Name: Doğrudan Atmosferik Basınç Kütle Spektrometresi Tek Hücre Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Öğrenin, LAESI kütle spektrometrisi ile tek hücre analizi yapmayı; bu yöntem atmosferik basınçta canlı bitki ve hayvan hücrelerindeki metabolitleri ve lipidleri doğrudan incelemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, aşağıdaki kurumlar tarafından mali destek kabul Ulusal Bilim Vakfı (Grant 0.719.232), Enerji Departmanı (Grant DEFG02-01ER15129), WM Keck Vakfı (Grant 041.904), ve George Washington Üniversitesi Araştırma Geliştirme Fonu. Yazarlar cömertçe Kızılötesi Fiber Sistemleri (Silver Spring, MD) yanı sıra Mark E. Reeves ve George Washington Joan A. Hoffmann tarafından fiber dağlama ile ilgili ilk tartışma için protokol tarafından sağlanan GeO2 tabanlı optik fiberler için minnettar Üniversitesi. Yazarlar ayrıca, protokol videoya sırasında ona yardım Jessica A. Stolee teşekkür etmek istiyorum.

1. Optik bileşenler <ol><li> Lazer ablasyon elektrosprey iyonizasyon (LAESI) kütle spektrometresi (MS) için lazer ablasyon 5 ns 2.94 mikron dalga boyunda lazer darbe tarafından üretilmektedir. Nd sürülen ayarlanabilir optik parametrik osilatör: YAG lazer (Opolette 100, Opotek A.Ş., Carlsbad, CA), bu çalışmada ablasyon için kullanılır. Tekrarlama oranı 5 ve 100 Hz arasında seçilir. Bu, doğrudan maruz kalması üzerine, göz veya deri ciddi kalıcı hasara neden olabilir bir sınıfı IV lazer. Cisimden yansımalı lazer ışını da cilt veya göz için tehlikeli olabilir. Korunması için uygun bir lazer koruyucu gözlük takın. </li><li> Germanyum dioksit tabanlı cam fiber optik kablo, Kızılötesi Fiber Systems, Inc (Silver Spring, MD) elde edilmiştir. Orada Hytrel ve fiber kaplamalar ucundan bunları kaldırmak için aşağıdaki yönergeleri izleyin poliimid. Isı 1-metil-2-pyrrolidinone 130-150 ° C davlumbaz. Lif, yaklaşık 1 dakika süreyle ya da kaplama kadar yumuşamaya başlar ve soyulabilir bu sıvı içine şerit istediğiniz biter batırın. Yumuşatılmış kaplama metanol ya da bir dakika izopropanol içine batırın ve kalan herhangi bir kaplama kapalı tüy bırakmayan bir peçete ile silin. Kaplama çıkardıktan sonra, cleave bir safir puanlama ve nazikçe onları yakalamaya bıçak (KITCO Fiber Optik, Virginia Beach, VA) fiber iki ucunda. </li><li> % 1 (v / v) nitrik asit (saflıkta) çözümü, bir ucunu fiber ucu kimyasal aşındırma istenilen netliği elde etmek için. Dikey seçilen ilk temastan sonra 300 ila 500 mm derinliğe kadar asit çözeltisi içine fiber sonuna bırakın. Gravür yaklaşık 15 dakika sonra, ucu kendiliğinden asit yüzeyinden ayırır. Bu sonuçlar ~ 15 mikron eğrilik yarıçapı ile fiber ucu sivriltilmiş. Herhangi bir asit artıklarını kaldırmak için deiyonize su ile durulayın. </li><li> Kazınmış sonuna bir micromanipulator lif (MN-151, Narishige, Tokyo, Japonya) Mount ve verimli enerji birikimi için hücre yüzey yakınlığı (~ 20 mm) yakın getirmek. </li><li> Mandren (BFC300, Siskiyou Corporation, Grants Pass, OR) tarafından çıplak fiber optik fiber olmayan kazınmış sonunda tutun. Optik uyum sağlanabilmesi için, fiber mandreni beş-eksenli bir tercüman (BFT-5, Siskiyou Corporation, Grants Pass, OR) monte edilir. Lazer enerjisi (0,5 - 1 mJ), non-kazınmış ucuna bir yüzü düz diğeri dışbükey kalsiyum florür veya