Name: Elektron Spin Rezonans Oksijen Haritalama için Canlı Türlerinin Micro-görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Öğrenin, canlı hücrelerin çevresindeki oksijen konsantrasyonunu mikron ölçeğinde üç boyutlu haritalamak için elektron spin rezonans mikroskobisi kullanmayı. Bu yöntem siyanobakterilerde fotosentez aktivitesini incelemek için uygulanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma kısmen hibe no tarafından desteklenmiştir. 213/09 İsrail Bilim Vakfı, hiçbir hibe. 2005258 BSF kuruluşundan itibaren, hiçbir hibe. Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) 201.665 ve Russell Berrie Nanoteknoloji Enstitüsü tarafından Technion. Biz Siyanobakterinin arz ve işlenmesiyle ilgili Technion Kimya Schulich Fakültesi Prof. Noam Adir ve Faris salame yardım kabul ediyorsunuz. Technion Mikro-Nano Fabrikasyon Ünitesi Svetlana Yoffis yardım ve desteği büyük ölçüde takdir edilmektedir.

1. ESR Micro görüntüleme Genel Bakış Öncelikle, kısa bir açıklama ESR, ESR mikroskopi ve sisteminin çeşitli bileşenleri sağlamak ve o zaman gerçek görüntüleme deneyleri anlatacağız. Elektron spin rezonans, altına yerleştirilen bir dış statik manyetik alan (Şekil 1), belirli bir frekansta elektromanyetik radyasyon eşleşmemiş elektron spin molekülleri tarafından emildiği bir spektroskopik tekniktir. ESR, serbest radikaller ve paramanyetik merkezleri ve kimlik tespiti için, kimya, biyoloji, fizik, malzeme bilimi gibi bilim geniş alanlarda istihdam edilmektedir. Bu canlı türlerinin paramanyetik moleküllerin çevre eğitimi için güçlü bir yöntemdir ve asitlik (pH), viskozite, oksijen, ve reaktif oksijen türleri konsantrasyonları 3 hakkında bilgi sağlar. ESR, heterojen örnekleri için, spektral bilgileri, manyetik alan gradyanlar 4 kullanımı yoluyla, mekansal çözüme bir şekilde (yani, bir görüntü elde ederek) elde edilebilir. Bu esas olarak proton spin gözlemler manyetik rezonans görüntüleme (MRG) daha yaygın yöntem çok benzer. Şimdiye kadar, bu ESR görüntüleme teknikleri birkaç santimetre nispeten büyük boyutu ve çözünürlük mm çaplı canlı örnekler için uygulanmıştır. ESR görüntülemede (Örneğin Şekil 2, 5 referans alınan bakın.) Nispeten yeni bir gelişme milimetre ve alt milimetre boyutunda örneklerin ölçümleri milimetre çaplı çözünürlükte küçük hayvanlar bakarak yeteneklerini uzantısı mikron ölçekli çözünürlüğü. Bu alan, 1 mikron 2 (Şekil 3 temsilcisi örneklerini görmek) yaklaşan bir çözünürlüğe sahip 3D ESR görüntüleri sağlayabilir bugün ESR mikroskopi olarak bilinir . ESR mikroskop aslında geleneksel bir ESR spektrometresi benzer. Bu satın alma süreci ve veri işleme kontrol etmek için statik alan, spin eksitasyon ve sinyal tespiti için bir mikrodalga sistemi, örnek tutmak için bir sonda ve bilgisayarlı bir konsol üretmek için bir mıknatıs vardır. Diğer bileşenler benzersiz ESR genel görüntüleme ve ESR küçük kopya da mevcut görüntüleme probu bulunmaktadır manyetik elektronik sistemin bir parçası alanında degrade kaynakları, ve degrade bobinleri. Bizim özel sistem hakkında daha fazla bilgi protokol filmde gösterilen ve referans 2'de açıklanmıştır. 2. ESR Micro görüntüleme Numune Hazırlama Bu aşama, ESR mikro görüntüleme deney için numune hazırlama yöntemi açıklanmıştır. Bu aşamada hücreler sonunda trityl radikal 6 tampon çözelti ile birlikte, özel olarak hazırlanmış cam ESR mikroskopi numune kabı alt yerleştirilir . Bu protokol siyanobakteriler hücrelerinin ölçüm açıklar ve bu nedenle, diğer hücre türleri için uygun ayarlamalar numune hazırlama aşamasında gerekli olabilir. <ol><li> İlk olarak, ~ 400 400 mikron boyutunda emici kağıt birkaç kareler alınan ve daha sonra 1.2 mL (40 mg / ml 'lik bir konsantrasyon) siyanobakteriler süspansiyon ile dolu bir Eppendorf tüp içine yerleştirilir. </li><li> Süspansiyon bir mikrosantrifüj 6000 RPM 2 dakika süreyle santrifüj edilir. </li><li> Bunu takiben, supernatant tampon ~ 50 mcL siyanobakteriler dehidratasyonu önlemek için sol dışında tamamen kaldırılır. Bu sürecin bir sonucu olarak, emici kağıt siyanobakteriler hücreleri tarafından doymuş yağlardır. </li><li> Ince cımbız kullanarak, birkaç lif kağıt ayıklanır ve bir bardak gibi özel olarak hazırlanmış cam numune tutucu 7 altına yerleştirilir. Trityl BG-11 çözüm 8, 9, 3 mM (bkz: Programı 1) ince bir şırınga yardımıyla numune tutucu eklenir . Sahibi, daha sonra küçük bir hava çıkışı açık bırakarak, UV yapıştırıcı kullanarak mühürlü. <table border="1"><tbody><tr><td> Stok 4 </td><td> Stok 3 </td><td> Stok 2 </td><td> Stok 1 </td></tr><tr><td> H 3 BO 3 2.86g/liter </td><td> K 2 HPO 4: 3H 2 O 4.0g/liter </td><td> MgSO 4: 7H 2 O 7.5g/liter </td><td> Na 2 Mg EDTA 0.1g/liter </td></tr><tr><td> MnCl 2: 4H 2 O 1.81g/liter </td><td></td><td></td><td> Ferrik amonyum sitrat 0.6g/liter </td></tr><tr><td> ZnSO 4: 7H 2 O 0.222g/liter </td><td></td><td></td><td> Sitrik asit: 1H2O 0.6g/liter </td></tr><tr><td> CuSO 4: 5H 2 O 0.079g/liter </td><td></td><td></td><td> CaCl 2: 2H 2 O 3.6g/liter </td></tr><tr><td> COCl 2 : 6H 2 O 0.050g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaMoO 4: 2H 2 O 0.391g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Programı 1. BG-11 ortamın hazırlanması. </li></ol> 3. ESR Micro-görüntüleme Deneyler <ol><li> Görüntüleme deney başlamak için, ESR mikro görüntüleme sistemi açmak ve görüntüleme probu içine girdiğini rezonatör örnek eklemek. </li><li> Şimdi, bilgisayar kontrol yazılımı kullanarak, "Dinle" modunda sistem ve ESR ölçümleri için kullanılan prob rezonans mikrodalga frekans bulmak. </li><li> Ki, darbe dizisi için zamanlama parametrelerini ayarlamak, uygulanan mikrodalga frekans eşleşen değer statik manyetik alan ve emin olmak için ESR sinyali gözlemlemek ardından bu sistemi fonksiyonları ve örnek iyi hazırlanmış. </li><li> Sonra, piksel sayısını görüntüleme parametreleri, gradyanlar gücünü ve gerekli değerleri degrade bakliyat uzunluğu ayarlayın. </li><li> Kurulum sonrasında interpulse ayırma, değerleri  500, 600, 700 ns ile Hahn eko görüntüleme darbe dizisi (Şekil 4), üç 3D ESR görüntüleri toplamak. </li><li> Örnek olarak tahmin Işık gerekli deneysel koşullara bağlı olarak açık ya da kapalı. </li><li> Satın alma sırasında, veriler otomatik olarak kaydedilir. Tezler ham veri dosyaları sonra trityl radikal konsantrasyon ve gevşeme zamanı önceden varolan bir kalibrasyon ile bir oksijen konsantrasyonu görüntü çevrilmiştir T 2 harita görüntülerini sağlamak için Matlab yazılımı komut dosyası üzerinden işlenir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Deney sonuçlarının farklı τ değerleri kaydedilmiş üç boyutlu birkaç ESR mikro-görüntüleri. Tipik ham veri görüntüleri Şekil 5'te verilmektedir. Karanlık koşullar altında ölçülen en büyük üç fotoğraf, sinyal yoğunluğunda azalma dışında çok benzer. Öte yandan, örnek farklı yerlerinde farklı dinlenme süreleri nedeniyle ışık ışınlama altında görüntü düzeni değişir. Bu veriler, Şekil 6'da gösterildiği gibi ve aynı zamanda gevşeme zamanı, T 2 (Şekil 7) görüntüleri bir genlik görüntü elde etmek için 1 işlenmiş olabilir. T 2 görüntüleri denklemi üzerinden rahatlama zaman oksijen konsantrasyonu bağlantılar önceden varolan bir kalibrasyon eğrisi ile oksijen konsantrasyonu değerleri çevrilir: <img src="/files/ftp_upload/2122/2122eq.jpg" alt="Denklem 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Denklem 1"> Burada, T 2 0 prob spin-spin relaksasyon zamanı anoksik koşullar altında (prob konsantrasyon, C ve D difüzyon katsayısı bağlı olarak), ve k bir orantılılık sabittir. Çoğu durumda, difüzyon katsayısı (gerekirse, prensip olarak doğrudan ESR 6, 10 ile de değerlendirilebilir, fakat) canlı örnekler için çok değişmez, ve spin konsantrasyon görüntüleme işlemi sırasında elde edilir. Bu nedenle, bu ilişkiyi doğrudan oksijen konsantrasyonu ölçmek için kullanılabilir. Şekil 6 geri dönecek olursak, siyanobakteriler hücreler esas numune tutucu sağ tarafta yer olduğunu genlik görüntü açıktır. Ayrıca, Şekil 7 dayalı, ışık O 2 üretimi başlatır ve özellikle siyanobakteriler yakın vokseller, çözümün O 2 konsantrasyonunda önemli bir artışa neden olduğu açıktır. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1: elektron spin rezonans enerji seviyeleri. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2: Tipik bir Tümör taşıyan fare oksijen konsantrasyonu görüntü. MRI görüntü dayalı anatomik bilgi, soldaki görüntü gösterir. Kararlı bir serbest radikal organik fare enjekte ve kendi ESR özellikleri, çevresi (sağda), oksijen konsantrasyonu sağlar. ESR tabanlı sonuçları MRG anatomik görüntü üzerine bindirilmiş. Görüş alanı 32 mm. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3: yüksek çözünürlüklü mikro ölçekli ES iki örnekPhotolithographically N @ C 60 tozu (solda) ve LiPc paramanyetik kristalleri ile oluşturulan örnek R görüntüleri (sağda) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4: mikrodalga (MW) gösteren ve degrade, G x, G y ve G z bakliyat Tipik Hahn görüntüleme darbe dizisi <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5: Tipik ham veri ESR mikro görüntüler: a, b ve c = 500.600.700 ns sırasıyla τ ölçülen ışık aydınlatma cyanobacterium örnek ham veriler. Öğeler, d, e, ve a, b ve c gibi ama ışık aydınlatması ile aynıdır. Yoğunluğu keyfi ölçeğinde çizilmiştir (ancak, üç karanlık veya hafif ham veri görüntüleri her içinde tutarlı) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig6.jpg" alt="Şekil 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 6"> Şekil 6: Genlik radikal çözüm konsantrasyonu (keyfi ölçekli) karşılık gelen görüntü. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig7.jpg" alt="Şekil 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 7"> Şekil 7: T 2 görüntüler ve ilgili [O 2] değerleri koyu (solda) ve ışık koşulları altında (sağda).

