Görüntüleme Protein-protein etkileşimleri In vivo

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hücre yüzeyindeki protein-protein etkileşimlerinin varlığını değerlendirmektir. Bu, öncelikle ilgilenilen iki reseptörün klonlanması ve ikinci bir adım olarak, emisyon spektrumları örtüşen iki florofora myo terminal üzerinden bağlanmasıyla gerçekleştirilir. Reseptör ekspresyonu için iki vektör, endotel hücrelerine eş zamanlı olarak transfekte edilir.

Bu noktada floroforlar, reseptör lokalizasyonunun yanı sıra genel ekspresyon düzeyinin değerlendirilmesine yardımcı olur. Ardından, konfokal mikroskopta kontrol olarak tekli transfeksiyon kullanılarak görüntüleme parametreleri belirlenir. Transfekte edilen hücreler, reseptör ekspresyon ve lokalizasyonlarının göreceli düzeylerine göre tek tek seçilir.

Ardından, FRET sonuçlarının kapsamını değerlendirmek amacıyla bu hücreler içindeki bölgeler görüntülenir. Bu sonuçlar, FRET ve konfokal mikroskopiye dayanarak endotel hücre yüzeyindeki tie1 ve tie2 etkileşimlerini göstermektedir. Merhaba, ben Virginia Commonwealth Üniversitesi Biyokimya ve Moleküler Biyoloji Bölümü'ndeki Dr. William Barton'ın laboratuvarından Tom Seger.

Bugün sizlere, FRET tabanlı konfokal mikroskopi ile endotel hücrelerdeki protein-protein etkileşimlerinin değerlendirilmesine yönelik bir prosedürü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu yöntemi, anjiyogenez sırasındaki reseptör etkileşimlerini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

FRET tabanlı bir yakınlık testi kullanarak protein-protein etkileşimlerini görüntülemek için, ilgilendiğiniz reseptörleri monomerik CFP veya YFP içeren pcd, a 3.1 hydro veya neo vektörünün NHE one eco R one bölgelerine klonlayarak başlayın. FRET tayini ampiriktir ve transmembran bölgesi ile floroforun başlangıcı arasındaki bağlayıcı (linker) uzunluğuna kritik derecede bağlıdır. Bu nedenle, incelenen her yeni reseptör çifti için farklı uzunluklarda birkaç bağlayıcı denenmelidir; vektörleri ekteki protokole uygun olarak transforme edin ve amplifiye edin.

Ardından, beraberindeki protokole uygun olarak transfeksiyon düzeyinde DNA hazırlayın, vektörleri transforme edin ve amplifiye edin. Daha sonra, transfeksiyon düzeyinde DNA hazırlayın ve hücreleri transfeksiyona hazırlamak için bunu mikrolitre başına bir mikrogramlık bir çalışma konsantrasyonuna seyreltin; doku kültürü ön kaportası altında, komple DMEM içerisinde büyütülen EAHY 92 6 hücrelerini iki mililitre medyum içeren lamel yerleştirilmiş 35 milimetrelik kaplara bölün. Her bir tekil reseptörün ekspresyonunu değerlendirmek için bir kap ve her bir reseptör çifti için bir kap hazırlayın.

Hücreleri ertesi güne kadar %95 karbondioksit atmosferi altında 37 °C'de inkübe edin. Transfeksiyon gününde kültür, yaklaşık %70 ila %90 konfluens düzeyinde olmalıdır. İki µg kimerik reseptör vektör DNA'sını, 200 µL önceden ısıtılmış Optimum-RF içinde sekiz µL Fuji N HD ile karıştırarak nükleolipid komplekslerini hazırlayın. Reseptör çiftleri için her bir reseptörden birer µg olmak üzere toplam iki µg ile transfekte edin; karışımı ters çevirerek nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.

İnkübasyon süresi boyunca, hücreleri transfeksiyona hazırlamak için taze medyumu aspire edin ve iki mililitre önceden ısıtılmış, antibiyotiksiz complete DMEM eklemeden önce her plakayı ılık PBS ile nazikçe ve kısaca yıkayın. Penisilin ve streptomisin, FU gene HD tedavisi sırasında hücreler için önemli ölçüde daha toksik olduğundan, bunların bulunmasından kaçınmak önemlidir. Kompleksi hücrelere damla damla ekleyin ve 20 ila 24 saat daha inkübe edin. 24 saat sonra, medyumu hücrelerden dikkatlice aspire edin ve transfeksiyon sonrası taze, antibiyotikli complete DMEM pipetleyin.

Hücre canlılığı nispeten yüksek kalmalıdır. Çok az sayıda yüzen hücre görülmeli veya hiç görülmemelidir. Canlı hücre görüntüleme yapmak için; mavi diyot argon ile yeşil, turuncu ve kırmızı helyum neon lazerlerle donatılmış A-T-C-S-P two A OBS konfokal lazer tarama mikroskobu, H-C-X-P-I-A-O 63 x 1.3 NA gliserin immersiyon objektifi, motorlu bir XY tablası ve sıcaklık, nem ve karbondioksit kontrollü bir tabla inkübatörü kullanıyoruz.

Emisyon kanalları arasındaki florokrom çapraz etkileşimini (crosstalk) ortadan kaldırmanın yanı sıra ekspresyon sorunlarını ve spesifik olmayan florokrom tutunmasını değerlendirmek için deneysel kontroller kritik öneme sahiptir. Bu doğrultuda, CFP ve YFP emisyon kanalları arasındaki çapraz etkileşimi önlemek amacıyla, her görüntüleme oturumunun kurulumunda tekli florokrom transfekte hücreler kullanılır. CFP ekspresyon kontrolünü beyaz ışık altında sahne inkübatörüne yerleştirin.