yansıma önleyici kaplama ZnSe objektif (Kızılötesi Optik Ürünler, Farmingdale, NY) ışın odaklama elyaf haline birleştirilmiştir. Korumalı altın aynalar (PF10-03-M01, Thorlabs, Newton, NJ) odaklama lens üzerine orta-kızılötesi lazer ışını yönlendirmek için kullanılır. </li></ol> 2. Elektrosprey Kurulum <ol><li> Elektrosprey sistemi aşağıdaki bileşenleri kullanılarak inşa edilebilir iletken perfluoroelastomer halkalı, bağlantı parçaları, boru kol, iğne bağlantı noktası (örneğin, U-435, M215, F-331Nx, F-242x, 9013, IDEX Sağlık ve Bilim, metal sendikası: Oak Harbor, WA) yanı sıra erimiş silika tüp (örneğin, CT360-100-50-5, Yeni Amaç A.Ş., Woburn, MA). Tavsiye edilen yayıcı paslanmaz çelikten imal edilmiş ve 50 mikron id (örneğin, MT320-50-5-5, Yeni Amaç A.Ş., Woburn, MA), konik bir uç vardır. </li><li> Elektrosprey için% 0.1 asetik asit (v / v)% 50 metanol çözeltisi hazırlayın. Çözümünü kullanarak bir şırınga pompası (Harvard Apparatus, Holliston, MA) tarafından 200 ile 300 nl / dak hızında pompalanır, örneğin, 500 ul şırınga (81.222 Hamilton Şirket, Reno, NV). </li><li> 2.800 ve 3.000 V arasındaki yüksek gerilim, sürekli bir elektrosprey oluşturmak için düzenlenmiş bir güç kaynağı (PS350, Stanford Araştırma Sistemleri A.Ş., Sunnyvale, CA) tarafından metal sendika uygulayın. Tüm elektrik bağlantılarını güvenli ve düzgün topraklanmış koruma korumalı olduğundan emin olun. Maruz kalan yüksek gerilim ile doğrudan temas, elektrik çarpmasına neden olabilir. </li></ol> 3. Numune Alma <ol><li> Uygun bir kaynaktan canlı doku ya da hücre örneği elde etmek ve bunları analiz yapılması tavsiye tutmak. Bu gösteri için Allium cepa ampuller yerel bir mağazadan satın alındı. Uzunlamasına bir ampul bir cerrahi neşter tarafından kesin. Bir ölçekte birkaç santimetre segment bir şerit içine kesitli oldu. Iç epidermal dokusunun sağlam bir tek tabaka sıyrılır. </li><li> Epidermisin ıslak yüzey doku önceden temizlenmiş cam mikroskop lamı üzerine monte etmek için kullanılır. Konumlama için üç eksenli bir çeviri sahnede monte genel amaçlı bir plaka tutucu (FP01, Thorlabs A.Ş., Newton, NJ) slayt tutun. Hücre bozulmasını önlemek için örnek montaj hemen sonra kütle spektrumları edinin. </li></ol> 4. Görüntüleme Sistemi <ol><li> İki uzun mesafe mikroskoplar analiz için hücreleri seçin ve bilenmiş fiber ucu ve hücre yüzeyi arasındaki mesafeyi korumak için kullanılır. Sonuncusu yüzeyinden ölçülen 15 ° -30 ° açı altında monte edilir. Bu sistem al5x sonsuz ong mesafe video mikroskobu (7x hassas optik zum, Edmund Optik, Barrington, NJ) düzeltilmiş bir CCD kamera ile donatılmıştır (Marlin F131, Müttefik Vizyon Teknolojileri objektif lens (M 5x Planı Apo, Mitutoyo Co, Kanagawa, Japonya) Stadtroda, Almanya), izleme ve görüntü yakalamak için. </li><li> Ikinci video mikroskop üst hücreler görselleştirmek için örnek yüzeyine dik açıda monte edilir. Bu sistem, ablasyon ve analiz için seçilen hücrenin üzerine fiber ucu hizalamak için görsel geribildirim sağlar. Uzun çalışma mesafesi objektif lens (10x M Planı Apo, Mitutoyo Co, Kanagawa, Japonya) ve bir CCD kamera, 10x sonsuza ile donatılmış 7x hassas zum optik (Edmund Optik, Barrington, NJ), oluşur düzeltildi. </li></ol> 5. Kitle Spectra alımı <ol><li> Lazer, elektrosprey ve kütle