<ol><li>Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-imaging+of+Oxygen+Concentration+near+Live+Photosynthetic+Cells+by+Electron+Spin+Resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Micro-imaging of Oxygen Concentration near Live Photosynthetic Cells by Electron Spin Resonance.</a> Biophysical Journal. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Blank, A., Suhovoy, E., Halevy, R., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESR+imaging+in+solid+phase+down+to+sub-micron+resolution%3A+methodology+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">ESR imaging in solid phase down to sub-micron resolution: methodology and applications.</a> J Phys Chem. 11, 6689-6699 (2009).</li>
<li>Gallez, B., Swartz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+EPR%3A+when%2C+how+and+why%3F%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">In vivo EPR: when, how and why?</a> NMR Biomed. 17, 223-225 (2004).</li>
<li>Eaton, G. R., Eaton, S. S., Ohno, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEaton%2C+GR+%22EPR+imaging+and+in+vivo+EPR%22">EPR imaging and in vivo EPR</a>. , CRC Press. Boca Raton. (1991).</li>
<li>Matsumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+imaging+of+tumor+oxygenation+and+microvascular+permeability+using+Overhauser+enhanced+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Simultaneous imaging of tumor oxygenation and microvascular permeability using Overhauser enhanced MRI.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 17898-17903 (2009).</li>
<li>Talmon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Diffusion+in+Porous+Media+by+PGSE%5BTitle%5D)+AND+%22ESR.+J+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular Diffusion in Porous Media by PGSE.</a> ESR. J Phys Chem. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Halevy, R., Talmon, Y., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolithographic+production+of+glass+sample+holders+for+improved+sensitivity+and+resolution+in+ESR+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">Photolithographic production of glass sample holders for improved sensitivity and resolution in ESR microscopy.</a> Applied Magnetic Resonance. 31, 591-598 (2007).</li>
<li>Allen, M. M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+Division+of+Some+Unicellular+Blue-Green+Algae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growth and Division of Some Unicellular Blue-Green Algae.</a> J Gen Microbiol. 51, 199-199 (1968).</li>
<li>Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generic+Assignments%2C+Strain+Histories+and+Properties+of+Pure+Cultures+of+Cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria.</a> J Gen Microbiol. 111, 1-61 (1979).</li>
<li>Blank, A., Talmon, Y., Shklyar, M., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+diffusion+in+liquid+phase+by+electron+spin+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Phys+Lett%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of diffusion in liquid phase by electron spin resonance.</a> Chem Phys Lett. 465, 147-152 (2008).</li>
</ol>

