DNA Fragments Electroeluting

Hi.Today size sindirim ve PCR ürünleri gibi DNA parçalarını saflaştırmak için elektro lusyonun nasıl yapıldığını göstereceğiz. Klonlama ve dizileme gibi daha ileri amaçlar için, elektro lution tercih edilen yöntemlerden biri olabilir. DNA'nın negatif elektrik yüküne dayanarak, elektro alanın içine yüksek bir hücre bariyeri yerleştirilir, parçalar düşer ve daha fazla göç etmeleri önlenir.

Bu yöntem, düşük maliyeti olan %80'e varan nispeten yüksek bir verimlilikle farklı kaynaklardan çok çeşitli DNA fragman boyutlarının saflaştırılmasına izin verir. Diğerlerinin yanı sıra kolonlar, reçine kitleri gibi diğer saflaştırma yöntemleriyle karşılaştırıldığında elektro lüsyonun bir başka avantajını temsil eder. DNA örneği ilk olarak saflaştırılacak istenen parçanın görselleştirilmesi ve tanımlanması için bir bezme bromür lekeli Aris jel elektroforezi ile görselleştirilir, elektroforez devam etmelidir.

Parçalar altında iyi ayrılmış, cılız kesim kesin olarak belirlenebilir. Elektroforezi takiben. İstenilen parça, yepyeni bir tıraş bıçağı kullanılarak ve jel dilimini ilgilenilen banda mümkün olduğunca yakın çevirmeye özen gösterilerek jelden düzgün bir şekilde çıkarılır.

Bu prosedür UV ışığından uygun koruma ve eldiven giyilerek yapılmalıdır. Elektro luteri Uygun yanma tamponu ile doldurduktan ve orta plato yüzeyine dökmeye özen gösterdikten sonra, jel dilimi V kanalına mümkün olduğunca yakın tekerleklerden birinin içine yerleştirilir. Vch kanalının içinde kabarcık olmamalıdır.

Bu, sıkışan havayı çıkarmak için kanalı tamponla yıkayarak önlenebilir. Daha sonra 100 mikrolitre yüksek tuz bariyeri, proksimal bölgeden kuyuya V kanalına dikkatlice eklenir. Hazne kapalıdır ve elektrotlar 100 ila 120 voltta elektro lusyona başlamak için güç kaynağına bağlanır.

Zaman atlaması, 20 kbs'ye kadar olan büyük parçalar için parça boyutuna bağlı olacaktır. 50 dakika ila bir saat yeterli olmalı ve küçük parçalar, tuz çözeltisinden ve son yetişkin tampon zincirine daha fazla elion girmesini önlemek için UV ışığı ile her 10 dakikada bir izlenmelidir. Bu durumda, ND bir enzimleri ile 560 nanogram plazmidi sindirdik ve parça başına 900 baz salmak için girdik, bu da bir numunenin 84 nanogramına eşdeğerdir.

Buna göre, jel dilimi kuyu içine yerleştirildikten sonra, elektro lusyon 100 voltta 25 dakika boyunca ilerleyecektir. Elektro çözelti tamamlandıktan ve DNA parçaları V kanalı içindeki güney yastığında sıkıştıktan sonra, haznenin distal tarafından kanaldan 400 mikrolitre çözelti geri kazanılır ve 1.5 mikrolitrelik bir mikro tüpe yerleştirilir Bir mikro çukura bağlı ince bir uç kullanarak, iki hacim soğuk mutlak etanol ekleyerek alkol çökeltmeye devam edin ve girdap ile karıştırın. Ek olarak, DNA geri kazanımı klasik tüplerinin verimini artırmak için iki ila üç mikrolitre glikojen eklenebilir Eksi 20 santigrat derecede bir saat veya alternatif olarak, bu sıcaklıkta gece boyunca santrifüjde dört santigrat derecede en yüksek hızda 25 dakika saklayın.

Bu kardiyo süpernatan ve bir mililitre soğuk,% 70 etanol Santrifüj ekleyerek dört santigrat derecede en yüksek hızda beş ila 10 dakika boyunca yıkayın, süpernatanı atın ve tüpler ters çevrilmiş bir konumda oda sıcaklığında kurumaya bırakın, 10 ila 15 mikrolitre çekirdeksiz suda harcanan gresler ve numunenin konsantrasyonunu belirlemeye devam edin. Bu durumda, saflaştırılmış numune 10 mikrolitre su içinde yeniden süspanse edildi ve 260 nanometre dalga boyunda bir spektrofotometrede mikrolitre başına 6.3 nanogramlık bir konsantrasyon göstererek niceliklendirildi ve bu da %75'lik bir verimliliği temsil etti. Değerli zamanınızın sadece 10 dakikasını bir kit ile ayırmanın daha iyi olacağını düşünüyor olabilirsiniz.

Bununla birlikte, bu süreçte harcanan zamana rağmen, doğa boyutları ve kaynakları taşıyan daha geniş bir numune yelpazesini saflaştırmanıza izin verecek birçok değişkeni kontrol edebileceksiniz. Mevcut durumda görebileceğiniz gibi, çoğu DNA saflaştırma kitine eşit veya daha iyi bir %75 verimlilik gözlemlenmiştir. Bugün bize katıldığınız için teşekkür ederiz.

Umarız bu protokolü araştırma projeleriniz için faydalı bulmuşsunuzdur.