu bir havlu klempi kullanarak sabitleyin.

Başka bir pamuklu çubuk kullanarak, perikard kesesini bulmak için sağ akciğeri kenara çekin. Ardından, bir çift mikro forseps ve bir çift büyük tırtıklı forseps kullanarak perikard kesesini yırtın ve kalbin apeksini açığa çıkarın. Kalbin apeksini sağ dişli mikro forseps ile tutun ve çözünürleştirilmiş matriksi enjekte etmek için iğneyi eğik ucu sola gelecek şekilde yerleştirin.

Apeksin üçte bir yüksekliğinde, epikardiyal yüzeye paralel şekilde. Büyük kalp veninden kaçındığınızdan emin olun. Çözünürleştirilmiş matris jelini enjekte edin ve iğneyi çıkarmadan önce birkaç saniye bekleyin.

Enjeksiyon bölgesindeki doku beyazlaşmalıdır; boşluktaki kanı pamuklu çubukla temizleyin, sağ akciğeri tutan havlu klempsini ve pamuklu çubuğu kavisli mikro hemostatlar kullanarak çıkarın ve 30 inç uzunluğunda 5-0 proline sütür ile ilk düğümü atın. Ardından, tamamen kapatmadan önce diyaframı sürekli sütür ve konik bir iğne ile kapatmak için sıçan dişli mikro pens kullanın. Göğüs boşluğunu tahliye etmek için PE 1 60 vakum tüpünü yerleştirin ve 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak etrafını kapatın.

Sütür sıkılaştırıldığında, diyafram konkav olmalıdır. Florlu buzu %1'e indirin. Kaviteyi açık tutan her iki 3-0 Vicryl sütürü çıkarın. Kasın fazla kısmını bir pamuklu çubuk veya steril gazlı bezle silerek nemlendirin.

Kas tabakasını aralıklı dikişlerle kapatmak için yeni bir üç sıfır sütür parçası kullanın. Ardından izofloranı kapatın. Bölgeyi temizleyin ve cildi kapatmak için zımba kullanın.

Ardından insizyon bölgesine üçlü antibiyotikli pomad uygulayın. Sıçanın %100 oksijen altında iyileşmesini bekleyin. Hayvan ventilatör çevresinde nefes almaya başladığında, trakeal tübü çıkarın.

Hayvan tekrar ayağa kalktığında, kilogram başına 0,05 miligram buprenorfin hidroklorür analjezikle deri altı enjeksiyonu yapın ve hayvanı steril bir havlu üzerine, ana kafesine geri yerleştirin. Suda çözünür matriks jeller enjekte edilen sıçanlardan alınan kalp dokuları, çeşitli zaman noktalarında genel doku analizi için kesitlenmiş; hematoksilin ve eozin ile boyanmıştır. Cerrahi sonrası erken zaman noktalarında, enjekte edilen bölge pembe lifli bir ağ olarak görünürken, daha geç zaman noktalarında interstisyel olarak yayılmıştır.

İki hafta sonra hücre girişi gözlemlenir. Enjekte edilen matriksin degradasyonu görülür. Eğer ECM enjeksiyondan önce biyotinle işaretlenmişse, matriks enjeksiyon bölgesindeki damar içi büyümesini ve oluşumunu görselleştirmek için biyotinin HRP konjuge streptavidin ile boyanmasıyla daha doğrudan görselleştirme sağlanabilir.

Buradaki lamlar fitzy ile birlikte boyanmıştır. Yeşil renkte gösterilen konjuge selektin endotel hücrelerine bağlanır ve kırmızı renkte gösterilen anti-düz kas aktin antikoru kullanılır. Enjeksiyon bölgesinin yakınında kök hücreler de tanımlanabilir.

Burada, C kit için yapılan bir immünohistokimya boyaması ile görselleştirilmişlerdir. Bu videoyu izledikten sonra, deselülerize dokudan çözünür ECM'nin nasıl oluşturulacağı ve kalp dokusu mühendisliği uygulamaları için in vivo olarak nasıl test edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Perikardiyal doku kullanıyor olsak da, herhangi bir doku kaynağıyla kullanılabilmesi için bu genel prosedürün modifiye edilmesi gerektiğini unutmayın.

İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.