Gramicidin tabanlı Floresan Testi; çift katlı lipid Özellikleri değiştirmek için Küçük Moleküller Potansiyel Belirleme

Bu prosedürün genel amacı, iki katmanlı yayılma proteinleri tarafından algılanan çift katmanlı özelliklerde ilaca bağlı değişiklikleri ölçmektir. Bu, önce Fluor yüklü, büyük tek taraflı sles yapılarak gerçekleştirilir. İşlemin ikinci adımı, vezikülleri gramin ile uyuşturmaktır.

Prosedürün üçüncü adımı, harici bir söndürücü eklemek ve iç floronun söndürme oranını ölçmektir. Dört. Prosedürün son adımı, floresan zaman seyrine gerilmiş bir üstel fonksiyon uydurarak gramin aktivitesi başına Flor söndürmedeki değişikliği ölçmektir. Sonuç olarak, amfi dosyalarının lipid çift katmanlı özelliklerini değiştirip değiştiremeyeceğini değerlendirmek için sonuçlar elde edilebilir.

Merhaba, ben Ola Anderson. Merhaba, ben Helson. Merhaba, ben Richie Kapo.

Ve ben Weill Cornell Tıp Fakültesi Fizyoloji ve Biyofizik Bölümü'nden Dr. Olaf Anderson'ın laboratuvarından Leah Sanford. Bugün size lipid biyo katman özelliklerindeki değişiklikleri ölçmek için bir prosedür göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü ilaçların ve küçük moleküllerin lipid bilar özellikleri üzerindeki etkilerini incelemek için kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım Bu prosedürün birinci gününde, lipiti dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığına dengelenmesini bekleyin. Dengelendikten sonra, 25 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir şişeye mililitre başına 0.6 mililitre 25 miligram, lipit ve kloroform çözeltisi ekleyin. Ardından, kloroformun tamamı buharlaşana kadar şişeyi sürekli döndürürken çözeltiyi nitrojen gazı altında kurutun.

Ve ince beyaz bir lipit tabakası, şişenin tüm alt yarısını kaplar, lipiti gece boyunca vakum altında bir kurusu içinde daha da kurutur. 100 milimolar sodyum nitrat, 25 milimolar, A NTS ve 10 milimolar HEP'ler pH yedi'den oluşan bir çözelti hazırlayın. Bu çözeltinin pH'ını ayarlarken, klorür içeren çözeltilerden kaçının.

Talyum Quencher, ikinci günde klorür ile çözünmeyen bir kompleks oluşturduğundan, lipitleri 1.67'de yeniden sulandırın. 10 milimolar lipid süspansiyonu elde etmek için bu elektrolit çözeltisinin bir mililitresi. Doğru konsantrasyona ulaşıldığında, para film ile kaplayın ve süspansiyonu iyice girdaplayın, numuneyi folyo ile ışıktan koruyun ve gece boyunca oda sıcaklığında yaşlanmasına izin verin.

Üçüncü günde, karışımı düşük güçlü bir sonikatta bir dakika boyunca sonikleştirin. Daha sonra numuneyi kuru buz üzerinde beş dakika dondurun, ardından ılık suda beş dakika çözün, donma çözülme döngüsünü dört ila beş kez tekrarlayın. Lipid süspansiyonunu bir Avanti mini ekstrüder kullanarak ekstrüde edin.

Mini ekstrüderi 0.1 mikron polikarbonat filtre ve filtre destekleri ile kurun, süspansiyonu 21 kez ileri geri ekstrüde yapın, böylece neredeyse yarı saydam bir süspansiyon karşı şırıngada sona erecek ve büyük bir üler vezikül veya LUV süspansiyonu ile sonuçlanacaktır. Ekstrüde süspansiyonu sodyum tamponu ile dengelenmiş bir PD 10 duling kolonu üzerinde çalıştırarak harici A NTS'yi çıkarın. Kolona 1,5 mililitre LUV süspansiyonu ve bir mililitre sodyum tamponu ekleyin.

Çözelti kolona tamamen dahil edildikten sonra, lipozomları üç mililitre sodyum tamponu ile elüte edin ve elüatı toplayın. Elde edilen A NTS dolgulu LUV stok çözeltisi yaklaşık dört ila beş milimolar lipid içermeli ve yarı saydam görünmelidir. Süt beyazı.

Solüsyonu folyo ile ışıktan koruyun ve kullanmadan 24 saat önce 13 santigrat derecede iyice girdapla saklayın. A NTS dolgulu LUV stok çözümü. UUV'ler mililitre ve/veya tortu başına bir gramdan daha büyük bir yoğunluğa sahip olduğundan.

Ardından A NTS dolgulu LUV stok çözeltisini seyreltin. Sodyum tamponu ile bir ila 20, lipozomların dörtte üçünü DMSO'da 260 nanogram abidin ile inkübe eder. Kalan dörtte birine gramin içermeyen aynı hacimde DMSO ekleyin.

Tüm numunelerde çözücü konsantrasyonunu sabit tutmak için, graminin 13 santigrat derecede 24 saat boyunca lipit veziküllerinin iç ve dış tek tabakaları arasında dengelenmesine izin verin. Burada, floresan söndürme oranını ölçmek için sıcaklık kontrollü uygulamalı bir fotofizik SX nokta 20 durdurulmuş akış spektro florimetresi kullanılır. Başlamak için, aletin ısınmasına izin vermek için aletleri bir saat önceden açın.

