Doğrudan Atmosferik Basınç Kütle Spektrometresi Tek Hücre Analizi
4 Eylül 2010
Lazer ablasyon elektrosprey iyonizasyon (LAESI) kütle spektrometresi hücreleri örnek bilenmiş bir fiber optik kablo kullanılarak, atmosferik basınç, bitki ve hayvan hücreleri üzerinde kütle spektrometresi ile tek bir hücre analizi yapılır.
Aşağıdaki deneyin genel amacı, tek bir canlı hücrenin içeriğini dışarı atmak ve serbest kalan biyomolekülleri, atmosferik basınçta bir kütle spektrometresi ile analiz edilmek üzere iyonize etmektir. Bu işlem, uzun mesafeli bir mikroskop aracılığıyla tek bir hücre seçilerek ve seçilen hücrenin sivriltilmiş bir optik fiber vasıtasıyla iletilen 2,94 mikrometre dalga boyundaki bir lazer darbesiyle ablasyonu yapılarak gerçekleştirilir. Tek bir hücrenin ablasyonu, ablasyon püskürtüsünü iyonize etmek için nötr partiküler maddelerden oluşan mikroskobik bir püskürtünün oluşmasıyla sonuçlanacaktır.
Bir elektro sprey tarafından yakalanır. Spreyden gelen yüklü damlacıklar, hücreden kaynaklanan ablasyon plümindeki partiküllerle birleşir. Ortaya çıkan damlacıklar, hücreden gelen moleküllerle tohumlanır ve ilgili iyonları üretir.
Tek bir hücreden elde edilen kütle spektrumunu gösteren sonuçlar elde edilmiştir. Spektrum, hücrenin metabolitleri ve lipidleri ile ilgili çok sayıda pik içermektedir. Merhaba, ben George Washington Üniversitesi Kimya Bölümü'ndeki Verese Laboratuvarı'ndan Dr. Bin Drester.
Bugün size, atmosferik basınçta kütle spektrometrisi ile tekil canlı hücrelerin doğrudan analizine yönelik prosedürü göstereceğiz. Bu prosedürü, laboratuvarımızda tekil bitki ve hayvan hücrelerinden elde edilen metabolitleri ve lipidleri incelemek için kullanıyoruz. Haydi başlayalım.
Lazer ablasyonu, elektro sprey iyonizasyonu ve kütle spektrometresi veya LAESI MS, 2,94 mikrometre dalga boyunda beş nanosaniyelik bir lazer darbesi ile gerçekleştirilir. Bu çalışmadaki ablasyon işlemi için neodimyum YAG lazer tarafından sürülen ayarlanabilir optik parametrik osilatör kullanılmıştır.
Başlamak için, bir optik fiberin aşındırılmış ucunu bir mikro manipülatöre monte edin ve hücre yüzeyine yakın bir konuma getirin. Enerjinin verimli bir şekilde depolanması için, optik hizalama amacıyla optik fiberin aşındırılmamış ucunu çıplak fiber tutucu ile tutun. Fiber tutucu, beş eksenli bir translatöre monte edilmiştir.
Korumalı altın aynalar kullanarak orta kızılötesi lazer ışınını odaklama merceğine yönlendirin ve ışını; plano konveks kalsiyum florür veya antirefle kaplamalı çinko selenür bir mercek aracılığıyla fiberin aşındırılmamış ucuna odaklayarak lazer enerjisini fibere aktarın. Sivritilmiş fiber ucu ile hücre yüzeyi arasındaki mesafeyi korumak için, yüzeyden ölçüldüğünde 15 ila 30 derecelik bir açıyla monte edilmiş uzun mesafe video mikroskobu kullanın. Bu sistem ayrıca, izleme ve görüntü yakalama için bir CCD kamera ile donatılmış, beş kat büyütmeli sonsuzluk düzeltmeli bir objektif mercekten oluşmaktadır.
Hücreleri üstten görüntülemek ve analiz için seçmek amacıyla, numune yüzeyine dik açıyla yerleştirilmiş ikinci bir video mikroskobu kullanılır. Bu sistem, ablasyon ve analiz için fiber ucun seçilen hücre üzerine hizalanmasını sağlayan görsel geri bildirim sağlar. Sistem, 10 kat sonsuz düzeltmeli uzun çalışma mesafeli bir objektif lens ve bir CCD kamera ile birlikte yedi kat hassas zoom optik adaptörden oluşmaktadır.
