Enterik Sinir Sistemi Alpha-sinüklein İçermelerin bir sonda ve Görüntü Analizi kullanarak Rotenone Oral İdaresi

Motor ve konuşma disfonksiyonu da dahil olmak üzere Parkinson hastalığının semptomları, beyindeki dopamin salgılayan hücrelerin aktivitesinin azalmasından kaynaklanır. Enterik sinir sistemi ve koku soğancığı en çok maruz kalan ve ilk etkilenen sinir yapılarıdır. Parkinson hastalığı, pestisit maruziyeti ile ilişkilendirilmiştir.

Pestisitlerin enterik sinir sistemi üzerindeki etkilerini analiz etmek için, pestisit roone farelere oral gavaj yoluyla uygulanır. Fareler daha sonra% 4 paraform, aldehit beyin ve enterik sinir sistemi ile intrakardiyak perfüze edilir. Doku ekstrakte edilir, hazırlanır ve PD ile ilişkili proteinler için immün boyalanır.

Konfokal mikroskopi ile elde edilen beta üç tübülin ve alfa sinüklein görüntüleri, pestisitlere maruz kalan hayvanlarda enterik sinir sistemi nöronları içinde alfa sinüklein birikimini göstermektedir. Bu tekniğin, rotenonun sistemik uygulaması gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, bu tekniği kullanarak, rotenonun etkisinin enterik sinir sistemi ile sınırlı olmasının sağlanmasıdır. Bu yöntem, Parkinson hastalığında etiyolojisi ve ilerlemesinin altında yatan mekanizmalar gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin sonuçları, yeni terapötik hedeflerin ve tanı yöntemlerinin geliştirilmesine izin vereceği için kule tedavisini ve Parkinson hastalığının teşhisini genişletir. Bu yöntem Parkinson hastalığının patofizyolojisi hakkında bilgi sağlayabilse de, diğer çevresel toksinlerin enterik, sempatik ve parasempatik sinir sistemleri ile bağırsak duvarı üzerindeki etkisinin incelenmesi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Genel olarak, bu yöntemlere yeni olan kişiler, gavajda ustalaşmak biraz zaman aldığı için mücadele edeceklerdir.

Bu yöntemler hakkında ilk olarak pestisitler ve Parkinson hastalığı arasındaki bağlantıyı okuduğumda aklıma geldi. 2005 yılında Berlin'de düzenlenen Dünya Parkinson Kongresi'nde yüksek CORAs konferansını görmek de yardımcı oldu. Bu yöntemin barışçıl bir şekilde gösterilmesi gereklidir.

Fareler insanlardan farklı bir anatomiye sahip oldukları için ol'ü gavaj ile uygulama yöntemi zordur, diğer tarafta bu görüntüler için özelleştirilmiş adımlarla görüntü analizi yapılmıştır. Hayvanı tartarak protokole başlayın. Uygun rotenon hacmini hesaplayın.

Hayvan ağırlığının gramı başına 0.01 mililitre gereklidir, bu da kilogram Roone dozu başına beş miligrama karşılık gelir. Bir mililitrelik bir şırıngayı roone solüsyonu ile şarj edin, ardından ikinci bir şırıngayı araç solüsyonu ile şarj edin. Fareyi kaldırın ve bir elinizle farenin kuyruğunu tutun.

Boynun derisini diğer elinizin ilk iki parmağıyla çekerek gerin. Baş iki parmak arasına sabitlendikten sonra, avucunuzun içine yaslayın ve ters çevirin. Kuyruğu düzelt.

Dördüncü ve beşinci parmakları kullanarak, başı arkaya doğru tutarak, farenin ağzını açmak için damağa bastırın. Gavajı nazikçe ağzına sokun. Gavajı, tam uzunluğu yerleştirilene kadar mide yönünde yavaşça hareket ettirin.

Materyalin akciğerlere girmesini önlemek için, emboliye hafifçe basarak roone solüsyonunu veya aracı uygulayın. Tamamlandığında, gavajı yavaşça çıkarın, bir kafesteki tüm hayvanlar bitene kadar hayvanı başka bir kafese geri koyun. Tedaviyi takiben fareler% 4 paraform aldehit ile intrakardiyak olarak takviye edilir.

