Name: DNA Fragments Electroeluting (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Öğrenin, DNA fragmanlarını elektroelüsyon yöntemiyle yüksek verimlilikle nasıl saflaştıracağınızı. Bu maliyet etkin teknik, moleküler biyoloji ve genetik araştırmalarında %80'e varan verim sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Çalışma Dr. Bermudez laboratuvar Conacyt (Hibe # 82.622) tarafından finanse edildi. Teşekkür Biz Gabriela Gutierrez-Sosa, Eliuth Reyes-Martinez ve Ximena Rodriguez-Torres electroleution prosedürü video kayıt için.

<ol><li> Arındırılmalıdır ilgi DNA parçaları seçmek için, bu agaroz çözülebilir veya akrilamid jeller 1 saat için 120 volt 0.5x TBE tamponu (Tris borat, EDTA) kullanılarak elektroforez etidyum bromür ile boyanmış jel. Bunun için, plazmid pProEx-GdMre11S ~ 700 ng (6000 bp), daha önce NdeI ve HindIII ile sindirilir 900 bp parçası (parçası plazmid ve 84 ng 560 ng) serbest bırakmak için kullanılır. </li><li> Electroeluter tankı (Şekil 1), orta plato üzerine onu dökmeyin özen orta platonun her iki tarafında eşit olarak dağıtılmış 0.5x TBE ile doldurulması gerekir. </li><li> Seçilen grubun (veya grup) jel kesip, numune odasında V kanal (her bir dilim) mümkün olduğunca yakın olarak yerleştirilir. Koşu tampon her iki mecliste de eklenmelidir; jel dilim karşılamak için yeterli. </li><li> Sıkışmış olan herhangi bir hava kabarcığı ortadan kaldırmak için kullanılan her V kanalı Pasteur pipeti ile yıkanmalıdır. </li><li> Sonra 10 M NH 4 asetat (Bromophenol Mavi küçük bir miktar yeterli renk eklenir, görselleştirme kolaylaştırmak için) 100 ul V kanal içinde yavaşça eklenir. </li><li> Yüksek tuz yastık herhangi bir tabanda önlemek için kapağı hafifçe kapatılmış olmalıdır. </li><li> Electroelution 25 dakika için 100 volt başlandı. </li><li> Electrolution tamamlandığında, 400 ul V-kanal kaldırıldı ve 1 saat veya gece boyunca soğuk etanol ve glikojen (DNA kurtarma artırmak için önerilir) 2 cilt, 4 ° C ile çöktürülmüş mikrofuge'de tüp yerleştirilir. </li><li> 20 dakika boyunca santrifüj, süpernatant kaldırmak ve% 70 etanol ile yıkayın. </li><li> Kuru tüp ve OD 260 nm DNA ölçmek. </li><li> Elde edilen geri kazanım oranı% 75 idi (84 ng V-kanal yerleştirildi 63 ng iyileşti). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2136/2136fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 Electroeluter diyagramı. Anot, bir katot dilimlenmiş jel bulunan tank, DNA her tarafında gösterilir (siyah kare olarak gösterilen) negatif yük nedeniyle katot doğru göç edecek. Sonra V-kanal bulunan tuz minder ters bir siyah üçgen olarak temsil kalmış olacak.

<ol><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 3 Volume Set (1989).</li>
</ol>

Çalıştırma süresi kadar parçaları için normalde parçalarının boyutu çok bağlı olacaktır küçük parçaları için her 10 dakikada bir izleme UV ışık geçmek parçası önlemek için gerekli iken 20 kb 1 saat 50 dakika yeterlidir tuz yastık ve dolayısıyla kurtarma azalan anodal tampon odasına. 100 volt güç kaynağı, bir akım en az 10 mAmp olduğunu emin olmak için çok önemlidir. DNA bant UV el lambası ile izlenmekte ve bu jel dilim ne zaman terk tespit edilebilir. Yastık tuz 3 M Na asetat ile de yapılabilir. Bu prosedür, modifiye enzimler, vb. Tarafından işlenen iyi kurtarma (~% 80) ile farklı boyutlarda DNA veya RNA parçaları arıtma kısıtlama enzimler tarafından sindirilemez, radyoaktif olması