spektrometresi, örneğin, bir quadrupole zaman uçuş sistemi (S-TOF Premier, Waters, Milford, MA) açın. Ablasyon spot ve elektrosprey birbirlerine göre verici ve maksimum iyon yoğunlukları ulaşmak için kütle spektrometresi ağzı pozisyonunu ayarlayarak LAESI iyon kaynağı geometri optimize edin. </li><li> Üst görünümü görüntüleme sistemi kullanılarak analiz için faiz hücreyi seçin. Seçimden sonra, doğrudan fiber optik ucu sivriltilmiş altında seçili hücre getirmek için örnek sahne taşıyın. ~ 20 mm ucu-hücre yüzeyinde mesafe yan mikroskop kullanarak tekrar ayarlayın. </li><li> Yangın kazınmış fiber ucu ile seçili hücre lazer bakliyat. Bu sonuç, hücre duvarı ve partiküler madde şeklinde sitoplazma ejeksiyon delinme. Elektrosprey postionization sonra, üretilen iyonlar kütle spektrometresi ve kütle spektrumları tarafından toplanan kaydedilir. </li><li> Veri toplama sonra, lazer, elektrosprey ve bekleme modunda kütle spektrometresi koymak veya bunları kapatın. Ablasyon A. tutun cepa, ışık mikroskobu ile isteğe bağlı gözlem için doku örneği. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Başarılı ablasyon, hücre duvarı ve bir LAESI kütle spektrumu toplanması patlama tek bir hücre. Başarısız bir deney, genellikle hiçbir ablasyon ve / veya kütle spektrumu sonuçları. Gösteri amaçlı, biz tek bir gömülü A. epidermal hücre LAESI-MS analiz sonuçlarını sunmak cepa ampul. Şekil 2a, bir hücrenin örnekleme sonra, temsili bir optik mikroskop görüntü gösterir. Hücre duvarı delikli ve perforasyonu ölçüde komşu hücrelerle sınırları ile sınırlıdır. Bitişik hücreleri sağlam gibi görünüyor. Şekil 2b hücreden üretilen bir temsilcisi LAESI kütle spektrumu gösterir. Iyonları çok çeşitli A. tespit cepa hücre ve onların doğru kitlelere göre, izotop dağılım şekilleri ve bazı durumlarda, tandem kütle spektrumları, onlar geçici endojen metabolitler atanır. Tek bir hücrenin tespit iyonları birden fazla hücre geleneksel LAESI-MS ile aynı doku analizi gözlenen olanlara benzerdi. 13 <img src="/files/ftp_upload/2144/2144fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. LAESI-MS ile tek bir hücre analizi şematik. Orta-IR lazer darbesi bir fiber optik birleştiğinde cam slayt üzerine yerleştirilen numune teslim edilir. Bilenmiş lif ucu hedef hücre içine ışık odaklanır ve yatırılan hücrenin enerji patlamaları. Üretilen ablasyon tüy (kırmızı noktalar) örnek spesifik iyon üretim damlacıkları kaynasabilirler bir elektrosprey tüy (siyah noktalar) (yeşil nokta) ile birleşti. Bu iyonlar analiz ve kütle spektrometresi (MS) tarafından tespit edilir. İki uzun mesafe Video mikroskoplar, Mikroskop 1 ve Mikroskop 2, fiber ucu ve hücre yüzeyi arasındaki mesafe izlemek ve analiz için bir hücre sırasıyla seçmek için kullanılmaktadır. <img src="/files/ftp_upload/2144/2144fig2a.jpg" alt="Şekil 2a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2a"> A. tek bir epidermal hücre Şekil 2a. Ablasyon işareti cepa ampul. Bitişik hücreleri görünür bir hasar göstermezler ve daha sonra ayrı ayrı analiz edilebilir. <img src="/files/ftp_upload/2144/2144fig2b.jpg" alt="Şekil 2b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2b"> Bir tek A. ablasyon karşılık gelen Şekil 2b. Mass Spektrum cepa epidermal hücre birincil ve ikincil metabolitleri varlığını gösterir.