Bu protokol, ESR mikro-görüntüleme canlı küçük örnekler yanında oksijen konsantrasyonu haritaya nasıl uygulanabileceğini gösteriyor. Mekansal çözünürlükte ~ 30 x 30 x 100 mikron yakın mikromolar oksijen konsantrasyonu duyarlılık ve voksel başına alt femtomole mutlak oksijen hassasiyeti göstermiştir. ESR mikro görüntüleme kullanımı hücrelerin yakın oksijen haritalama için mikro elektrotlar veya fosforesans / floresan dayalı mevcut teknikleri tamamlar. Ayrıca, uygun paramanyetik probu ile, hücre içi oksijen mikro-görüntüleme, diğer yöntemlerle elde etmek için çok zor bir yeteneği kolayca uygulanabilir olacaktır. Yakın bir gelecekte, süper oksit konsantrasyonu, asitlik (pH), prob difüzyon katsayısı ve tabii ki, oksijen konsantrasyonu gibi kontrast parametreleri sağlayarak, daha birkaç mikron çözünürlüğü ile canlı örnek görüntüler elde etmek için bu metodoloji geliştirmek planlıyoruz. Bu yetenekler, kontrast tip açısından ve hem de örnekleri özellikleri (bazı durumlarda örneğin şeffaf olmayan kalın örnekleri, hücre içi vs. Ekstrasellüler ölçümler) mevcut optik tabanlı yöntemlere tamamlayıcı niteliktedir.

<table><tbody><tr><td>Santrifüj </td><td>Kendro</td><td>Heraus, 75003235</td><td></td></tr><tr><td>Perdeuterize triarilmetil (tritil) radikali</td><td>Novosibirsk</td><td></td><td>Referans &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; içinde açıklanan yöntem kullanılarak Novosibirsk'te sentezlenmiştir.</td></tr><tr><td>BG-11 tamponu</td><td></td><td></td><td>Hazırlama talimatları için Şema 1 ve referans 8, 9'a bakınız.</td></tr><tr><td>Şırınga</td><td>Hamilton Co</td><td>Microliter 7000.5</td><td></td></tr><tr><td>Ultraviyole Kürleme</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>NOA63 veya NOA61.</td><td></td></tr></tbody></table>

elektron spin rezonans oksijen haritalama için canlı türlerinin micro-görüntüleme

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

Bu protokol mikron ölçekli çözünürlük 1 canlı hücreleri derhal ortamda oksijen düzeyleri üç boyutlu haritalama için bir elektron spin rezonans (ESR) mikro görüntüleme yöntemi açıklamaktadır. Oksijen yaşam döngüsünde en önemli moleküllerden biridir. Mitokondride oksidatif fosforilasyon terminal elektron alıcısı olarak görür ve reaktif oksijen türlerinin üretiminde kullanılır. Oksijen ölçümleri, mitokondriyal ve metabolik fonksiyonları, sinyal yolları, çeşitli uyaranların, membran geçirgenlik ve hastalık farklılaşma etkisi çalışması için önemlidir. Oksijen tüketimi, bu nedenle, bütün organizmaların hücreleri mitokondri çeşitli biyolojik sistemler geniş uygulanabilir hücre metabolizması, bilgilendirici bir göstergedir. Önemi nedeniyle, pek çok yöntem canlı sistemlerde oksijen ölçümleri için geliştirilmiştir. Şu girişimleri yüksek çözünürlüklü oksijen görüntüleme sağlamak için, özellikle yüksek foto-toksisite ve düşük oksijen hassasiyeti problar istihdam olarak tatmin edici sonuçlar sağlamak için başarısız optik floresans ve fosforesans yöntemleri dayanmaktadır. ESR, örnek dışsal paramanyetik probları sinyal ölçer, oksijen konsantrasyonu çok hassas ölçümler sağlamak için bilinir. Tipik bir vakada, ESR ölçümleri prob lineshape genişletilmesi ve / veya yerel oksijen konsantrasyonu doğrudan bağlantılı olan dinlenme süresini kısaltarak haritası. (Oksijen paramanyetik; bu nedenle, dışsal paramanyetik probu ile çarpışan, onun rahatlama kez darlığı.) Geleneksel olarak, bu tür deneyler, düşük çözünürlüklü, küçük hayvanlar görüntüleme için milimetre çaplı ESR ile yürütülmektedir. Burada da küçük canlı örneklerin incelenmesi için ESR görüntüleme mikron ölçeğinde yapılmalıdır nasıl göstermektedir. ESR mikro görüntüleme, oda sıcaklığında 2 1 mikron yaklaşan bir çözünürlük ile mekansal çözüme ESR sinyalleri toplanmasını sağlayan nispeten yeni bir metodoloji . Bu protokol kağıt ana amacı, bu yeni yöntem, yeni geliştirilen oksijen duyarlı problar ile birlikte, küçük canlı örneklerinde oksijen düzeyleri haritalama uygulanabilir nasıl göstermektir. Mekansal çözünürlükte ~ 30 x 30 x 100 mikron yakın mikromolar oksijen konsantrasyonu duyarlılık ve voksel başına alt femtomole mutlak oksijen hassasiyeti göstermiştir. ESR mikro görüntüleme kullanımı hücrelerin yakın oksijen haritalama için mikro elektrotlar veya fosforesans / floresan dayalı mevcut teknikleri tamamlar. Ayrıca, uygun paramanyetik probu ile, aynı zamanda hücre içi oksijen mikro-görüntüleme, diğer yöntemlerle elde etmek için çok zor bir yeteneği kolayca uygulanabilir olacaktır.