PBS'de bağırsaklar daha sonra diseksiyon ile ekstrakte edilir ve gece boyunca% 15 sükroz içine yerleştirilir. Ertesi gün, doku% 30 sükroza aktarılır ve gece boyunca dört santigrat derecede tekrar inkübe edilir. Doku daha sonra eksi 80 derecelik bir dondurucuya yerleştirilir ve 20 mikronluk bir kriyostat kullanılarak kullanıma kadar saklanır.

Kesitler rost slaytlarına, blokaj ve immün boyama prosedürlerine aktarılır. Daha sonra anti beta, üç tübülin ve Antifa sinüklein antikorları kullanılarak gerçekleştirilir. Harici bir kişinin verilerin kör bir analizini yapması önerilir.

Analize başlamak için Fiji yazılımını açın. Konfokal görüntü dosyasını açın. Ardından kanalları, her kanal üzerinde bağımsız olarak çalışacak şekilde mümkün olduğunca bölün.

Kullanılmayacak kanalları kapatın ve piksel boyutunu seçin, analiz edin, ayarlayın, ölçeklendirin ve piksel boyutunu bir olarak ayarlayın. Bilinen mesafeyi 0.13 olarak ayarlayın ve global'e tıklayın. Görüntünün boyutu artık mikron cinsinden gösterilecektir.

Alfa sinüklein kanalını seçin ve ganglionu seçin. Seçimin ganglionu tüm dilimlerde çevrelediğinden emin olun. Görüntüyü, ganglion seçiliyken çoğaltın, yalnızca gangliyonun boyutundaki bir görüntü çoğaltılır.

Düzenle'ye basın, görüntünün dışında kalan kısmı temizle, seçilen bölge siyah olur. Prosedürün ne kadar iyi gittiğini belirlemek için görüntüyü yeniden çoğaltın. Sinyal-arka plan gürültüsü oranı düşük olan görüntüler, görüntü analizi için kullanılmamalıdır.

Görüntü ayarlama eşiğini seçin. Ardından maksimum entropiyi seçin. Ardından, prosedürün iyi gittiğinden emin olmak için kırpılan görüntüdeki dilimlerin ve orijinal olanın üzerine gidin.

Tropik eşik, görüntü histogramına dayalı olarak bir yoğunluk sinyali seviyesi seçer ve yalnızca bu eşikten daha yüksek yoğunluklara sahip pikseller, siyah üzerine beyaz görüntü seçme işleminde görüntülenecektir. Ardından pürüzsüz'e tıklayın. Bu adım, görüntülerin pikselli kenarlarını düzgün kenar seçme işlemine dönüştürür.

Ardından ikiliye tıklayın ve İkili yap'ı seçin. Görüntü, çoğaltılan görüntü üzerinde bir sonraki adımı gerçekleştirmek için beyaz görüntü üzerinde siyah bir görüntü olarak görüntülenecektir, analiz et'e tıklayın, parçacıkları analiz edin. Ardından ana hatları göster'i seçin ve özetlemeye tıklayın.

Ayarın geri kalanı varsayılan olarak bırakılmalıdır. Bu işlev, bir sinyale sahip toplam piksel sayısını ve sinyalli piksellerin toplam yüzeyi olarak birlikte gruplandırılan pikselleri tanır. Ayrıca piksel gruplarının sayısı ve ortalama boyut bildirilir.

İyi ayarlanan en büyük toplam alana sahip dilimi karşılaştırın ve seçin. Dilim işaretlenecektir. Veri tablosunu toplam alfa sinüklein yüzeyi, inklüzyon sayısı ve ortalama partikül boyutu ile kopyalayın.

Verileri bir Excel elektronik tablosuna yapıştırın veya başka bir yere açıklama ekleyin. Fiji'ye dönüş. Beta tübülin kanalında önceki seçili dilimi bulun ve seçin.

Ganglion alanını seçin ve analiz etmeye tıklayın. Ardından ölç'ü seçin. Ganglionun toplam yüzeyini gösteren başka bir tablo görünecektir.