<ol><li>Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ambient+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ambient Mass Spectrometry.</a> Science. 311, 1566-1570 (2006).</li>
<li>Chen, Z. Y., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+plume+expansion+in+atmospheric+pressure+midinfrared+laser+ablation+of+water-rich+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+E%22%5BJournal%5D)">Early plume expansion in atmospheric pressure midinfrared laser ablation of water-rich targets.</a> Physical Review E. E77, 036316-036316 (2008).</li>
<li>Li, Y., Shrestha, B., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atmospheric+Pressure+Molecular+Imaging+by+Infrared+MALDI%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry.+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Atmospheric Pressure Molecular Imaging by Infrared MALDI.</a> Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 79, 523-532 (2006).</li>
<li>Li, Y., Shrestha, B., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atmospheric+Pressure+Infrared+MALDI+Imaging+Mass+Spectrometry+for+Plant+Metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Atmospheric Pressure Infrared MALDI Imaging Mass Spectrometry for Plant Metabolomics.</a> Analytical Chemistry. 80, 407-420 (2007).</li>
<li>Nemes, P., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+for+Atmospheric+Pressure+in+Vivo%2C+and+Imaging+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Laser Ablation Electrospray Ionization for Atmospheric Pressure in Vivo, and Imaging Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 79, 8098-8106 (2007).</li>
<li>Shrestha, B., Li, Y., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+pharmaceuticals+and+excreted+xenobiotic+and+endogenous+metabolites+with+atmospheric+pressure+infrared+MALDI+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of pharmaceuticals and excreted xenobiotic and endogenous metabolites with atmospheric pressure infrared MALDI mass spectrometry.</a> Metabolomics. 4, 297-311 (2008).</li>
<li>Nemes, P., Barton, A. A., Li, Y., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ambient+Molecular+Imaging+and+Depth+Profiling+of+Live+Tissue+by+Infrared+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ambient Molecular Imaging and Depth Profiling of Live Tissue by Infrared Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 80, 4575-4582 (2008).</li>
<li>Nemes, P., Barton, A. A., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Imaging+of+Metabolites+in+Tissues+under+Ambient+Conditions+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Imaging of Metabolites in Tissues under Ambient Conditions by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81, 6668-6675 (2009).</li>
<li>Nemes, P., Woods, A. S., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Imaging+of+Small+Metabolites+and+Lipids+in+Rat+Brain+Tissues+at+Atmospheric+Pressure+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Imaging of Small Metabolites and Lipids in Rat Brain Tissues at Atmospheric Pressure by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 82, 982-988 (2010).</li>
<li>Shrestha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+analysis+of+lipids+and+small+metabolites+in+mouse+brain+tissue+by+AP+IR-MALDI+and+reactive+LAESI+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Direct analysis of lipids and small metabolites in mouse brain tissue by AP IR-MALDI and reactive LAESI mass spectrometry.</a> Analyst. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Sripadi, P., Nazarian, J., Hathout, Y., Hoffman, E., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+analysis+of+metabolites+from+the+untreated+tissue+of+Torpedo+californica+electric+organ+by+mid-infrared+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">In vitro analysis of metabolites from the untreated tissue of Torpedo californica electric organ by mid-infrared laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Metabolomics. 5, 263-276 (2009).</li>
<li>Shrestha, B., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Metabolic+Profiling+of+Single+Cells+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">In Situ Metabolic Profiling of Single Cells by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81, 8265-8271 (2009).</li>
<li>Shrestha, B., Nemes, P., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+and+Analysis+of+a+Single+Cell+by+Consecutive+Laser+Pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+A%22%5BJournal%5D)">Ablation and Analysis of a Single Cell by Consecutive Laser Pulses.</a> Applied Physics A. , (2010).</li>
</ol>