Elektrospray sistemi; iletken perflor elastomerli metal bir bağlantı, ferrül bağlantı parçaları, borular, kılıf iğne girişi ve FU silika borular kullanılarak oluşturulmuştur. Önerilen emiter paslanmaz çelikten yapılmıştır ve 50 µm çapında konik bir uca sahiptir; elektrospray için %0,1 asetik asit içeren %50 metanol çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi bir şırınga pompası ile dakikada 200 ila 300 nL hızla pompalayın.
500 µL'lik bir şırınga kullanılarak, regüleli bir güç kaynağı aracılığıyla metal birleşim noktasına 2.803.000 V arasında yüksek bir voltaj uygulanacaktır. Sabit bir elektro sprey oluşturmak için, açık yüksek voltajla doğrudan temas elektrik şokuna yol açabileceğinden, tüm elektrik bağlantılarının güvenli olduğundan, ekranlama ile korunduğundan ve uygun şekilde topraklandığından emin olun. Canlı doku veya hücre örneğini uygun bir kaynaktan temin edin ve analizden önce önerilen şekilde muhafaza edin.
Bu demonstrasyon için kullanılan allium cepa soğanları yerel bir mağazadan satın alınmıştır. Allium cepa soğanı örnek hazırlığı için bir soğanı cerrahi bisturi ile boyuna kesin ve soğan soğanı pulundan yaklaşık iki santimetrekarelik bir segment kesin. Ardından, iç epidermal dokunun bozulmamış tek bir tabakasını soyun. Epidermisinin ıslak yüzeyini kullanarak dokuyu önceden temizlenmiş bir cam mikroskop lamı üzerine yerleştirin.
Lamı, konumlandırma için üç eksenli bir translasyon tablasına monte edilmiş genel amaçlı bir plaka tutucuyla tutun. Hücre bozulmasını önlemek için örneği monte ettikten hemen sonra kütle spektrumlarını elde edin. İşleme lazeri, elektrosprayı ve kütle spektrometresini açarak başlayın.
Ablasyon noktasının ve elektro sprey yayıcısının konumlarını birbirlerine ve kütle spektrometresinin orifisine göre ayarlayarak lazy iyon kaynağının geometrisini optimize edin. Maksimum iyon yoğunluğunu elde etmek için, üstten görünüm görselleştirme sistemini kullanarak analiz için ilgili hücreyi seçin. Seçimin ardından, seçilen hücreyi optik fiberin sivriltilmiş ucunun doğrudan altına getirmek için numune tablasını hareket ettirin.
Yan görünüm mikroskobu kullanarak, uç ile hücre yüzeyi arasındaki mesafeyi yaklaşık 20 mikron olacak şekilde yeniden ayarlayın. Seçilen hücreye aşındırılmış fiber uç aracılığıyla lazer darbeleri göndererek doğru konumu belirleyin. Bu işlem, hücre duvarının perforasyonuna ve sitoplazmanın partikül şeklinde dışarı atılmasına neden olur.
Elektrosprayeleme ile iyonizasyon sonrası, üretilen iyonlar kütle spektrometresi tarafından toplanır ve kütle spektrumları kaydedilir. Veri alımı tamamlandıktan sonra lazeri, elektrosprayleme sistemini ve kütle spektrometresini bekleme moduna alın veya kapatın. Ablasyon uygulanan allium cper doku örneğini isteğe bağlı ışık mikroskobu gözlemi için saklayın; tek bir hücrenin başarılı bir şekilde ablasyonu, hücre duvarının patlamasıyla ve belirgin bir kütle spektrumunun elde edilmesiyle sonuçlanır.
Bir allium SEPA soğanının gömülü tek bir epidermal hücresine uygulanan lazy MS analizinin sonuçları, temsili bir optik mikroskopi görüntüsüyle birlikte burada sunulmuştur. Bir hücreden örnekleme yapıldıktan sonra, hücre duvarı delinir ve delinme boyutu komşu hücrelerle olan sınırlar tarafından kısıtlanır. Bitişikteki hücreler sağlam görünmektedir.