<table><tbody><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111L</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104L</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; asetat</td><td>JT Baker</td><td>0596</td><td></td></tr><tr><td>agaroz</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Biyofotometre</td><td>Eppendorf</td><td>6131 000 020</td><td></td></tr><tr><td>Elektro&amp;#8211;Luter</td><td>İnter-beat Aralığı</td><td>UEA CAT 46000</td><td></td></tr></tbody></table>

dna fragments electroeluting

Electroeluting DNA Fragments

Saf DNA parçalarının Moleküler Biyoloji farklı amaçlar için kullanılır ve çok sayıda prosedür tarafından hazırlanmış olabilir. Çoğu ilgi grup ayırmak için, DNA parçalarının bir önceki elektroforez gerektirir. Sonra, bu grubun bir agaroz veya akrilamid jel eksize edilip kullanarak saflaştırılmış: cam veya silika partikülleri, DEAE-selüloz membranlar, bağlayıcı ve elüsyon &quot;yöntemi ezmek ve emmek&quot; electroelution ya da çok sık pahalı ticari arıtma kitleri. Böylece, bir yöntem seçerek çoğunlukla laboratuvar mevcuttur ne bağlı olacaktır. Electroelution prosedür uygulamaları çok sayıda (sıralama, Radyoaktif, enzimatik kısıtlama, enzimatik modifikasyonu, klonlama vb) kullanılmak üzere çok temiz DNA arındırmak için izin verir. Bu prosedür yerleştirerek oluşur DNA bant-sonra uygulayarak mevcut electroeluter örnek kuyu, içine agaroz veya akrilamid dilim içeren DNA parçalarının agaroz bırakmak yapacak ve böylece daha sonra etanol yağış ile kurtarılamaz bir yastık tuz hapsedilir.

Bu prosedür, yüksek verim DNA parçalarının arıtma sağlar.

DNA Fragments Electroeluting

Saflaştırılmış DNA fragmanları, Moleküler Biyoloji'de farklı amaçlar için kullanılır ve çeşitli prosedürlerle hazırlanabilirler. Bunların çoğu ... gerektirir.