Hücre bir sitoplazma ve hücre duvarı ya da membran çekme dayanımı, su içeriği LAESI-MS analizi sırasında tek hücre ablasyon düzenleyen kritik faktörlerdir. Lazer fluens farklı hücre tiplerinin ablasyon eşikleri ulaşmak için ayarlanmalıdır. Teslim lazer fluens, lazer darbe enerji ve fiber ucu ve hücre yüzeyi arasındaki mesafeye bağlıdır. Komşu hücreleri tek bir hücre analizi sırasında pertürbasyon en aza indirilmesi önemlidir. Ablasyon eşiğinde lazer enerjisi tutulması komşu hücreleri üzerindeki etkisini analiz sınırlar. Potansiyel uygulamalardan biri tek hücre MS kimyasal görüntüleme için doğal hacimsel piksel (vokseller) olarak kullanıyor. Yapay genellikle dikdörtgen bir ızgara üzerinde veri toplama ile karşılaştırıldığında, bir defada bir doku bir hücre kimyasal görüntüleme hücreleri arasındaki biyokimyasal etkileşimler mekansal organizasyon korumak için daha olasıdır.

<table><tbody><tr><td>Asetik asit</td><td>Fluka</td><td>45727</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fluka</td><td>65548</td><td></td></tr><tr><td>1-metil-2-pirolidinon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M79603</td><td></td></tr><tr><td>Su</td><td>Fluka</td><td>39259</td><td></td></tr></tbody></table>

doğrudan atmosferik basınç kütle spektrometresi tek hücre analizi

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Tek hücre Biyokimyasalların analizi, aynı hücre türleri bile kendi fizyolojik koşullar ve çevre ile etkileşim bağlı olarak heterojen bir biyokimyasal makyaj sergiler hücre metabolizması, hücre döngüsü, adaptasyon, hastalık durumları, vb anlamak için önemlidir. Kütle spektrometresi (MS), tek hücre Biyomoleküllerin analizi için kullanılan geleneksel yöntemlerin, kapsamlı bir numune hazırlama güveniyor. Kendi doğal ortamı ve geniş numune işleme hücrelerin çıkarılması hücresel bileşimindeki değişikliklere yol açabilir. Ortam iyonizasyon yöntemleri kendi doğal ortamında ve geniş numune hazırlama olmadan numunelerin analizi sağlar. 1 2.94 mikron dalga boyunda biyolojik maddeler (orta-IR) orta kızılötesi lazer ablasyon dayalı teknikler su ani uyarma kullanan faz sonuçları patlama 2 lazer ablasyon elektrosprey iyonizasyon (LAESI) ve atmosferik basınç kızılötesi matris yardımlı lazer desorpsiyon iyonizasyon (AP IR-MALDI) olarak orta-IR lazer radyasyonu dayalı Ortam iyonizasyon teknikleri, başarılı bir şekilde doğrudan analiz etmek için su yeteneğini göstermişlerdir atmosferik basınç zengin doku ve biofluids LAESI, çoğunlukla iyonları üretmek için yüksek ücret elektrosprey damlacıkları ile örnek pekişen nötr partikül madde oluşur orta-IR lazer ablasyon tüy 3-11 . Son zamanlarda, tek hücre orta-IR ablasyon kazınmış bir fiber üzerinden orta-IR radyasyon sunarak yapıldı. Bu ablasyon üretilen tüy LAESI-MS tek hücreleri çeşitli metabolitlerin analizi sağlayan bir elektrosprey postionized 12 Bu makale LAESI-MS kullanarak tek bir hücre analizi için detaylı bir protokol açıklar . Sunulan video Allium cepa ampul cilde tek bir epidermal hücre analizi göstermektedir. Sisteminin şematik Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. Hücreden tek bir hücre ablasyon ve bir LAESI kütle spektrumu bir temsilci örnek Şekil 2&#39;de verilmektedir.

Lazer ablasyon elektrosprey iyonizasyon (LAESI) kütle spektrometresi hücreleri örnek bilenmiş bir fiber optik kablo kullanılarak, atmosferik basınç, bitki ve hayvan hücreleri üzerinde kütle spektrometresi ile tek bir hücre analizi yapılır.

