Elektron Spin Rezonans Oksijen Haritalama için Canlı Türlerinin Micro-görüntüleme

Aşağıdaki deneyin genel amacı, elektron spin rezonansı veya ESR mikroskobisi ile canlı hücrelerin yakın çevresindeki oksijen konsantrasyonunun mikron ölçekli, üç boyutlu görüntülerini elde etmektir. Protokol, yaygın fotosentetik hücreler olan siyanobakteriler üzerinde gösterilecektir. Bu işlem, öncelikle ESR mikroskobisi numune tutucu içerisinde bir siyanobakteri hücresi örneği hazırlanarak gerçekleştirilir.

Stabil bir organik radikal çözeltisine gömülmüştür. Numune tutucu, ESR mikroskop sisteminin statik elektromıknatısının içine giren görüntüleme probunun içine yerleştirilir. Ardından, ESR mikroskobu tarafından organik radikal çözeltisinin birkaç üç boyutlu ESR mikro görüntüsü elde edilir.

Bu işlem, çeşitli darbe dizisi varyantları için ve sıklıkla ışıklı ve karanlık ortamlar gibi çeşitli dış koşullar altında gerçekleştirilir. Ardından, radikalin üç boyutlu uzaysal olarak çözünürleştirilmiş relaksasyon sürelerini çıkarmak amacıyla ham veri görüntüleri bilgisayar tarafından işlenir. Bu relaksasyon süreleri, önceden yapılmış kalibrasyon aracılığıyla oksijen konsantrasyonuna dair doğrudan bir ölçüm sağlayarak, ölçülen numunelerin çeşitli dış koşullar altındaki tam üç boyutlu oksijen haritalarının oluşturulmasına imkan tanır.

Siyanobakterilerin ışık uygulanmadığında oksijen üretmediğini açıkça gösteren sonuçlar elde edilmiştir. Ayrıca, ışık ışınlaması altında, siyanobakteri hücrelerinin yakınında belirgin bir oksijen gradyanı ve oksijen heterojenliği oluştuğu gösterilmiştir. Merhaba, ben Haifa'daki Technion, İsrail Teknoloji Enstitüsü Kimya Fakültesi BLA laboratuvarından al.

Bugün size, yakın alan mikroskobisi aracılığıyla canlı hücrelerin yakınındaki oksijen konsantrasyonlarının yüksek uzamsal çözünürlükte üç boyutlu olarak haritalanması için kullanılan bir prosedürü göstereceğiz. Laboratuvarımızda hücrelerin oksijen tüketim hızını ve metabolik aktivitesini incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Hadi başlayalım.

Elektron spin rezonansı veya ESR, dış statik bir manyetik alan altına yerleştirilmiş eşleşmemiş elektron spinine sahip paramanyetik türler tarafından belirli bir frekanstaki elektromanyetik radyasyonun absorbe edildiği spektroskopik bir tekniktir. Oksijen ve reaktif oksijen türlerinin konsantrasyonları da dahil olmak üzere, canlı türlerdeki paramanyetik moleküllerin ortamını incelemek için güçlü bir yöntemdir. Burada, heterojen örnekler için tümör taşıyan bir farenin tipik bir oksijen konsantrasyon görüntüsü gösterilmektedir.

ESR spektral bilgileri, manyetik alan gradyanları kullanılarak mekansal olarak çözünür bir biçimde elde edilebilir. Fareye kararlı, serbest, organik bir radikal enjekte edilmiş olup, bunun ESR özellikleri çevresindeki oksijen konsantrasyonunu sağlamaktadır. ESR tabanlı sonuçlar, bir MRI anatomik görüntüsü üzerine bindirilmiştir.

Şimdiye kadar, canlı örneklerin bu tür ESR görüntüleme teknikleri yalnızca milimetre ölçeğindeki nispeten büyük örneklerle gerçekleştirilmiştir. Çözünürlüklü ESR mikroskobisi, milimetre ve milimetre altı boyutlardaki örneklerin ölçümlerini içererek bir mikrona yaklaşan çözünürlükte üç boyutlu ESR görüntüleri sağlar.

Burada, NNC 60 tozu ve lityum ferrosiyanür paramanyetik kristalleri ile hazırlanmış örneklerin yüksek çözünürlüklü mikron ölçekli ESR görüntülerinden iki örnek yer almaktadır. Bir ESR mikroskobu, statik alanı oluşturmak için bir mıknatısa, spin eksitasyonu ve sinyal tespiti için bir mikrodalga sistemine, numuneyi tutmak için bir proba ve veri toplama sürecini ve veri işlemeyi kontrol eden bilgisayarlı bir konsola sahip olması bakımından geleneksel bir ESR spektrometresine benzer. Sistemin diğer bileşenleri arasında elektronik sistemin bir parçası olan manyetik alan gradyan sürücüleri ve görüntüleme probunda yer alan gradyan bobinleri bulunur.

Gradyan bobinleri ayrıca, numunenin ışıkla ışınlanmasına olanak tanıyan bir açıklığa sahiptir. Deney sırasında minimumdehidrasyon sağlamak için numuneye kontrollü sıcaklıkta nemli hava uygulanır. ESR mikroskobisinin temel ayırt edici özellikleri; probun ve gradyan bobinlerinin küçük boyutu, sistemin daha yüksek spin hassasiyeti ve manyetik alan gradyan sürücülerinin yüksek gücüdür. Bu prosedüre başlamadan önce, 40 mg/mL konsantrasyonda bir siyanobakteri süspansiyonu hazırlayın.