Hücrelere odaklanmak için Z tablasını ayarlayın. Her iki emisyon kanalını izlerken, CFP emisyon tespiti için SP pencere ayarlarını 465 ila 505 nanometreye, YFP için ise 525 ila 600 nanometreye ayarlayın ve CFP'yi 458 nanometrede uyarın. A OTF'yi kullanarak, CFP'nin YFP emisyon kanalına belirgin bir sızıntı yapmasını önleyecek şekilde lazer gücünü ayarlayın.

Bu ayarı kaydedin. 514 nanometredeki uyarım gücünü ayarlayarak, CFP kanalındaki YFP çapraz konuşması (crosstalk) için aynı kontrolü gerçekleştirin. Yalnızca YFP eksprese eden hücreler için bu ayarı kaydedin.

Ardından, CFP ve YFP eksprese eden hücreler sahne inkübatörüne yerleştirilir. LICO konfokal yazılımının dizi ayarları kullanılarak, yazılımın kabul edilebilir fotobleyking programı hariç, uygun membran lokalizasyonuna sahip ve benzer düzeylerde CFP ve YFP eksprese eden hücreler LICO yazılımı ile tespit edilir.

Donör ve akseptör ayarlarını sırasıyla kayıtlı CFP ve YFP ayarlarınıza getirin. Hücreye yakınlaştırarak, hücresel membran üzerinde YFP'nin fotoyıkımının gerçekleşeceği bir ilgi alanı veya ROI belirleyin ve akseptörün fotoyıkımı için programı başlatın. AOTF'yi 514 nanometrenin %100'üne ayarlayın ve lazer ağartması, YFP emisyonunun %70'i tükenene kadar devam etsin.

Ağartmayı hızlandırmak için fotobleaching sırasında genellikle lazerin raster ekseninde ROI'ler seçilir. Hücresel hareketi izleyin ve XY düzleminde belirgin hareketle elde edilen ölçümleri reddedin. Bu ölçümler yanlış FRET verimlilikleri bildirebileceğinden, hem donör hem de akseptör için ağartma öncesi ve sonrası görüntüler kaydedilir ve FRET verimliliği, tüm Dpost > Dpre durumları için FRET verimliliği = (post - DLO) / depost olarak hesaplanır; burada Dpre ve Dpost sırasıyla fotobleaching öncesi ve sonrası donör şiddetleridir.

Deneysel değişkenliğin boyutunu belirlemek için JMP kullanılır. Bireysel reseptörler, farklı uzunluklardaki juxtamembran dizileriyle birlikte hem CFP hem de YFP ile füzyonlanmalıdır. Mümkün olan en iyi reseptör FRET partneri çiftini belirlemek için, diğerleri tarafından elde edilen önceki bulgulara rağmen, transfeksiyon verimlilikleri tipik olarak %30 ile %40 arasındadır.

Bir vektörün transfeksiyonunun ve ekspresyonunun diğerini desteklediğini gözlemlemedik. Hatta, sıklıkla flora birinin veya diğerinin özel ekspresyonunu gözlemliyoruz. Bu temsili görüntüler, bir EAHY 9 26 hücresinde CFP ve YFP arasında gerçekleşen fret'in akseptör fotobeyazlatma analizini göstermektedir.

CFP ve YFP emisyon kanalları, fotoblökleme öncesinde ve sonrasında ayrı ayrı izlenmiş ve hesaplamalar ilgili bölgeyle sınırlandırılmıştır. T reseptör sistemi için yönlendirme amacıyla A-C-F-P-Y-F-P birleştirilmiş görüntüsünün büyütülmüş üst katmanında, kırmızı kutu içerisinde FRET verimliliği, 1,0'da yüksek (kırmızı renkli) ile sıfırda düşük (mor renkli) arasında mutlak bir aralık olarak gösterilmektedir. Burada gösterildiği üzere, tipik FRET verimlilik değerleri epitel hücreler için %20 ila %28, endotel hücreler için ise %19 ila %23'tür.

Bu teknikte uzmanlaşıldığında, işlem uygun şekilde gerçekleştirilirse genellikle üç ila dört gün sürer. Bu prosedür uygulanırken, hedef proteininiz ile füzyon floresan protein arasındaki bağlayıcı uzunluğunun yanı sıra, bunların ekspresyon seviyelerinin ve hücresel hareketlerinin, işlem sonrası FRET ölçümünü doğrudan etkilediğini unutmamak önemlidir. Ayrıca, gelişimin ardından sinyal iletim yolakları hakkında bilgi edinmek amacıyla sinyal aktivasyonuna yönelik biyokimyasal analizler gerçekleştirilebilir.

Bu teknik, zayıf veya geçici protein-protein etkileşimlerinin incelenebileceği bir analiz yöntemi sunar. Bu videoyu izledikten sonra, canlı hücrelerde kendi FRET tabanlı yakınlık analizlerinizi nasıl gerçekleştireceğiniz konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Doku kültüründeki hücrelerle çalışırken, uygun güvenlik önlemlerinin her zaman takip edilmesi gerektiğini unutmayın.

İzlediğiniz için teşekkür eder, gelecekteki fret deneylerinizde başarılar dileriz.