Name: Axon Büyüme, Yeni Bir Coculture Yöntemle Çalışması Glial Hücre heterojenite Etkisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Öğrenin, glial hücre heterojenitesinin akson büyümesine etkisini yeni bir kokültür yöntemiyle incelemeyi. Rat korteks glial hücreleri ve dorsal kök gangliyonu nöronları kullanılarak sinirbilim araştırmaları için güvenilir bir model geliştirilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmada, FMMU yeni bir temel ve kısmen NIH finansman bulma desteklenmiştir.

1. Glia Hücre Kültür Glial hücreleri, merkezi sinir sisteminin farklı bölgelerinde yetiştirilebilir. Tüm süreç süreç resimde gösterilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111process.jpg" alt="Süreç 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Süreç 1"> Gün 1 Kaplama kültür plaka ve lamelleri <ol><li> Kuru steril cam mikroskop yuvarlak bir otoklavda lamelleri. </li><li> Sterilize 24-kuyu kültür plaka içine Plaka sterilize lamelleri. </li><li> Kat poli-lisin ve kök sıcaklık altında 2 saat süreyle inkübe lamelleri. </li><li> 3. adımı aynı şekilde Kat 6 kuyu kültür plakalar. </li><li> Lamelleri ve 6-iyi bir kültür plaka iki kez distile su ve kültür kaputun içindeki kuru hava ile yıkayın. </li><li> 37 derece altında,% 5 CO 2 ile 6-plaka 24-plaka ve 2 mL her bir kuyu içinde her bir kuyunun 200 mcL DMEM orta (% 10 FBS) ekleyin ve kuvöz içine koydu </li></ol> 2. Gün Yalıtımlı korteks ve glial hücre kültürü <ol><li> Pozitif akış diseksiyonu kaput sterilize edin. </li><li> 20 dakika UV ışığı açın. </li><li> % 70 etanol ile tüm yüzeylerde Sprey ve kullanmadan önce 15 dakika bekleyin. </li><li> gergin değiştirmek: anestezisi sıçan hipotermi yavrular (P2-P6) ve işletim makas kullanarak framen magnum üssünde başını kesmek. </li><li> Kafatası kapalı bir iris makas ve soyma kullanarak sagital sütür boyunca kafatası açın. </li><li> Önbeyin çıkarın ve stereomikroskop altında, L15, orta soğutulmuş içine koymak, dikkatli bir şekilde, kan damarları ile dura ve pia membran temiz korteks izole ve L15 orta birkaç kez yıkayın. </li><li> Korteks mikrocerrahi makas ile küçük parçalar halinde kesin. </li><li> Tripsin-EDTA için 37 derece 15 dakika, korteks parçaları ve inkübe içine orta L15 ile hazırlanan% 0.125 ekleyin. </li><li> Final konsantrasyon 10ug/mL DNaz stok solüsyonu eklemek için, doku çözüm aspirat ve yangın parlatılmış cam Pasteure pipet ile 20 kez, tek hücre süspansiyon toplamak, tüp içinde 50ml 20ml DMEM ortama% 20 FBS ile doku blokları transfer. </li><li> DMEM orta, yeniden askıya% 10 FBS ile DMEM hücreleri, 5000-10000/cm 2 hemasitometre, tohum hücreleri ile mikroskop altında hücreleri saymak. Hücre süspansiyonu bir kez yıkayın . 37 derece% 5 inkübatör hücreleri koruyun, orta haftada 2 kez yarım değiştirin. </li></ol> 2. Dorsal kök gangliyon Nöronlar İzolasyon, Kültür ve Arıtma 1. Gün Kültür Malzeme hazırlayın <ol><li> Poli-lizin, yıkama lamelleri ile sterilize lamelleri ile iki kez su ve hava kuru damıtmak Coat, 24 kuyu tabak içine koydu. </li><li> % 2 B27 ve 2.5 sn NGF (50 ng / ml) ile 100μL Neurobasal orta, 37 derece,% 5 CO 2 tabak koyun. </li></ol> 2. Gün embriyolar DRG'ler Isolate <ol><li> Glial hücre kültürü aynı şekilde akışını kaput sterilize edilmiştir. </li><li> Doz aşımı ile CO 2,% 70 etanol ile sterilize karın hamile bir sıçan Euthanize (E15), embriyolar rahim izole edilmiş ve soğutulmuş L15 orta koymak. </li><li> 35mm yemekleri stereomikroskopta ve transfer altında soğutulmuş L15 orta dorsal kök gangliyon Spinal kabloları izole edin. </li><li> Tek hücre süspansiyonu toplayın ve NBF orta (Neurobasal orta% 2 B27 ve 2.5 sn NGF (50 ng / ml) içeren) ile bir kez yıkayın. </li></ol> 