Doğrudan Atmosferik Basınç Kütle Spektrometresi Tek Hücre Analizi

Tek hücrelerdeki biyokimyasalların analizi; hücre metabolizması, hücre döngüsü, adaptasyon, hastalık durumları vb. süreçlerin anlaşılması için önemlidir. Aynı hücre bile...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, tek bir canlı hücrenin içeriğini dışarı atmak ve serbest kalan biyomolekülleri, atmosferik basınçta bir kütle spektrometresi ile analiz edilmek üzere iyonize etmektir. Bu işlem, uzun mesafeli bir mikroskop aracılığıyla tek bir hücre seçilerek ve seçilen hücrenin sivriltilmiş bir optik fiber vasıtasıyla iletilen 2,94 mikrometre dalga boyundaki bir lazer darbesiyle ablasyonu yapılarak gerçekleştirilir. Tek bir hücrenin ablasyonu, ablasyon püskürtüsünü iyonize etmek için nötr partiküler maddelerden oluşan mikroskobik bir püskürtünün oluşmasıyla sonuçlanacaktır.Bir elektro sprey tarafından yakalanır. Spreyden gelen yüklü damlacıklar, hücreden kaynaklanan ablasyon plümindeki partiküllerle birleşir. Ortaya çıkan damlacıklar, hücreden gelen moleküllerle tohumlanır ve ilgili iyonları üretir.Tek bir hücreden elde edilen kütle spektrumunu gösteren sonuçlar elde edilmiştir. Spektrum, hücrenin metabolitleri ve lipidleri ile ilgili çok sayıda pik içermektedir. Merhaba, ben George Washington Üniversitesi Kimya Bölümü'ndeki Verese Laboratuvarı'ndan Dr. Bin Drester.Bugün size, atmosferik basınçta kütle spektrometrisi ile tekil canlı hücrelerin doğrudan analizine yönelik prosedürü göstereceğiz. Bu prosedürü, laboratuvarımızda tekil bitki ve hayvan hücrelerinden elde edilen metabolitleri ve lipidleri incelemek için kullanıyoruz. Haydi başlayalım.Lazer ablasyonu, elektro sprey iyonizasyonu ve kütle spektrometresi veya LAESI MS, 2,94 mikrometre dalga boyunda beş nanosaniyelik bir lazer darbesi ile gerçekleştirilir. Bu çalışmadaki ablasyon işlemi için neodimyum YAG lazer tarafından sürülen ayarlanabilir optik parametrik osilatör kullanılmıştır.Başlamak için, bir optik fiberin aşındırılmış ucunu bir mikro manipülatöre monte edin ve hücre yüzeyine yakın bir konuma getirin. Enerjinin verimli bir şekilde depolanması için, optik hizalama amacıyla optik fiberin aşındırılmamış ucunu çıplak fiber tutucu ile tutun. Fiber tutucu, beş eksenli bir translatöre monte edilmiştir.Korumalı altın aynalar kullanarak orta kızılötesi lazer ışınını odaklama merceğine yönlendirin ve ışını; plano konveks kalsiyum florür veya antirefle kaplamalı çinko selenür bir mercek aracılığıyla fiberin aşındırılmamış ucuna odaklayarak lazer enerjisini fibere aktarın. Sivritilmiş fiber ucu ile hücre yüzeyi arasındaki mesafeyi korumak için, yüzeyden ölçüldüğünde 15 ila 30 derecelik bir açıyla monte edilmiş uzun mesafe video mikroskobu kullanın. Bu sistem ayrıca, izleme ve görüntü yakalama için bir CCD kamera ile donatılmış, beş kat büyütmeli sonsuzluk düzeltmeli bir objektif mercekten oluşmaktadır.Hücreleri üstten görüntülemek ve analiz için seçmek amacıyla, numune yüzeyine dik açıyla yerleştirilmiş ikinci bir video mikroskobu kullanılır. Bu sistem, ablasyon ve analiz için fiber ucun seçilen hücre üzerine hizalanmasını sağlayan görsel geri bildirim sağlar. Sistem, 10 kat sonsuz düzeltmeli uzun çalışma mesafeli bir objektif lens ve bir CCD kamera ile birlikte yedi kat hassas zoom optik adaptörden oluşmaktadır.Elektrospray sistemi; iletken perflor elastomerli metal bir bağlantı, ferrül bağlantı parçaları, borular, kılıf iğne girişi ve FU silika borular kullanılarak oluşturulmuştur. Önerilen emiter paslanmaz çelikten yapılmıştır ve 50 µm çapında konik bir uca sahiptir; elektrospray için %0,1 asetik asit içeren %50 metanol çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi bir şırınga