Burada, hücreden elde edilen temsili bir lazer kütle spektrumu gösterilmiştir. Hücre başına allium denizinden çok çeşitli iyonlar saptanmış ve bunların doğru kütleleri, izotop dağılım desenleri ve tandem kütle spektrumlarına dayanarak iyonlar dikkatle endojen metabolitlerle eşleştirilmiştir. Tek bir hücreden saptanan iyonlar, aynı dokunun çoklu hücrelerin geleneksel lazer MS analiziyle incelenmesinde gözlenenlerle benzerlik göstermiştir.
Sizlere, atmosferik basınçta kütle spektrometresi ile tekil canlı hücrelerin nasıl analiz edileceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, sınıf dört kızılötesi lazerlerin neden olabileceği kazara maruziyetten kaçınmak için koruyucu gözlük takmayı unutmamak önemlidir. Hepsi bu kadar.
İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.
Genel Bakış
Bu çalışma, bitki ve hayvan hücrelerinin tek hücre analizleri için lazer ablasyon elektrospray iyonizasyon (LAESI) kütle spektrometresinin kullanımını göstermektedir. Bu yöntem, hücresel metabolitlerin ve lipidlerin atmosferik basınçta doğrudan analizine olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kütle Spektrometrisi
- Hücre Biyolojisi
- Analitik Kimya
Arka Plan
- Tek hücre analizi, hücresel fonksiyonların anlaşılması için kritik öneme sahiptir.
- LAESI kütle spektrometrisi, kapsamlı numune hazırlığına gerek kalmadan biyomoleküllerin analiz edilmesini sağlar.
- Bu teknik hem bitki hem de hayvan hücrelerine uygulanabilir.
- Metabolitlerin ve lipidlerin anlaşılması, hücresel süreçlere dair içgörüler sağlayabilir.
Çalışmanın Amacı
- Tekil canlı hücrelerin doğrudan analizi için bir yöntem geliştirmek.
- Tekil hücrelerde bulunan metabolitleri ve lipidleri incelemek.
- Biyolojik araştırmalarda LAESI kütle spektrometrisinin uygulanabilirliğini göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- Uzak mesafe mikroskobu kullanılarak tek bir hücrenin seçilmesi.
- Optik fiber aracılığıyla iletilen bir lazer darbesi kullanılarak hücrenin ablasyonu.
- Bir elektrospray sistemi kullanılarak ablasyon plumanın iyonizasyonu.
- Bir kütle spektrometresi kullanılarak kütle spektrumlarının toplanması.
Ana Sonuçlar
- Tekil hücrelerin başarılı bir şekilde ablasyonu, metabolitler ve lipidlerle ilişkili pikler içeren kütle spektrumları ile sonuçlanmıştır.
- Yöntem, komşu hücrelere minimum düzeyde zarar verdiğini göstermiştir.
- Kütle spektrumları, hücresel kompozisyon hakkında ayrıntılı bilgi sağlamıştır.
- Görsel geri bildirim sistemleri, hücre seçimi ve analizinin hassasiyetini artırmıştır.
Sonuçlar
- LAESI kütle spektrometrisi, tek hücre analizi için etkili bir araçtır.
- Bu teknik, hücresel bileşenlerin gerçek zamanlı analizine olanak tanır.
- Bu yöntem, tek hücreleri içeren çeşitli biyolojik çalışmalara uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Atmosferik basınçta doğrudan tek hücre kütle spektrometrisi, doğal hücresel durumları bozmadan etiketsiz metabolik profilleme yapılmasına olanak tanır ve izojenik popülasyonlardaki heterojen biyobelirteç ekspresyonunu ortaya çıkararak erken hedef validasyonunu destekler. Bu yetenek, fenotipik tarama sonuçlarıyla korele olan kantitatif, uzaysal olarak çözünürlemiş metabolit verileri sağlayarak aday belirleme sürecindeki riskleri azaltır ve preklinik hedef seçimindeki devam/dur kararlarına bilgi sağlar. Yöntemin canlı hücrelerle uyumluluğu ve minimum numune hazırlığı gerektirmesi, moleküler hedeflerin hızlı ve tekrarlanabilir fenotipik ankrajlamasını gerektiren keşif aşaması iş akışlarıyla örtüşmektedir.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Fizyolojik koşullar altında tek canlı hücrelerdeki endojen metabolit ve lipid heterojenliğini haritalayarak terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Fiksasyon veya ekstraksiyon artefaktları olmadan biyokimyasalların doğrudan, etiketsiz tespiti yoluyla mekanistik belirsizliği azaltır.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Tekil hücrelerden kantitatif ve tekrarlanabilir kütle spektrumları üretir; böylece metabolit tabanlı fenotipik tarama için analiz standardizasyonuna olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Fiber ile iletilen lazer ablasyonu ve elektrospray iyonizasyonu aracılığıyla ölçeklenebilir platform kullanımını destekleyerek, otomatik tek hücre analiz iş akışlarına entegrasyonu kolaylaştırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Tek hücreli LAESI-MS verilerinden translasyonel biyobelirteç adayları sağlayarak, keşif aşamasındaki metabolik fenotipleri preklinik modellerle ilişkilendirir.