3. Gün Purify DRG Nöronlar <ol><li> 18h-24h nöron tohumlama sonra, nihai konsantrasyonu 20 mcM ve son hacim 200 mcL nöron kültürüne 1 mM konsantre FUDR stok solüsyonu ekleyin. </li><li> 72h sonra Neurobasal orta FUDR olmadan% 2 B27 ve 2.5 sn NGF (50ng/mL) içeren yarım orta yerine. Bundan sonra, her gün orta değiştirin. </li></ol> 3. Glial hücreleri ile Coculture DRG nöronlar <ol><li> Glial hücre kültürü izdiham (20 gün sonra tohumlama) ulaştığında, bu nöronlar ile coculture hazır. </li><li> 24 saat arıtılmış nöronlar eklemeden önce, glial hücreler orta,% 2 B27 ve 2.5 sn NGF (50 ng / ml) içeren Neurobasal orta değiştirildi. </li><li> Saf nöronlar kültür kuyulardan toplanmıştır yangın cilalı Pasteure pipet ile mekanik geçerek, tek hücre süspansiyonu elde edildi. </li><li> Nöron sayısını sayma sonra,% 2 B27 ve 2.5 sn NGF (50ng/mL) içeren Neurobasal orta konfluent glial hücreler üzerinde 500/cm 2 numaralı seribaşı. </li><li> Glial hücreler nöronlar yapışma ve neurite büyüme kaydedilmiş ve hücre tipi özel antikorları kullanarak görüntü analiz yazılımı ve immünhistokimya farklı zaman noktalarında analiz olabilir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar <ol><li> Glial hücre kültürü: tohumlama sonra, glial hücreleri yaklaşık 20 günde konfluent olacak. Faz kontrast microsc altındayerdir, kolayca farklı morfolojik glial hücre alt farklı büyüme paterni altyapılar oluşturdu ve immuocytochemisty tekniği (Şekil 1, Şekil 2) gösterildiği gibi GFAP pozitif astrositler% 90 daha fazla olduğu tespit edilmiştir. </li><li> DRG nöronlar kültürü: yöntem, 72 saat FUDR tedavi sonra, DRG nöronların saflık 6 gün içinde% 99 gibi yüksek ulaşacak, DRG nöronlar kendi benzersiz morfolojileri gösterdi ve yüksek yoğunluklu neurite büyüme (Şekil 3, Şekil 4). </li><li> Glial hücre ve nöronlar coculture: DRG nöronlar yapışma ve neurite akıbet tohumlama sonra 4 saat içinde glial hücreleri kolayca oluştu, dikkatli gözlemler nöron yapışma ve neurite büyüme özel büyüme paterni altyapılardan oluşan glial hücre alt etkilenmiş olduğunu gösterdi, bu kolayca tespit edilebilir faz kontrast mikroskop altında ve immünsitokimya (Şekil 5, Şekil 6). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Konfluent glial hücrelerin morfolojisi. Kortikal glial hücreleri polylysine kaplı lamel kaplama ve 20 gün kültüre, glial hücreler farklı büyüme paterni not, sol tarafındaki hücreleri yayılan bir şekilde düzenlenmiştir. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Glial fibriler asidik protein (GFAP) antikor etiketli konfluent glial hücreleri sağ tarafta GFAP (kırmızı) pozitif hücrelerin yayılan düzenleme unutmayın. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Dorsal kök gangliyon nöronları FUDR tedavi olmadan in vitro büyüdü. Kirlenmesine neden olan hücreleri nöronların background DRG kurdu. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. Dorsal kök gangliyon nöronları FUDR tedavi sonra in vitro büyüdü. Arka plan kirlenmesine neden olan hücreler tamamen ortadan kaldırılmıştır. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5. Glial hücreler üzerinde yetişen Dorsal kök gangliyon nöronları. Nöronlar yapışma ve yayılan düzenlenmiş hücreleri inhibe neurite büyüme ve sağ tarafında glial hücreler üzerinde sınırlı kalmıştır. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig6.jpg" alt="Şekil 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 6"> Şekil 6. Nörofilaman antikor etiketli glial hücreler üzerinde büyüyen Dorsal kök gangliyon nöronları neurite (yeşil), yayılan sol tarafında düzenlenen glial hücreleri inhibe ve sağ tarafında sınırlı idi, tüm glial hücreler GFAP antikor (kırmızı) etiketli .