pompası ile dakikada 200 ila 300 nL hızla pompalayın.500 µL'lik bir şırınga kullanılarak, regüleli bir güç kaynağı aracılığıyla metal birleşim noktasına 2.803.000 V arasında yüksek bir voltaj uygulanacaktır. Sabit bir elektro sprey oluşturmak için, açık yüksek voltajla doğrudan temas elektrik şokuna yol açabileceğinden, tüm elektrik bağlantılarının güvenli olduğundan, ekranlama ile korunduğundan ve uygun şekilde topraklandığından emin olun. Canlı doku veya hücre örneğini uygun bir kaynaktan temin edin ve analizden önce önerilen şekilde muhafaza edin.Bu demonstrasyon için kullanılan allium cepa soğanları yerel bir mağazadan satın alınmıştır. Allium cepa soğanı örnek hazırlığı için bir soğanı cerrahi bisturi ile boyuna kesin ve soğan soğanı pulundan yaklaşık iki santimetrekarelik bir segment kesin. Ardından, iç epidermal dokunun bozulmamış tek bir tabakasını soyun. Epidermisinin ıslak yüzeyini kullanarak dokuyu önceden temizlenmiş bir cam mikroskop lamı üzerine yerleştirin.Lamı, konumlandırma için üç eksenli bir translasyon tablasına monte edilmiş genel amaçlı bir plaka tutucuyla tutun. Hücre bozulmasını önlemek için örneği monte ettikten hemen sonra kütle spektrumlarını elde edin. İşleme lazeri, elektrosprayı ve kütle spektrometresini açarak başlayın.Ablasyon noktasının ve elektro sprey yayıcısının konumlarını birbirlerine ve kütle spektrometresinin orifisine göre ayarlayarak lazy iyon kaynağının geometrisini optimize edin. Maksimum iyon yoğunluğunu elde etmek için, üstten görünüm görselleştirme sistemini kullanarak analiz için ilgili hücreyi seçin. Seçimin ardından, seçilen hücreyi optik fiberin sivriltilmiş ucunun doğrudan altına getirmek için numune tablasını hareket ettirin.Yan görünüm mikroskobu kullanarak, uç ile hücre yüzeyi arasındaki mesafeyi yaklaşık 20 mikron olacak şekilde yeniden ayarlayın. Seçilen hücreye aşındırılmış fiber uç aracılığıyla lazer darbeleri göndererek doğru konumu belirleyin. Bu işlem, hücre duvarının perforasyonuna ve sitoplazmanın partikül şeklinde dışarı atılmasına neden olur.Elektrosprayeleme ile iyonizasyon sonrası, üretilen iyonlar kütle spektrometresi tarafından toplanır ve kütle spektrumları kaydedilir. Veri alımı tamamlandıktan sonra lazeri, elektrosprayleme sistemini ve kütle spektrometresini bekleme moduna alın veya kapatın. Ablasyon uygulanan allium cper doku örneğini isteğe bağlı ışık mikroskobu gözlemi için saklayın; tek bir hücrenin başarılı bir şekilde ablasyonu, hücre duvarının patlamasıyla ve belirgin bir kütle spektrumunun elde edilmesiyle sonuçlanır.Bir allium SEPA soğanının gömülü tek bir epidermal hücresine uygulanan lazy MS analizinin sonuçları, temsili bir optik mikroskopi görüntüsüyle birlikte burada sunulmuştur. Bir hücreden örnekleme yapıldıktan sonra, hücre duvarı delinir ve delinme boyutu komşu hücrelerle olan sınırlar tarafından kısıtlanır. Bitişikteki hücreler sağlam görünmektedir.Burada, hücreden elde edilen temsili bir lazer kütle spektrumu gösterilmiştir. Hücre başına allium denizinden çok çeşitli iyonlar saptanmış ve bunların doğru kütleleri, izotop dağılım desenleri ve tandem kütle spektrumlarına dayanarak iyonlar dikkatle endojen metabolitlerle eşleştirilmiştir. Tek bir hücreden saptanan iyonlar, aynı dokunun çoklu hücrelerin geleneksel lazer MS analiziyle incelenmesinde gözlenenlerle benzerlik göstermiştir.Sizlere, atmosferik basınçta kütle spektrometresi ile tekil canlı hücrelerin nasıl analiz edileceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, sınıf dört kızılötesi lazerlerin neden olabileceği kazara maruziyetten kaçınmak için koruyucu gözlük takmayı unutmamak önemlidir. Hepsi bu kadar.İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