ESR mikro görüntüleme numune hazırlığına başlamak için, ince cımbız kullanarak yaklaşık 400 x 400 mikron boyutunda birkaç adet emici kağıt kare alın. Ardından bunları bir einor tüpüne yerleştirin. Sonrasında tüpü 1.2 millilitersiyan siyanobakteri süspansiyonu ile doldurun.

Ardından, süspansiyonu bir mikro santrifüjde 6.000 RPM'de iki dakika boyunca santrifüjleyin; santrifüjleme sonrası, siyanobakterilerin susuz kalmasını önlemek amacıyla yaklaşık 50 µL kalacak şekilde süpernatantı tamamen uzaklaştırın. Bu işlem, emici kağıdın siyanobakteri hücreleri ile doyurulmasını sağlar. Daha sonra, özel olarak hazırlanmış bardak şeklinde bir numune tutucu hazırlayın, ince bir cımbız kullanarak kağıttan birkaç fiber çıkarın ve bunları numune tutucunun tabanına yerleştirin.

Ardından, yazılı protokolde açıklandığı şekilde hazırlanan 3 mM tridel ve BG 11 çözeltisinden bir şırınga yardımıyla ekleyin. Daha sonra, cam numune tutucunun kenarları ile ona uygun kapak camı parçası arasına yapıştırıcı uygulayarak numune tutucuyu UV ile kürlenebilir yapıştırıcı ile mühürleyin ve küçük bir hava çıkışını açık bırakın. Son olarak, yapıştırıcıyı 2 saniye boyunca UV ışığı ile kürleyin.

Görüntüleme deneyine başlamak için ESR mikro görüntüleme sistemini açın ve numuneyi görüntüleme probunun içine yerleştirilen rezonatöre yerleştirin. Şimdi bilgisayar kontrol yazılımını kullanarak sistemi ayar moduna getirin ve ESR ölçümleri için kullanılacak olan probun rezonans mikrodalga frekansını bulun. Bunu takiben, statik manyetik alanı uygulanan mikrodalga frekansıyla eşleşen değere ayarlayın.

Sistemin düzgün çalıştığından ve numunenin iyi hazırlandığından emin olmak için darbe dizisinin zamanlama parametrelerini ayarlayın ve ESR sinyalini gözlemleyin. Ardından piksel sayısı, gradyanların gücü ve gradyan darbelerinin uzunluğu gibi görüntüleme parametrelerini gerekli değerlere ayarlayın. Kurulumun ardından, 500 600 ve 700 nanosaniyelik darblar arası ayırma tau değerlerine sahip bir Hahn Echo Imaging darbe dizisi ile üç adet 3D ESR görüntüsü toplayın.

Bu noktada, eğer deney koşulları boyunca gerekiyorsa numune üzerindeki ışık projeksiyonunu açın; veriler otomatik olarak kaydedilir. Veri toplama işleminin ardından, ham veri dosyaları MATLAB yazılım betiği aracılığıyla işlenir. Yazılımı kullanarak trill radikal konsantrasyonu ve relaksasyon süresinin görüntülerini oluşturun.

T iki haritasını oluşturun ve ardından bu görüntüleri, oksijen konsantrasyonunu relaksasyon süresine bağlayan önceden mevcut bir kalibrasyon eğrisi aracılığıyla oksijen konsantrasyonu görüntüsüne dönüştürün. Burada T iki sıfır, probların konsantrasyonu C ve difüzyon katsayısı D'ye bağlı olarak, anoksik koşullar altındaki probun spin-spin relaksasyon süresidir. Siyanobakteriler üzerinde gerçekleştirilen birkaç üç boyutlu ESR görüntüleme deneyinden elde edilen tipik ham veri görüntüleri gösterilmiştir. Bu görüntüler, karanlık veya aydınlık koşullar altında farklı tau değerleri ile elde edilmiştir.

Karanlık koşullar altında, spin gevşeme süresi T₂ nedeniyle daha büyük T değerleri için yoğunluğun azalması dışında sonuçlar birbirine çok benzerdir. Buna karşılık, ışık ışınlaması altında, numune genelindeki farklı gevşeme süreleri nedeniyle görüntü deseni değişir. Bu veriler daha sonra, bu görüntüden bir genlik görüntüsü elde etmek için işlenir.

Siyanobakterilerin temel olarak numune tutucunun sağ tarafında yer aldığı görülmektedir. İki görüntü, oksijen konsantrasyonunu relaksasyon süresine bağlayan mevcut bir kalibrasyon eğrisi aracılığıyla oksijen konsantrasyon değerlerine dönüştürülür. Sonuçlar, siyanobakteriler için ışık varlığında ve yokluğunda gösterilmiştir.

Oksijen üretiminin ışıkla başladığı ve çözelti oksijen konsantrasyonunda önemli bir artışa neden olduğu açıkça görülmektedir. Bu durum, temel olarak siyanobakterili emici kağıt liflerinin yakınındaki voksellelerde, radikal T iki değerinde bir azalmaya yol açar. E ESR mikroskobu ile oksijen konsantrasyonunu haritalamak amacıyla, stabil serbest radikallere sahip canlı hücreler içeren bir örneğin nasıl hazırlanacağını size göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, S değişkenliğini sağlamak ve örneğin bozulmasını önlemek için işlemin mümkün olduğunca kısa tutulması gerektiğini hatırlamak önemlidir.

İşte böyle. Bizi izlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.