<ol><li>Rossignol, S., Schwab, M., Schwartz, M., Fehlings, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+injury%3A+time+to+move%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spinal cord injury: time to move?</a> J Neurosci. 27 (44), 11782-11792 (2007).</li>
<li>Yiu, G., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+inhibition+of+CNS+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial inhibition of CNS axon regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 7 (8), 617-627 (2006).</li>
<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+and+magic+of+glia%3A+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li>
<li>Matyash, V., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+astrocyte+morphology+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in astrocyte morphology and physiology.</a> Brain Res Rev. , (2009).</li>
<li>Wanner, I. B., Deik, A., Torres, M., Rosendahl, A., Neary, J. T., Lemmon, V. P., Bixby, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vitro+model+of+the+glial+scar+inhibits+axon+growth.+Glia%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A new in vitro model of the glial scar inhibits axon growth. Glia.</a> 56 (15), 1691-1709 (2008).</li>
<li>Kuffler, D. P., Sosa, I. J., Reyes, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+chondroitin+sulfate+proteoglycan+inhibits+dorsal+root+ganglion+neuron+neurite+outgrowth+and+substrate+specificity+via+a+soma+and+not+a+growth+cone+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Schwann cell chondroitin sulfate proteoglycan inhibits dorsal root ganglion neuron neurite outgrowth and substrate specificity via a soma and not a growth cone mechanism.</a> J Neurosci Res. 87 (13), 2863-2871 (2009).</li>
<li>Kleitman, N., Wood, P. M., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+culture+method+for+the+study+of+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Culturing+nerve+cells%22%5BJournal%5D)">Tissue culture method for the study of myelination.</a> Culturing nerve cells. , P559-P559 (1998).</li>
</ol>

Bu deney protokolü, glial hücreler, nöron yapışma ve neurite büyüme özellikle astrosit heterojenite etkisi çalışma iki hedeflere ulaşmak için tasarlanmıştır. Ilk golü bu deneyde astrosit heterojenite, mümkün olduğu kadar korumak için, konfluent glial hücre kültürü zenginleştirilmiş astrositler daha fazla hücre hasarı ve astrositler yaralanması tepki neden olabilecek herhangi bir kimyasal tedavi ve sindirim yayılma olmadan birincil kültür karışık oldu. Son astrosit saflık fibrobasts FN tarafından doğrulanmadı olarak% 1&#...

<table><tbody><tr><td>DMEM(yüksek glikoz)</td><td>Invitrogen</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>L15 besiyeri</td><td>Invitrogen</td><td>11415-114</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10437-077</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Besiyeri</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>poli-lizin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4832</td><td>kültür sınıfı</td></tr><tr><td>NGF(2.5S)</td><td>Invitrogen</td><td>13257-019</td><td></td></tr><tr><td>B27 takviyesi</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>0.25% tripsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>nörofilament antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab24575</td><td></td></tr></tbody></table>

axon büyüme, yeni bir coculture yöntemle Çalışması glial hücre heterojenite etkisi

Study Glial Cell Heterogeneity Influence on Axon Growth Using a New Coculture Method

Tüm memelilerin merkezi sinir sisteminde, yaralanma sonrası kopmuş aksonları 1 çok kötü orijinal hedefleri ve fonksiyonel iyileşme, rejenerasyon mümkün değildir. Akson rejenerasyonu yetmezliği kombine düşmanca glial hücre çevre, miyelin ilgili inhibitör molekülleri ve içsel nöron rejeneratif kapasitesi 2 azalma da dahil olmak üzere çeşitli faktörlerin bir sonucudur. Astrositler merkezi sinir sisteminde en baskın glial hücre tipi ve fizyoloji ve patoloji koşulları 3 altında akson fonksiyonlarında önemli rol oynar. Kontrast, homolog oligodendrosit astrositler farklı morfolojileri ve gen ekspresyonu 4 farklı astrosit alt popülasyonlar oluşan heterojen bir hücre popülasyonu vardır. Akson büyüme üzerindeki etkiler bu heterojenite fonksiyonel önemi, büyük ölçüde bilinmemektedir. Özellikle glial hücre, nöron davranış astrosit heterojenite fonksiyonunu incelemek için, biz, ortak kültür, sıçan korteks elde glial hücreleri ile yüksek saflaştırılmış dorsal kök gangliyon nöronları yeni bir yöntem oluşturdu. Bu teknikle, aynı koşul altında farklı astrositler alt popülasyonlar nöron yapışma ve akson büyüme karşılaştırabileceksiniz. Bu raporda, astrositler izolasyonu ve kültürü, dorsal kök ganglionlar nöronlar izolasyon ve saflaştırma ve astrositler ile nöronların DRG ko-kültür için bu yöntemi ayrıntılı protokol verir. Bu yöntem ayrıca, nöronlar ve glial hücreler arasındaki hücresel veya bölgesel belirli bir etkileşim çalışması için diğer beyin bölgelerine uzatılabilir.