direct-analysis-single-cells-mass-spectrometry-at-atmospheric

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Lazer ablasyon elektrosprey iyonizasyon (LAESI) kütle spektrometresi bir atmosferik basınçlı iyon kaynağı. Görüntüleme modunda, orta-kızılötesi lazer probları bir doku bölüm veya bir biyofilm boyunca moleküllerin dağılımları. Bu teknik, doğal deneysel koşullar altında yürütülen çeşitli biyoanalitik çalışmalar için yeni bir yaklaşım sunuyor.

Atmosferik basınç Moleküler Görüntüleme LAESI Kütle Spektrometresi Biyolojik Dokular ve Biyofilmler

Burada, MS analizi için minyatür çok işlevli bir cihaz olan tek probu kullanarak hem dokuların ortam kütle spektrometresi görüntülemesini (MSI) hem de yerinde canlı tek hücreli MS (SCMS) analizini gerçekleştirmek için protokoller sunuyoruz.

Tek prob Uygulamalar: Ortam Koşullarında Kütle Spektrometre Görüntüleme ve Tek Hücre Analizi

Gerçek zamanlı yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ve çok değişkenli istatistiksel analiz doğrudan analizi ile botanik malzemenin türü tanımlanması için bir yöntem sunulmuştur.

Gerçek Zamanlı Yüksek Çözünürlüklü Kütle Spektrometresi Doğrudan Analizi Kullanılarak Botanik Malzeme Hızlı Yüksek verim Türler Kimlik

Biz hızlı içinde in situ örnekleme yüksek kesinlik ve en az işgal kılcal tabanlı mikro-örnekleme, kimyasal bir anlık görüntüsünü metabolik aktivite karakterizasyonu kolaylaştırmak için kullanarak tek bir hücre bulunan küçük bir bölümünün etkinleştirmek adımları tarif canlı embriyolar bir ölçüye göre tek hücre Kapiler Elektroforez ve kütle spektrometresi platformu kullanarak.

Microprobe kılcal Elektroforez kütle spektrometresi canlı Kurbağa (Xenopus laevis) embriyo tek hücreli Metabolomics için

Entegre hücre manipülasyon platformu, ortam koşullarında bireysel süspansiyon hücrelerinin on-line analizi için tek prob Kütle Spektrometrisi kurulumu ile birlikte kullanılmak üzere geliştirilmiştir.

Entegre hücre manipülasyon platformu tek süspansiyon hücrelerinde Ilaçların ve metabolitlerin Kütle Spektrometrisi analizi için tek prob ile birleştiğinde

Bu protokol, tek hücreli çözünürlüğe ulaşabilen entegre bir Raman spektroskopi-kütle spektrometresi (MS) platformu sunar. Raman spektroskopisi ilaçlara hücresel yanıt çalışma için kullanılabilir, MS ilaç alımı ve metabolizma hedefli ve kantitatif analizi için kullanılabilir iken.

Tek Hücreli İlaç Alımı, Metabolizması ve Etkileri Üzerine Entegre Raman Spektroskopisi ve Kütle Spektrometresi Platformu

Bu protokolde, memeli hücrelerinin, hem manuel hem de otomatik pipetleme seçenekleriyle, ticari olarak temin edilebilen reaktifler ve ekipmanlar kullanılarak kütle spektrometresi yoluyla tek hücreli proteomik analiz için nasıl hazırlanacağını açıklıyoruz.

Dondurarak Isı Lizisi ve İzobarik Taşıyıcı Kullanarak Kütle Spektrometresi Analizi için Tek Hücreli Proteomik Hazırlık

Bu protokol, uçucu tuz çözeltisi yıkama, hızlı sıvı nitrojen söndürme, dondurarak kurutma ve -8 °C'de depolamayı birleştirerek tek hücreli kütle spektrometrisi (SCMS) için hücre metabolitlerini korumayı amaçlamaktadır. Metabolit profillerini korumak için sıvı nitrojen söndürmenin gerekli olduğunu, metabolik değişiklikleri önlemek için uzun süreli soğuk depolamanın en aza indirilmesi gerektiğini göstermektedir.

Tek Hücreli Kütle Spektrometresi Metabolomik Çalışmaları için Numune Hazırlama: Kombine Hücre Yıkama, Söndürme, Kurutma ve Depolama

Bu protokol, yüksek mekansal çözünürlüklü metabolomik analiz için desorpsiyon elektrosprey iyonizasyonu ve Orbitrap kütle spektrometreleriyle eşleştirilen OVCAR-8 hücrelerinin tek hücreli kütle spektrometrisi görüntülemesini açıklar.

Orbitrap Kütle Spektrometrelerine Bağlı Desorpsiyonlu Elektrosprey İyonizasyon Kullanarak Tek Hücreli Kütle Spektrometrisi Görüntüleme

Bu video Matriks Yardımlı Lazer Desorpsiyon İyonizasyon Kütle Spektrometresi (MALDI-MS) ile peptitler ve proteinlerin analizi için bir ultra-ince matris / analit bir tabaka hazırlık göstermektedir.

MALDI Numune Hazırlama: Ultra İnce Tabaka Yöntemi

Öğrenin, LAESI kütle spektrometrisi ile tek hücre analizi yapmayı; bu yöntem atmosferik basınçta canlı bitki ve hayvan hücrelerindeki metabolitleri ve lipidleri doğrudan incelemenizi sağlar.

Doğrudan Atmosferik Basınç Kütle Spektrometresi Tek Hücre Analizi

Daha fazla video keşfet