Axon Büyüme, Yeni Bir Coculture Yöntemle Çalışması Glial Hücre heterojenite Etkisi

Bu prosedürün genel amacı, glial heterojenliğin DRG Akson Büyümesi ve Hücre Deiyonizasyonu üzerindeki etkisini incelemektir. Bu işlem, öncelikle neonatal sıçan korteksinden glial hücrelerin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise sıçan embriyosu DRG nöronlarının kültüre edilmesi ve saflaştırılmasıdır.

Prosedürün üçüncü adımı, saflaştırılmış DRG nöronlarının glio hücreleri üzerine eklenmesidir. Prosedürün son adımı ise hücre aksonlarındaki ekson büyümesini gözlemlemek, hücre boyama ve kantitasyon analizlerini gerçekleştirmektir. Sonuç olarak, bulgular elde edilebilir.

Bu çalışma, zaman ayarlı kayıt ve immünofloresan mikroskopi aracılığıyla, DRG nöron büyümesinin heterojen glial hücreler tarafından etkilendiğini göstermektedir. Merhaba, UCLA Nöroloji Bölümü'ndeki Nörogörüntüleme laboratuvarındayım. Bugün size, yeni bir nöron kültürü yönteminde G hücresinin heterojen etkisinin büyüme üzerindeki etkisini incelemek için kullanılan bir prosedürü göstereceğiz.

Laboratuvarımızda, nöronlar ve ggl hücreleri arasındaki etkileşimi incelemek için bu yeni yöntemi kullanıyoruz. Öyleyse çalışmayı test edelim. Glia hücreleri ve dorsal kök ganglion nöronlarının veya DRG'lerin bir ko-kültürünü oluşturmak için, işe glia hücrelerini bir doku kültürü kabininde kültüre ederek başlayacağız. Önceden sterilize edilmiş 24 kuyucuklu kültür plaklarının tabanlarını sterilize edilmiş yuvarlak cam lamellerle kaplayın; altı kuyucuklu bir kültür plağının kuyucuklarındaki lamelleri polilisin ile kaplayın ve oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin.

Lamelleri ve kültür plakalarını iki kez distile su ile yıkayın ve havada kurutun. Ardından, sırasıyla her bir 24 kuyucuklu veya altı kuyucuklu plağa 200 µL veya 2 mL %10 fetal bovin serum (FBS) içeren dcos modifiyeli eagles medium veya DMEM pipetleyin. Plakaları ertesi güne kadar 37 °C'de %5 karbon dioksit içeren inkübatöre yerleştirin.

Pozitif akışlı diseksiyon kabinini sterilize edin. UV ışığını 20 dakika boyunca açık tutun ve ardından kabin altındaki tüm yüzeylere %70 etanol püskürtüp kullanmadan önce 15 dakika bekleyin. Hipotermi ile anestezi uygulanmış, P2 ile P6 arasındaki iki sıçan yavrusunun başlarıyla işleme başlayın.

Ardından, ameliyat makasıyla foramen magnum tabanından başsız hale getirilir. İris makası kullanarak sagital sütür boyunca kranyum açılır ve kafatası soyulur. Ön beyin çıkarılıp soğutulmuş levo wit's L 15 içine yerleştirilir ve aynı işlem ikinci baş için tekrarlanır.

Ardından bir stereo mikroskop altında çalışarak; durayı, beyni örten zarları ve kan damarlarını dikkatlice temizleyin. Korteksi izole edin ve L 15 medyum ile birkaç kez yıkayın.

Korteksi küçük parçalara ayırmak için mikrocerrahi makası kullanın. Ardından, %0,125 tripsin içeren EDTA'lı L 15 besiyerinde 37 °C'de 15 dakika inkübe edin. Sonrasında, doku bloklarını %20 FBS içeren 20 mL DMEM içeren 50 mL'lik bir tüpe aktarın.

DS'yi 10 µg/mL final konsantrasyona ulaşacak şekilde ekleyin. Ardından, hücreleri ayırmak için alevle cilalanmış bir pasta pipeti kullanarak doku solüsyonunu yaklaşık 20 kez karıştırın. Son olarak, hücreleri %10 FBS içeren DMEM ile bir kez yıkayın ve bir hemositometre ile hücre sayısını belirleyin.

Ardından hücreleri santimetrekare başına 5.000 ila 10.000 hücre olacak şekilde ekle ve 37 °C'de ve %5 karbondioksitte inkübe et. DRG'leri izole etmek, saflaştırmak ve kültüre etmek için besiyerini haftada iki kez değiştir. İlk olarak, daha önce gösterildiği gibi polilizin kaplı cam lameller ile 24 kuyucuklu plakaları hazırla.