Bu protokol, glial hücre heterojenite bir akson büyüme üzerindeki etkisini incelemek için yeni bir yöntem tarif<em&gt; In vitro</em&gt; Ko-kültür sistemi. Rat kortikal glial hücreleri birleştiği kültürlü ve yüksek sıçan dorsal kök gangliyon nöronları saflaştırılmış ile kültüre edildi. Farklı glial hücre nöronlar yapışma ve akson büyüme etkisi aynı kültürü doğrudan karşılaştırıldı. Bu yöntem, doğrudan nöron yapışma ve akson büyüme glial hücre heterojenite etkisini incelemek için yeni bir yol sağlar.

Axon Büyüme, Yeni Bir Coculture Yöntemle Çalışması Glial Hücre heterojenite Etkisi

Tüm memelilerin merkezi sinir sisteminde, yaralanma sonrası kopan aksonlar orijinal hedeflerine doğru yeniden rejenerasyon gösteremezler ve fonksiyonel iyileşme...

Bu prosedürün genel amacı, glial heterojenliğin DRG Akson Büyümesi ve Hücre Deiyonizasyonu üzerindeki etkisini incelemektir. Bu işlem, öncelikle neonatal sıçan korteksinden glial hücrelerin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise sıçan embriyosu DRG nöronlarının kültüre edilmesi ve saflaştırılmasıdır.Prosedürün üçüncü adımı, saflaştırılmış DRG nöronlarının glio hücreleri üzerine eklenmesidir. Prosedürün son adımı ise hücre aksonlarındaki ekson büyümesini gözlemlemek, hücre boyama ve kantitasyon analizlerini gerçekleştirmektir. Sonuç olarak, bulgular elde edilebilir.Bu çalışma, zaman ayarlı kayıt ve immünofloresan mikroskopi aracılığıyla, DRG nöron büyümesinin heterojen glial hücreler tarafından etkilendiğini göstermektedir. Merhaba, UCLA Nöroloji Bölümü'ndeki Nörogörüntüleme laboratuvarındayım. Bugün size, yeni bir nöron kültürü yönteminde G hücresinin heterojen etkisinin büyüme üzerindeki etkisini incelemek için kullanılan bir prosedürü göstereceğiz.Laboratuvarımızda, nöronlar ve ggl hücreleri arasındaki etkileşimi incelemek için bu yeni yöntemi kullanıyoruz. Öyleyse çalışmayı test edelim. Glia hücreleri ve dorsal kök ganglion nöronlarının veya DRG'lerin bir ko-kültürünü oluşturmak için, işe glia hücrelerini bir doku kültürü kabininde kültüre ederek başlayacağız. Önceden sterilize edilmiş 24 kuyucuklu kültür plaklarının tabanlarını sterilize edilmiş yuvarlak cam lamellerle kaplayın; altı kuyucuklu bir kültür plağının kuyucuklarındaki lamelleri polilisin ile kaplayın ve oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin.Lamelleri ve kültür plakalarını iki kez distile su ile yıkayın ve havada kurutun. Ardından, sırasıyla her bir 24 kuyucuklu veya altı kuyucuklu plağa 200 µL veya 2 mL %10 fetal bovin serum (FBS) içeren dcos modifiyeli eagles medium veya DMEM pipetleyin. Plakaları ertesi güne kadar 37 °C'de %5 karbon dioksit içeren inkübatöre yerleştirin.Pozitif akışlı diseksiyon kabinini sterilize edin. UV ışığını 20 dakika boyunca açık tutun ve ardından kabin altındaki tüm yüzeylere %70 etanol püskürtüp kullanmadan önce 15 dakika bekleyin. Hipotermi ile anestezi uygulanmış, P2 ile P6 arasındaki iki sıçan yavrusunun başlarıyla işleme başlayın.Ardından, ameliyat makasıyla foramen magnum tabanından başsız hale getirilir. İris makası kullanarak sagital sütür boyunca kranyum açılır ve kafatası soyulur. Ön beyin çıkarılıp soğutulmuş levo wit's L 15 içine yerleştirilir ve aynı işlem ikinci baş için tekrarlanır.Ardından bir stereo mikroskop altında çalışarak; durayı, beyni örten zarları ve kan damarlarını dikkatlice temizleyin. Korteksi izole edin ve L 15 medyum ile birkaç kez yıkayın.Korteksi küçük parçalara ayırmak için mikrocerrahi makası kullanın. Ardından, %0,125 tripsin içeren EDTA'lı L 15 besiyerinde 37 °C'de 15 dakika inkübe edin. Sonrasında, doku bloklarını %20 FBS içeren 20 mL DMEM içeren 50 mL'lik bir tüpe aktarın.DS'yi 10 µg/mL final konsantrasyona ulaşacak şekilde ekleyin. Ardından, hücreleri ayırmak için alevle cilalanmış bir pasta pipeti kullanarak doku solüsyonunu yaklaşık 20 kez karıştırın. Son olarak, hücreleri %10 FBS içeren DMEM ile bir kez yıkayın ve bir hemositometre ile hücre sayısını belirleyin.Ardından hücreleri santimetrekare başına 5.000 ila 10.000 hücre olacak şekilde