Bu protokol, elektron spin rezonans mikroskobu ile canlı hücreler hemen ortamda oksijen konsantrasyonu mikron ölçekli üç boyutlu görüntüleme için bir yöntem açıklanır.

Elektron Spin Rezonans Oksijen Haritalama için Canlı Türlerinin Micro-görüntüleme

Bu protokol, ... yakın çevresindeki oksijen seviyelerinin üç boyutlu haritalanması için bir elektron spin rezonans (ESR) mikro-görüntüleme yöntemini açıklamaktadır.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, elektron spin rezonansı veya ESR mikroskobisi ile canlı hücrelerin yakın çevresindeki oksijen konsantrasyonunun mikron ölçekli, üç boyutlu görüntülerini elde etmektir. Protokol, yaygın fotosentetik hücreler olan siyanobakteriler üzerinde gösterilecektir. Bu işlem, öncelikle ESR mikroskobisi numune tutucu içerisinde bir siyanobakteri hücresi örneği hazırlanarak gerçekleştirilir.Stabil bir organik radikal çözeltisine gömülmüştür. Numune tutucu, ESR mikroskop sisteminin statik elektromıknatısının içine giren görüntüleme probunun içine yerleştirilir. Ardından, ESR mikroskobu tarafından organik radikal çözeltisinin birkaç üç boyutlu ESR mikro görüntüsü elde edilir.Bu işlem, çeşitli darbe dizisi varyantları için ve sıklıkla ışıklı ve karanlık ortamlar gibi çeşitli dış koşullar altında gerçekleştirilir. Ardından, radikalin üç boyutlu uzaysal olarak çözünürleştirilmiş relaksasyon sürelerini çıkarmak amacıyla ham veri görüntüleri bilgisayar tarafından işlenir. Bu relaksasyon süreleri, önceden yapılmış kalibrasyon aracılığıyla oksijen konsantrasyonuna dair doğrudan bir ölçüm sağlayarak, ölçülen numunelerin çeşitli dış koşullar altındaki tam üç boyutlu oksijen haritalarının oluşturulmasına imkan tanır.Siyanobakterilerin ışık uygulanmadığında oksijen üretmediğini açıkça gösteren sonuçlar elde edilmiştir. Ayrıca, ışık ışınlaması altında, siyanobakteri hücrelerinin yakınında belirgin bir oksijen gradyanı ve oksijen heterojenliği oluştuğu gösterilmiştir. Merhaba, ben Haifa'daki Technion, İsrail Teknoloji Enstitüsü Kimya Fakültesi BLA laboratuvarından al.Bugün size, yakın alan mikroskobisi aracılığıyla canlı hücrelerin yakınındaki oksijen konsantrasyonlarının yüksek uzamsal çözünürlükte üç boyutlu olarak haritalanması için kullanılan bir prosedürü göstereceğiz. Laboratuvarımızda hücrelerin oksijen tüketim hızını ve metabolik aktivitesini incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Hadi başlayalım.Elektron spin rezonansı veya ESR, dış statik bir manyetik alan altına yerleştirilmiş eşleşmemiş elektron spinine sahip paramanyetik türler tarafından belirli bir frekanstaki elektromanyetik radyasyonun absorbe edildiği spektroskopik bir tekniktir. Oksijen ve reaktif oksijen türlerinin konsantrasyonları da dahil olmak üzere, canlı türlerdeki paramanyetik moleküllerin ortamını incelemek için güçlü bir yöntemdir. Burada, heterojen örnekler için tümör taşıyan bir farenin tipik bir oksijen konsantrasyon görüntüsü gösterilmektedir.ESR spektral bilgileri, manyetik alan gradyanları kullanılarak mekansal olarak çözünür bir biçimde elde edilebilir. Fareye kararlı, serbest, organik bir radikal enjekte edilmiş olup, bunun ESR özellikleri çevresindeki oksijen konsantrasyonunu sağlamaktadır. ESR tabanlı sonuçlar, bir MRI anatomik görüntüsü üzerine bindirilmiştir.Şimdiye kadar, canlı örneklerin bu tür ESR görüntüleme teknikleri yalnızca milimetre ölçeğindeki nispeten büyük örneklerle gerçekleştirilmiştir. Çözünürlüklü ESR mikroskobisi, milimetre ve milimetre altı boyutlardaki örneklerin ölçümlerini içererek bir mikrona yaklaşan çözünürlükte üç boyutlu ESR görüntüleri sağlar.Burada, NNC 60 tozu ve lityum ferrosiyanür paramanyetik kristalleri ile hazırlanmış örneklerin yüksek çözünürlüklü mikron ölçekli ESR görüntülerinden iki örnek yer almaktadır. Bir ESR mikroskobu, statik alanı oluşturmak için bir mıknatısa, spin eksitasyonu ve sinyal tespiti için bir mikrodalga sistemine, numuneyi tutmak için bir proba ve veri toplama sürecini ve veri işlemeyi kontrol eden bilgisayarlı bir konsola sahip olması bakımından geleneksel bir ESR spektrometresine benzer. Sistemin diğer bileşenleri arasında elektronik sistemin bir parçası olan manyetik alan gradyan sürücüleri ve görüntüleme probunda yer alan gradyan bobinleri bulunur.Gradyan bobinleri ayrıca, numunenin ışıkla ışınlanmasına olanak tanıyan bir açıklığa sahiptir. Deney sırasında minimumdehidrasyon sağlamak için numuneye kontrollü sıcaklıkta nemli hava uygulanır. ESR mikroskobisinin temel ayırt edici özellikleri; probun ve gradyan bobinlerinin küçük boyutu, sistemin