- Operasyonel Değer: Farklı hücre tipleri ve koşullar arasında tutarlı, depo içermeyen moleküler okumalar sunarak, hedef doğrulamadan öncü bileşik optimizasyonuna kadar süreklilik sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hipotez odaklı hedef doğrulamadan öncü bileşik tanımlamaya kadar uzanan keşif sürecine uygundur; burada tek hücreli metabolik profilleme, bileşik taraması öncesinde hedef güvenilirliği ve fenotipik analiz tasarımı hakkında bilgi sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Ablasyona uğramış tek hücrelerden doğrudan endojen metabolit ve lipidleri saptayarak yolak açıklığa kavuşturulmasını ve biyolojik risklerin azaltılmasını destekler.
- Tarama: Yerel hücresel biyokimyayı yansıtan kantitatif, çökelme içermeyen kütle spektrumlarının üretimi aracılığıyla analiz hazırlığını mümkün kılar.
- Analitik: Doğru kütle, izotop dağılımı ve tandem MS yoluyla metabolit ve lipid okumaları sağlayarak deneysel koşullar arasında karşılaştırmalı analize olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Hastalıkla ilgili sistemlerle uyumlu metabolit imzalarını belirleyerek ve biyobelirteç uyumunu destekleyerek preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Boylamsal tek hücre çalışmaları için yeniden kullanılabilir analitik bir kapasite işlevi görerek projeler arası yeniden doğrulama ihtiyaçlarını azaltır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Örnek perturbasyonu olmaksızın, hücresel metabolitlerin doğrudan ortam iyonizasyonu yoluyla hedef doğrulamada öngörüsel güven.
- Operasyonel Değer: Atmosferik basınç altında, fiber kuplajlı lazer ablasyonu ve kontrollü elektrospray iyonizasyonu aracılığıyla standartlaştırma ve tekrarlanabilirlik.
- Stratejik Değer: Hedeflerin erken dönem metabolik risk analizleri yoluyla geç evre biyolojik risklerin azaltılmasıyla iyileştirilmiş devam/durdurma kararları.
- Portföy Etkisi: Heterojen yanıtların tek hücre çözünürlüğü ile analizi sayesinde bileşik etkilerinin katmanlandırılmasını sağlayan riskle uyumlu önceliklendirme.
Uygulama Hususları
- Orta-IR ablasyon ve elektrospray iyonizasyon için lazer güvenliği, optik hizalama ve kütle spektrometrisi veri yorumlama konularında uzmanlık gerektirir.
- Ayarlanabilir orta-IR lazer sistemlerine, optik fiber iletimine, yüksek voltajlı elektrospray emitörlerine ve senkronize kütle spektrometresi veri toplama sistemlerine bağlıdır.
- Laboratuvarlar arasında tekrarlanabilir iyon verimi için hücre işleme, ablasyon parametreleri ve sprey geometrisinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Bitki, memeli veya mikrobiyal modeller arasında geçiş yapılırken farklı hücre boyutları, membran sertliği ve hücre dışı matris için adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Geometrik optimizasyon adımlarında belirtildiği üzere, pluma yayılım etkileri ve iyonizasyon verimliliğinin ablasyon noktası ile sprey arasındaki mesafeye bağımlılığı gibi pratik sınırlamaları içerir.