ekle ve 37 °C'de ve %5 karbondioksitte inkübe et. DRG'leri izole etmek, saflaştırmak ve kültüre etmek için besiyerini haftada iki kez değiştir. İlk olarak, daha önce gösterildiği gibi polilizin kaplı cam lameller ile 24 kuyucuklu plakaları hazırla.Her bir lam üzerine 100 µL NVF besiyeri ekleyin ve plakları ertesi güne kadar 37 °C'de inkübe edin. Pozitif akış kabinini daha önce olduğu gibi sterilize edin. Ardından, karbon dioksit ile ötanize edilmiş gebe bir sıçanın uterusundan stereo mikroskop altında izole edilen E 12 ile E 15 arasındaki sıçan embriyoları ile işleme başlayın.Bağlı dorsal kök gangliyonları ile birlikte omurilikleri izole edin ve soğutulmuş L 15 medium içeren 35 milimetrelik kaplara aktarın. Mikrocerrahi pensleri kullanarak, bağlı DRG'leri omuriliklerden dikkatlice ayırın; DRG'lere zarar vermeden soğutulmuş L 15 medium içerisinde bağlı aksonları kesin.Tüm DRG'ler spinal kordlardan izole edildiğinde, genellikle tek bir spinal korddan 20 ila 30 DRG izole edilir. İzole edilen tüm DRG'ler %0,125 tripsin içeren EDTA'ya alınır ve 37 °C'de, %5 karbondioksit ortamında 20 dakika inkübe edilir; ardından hücreler %20 FBS içeren DMEM ile bir kez yıkanır; sonra DNA'lar eklenir ve glial hücrelerde gösterildiği gibi homojen bir hücre süspansiyonu oluşturmak için ateşle cilalanmış bir pasta pipet kullanılarak birkaç kez pipetlenir. MBF medium ile ikinci bir yıkama işlemi gerçekleştirilir, hücreler sayılır ve ardından DRG nöronlarını saflaştırmak için hücreler, 24 kuyucuklu plaklardaki hazırlanmış lamel camların üzerine kuyucuk başına 5.000 hücre olacak şekilde ekilerek gece boyunca inkübe edilir.Ekimden 18 ila 24 saat sonra. Besiyerini, 20 micromolar beş fluoro iki doxy uridine içeren nörobazal besiyeri ile değiştirin. 72 saat sonra, besiyerinin yarısını FUDR içermeyen nörobazal besiyeri ile değiştirin.Besiyeri ardından gün aşırı yenilenir. Glial hücrelerin ekiminden yaklaşık 20 gün sonra, hücreler konfluens düzeyine ulaşacak ve iki hücre tipinin birleştirilmesinden 24 saat önce nöronlarla birlikte kültüre edilmeye hazır hale gelecektir.Glial hücre besiyerini MBF besiyeri ile değiştirin. Daha önce gösterildiği şekilde, saflaştırılmış DRG'lerin tek hücre süspansiyonunu hazırlayın. Hücre yoğunluğunu belirleyin.Ardından, santimetrekareye 500 hücre düşecek şekilde nöronları glial hücrelerin üzerine ekleyin. Glial hücreler üzerindeki nöron canlılığı ve nörit çıkışı, görüntü analiz yazılımı ve hücre tipine özgü antikorlarla immünokimya kullanılarak çeşitli zaman noktalarında analiz edilebilir. Burada ayrı ayrı ve ko-kültür olarak kültüre edilmiş glial hücrelerin ve DRG nöronlarının örnekleri yer almaktadır; glial hücreler 20 gün sonra konfluens hale gelir.Kültürde. Faz kontrast mikroskobu altında, farklı glial hücre alt popülasyonlarının belirgin büyüme modelleri ve morfolojiler oluşturduğu açıkça görülmüştür. İmmünositokimya ile ise GFAP pozitif astrositlerin kültürün %90'ından fazlasını oluşturduğu belirlenmiştir.FUDR ile 72 saat boyunca uyguladığımız tedavi yöntemini kullanarak, DRG nöronlarının saflığı altı gün içinde %99'a kadar ulaşacak ve nöronlar ile glial hücrelerin bir ko-kültüründe, yoğun nörit büyümesi ile beraber kendilerine özgü morfolojilerini sergileyeceklerdir. DRG nöron gövdesi ve nörit uzaması, nöronlar ekildikten sonraki dört saat içinde glial hücreler üzerinde kolayca gerçekleşmiştir; nöron gövdesi ve nörit büyümesi, faz kontrast mikroskobu altında kolayca tanımlanabilen özel büyüme örüntüsü alt yapılarını oluşturan glial hücre alt popülasyonlarından etkilenmiştir. Ayrıca, glial hücre heterojenliğinin nöron büyümesi üzerindeki etkisini incelemek amacıyla, DRG nöronlarının glial hücrelerle ko-kültürünün nasıl yapılacağını immünositokimya ile göstereceğim.Bu oturum gerçekleştirilirken, dokuya çok nazik davranılması ve hücrelerin besiyerinde tutulması gerektiğini hatırlamak oldukça önemlidir. Hücreleri asla havaya maruz bırakmayın ve kurumalarına izin vermeyin. Hepsi bu kadar.İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