Verileri tablodan alfa sinüklein ölçümünün yakınındaki bir Excel elektronik tablosuna çıkarın veya Excel'i kullanarak başka bir yere kopyalayın. Lokal olarak etki eden roonun enterik sinir sistemi üzerindeki etkilerini analiz etmek için toplam alfa-sinüklein yüzeyi ve ganglion boyutuna göre normalize edilmiş inklüzyon sayısını elde etmek için alfa sinüklein ölçümünde elde edilen farklı parametreleri ganglion yüzeyine bölün, bilinen pestisit çürüklüğünün kilogramı başına beş miligram, 1 yaşındaki C 57 siyah altı fareye oral gavaj ile uygulandı. Burada gösterilen kromatogram, uygulamadan bir saat sonra bilinen bir rotanın varlığını gösterir: bir kilogram rotenon başına 20 miligram, 10 ve kilogram rotenon başına beş miligram ile tedavi edilen fareleri kontrol eder.

Burada gösterildiği gibi HPLC ile kan ve beyin ve beyin sapı ekstraksiyonları için rotenon seviyeleri belirlendi. Oral gavaj ile çürük kilogram başına beş miligram uygulanması, H plc tarafından belirlenen tedaviden bir, iki veya üç saat sonra kanda ölçülebilir seviyelere neden olmaz. Bu grafik, tedavi edilen farelerin beyin ve beyin sapındaki çürüme seviyelerini göstermektedir.

Ekstraksiyondan bir saat sonra kilogram başına 10 miligram veya daha az rotenon görülür, beyin veya beyin sapı örneklerinde roton seviyesi yoktur. Mitokondriyal kompleksin uygulanmasından bir saat sonra, 1.5 aylık tedavi edilen farelerin kas ve beyin örneklerinde bir aktivite değerlendirildi. Mitokondriyal kompleksin inhibisyonu olmayan gruplar arasında anlamlı bir fark yoktur, bu nedenle bu bölgelerde ron olmadığını doğrular.

Parkinson hastalığının, ron uygulamasını takiben Lewy vücut bileşeni alfa sinükleinin analizi, alfa sinükleinin toplam yüzey miktarının, alfa sinüklein inklüzyonların varlığının ve hücredeki alfa sinüklein paterninin güvenilir bir şekilde belirlenmesini sağlar. Bu şekil, burada görülebileceği gibi duodenum ve ileum kesitlerinde anti beta üç tübülin, alfa sinüklein ve DAPI boyamasını göstermektedir. Bilinen hamam böceği ile 1.5 aylık tedavi, enterik sinir sistemi gangliyonlarında artmış bir alfa sinüklein punktat paternine neden oldu, hatta üç aylık kontrollere kıyasla bir tane.

Bu patern hem ileumda hem de duodenumda görülebilir. Üç aylık tedaviyi takiben, daha büyük alfa sinüklein inklüzyonları oluşumu görülebilir, anti alfa sinüklein, theof, flavin ve DPI kullanılarak immünofloresan boyama, sadece üç ayda daha büyük alfa sinüklein birikimlerinin agregasyonunu gösterir. Bu deney, otomatik segmentasyon ve entropi tabanlı eşikleme yöntemleri kullanılarak analiz edilmiştir.

Soldaki grafikte, her sütun toplam alfa sinüklein yüzeyini ganglion yüzeyine temsil eder. Sağdaki grafikte, her sütun, alınan ganglion yüzeyi başına toplam alfa sinüklein inklüzyonu sayısını temsil eder. Birlikte, bu veriler birlikte, rotenonun lokal uygulamasının, enterik sinir sistemi gangliyonlarında alfa sinüklein fosforilasyonunu, birikimini ve gliozis ile agregasyonunu indüklediğini göstermektedir

Bu prosedürü denerken, gavajı nazikçe sokmak önemlidir ve herhangi bir engel bulunursa, bu prosedürleri izleyerek çıkarıp tekrar sokmak daha iyidir. HPLC, immün boyama ve görüntü analizi gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu, diğer bölgeleri, maddenin etkilerini ve hatta maddenin gelişiminden sonra kandaki varlığını analiz etmeyi sağlayacaktır.

Bu teknik, sinirbilimcilerin çevresel nörotoksinlerin enterik sinir sistemi üzerindeki etkilerini araştırmalarının yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, mastarı doğru bir şekilde uygulayabilmeli ve immünokimyadan gelen görüntüleri analiz edebilmelisiniz. Çürük ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın.

Bu nedenle bu işlemi gerçekleştirirken eldiven ve maske kullanılmasını tavsiye ederiz. Öğr.