daha yüksek spin hassasiyeti ve manyetik alan gradyan sürücülerinin yüksek gücüdür. Bu prosedüre başlamadan önce, 40 mg/mL konsantrasyonda bir siyanobakteri süspansiyonu hazırlayın.ESR mikro görüntüleme numune hazırlığına başlamak için, ince cımbız kullanarak yaklaşık 400 x 400 mikron boyutunda birkaç adet emici kağıt kare alın. Ardından bunları bir einor tüpüne yerleştirin. Sonrasında tüpü 1.2 millilitersiyan siyanobakteri süspansiyonu ile doldurun.Ardından, süspansiyonu bir mikro santrifüjde 6.000 RPM'de iki dakika boyunca santrifüjleyin; santrifüjleme sonrası, siyanobakterilerin susuz kalmasını önlemek amacıyla yaklaşık 50 µL kalacak şekilde süpernatantı tamamen uzaklaştırın. Bu işlem, emici kağıdın siyanobakteri hücreleri ile doyurulmasını sağlar. Daha sonra, özel olarak hazırlanmış bardak şeklinde bir numune tutucu hazırlayın, ince bir cımbız kullanarak kağıttan birkaç fiber çıkarın ve bunları numune tutucunun tabanına yerleştirin.Ardından, yazılı protokolde açıklandığı şekilde hazırlanan 3 mM tridel ve BG 11 çözeltisinden bir şırınga yardımıyla ekleyin. Daha sonra, cam numune tutucunun kenarları ile ona uygun kapak camı parçası arasına yapıştırıcı uygulayarak numune tutucuyu UV ile kürlenebilir yapıştırıcı ile mühürleyin ve küçük bir hava çıkışını açık bırakın. Son olarak, yapıştırıcıyı 2 saniye boyunca UV ışığı ile kürleyin.Görüntüleme deneyine başlamak için ESR mikro görüntüleme sistemini açın ve numuneyi görüntüleme probunun içine yerleştirilen rezonatöre yerleştirin. Şimdi bilgisayar kontrol yazılımını kullanarak sistemi ayar moduna getirin ve ESR ölçümleri için kullanılacak olan probun rezonans mikrodalga frekansını bulun. Bunu takiben, statik manyetik alanı uygulanan mikrodalga frekansıyla eşleşen değere ayarlayın.Sistemin düzgün çalıştığından ve numunenin iyi hazırlandığından emin olmak için darbe dizisinin zamanlama parametrelerini ayarlayın ve ESR sinyalini gözlemleyin. Ardından piksel sayısı, gradyanların gücü ve gradyan darbelerinin uzunluğu gibi görüntüleme parametrelerini gerekli değerlere ayarlayın. Kurulumun ardından, 500 600 ve 700 nanosaniyelik darblar arası ayırma tau değerlerine sahip bir Hahn Echo Imaging darbe dizisi ile üç adet 3D ESR görüntüsü toplayın.Bu noktada, eğer deney koşulları boyunca gerekiyorsa numune üzerindeki ışık projeksiyonunu açın; veriler otomatik olarak kaydedilir. Veri toplama işleminin ardından, ham veri dosyaları MATLAB yazılım betiği aracılığıyla işlenir. Yazılımı kullanarak trill radikal konsantrasyonu ve relaksasyon süresinin görüntülerini oluşturun.T iki haritasını oluşturun ve ardından bu görüntüleri, oksijen konsantrasyonunu relaksasyon süresine bağlayan önceden mevcut bir kalibrasyon eğrisi aracılığıyla oksijen konsantrasyonu görüntüsüne dönüştürün. Burada T iki sıfır, probların konsantrasyonu C ve difüzyon katsayısı D'ye bağlı olarak, anoksik koşullar altındaki probun spin-spin relaksasyon süresidir. Siyanobakteriler üzerinde gerçekleştirilen birkaç üç boyutlu ESR görüntüleme deneyinden elde edilen tipik ham veri görüntüleri gösterilmiştir. Bu görüntüler, karanlık veya aydınlık koşullar altında farklı tau değerleri ile elde edilmiştir.Karanlık koşullar altında, spin gevşeme süresi T₂ nedeniyle daha büyük T değerleri için yoğunluğun azalması dışında sonuçlar birbirine çok benzerdir. Buna karşılık, ışık ışınlaması altında, numune genelindeki farklı gevşeme süreleri nedeniyle görüntü deseni değişir. Bu veriler daha sonra, bu görüntüden bir genlik görüntüsü elde etmek için işlenir.Siyanobakterilerin temel olarak numune tutucunun sağ tarafında yer aldığı görülmektedir. İki görüntü, oksijen konsantrasyonunu relaksasyon süresine bağlayan mevcut bir kalibrasyon eğrisi aracılığıyla oksijen konsantrasyon değerlerine dönüştürülür. Sonuçlar, siyanobakteriler için ışık varlığında ve yokluğunda gösterilmiştir.Oksijen üretiminin ışıkla başladığı ve çözelti oksijen konsantrasyonunda önemli bir artışa neden olduğu açıkça görülmektedir. Bu durum, temel olarak siyanobakterili emici kağıt liflerinin yakınındaki voksellelerde, radikal T iki değerinde bir azalmaya yol açar. E ESR mikroskobu ile oksijen konsantrasyonunu haritalamak amacıyla, stabil serbest radikallere sahip canlı hücreler içeren bir örneğin nasıl hazırlanacağını size göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, S değişkenliğini sağlamak ve örneğin bozulmasını önlemek için işlemin mümkün olduğunca kısa tutulması gerektiğini hatırlamak önemlidir.İşte böyle. Bizi izlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.