study-glial-cell-heterogeneity-influence-on-axon-growth-using-new

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

In vitro MSS akson glia etkileşim araştırmaları için bir roman çok bölmesi nöron ko-kültür mikrosistem platformu geliştirdi. Platform altı paralel olarak bağımsız deneyler yapma yeteneğine sahiptir ve yeni geliştirilmiş bir makro / mikro hibrid imalat yöntemi kullanılarak imal edildi.

Çok bölmesi MSS Nöron glia Co-kültür mikroakışkan Platformu

Bu çalışma, bir roman nöronal akson ve (astro) glia ko-kültür platformu kurma prosedürleri açıklar. Bu ko-kültür sisteminde, bir tek akson (ve tek bir glial hücre) arasındaki doğrudan etkileşim manipülasyon glial sinyalleşme karşılıklı nöronların mekanik analiz izin veren, uygun olur.

Mikroakışkan Kültür Platformu Glia Etkileşimi (MCP) tabanlı Nöronal Akson ve Glia Co-kültür Sistemi Nöron görüntülenmesi Analizi

Bu video, bölümlere ayrılmış bir yaklaşım kullanarak dolaylı bir nöron-astrosit ko-kültürü oluşturmak için bir yöntemi göstermektedir. Bu kurulumda, nöronlar ve astrositler uzamsal olarak ayrılır, ancak şartlandırılmış bir ortamı paylaşırlar. Astrositler tarafından salınan nörotrofik faktörler, nöron farklılaşmasını ve sinaptik bağlantıların oluşumunu teşvik ederek nöron-glia etkileşimlerini düşündürür.

Nöron-glia etkileşimlerini incelemek için dolaylı bir nöron-astrosit ko-kültür tekniği

Bu video, bir dorsal kök ganglion eksplant ve Schwann hücrelerinin kokülasyon modelini göstermektedir. Kokültür koşullarında, askorbik asit, Schwann hücrelerinin miyelinatör formlara farklılaşmasını teşvik eder. Miyelinizan Schwann hücreleri, sinir fonksiyonu için gerekli olan bir miyelin kılıfı oluşturmak için aksonları birden çok kez sarar.