Merhaba. Bugün size, sindirim ve PCR ürünleri gibi DNA fragmanlarını saflaştırmak için elektro elüsyonun nasıl gerçekleştirildiğini göstereceğiz. Klonlama ve dizileme gibi ileri amaçlar için elektro elüsyon, tercih edilen yöntemlerden biri olabilir. DNA'nın negatif elektrik yüküne dayanarak, elektro alana yüksek bir hücre bariyeri yerleştirilir; bu durum fragmanların çökelmesini sağlar ve daha fazla migrasyonlarını engeller.Bu yöntem, farklı kaynaklardan geniş bir DNA fragman boyutu aralığının %80'e varan nispeten yüksek bir verimlilikle saflaştırılmasına olanak tanır. Düşük maliyeti, kolonlar ve reçine kitleri gibi diğer saflaştırma yöntemleriyle karşılaştırıldığında elektro-elüsyonun bir başka avantajını oluşturur. DNA örneği, saflaştırılacak istenen fragmanın görselleştirilmesi ve tanımlanması amacıyla öncelikle etidyum bromür ile boyanmış agaroz jel elektroforezi ile görüntülenir; ardından elektroforez işlemine devam edilmelidir.Fragmanlar iyi ayrıştırıldığında, boyutun küçük olduğu kesin olarak belirlenebilir. Elektroforezi takiben, istenen fragman, yeni bir jilet kullanılarak ve jel dilimi ilgi duyulan banda mümkün olduğunca yakın döndürülerek jelden özenle kesilip çıkarılır.Bu prosedür, UV ışığından uygun şekilde korunarak ve eldiven giyilerek gerçekleştirilmelidir. Elektrolüter uygun yıkama tamponu ile doldurulup tamponun orta plakanın yüzeyine taşmasına dikkat edildikten sonra, jel dilimi tekerleklerden birinin içine, V kanalına mümkün olduğunca yakın olacak şekilde yerleştirilir. V kanalının içinde hava kabarcığı bulunmamalıdır.Hapsolmuş havayı uzaklaştırmak için kanalın tamponla yıkanmasıyla bu durum önlenebilir. Ardından, yüksek tuzlu bariyerden 100 microliters, kuyucuğa yakın konumdan V kanalına dikkatlice eklenir. Hazne kapatılır ve 100 ila 120 volt değerinde elektrolüsyonu başlatmak için elektrotlar güç kaynağına bağlanır.Zaman aşımı, 20 kb'ye kadar olan büyük fragmanlar için fragman boyutuna bağlı olacaktır. 50 dakika ile bir saat arası yeterli olmalı ve küçük fragmanlar, tuz çözeltisi üzerinden son adult buffer zincirine daha fazla elüsyonu önlemek için UV ışığı ile her 10 dakikada bir izlenmelidir. Bu durumda, 900 baz çiftlik bir fragman açığa çıkarmak için 560 nanogram plazmidi ND one ve entry enzimleri ile sindirdik; bu, 84 nanogramlık bir örneğe eşdeğerdir.Buna göre, jel dilimi kuyuya yerleştirildikten sonra, 100 volt değerinde 25 dakika boyunca elektroelüsyon işlemi gerçekleştirilir. Elektroelüsyon tamamlanıp DNA fragmanları V kanalındaki alt yastıkta toplandığında, kanalın hazne distal tarafından 400 µL çözelti geri kazanılır ve bir mikropipete takılı ince uç kullanılarak 1,5 µL'lik bir mikrotüpe aktarılır; ardından iki hacim soğuk absolut etanol eklenip vorteksle karıştırılarak alkol çöktürme işlemine geçilir. Ek olarak, DNA geri kazanım verimini artırmak için iki ila üç µL glikojen eklenebilir. Tüpler -20 °C'de bir saat boyunca veya alternatif olarak bu sıcaklıkta gece boyunca bekletilir, ardından 4 °C'de maksimum hızda 25 dakika boyunca santrifüj edilir.Bu süpernatantı ve yıkama işlemini bir mililitre soğuk, %70 etanol ekleyerek gerçekleştirin. Dört santigrat derecede, maksimum hızda beş ila 10 dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatantı uzaklaştırın ve tüpler ters konumdayken oda sıcaklığında kurumaya bırakın. Pelletleri 10 ila 15 mikrolitre nükleazsız su içinde resüspande edin ve numunenin konsantrasyonunu belirleme işlemine geçin. Bu durumda, saflaştırılmış numune 10 mikrolitre suda resüspande edilmiş ve 260 nanometre dalga boyundaki bir spektrofotometrede miktar tayini yapılmıştır; sonuçlar %75 verimliliği temsil eden 6,3 nanogram/mikrolitre konsantrasyon göstermiştir. Değerli vaktinizin sadece 10 dakikasını bir kit ile harcamanın daha iyi olabileceğini düşünüyor olabilirsiniz.Buna rağmen, bu süreçte harcanan zamana karşın, doğaları gereği farklı boyut ve kaynaklara sahip daha geniş bir örnek yelpazesini saflaştırmanıza olanak tanıyan birçok değişkeni kontrol edebileceksiniz. Mevcut durumda gördüğünüz üzere, çoğu DNA saflaştırma kitiyle eşit veya onlardan daha iyi olan %75 verimlilik gözlemlenmiştir. Bugün bize katıldığınız için teşekkür ederiz.Bu protokolün araştırma projeleriniz için faydalı olduğunu umuyoruz.

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

"E-DNA" sensörleri, reagentless, kan ve diğer karmaşık matrisler doğrudan meydan bile iyi bir performans elektrokimyasal biyosensörler, nükleik asit, protein ve küçük molekül analitler geniş bir algılama için adapte edilmiştir. Burada bu tür sensörlerin üretimi ve kullanımı için genel bir prosedür mevcut.

Nükleik Asitler, Proteinler ve Küçük Moleküller Reagentless Algılama Elektrokimyasal DNA Biyosensörler Fabrikasyon

Agaroz jel elektroforez ile DNA parçalarının ayrılması için temel bir protokol tarif edilmektedir.

DNA kırıntıları Ayrılma Agaroz Jel Elektroforezi

Biz son zamanlarda basit bir bakteriyel tespiti için floresan assay "mix-ve-okuma" kurmak için uygulanabilir Flourogenik DNAzyme probları üretmek için yeni bir yaklaşım bildirdin. Bu özel DNA sondaları böylece floresans sinyali kuşağa bakteriyel algılama çevirme belirli bakteri tarafından üretilen ham hücre dışı karışımı (CEM) varlığında, bir kromofor-değiştirilmiş-DNA RNA kimerik substratın bölünme katalize. Bu yazıda, "RFD-EC1" ifade belirli bir DNAzyme prob modeli bakterinin tespiti için...