electron-spin-resonance-micro-imaging-live-species-for-oxygen

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu teknik, canlı moleküler karakterizasyonu için yüksek çözünürlüklü sihirli açısı proton MR spektroskopi (HRMAS 1H-MRS) iplik kullanımını...

Canlı Manyetik Rezonans Spektroskopisi Drosophila melanogaster Magic Açısı İplik kullanarak

Elektron paramanyetik rezonans (EPR) spektroskopisi demir (II)-N-metil-D-glukamin ditiokarbamat, Fe (MGD) kullanılarak, insan nötrofil gelen sığır aort endotelyal hücreler ve süperoksit anyon radikal nitrik oksit tespit etmek için...

Nitrik Oksit ve hücreler arası Elektron Paramanyetik Rezonans Spektroskopisi ile süperoksit Radikal Anyon tespiti Spin Tuzakları kullanarak

Floresan etiketli otofaji belirteçlerin zaman atlamalı mikroskopi yüksek temporal çözünürlük ile dinamik otofaji yanıt izleme sağlar. 3 farklı renklerin bir kombinasyonu belirli Otofaji ve organel belirteçleri kullanarak, güçlü bir mekansal ve zamansal bağlamda autophagosome oluşumuna bir protein katkısı takip edebilir.

Erken Otofaji Etkinlikler Hücre Görüntüleme Canlı: Omegasomes ve Ötesi

Yeni bir elektron para-manyetik rezonanstır (EPR) yöntemi, hızlı tarama EPR (RS-EPR), geleneksel bir sürekli dalga (CW) teknikten üstün ve in vivo görüntüleme için yeni alanları açar 2B spektral mekansal görüntüleme için gösterilmiştir. Sonuçlar 250 MHz'de gösterilmiş, ancak teknik herhangi bir frekansta uygulanabilir.