Nöron Miyelinasyonu için Dorsal Kök Ganglion Eksplantının Schwann Hücreleri ile Birlikte Kültürlenmesi

Dorsal kök gangliyon (DRG), periferal sinir sisteminin duyusal nöronlar ihtiva eden yapılardır. Ayrışmış zaman, yaralanma yerinde in vivo ortamda taklit in vitro sinir rejenerasyonu ve miyelin incelemek için değerli bir model sağlayan, Güney Carolina gibi yağ elde edilen kök hücreleri (ASC) ile birlikte kültürlenebilir.

Kök Ganglia Nöronlar ve Farklılaştırılmış Yağ-türetilmiş Kök Hücreler Dorsal: bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Co-kültür Modeli Periferik Sinir Rejenerasyon Eğitim

Bu protokol nöron glia etkileşimlerinin bölümlere analizi için dolaylı nöron astrosit kokültürü açıklar.

Dolaylı nöron astrosit Coculture Deneyi: Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Nöron glia Etkileşimleri Detaylı Soruşturma Set-up

Bu iletişim kuralı, ayrışmış birleştirerek insan pluripotent kök hücre elde edilen nöronlar için tekrarlanabilir bir yöntemi açıklamak için amacımız ve astrocytes 3D içine birlikte cocultures, bunlar yuvar ücretsiz kayan koşulları ve daha sonra korumak küre immunoanalysis ve multielectrode dizi kayıtları ile küre sinaptik devre etkinliğin ölçülmesi.

Sinaptik Microcircuit modelleme 3D Cocultures Astrocytes ve Neurons insan Pluripotent kök hücre ile

Burada gerçek zamanlı olarak insan glioma hücre (hGC) göç çalışması için eski vivo karışık monolayer kültür sistemi saiyoruz. Bu model, hGC'ler ile hem miyelinli hem de miyeline olmayan aksonlar arasındaki etkileşimleri bölümlere ayrılmış bir oda içinde gözlemleme olanağı sağlar.

Dorsal Kök Ganglion Akson-Oligodendrocyte Co-Kültürler İnsan Glioma Hücre Göç Gerçek Zamanlı İzleme

Burada, nöron ve astrositle zenginleştirilmiş kültürlerin veya embriyonik korteksten nöron-glia kültürlerin kurulmasını sağlayan, yüksek verim ve tekrarlanabilirlik ile özel kültür ortamı nı kullanarak basit bir yaklaşım salıyoruz.

İskemide Nöron-Glia Etkileşimlerinin Rolünü Nörade İncelemek İçin Hücre Kültürü Modeli

Nöral yaralanmadan sonra koku alma glia (OEG) nörojeneratif kapasitesini değerlendirmek için bir in vitro model sunuyoruz. RGN aksonal ve somatodendritik belirteçleri analiz ederek, OEG monolayerleri üzerinde axotomized adult retinal ganglion nöronlarının (RGN) bir kokülatürüne ve daha sonra aksonal rejenerasyon çalışmasına dayanmaktadır.

Beyazlatılmış Sıçan Retinal Ganglion Nöronlarının Koku Alma Ensheathing Glia ile Birlikte, Yetişkin Aksonal Rejenerasyonun In Vitro Modeli Olarak

Burada, desenli nöronlar üzerinde glioblastoma (GBM) göçünü analiz etmek için kullanımı kolay bir ortak kültür tahlili sunuyoruz. Nöronlar üzerinde GBM hücre göçünün kolay ölçülmesi için FiJi yazılımında bir makro geliştirdik ve nöronların GBM hücre invaziv kapasitesini değiştirdiğini gözlemledik.

Göç ve Hücresel Etkileşimleri İncelemek İçin Desenli Nöronlarda Glioblastoma Kök Benzeri Hücrelerin Ortak Kültürü

Öğrenin, glial hücre heterojenitesinin akson büyümesine etkisini yeni bir kokültür yöntemiyle incelemeyi. Rat korteks glial hücreleri ve dorsal kök gangliyonu nöronları kullanılarak sinirbilim araştırmaları için güvenilir bir model geliştirilir.

Axon Büyüme, Yeni Bir Coculture Yöntemle Çalışması Glial Hücre heterojenite Etkisi

Daha fazla video keşfet