Her bir lam üzerine 100 µL NVF besiyeri ekleyin ve plakları ertesi güne kadar 37 °C'de inkübe edin. Pozitif akış kabinini daha önce olduğu gibi sterilize edin. Ardından, karbon dioksit ile ötanize edilmiş gebe bir sıçanın uterusundan stereo mikroskop altında izole edilen E 12 ile E 15 arasındaki sıçan embriyoları ile işleme başlayın.

Bağlı dorsal kök gangliyonları ile birlikte omurilikleri izole edin ve soğutulmuş L 15 medium içeren 35 milimetrelik kaplara aktarın. Mikrocerrahi pensleri kullanarak, bağlı DRG'leri omuriliklerden dikkatlice ayırın; DRG'lere zarar vermeden soğutulmuş L 15 medium içerisinde bağlı aksonları kesin.

Tüm DRG'ler spinal kordlardan izole edildiğinde, genellikle tek bir spinal korddan 20 ila 30 DRG izole edilir. İzole edilen tüm DRG'ler %0,125 tripsin içeren EDTA'ya alınır ve 37 °C'de, %5 karbondioksit ortamında 20 dakika inkübe edilir; ardından hücreler %20 FBS içeren DMEM ile bir kez yıkanır; sonra DNA'lar eklenir ve glial hücrelerde gösterildiği gibi homojen bir hücre süspansiyonu oluşturmak için ateşle cilalanmış bir pasta pipet kullanılarak birkaç kez pipetlenir. MBF medium ile ikinci bir yıkama işlemi gerçekleştirilir, hücreler sayılır ve ardından DRG nöronlarını saflaştırmak için hücreler, 24 kuyucuklu plaklardaki hazırlanmış lamel camların üzerine kuyucuk başına 5.000 hücre olacak şekilde ekilerek gece boyunca inkübe edilir.

Ekimden 18 ila 24 saat sonra. Besiyerini, 20 micromolar beş fluoro iki doxy uridine içeren nörobazal besiyeri ile değiştirin. 72 saat sonra, besiyerinin yarısını FUDR içermeyen nörobazal besiyeri ile değiştirin.

Besiyeri ardından gün aşırı yenilenir. Glial hücrelerin ekiminden yaklaşık 20 gün sonra, hücreler konfluens düzeyine ulaşacak ve iki hücre tipinin birleştirilmesinden 24 saat önce nöronlarla birlikte kültüre edilmeye hazır hale gelecektir.

Glial hücre besiyerini MBF besiyeri ile değiştirin. Daha önce gösterildiği şekilde, saflaştırılmış DRG'lerin tek hücre süspansiyonunu hazırlayın. Hücre yoğunluğunu belirleyin.

Ardından, santimetrekareye 500 hücre düşecek şekilde nöronları glial hücrelerin üzerine ekleyin. Glial hücreler üzerindeki nöron canlılığı ve nörit çıkışı, görüntü analiz yazılımı ve hücre tipine özgü antikorlarla immünokimya kullanılarak çeşitli zaman noktalarında analiz edilebilir. Burada ayrı ayrı ve ko-kültür olarak kültüre edilmiş glial hücrelerin ve DRG nöronlarının örnekleri yer almaktadır; glial hücreler 20 gün sonra konfluens hale gelir.

Kültürde. Faz kontrast mikroskobu altında, farklı glial hücre alt popülasyonlarının belirgin büyüme modelleri ve morfolojiler oluşturduğu açıkça görülmüştür. İmmünositokimya ile ise GFAP pozitif astrositlerin kültürün %90'ından fazlasını oluşturduğu belirlenmiştir.

FUDR ile 72 saat boyunca uyguladığımız tedavi yöntemini kullanarak, DRG nöronlarının saflığı altı gün içinde %99'a kadar ulaşacak ve nöronlar ile glial hücrelerin bir ko-kültüründe, yoğun nörit büyümesi ile beraber kendilerine özgü morfolojilerini sergileyeceklerdir. DRG nöron gövdesi ve nörit uzaması, nöronlar ekildikten sonraki dört saat içinde glial hücreler üzerinde kolayca gerçekleşmiştir; nöron gövdesi ve nörit büyümesi, faz kontrast mikroskobu altında kolayca tanımlanabilen özel büyüme örüntüsü alt yapılarını oluşturan glial hücre alt popülasyonlarından etkilenmiştir. Ayrıca, glial hücre heterojenliğinin nöron büyümesi üzerindeki etkisini incelemek amacıyla, DRG nöronlarının glial hücrelerle ko-kültürünün nasıl yapılacağını immünositokimya ile göstereceğim.

Bu oturum gerçekleştirilirken, dokuya çok nazik davranılması ve hücrelerin besiyerinde tutulması gerektiğini hatırlamak oldukça önemlidir. Hücreleri asla havaya maruz bırakmayın ve kurumalarına izin vermeyin. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.