Hızlı Tarama Elektron Paramagnetik Rezonans Görüntüleme Fizyolojik Önemli Parametreler için Yeni bulvarlar açar<em&gt; İn Vivo</em

Optik sensör folyoları ile 2D O2 dağıtımlarının haritalama için yeni, frekans etki alanı parlaklık ömür boyu kamera kullanımını anlatıyoruz. Kamera sistemi ve görüntü analizi prosedürleri, su bitkilerinin rizosferinde O2 mikro ortamının görselleştirilmesi için sensör folyolarının hazırlanması, kalibrasyonu ve uygulanması ile birlikte açıklanmıştır.

Frekans-Etki Alanı Tabanlı Kamera Sistemi ile O2'nin Lüminesans Yaşam Boyu Görüntülemesi

Protokol, standart bir floresan mikroskobunda oksijenasyonlarının ve hücre ölümlerinin çok parametrik analizini kullanarak biyobaskı için yüksek verimli sferoid üretimini tanımlar. Bu yaklaşım, sferoidlerin yaşayabilirliğini kontrol etmek ve 3D doku, tümör mikroçevresi ve başarılı (mikro) doku biyofabrikasyonunun modellenmesinde önemli olan standardizasyonu gerçekleştirmek için uygulanabilir.

Çok Hücreli Sferoidlerin Uygun Fiyatlı Oksijen Mikroskobu Destekli Biyofabrikasyonu

Bu yazıda, uzun bozunma yayan numunelerin makroskopik fotolüminesans ömür boyu görüntülenmesi için yeni, hızlı bir optik görüntüleyicinin kullanımı açıklanmaktadır. Entegrasyon, görüntü toplama ve analiz prosedürleri, görüntüleme için sensör malzemelerinin hazırlanması ve karakterizasyonu ve görüntüleyicinin biyolojik numunelerin incelenmesinde uygulanması ile birlikte açıklanmaktadır.

Biyomedikal Uygulamalar için Floresan Ömür Boyu Makro Görüntüleyici

İki foton uyarma floresan mikroskobu (2PEF) ile entegre olan döteryum-oksit (ağır suD2O) problu uyarılmış Raman saçılımı (DO-SRS) mikroskobu kullanılarak amino asitler tarafından düzenlenen hücrelerdeki metabolik aktiviteleri doğrudan görselleştirmek için bir protokol sunuyoruz.

Aromatik Amino Asitler Tarafından Düzenlenen Hücre Metabolizmasının Biyoortogonal Kimyasal Görüntülenmesi

Murin tümörlerinin kantitatif 3D oksijen haritaları, Pulse Elektron Paramanyetik Rezonans kullanılarak noninvaziv olarak görüntülendi. Anatomi ve vasküler yapı için ultrason B-mod ve Power Doppler kullanıldı. Her iki modaliteden alınan görüntüler üst üste bindirilerek multi-parametrik tümör analizi sağlandı.

Tümör Hipoksi Değerlendirmesi: Elektron Paramanyetik Rezonans ile İn Vivo 3D Oksijen Görüntüleme 

Etiketsiz optik görüntüleme modalitelerini birleştiren çok modlu bir platform kullanarak, hücresel dinamikleri ve metabolizmayı görselleştirmek ve ölçmek için bir protokol geliştirdik. Çoklu foton floresansı, ikinci harmonik üretimi ve uyarılmış Raman saçılma mikroskobu yoluyla görüntüleme yoluyla, hücresel ve moleküler çevreye bütünsel bir genel bakış oluşturabiliriz.

Hücresel metabolizmayı incelemek için multimodal optik görüntüleme platformu

Beyin örneklerindeki tüm hücrelerin mezoscale olarak tarafsız görüntülenmesini sağlayan ve aynı örnekte bant tabanlı seri taramalı elektron mikroskopisinin görüntüleme iş akışına sorunsuz entegre edilebilen Optik Çok Katmanlı Girişim Tomografisi (OMLIT) adlı yeni bir görüntüleme tekniği tanıttık.

Mezoskopik Tüm Hücreli Beyin Haritalama İçin Taramalı Elektron Mikroskopi Uyumlu Optik Görüntüleme Yöntemi

Öğrenin, canlı hücrelerin çevresindeki oksijen konsantrasyonunu mikron ölçeğinde üç boyutlu haritalamak için elektron spin rezonans mikroskobisi kullanmayı. Bu yöntem siyanobakterilerde fotosentez aktivitesini incelemek için uygulanır.

Elektron Spin Rezonans Oksijen Haritalama için Canlı Türlerinin Micro-görüntüleme

Daha fazla video keşfet