Uyarma için raportörlü yarık tek eğik çizgi olmalı ve pro data SX yazılımı kullanılarak emisyonu kaydetmek için 4 55 nanometre yüksek geçiren filtre kullanılmalıdır. Önce kayıt koşullarını ayarlayın, monokromatör uyarma dalga boylarını 3 52 nanometreye ayarlayın. Basınç tutma ayarını kullanın.

Zamanı bir saniyeye ve puanları 5.000'e ayarlayın. Tekrar sayısını arabellek çalıştırmaları için dokuza ve söndürücü çalıştırmaları için 13'e ayarlayın. Essex yazılımında sıcaklığı izleyin, sürücü profilini kontrol edin.

Sürücü hacmi, her şırıngadan 60 mikrolitreyi karıştıran 120 mikrolitreye ayarlanmalıdır. Bu, yaklaşık 1.2 milisaniyelik bir ölü zaman verir. Floresan dedektöründeki yüksek voltajı veya kazancı yaklaşık 420 volta ayarlayın.

Amaç, karanlıkta 25 santigrat derecede 10 dakika boyunca önceden hazırlanmış A NTS yüklü UUV'leri dengeleyen yaklaşık sekiz floresan okuması elde etmektir. Dengelendikten sonra numuneyi girdaplayın, ardından sol şırıngaya yükleyin. Doğru şırınga yükünde, sodyum tamponu veya talyum. Söndürücü.

Şırıngaları ileri geri iterek hava kabarcıklarını çıkarın. Her iki şırınga da eşit şekilde yüklenmelidir. İlk numune için vanaları kapatmadan önce, sodyum tamponu ile floresan kaydedin.

Dört kez tekrarlayın ve kazancı gerektiği gibi ayarlayın. Ardından kalan numuneler için beş kez daha tekrarlayın. Sodyum tamponu ile dokuz tekrar kaydedin.

Sodyum tamponunu talyum söndürücü ile değiştirin ve 13 tekrar kaydedin. Su ile durulayın ve bir sonraki numune kontrollerine devam edin. Gramin içermeyen ve çözücü içeren, gramin içermeyen ve maksimum bileşik konsantrasyonuna sahip numuneleri dahil edin.

Floresan testini takiben hem gramin hem de çözücü ile, verileri analiz için MATLAB yazılımına okuyun. Tüm tampon ve söndürücü tekrarlarında okunan her numune için, ilk dört tekrar daha önce tüpte bulunanlarla kontamine olacaktır. Bu durumda sinyal, önceki yıkamadan elde edilen su ile karıştırılan sodyum tampon numunesinden gelir.

Beşten dokuza kadar olan tekrarlar, yalnızca örnekten gelen sinyali temsil eder. Bu nedenle, her durumda her zaman ilk dört tekrarı hariç tutarız. Herhangi bir karıştırma artefaktını önlemek için, izleri manuel olarak gözden geçirin ve karıştırma artefaktları ve/veya kabarcıklar nedeniyle ani artışlar veya sapmalar içeren kırmızı iz gibi kötü tekrarları kaldırın.

Daha sonra, söndürücü tekrarlarını, her deney koşulu için her numune için tampon tekrarlarının ortalama başlangıç değerine normalleştirin, tüm numunelerin ortalamalarını, gramin içermeyen tek bir görselleştirme numunesi grafiğinde birleştirin, hepsi benzer olmalı ve neredeyse hiç floresan söndürme göstermemelidir. Gram sidin içeren numuneler için veziküllere talyum iyonunun yavaş yavaş girmesi nedeniyle floresan sinyalinde yavaş bir azalma olur. Floresan zaman seyri bileşik tarafından gözle görülür şekilde değiştirilirse, bileşik, normalleştirilmiş floresan söndürme eğrilerinin ilk iki ila 100 milisaniyesine gerilmiş bir üstel olarak test edilen konsantrasyonda lipid çift tabaka özelliklerini değiştirir.

Bireysel tekrarlar için ve hızı iki milisaniye olarak hesaplayın. Ardından, tek bir numuneden belirli bir numune için ortalamaları ve standart sapmaları hesaplayın, burada kapak olarak gösterilen kapsaisinin etkisini, ga olarak gösterilen graminin yokluğunda veya varlığında floresan söndürme süresi boyunca gözlendiğini tekrarlar, normalleştirilmiş floresan sinyali burada bir saniye boyunca gösterilir. Gri noktalar tüm tekrarlardan elde edilen sonuçları temsil ederken, kırmızı çizgiler ortalamalardır.

Normalleştirilmiş floresan sinyalinin ilk 100 milisaniyesi gösterilir. Gri noktalar, her koşul için tek bir tekrardan elde edilen sonuçlardır. Kırmızı çizgiler bu tekrarlara üstel olarak uzatılır.

Boğulmuş mavi çizgi, iki milisaniye işaretini belirtir. Söndürme hızının belirlendiği zaman. Söndürme oranındaki nispi değişiklik, verilerin kontrol numunesine gramin ile ve değiştirici olmadan normalleştirilmesiyle belirlenir.

Kapsaisin, lipid çift tabakasını emdiğinde, iki tabaka özelliklerini değiştirir. Daha yumuşak çift tabakaya doğru değişim, mono dimer dengesinde gram tarafında iletken dimer lehine bir kayma olarak yansıtılacaktır. Az önce size küçük bir molekülün çift katmanlı bozucu etkilerini ölçmek için bir prosedür gösterdik.

Bu prosedürü yaparken, aynı vezikül grubunu kullanan her deney için uygun kontrolleri kullanmayı unutmamak önemlidir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.