Flourogenik DNAzymes kullanarak Bakterilerin Tespiti

Bu videoda, otomatik kılcal elektroforez kullanarak hücresiz DNA veya cfDNA fragmanlarının boyut dağılımını analiz ediyoruz. Bu teknik, apoptoz sırasında kanser hücreleri tarafından salınan DNA parçalarının profili hakkında bilgi edinmeye yardımcı olur.

cfDNA'nın Otomatik Kapiler Elektroforez Tabanlı Parça Boyutu Dağılımı Analizi: Biyosıvılardan İzole Edilen DNA Parçalarının Boyut Dağılımını İncelemek İçin DNA Mikroçip Tabanlı Bir Yöntem

Bu videoda, PCR amplikonları boyutlarına göre ayırmak için kullanılan mikroakışkan kılcal elektroforez tekniği açıklanmaktadır. Bu teknik, floresan boyalar ve standart moleküler boyut belirteçleri kullanılarak parça boyutlandırmaya yardımcı olur.

PCR Ürünlerinin Parça Boyutlandırması için Mikroakışkan Kılcal Elektroforez: DNA Parçalarını Boyuta Göre Ayırmak için Mikroçip Tabanlı Bir Elektroforetik Ayırma Tekniği

Biz DNA hibridizasyon tespiti için mikroakışkan tabanlı elektrokimyasal Bioçip sunuyoruz. SsDNA probu fonksiyonlandırmalar ardından, özgüllük, duyarlılık ve algılama limiti tamamlayıcı ve non-ssDNA hedefleri ile incelenmiştir. Sonuçlar 3.8 nM'lik bir algılama sınırı ile, elektro-kimyasal sistemine DNA hibridizasyonu olaylarının etkisini göstermektedir.

Etiket-serbest DNA Hibridizasyon Analiz için mikroakışkan tabanlı Elektrokimyasal Biochip

Geliştirilmiş İndirgenmiş Temsil Bisülfit Dizileme, sitozin bisülfit dönüşümü ile birleştirilmiş restriksiyon enzim sindirimine dayalı DNA metilasyon analizi için dizileme kitaplıklarının hazırlanması için bir yöntemdir. Bu protokol 50 ng başlangıç materyali gerektirir ve GC açısından zengin genomik bölgelerde baz çifti çözünürlük verileri verir.

Baz Çifti Çözünürlük DNA metilasyon Değerlendirme Temsil bisülfit sıralamayı İndirimli pekiştirilmiş

Geleneksel kütük jel elektroforezi (SGE) deneyleri karmaşık bir aparat ve yüksek kimyasal tüketim gerektirir. Bu çalışma kısa bir zaman aralığında DNA parçalarını ayırmak için düşük maliyetli bir yöntemi açıklayan bir protokol sunmaktadır.

Akıllı Telefon ile DNA Parçalarının Ayırılmasının Gerçek Zamanlı İzlenmesi

Vitro seçimi ve gruba özgü maddedir asit ester-bağlama DNA aptamers karakterizasyonu için bir protokol sunulmuştur. Bir elektrokimyasal aptasensor içinde seçilen aptamer uygulanması da dahil edilir.

Maddedir asit Ester-bağlama DNA Aptamer seçimi, karakterizasyonu ve elektrokimyasal bir Aptasensor uygulamaya

Burada, düşük moleküler ağırlıklı hücre dışı DNA oranını artırarak çevresel antimikrobiyal direnci (AMR) değerlendirmek için basit bir teknik sunuyoruz. % 20 -% 30 PEG ve 1.2 M NaCl ile önceki tedavi, hem genomik hem de yatay olarak transfer edilen AMR genlerinin saptanmasına izin verir. Protokol, ek optimizasyon ile kitsiz bir sürece uygundur.

Antimikrobiyal Direncin Kapsamlı Değerlendirmesi için Atık Sudan Düşük Moleküler Ağırlıklı DNA'nın Gelişmiş Ekstraksiyonu 

Öğrenin, DNA fragmanlarını elektroelüsyon yöntemiyle yüksek verimlilikle nasıl saflaştıracağınızı. Bu maliyet etkin teknik, moleküler biyoloji ve genetik araştırmalarında %80'e varan verim sağlar.

DNA Fragments Electroeluting

Daha fazla video keşfet