Name: Görüntüleme Protein-protein etkileşimleri In vivo /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Öğrenin, FRET tabanlı yakınlık analizi ile endotelyal hücrelerdeki protein-protein etkileşimlerini canlı hücre görüntüleme kullanarak nasıl değerlendireceğinizi. Bu yöntem, anjiyogenez sırasında reseptör dinamiklerini incelemek için güvenilir bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Dr. Scott Henderson konfokal mikroskobu ile yardım için kabul etmek istiyoruz. Bu araştırma, WAB Mikroskopi Tıp Massey Kanser Merkezi ve Okulu (VCU) VCU-Bölümü yapıldı WAB için Ulusal Sağlık 1RO1CA127501 Enstitüleri hibe yanı sıra pilot proje finansmanı tarafından desteklenmiştir. Nörobiyoloji &amp; kısmen NIHNINDS Merkezi çekirdekli hibe 5P30NS047463 finansman ile desteklenen Anatomi Mikroskopi Tesisi,,.

Protokol üç önemli adımlar oluşur. Memeli bir ifade amino-terminal CFP ve / veya YFP monomerik sürümleri için vektör sadece kısa bir süre tartışılan olacaktır ilgi gen ilk adım klonlama. Ikinci ve üçüncü adımları EA.hy926 endotel hücreleri içine vektör DNA transfeksiyon ve FRET ile konfokal görüntüleme, daha derinlemesine aşağıda özetlenmiştir. 1. OBP ve YFP Kimerik Reseptörler İnşaatı Ilgi Reseptörler CFP ve YFP monomerik gelişmiş versiyonları için amino-terminal klonlanmış olmalıdır. FRET, belirlenmesi, deneysel ve eleştirel transmembran bölgeye yayılan ve fluorofor 1 başlaması arasında ilintileyici uzunluğu üzerine bağlıdır . Bu nedenle, birkaç farklı uzunluklarda ilintileyici soruşturma altında her yeni reseptör çifti için araştırılmalıdır. <ol><li> Monomerik C veya YFP (bu vektör laboratuarımızda elde edilebilir) içeren pcDNA3.1 rutubet R ya da neo R vektör içine NheI / EcoRI sitelerine ilgi reseptör klonu. * Not Gerekirse, NheI SpeI ve XbaI dahil uyumlu diğer birçok enzimler. </li><li> Uygun bir endA1 reca yetkili hücre hattı (rutin Mach1 kullanmak) ligasyon reaksiyonu dönüştürün. Ekran kolonilerin varlığı eklemek için DNA mutasyonlarının yokluğunda doğrulamak için sıralama tarafından izledi. </li><li> Başarılı moleküler klonlama konformasyon elde edilmesi üzerine, Qiagen, ya da benzer DNA kitleri kullanılarak steril su veya TE transfeksiyon dereceli vektör DNA hazırlamak. UV spektroskopisi kullanarak, konsantrasyon ve saflık değerlendirin. DNA tipik verim 100-200 mikrogram, rutin bir çalışma stok 1 mcg / ml 'ye seyreltilerek aralığında olmalıdır. </li></ol> 2. EA.hy 926 Hücreler, Transfeksiyon <ol><li> Mattek lamel (0) sayılı, 2 ml orta 35 mm yemekleri tam-DMEM yetişen EA.hy 926 hücreler 4, (% DMEM 10 fetal sığır serumu + Pen. / Strep.) Böl . Konservatif bir konfluent çanak 15 cm ~ 15 yemekleri (~% 90 konfluent ertesi gün) elde edebilirsiniz. Her bir reseptör ifade yanı sıra her alıcı çifti için bir çanak değerlendirmek için bir tabak hazırlayın. </li><li> Hücrelerin 37% 5 CO 2 atmosferde gece boyunca inkübe İzin ° C Ertesi gün, kültürleri, ~% 70-90 konfluent olmalıdır. </li><li> Transfeksiyon gün, Fugene6 8 mcL kimerik reseptör vektör DNA (2 mcL) 2 mg, önceden ısıtılmış OptiMEM 200 mcL karıştırılarak nucleolipid kompleksleri hazırlayacak. Reseptör çiftleri için, her reseptör 2 mikrogram toplam 1 mcg transfect (aşağıya tartışma bakın). </li><li> Tersine çevirerek yavaşça karıştırın. </li><li> 30 dakika oda sıcaklığında inkübe devam edin. </li><li> Kuluçka dönemi sırasında, hücrelerin transfeksiyon için hazırlamak. Taze medya aspire ve antibiyotik olmadan önceden ısıtılmış 2 mL tam-DMEM (DMEM + FBS) ilave önce sıcak PBS ile hafifçe ve kısaca her plaka yıkayın. Fugene6 ile tedavi sırasında hücrelere çok daha fazla toksik olduğu, Penisilin ve Streptomisin varlığını önlemek için önemlidir. </li><li> Hücrelere bilge karmaşık damla ekleyin ve ek bir 20-24 saat boyunca inkübe 37 ° C,% 5 CO 2 atmosfer . </li><li> 24 saat sonra hücrelerin, dikkatlice medya aspirat ve antibiyotikler ile taze tam DMEM pipetle. Transfeksiyon sonra, hücre canlılığı nispeten yüksek kalmalıdır, yani hiçbir kayan hücreleri çok az dikkat edilmelidir. </li><li> Gen ifadesi, genellikle ek bir 48-60 saat sonrası transfeksiyon sonra maksimum. Ancak, görüntüleme, 24 saat gibi kısa bir tipik olarak uygulanabilir. En iyi gen ekspresyonu için zaman ders deneyler yapılmalıdır. </li></ol> 3. Konfokal Görüntüleme ve Analiz FRET Canlı hücre görüntüleme mavi diyot (405 nm), Argon (458, 476, 488, 514 nm) ile donatılmış bir Leica TCS SP2 Kelime Size Neyi Çağrıştırıyor konfokal lazer tarama mikroskobu yapılır. yeşil HeNe (543 nm), turuncu HeNe (594 nm), ve kırmızı HeNe (633 nm) lazerler, bir HCX PI Apo 63x/1.3 na gliserin daldırma objektif lens, bir motorize XY (Märzhäuser) ve çevre kontrollü ( sıcaklık, nem ve CO 2) evre inkübatör (Pecon). Deneysel kontrolleri fluorofor emisyon kanallarının yanı sıra, değerlendirmek ifade sorunları ve non-spesifik fluorofor multimerization arasında çapraz tartışma ortadan kaldırmak için kritik öneme sahiptir. Gibi, tek fluorofor transfections her görüntü oturumu kurmak için kullanılmaktadır. Negatif kontroller (bilinen noninteracting reseptörleri kullanarak), arka plan belirlemek amacıyla yapılacak gerekecektir FRET FRET aşırı ifade nedeniyle oluşur. <ol><li> CFP YFP için emisyon kanallar arasında crosstalk ortadan kaldırmak için, CFP ifade kontrol sahne kuvöz içine yerleştirin. Beyaz ışık kullanarak, odaklanmak için Z plaka ayarlamakhücrelere. </li><li> CFP 465-505 nm ve 525-600 nm YFP emisyon algılama SP pencere ayarları ayarlayın. </li><li> Hem de emisyon kanalları izleme, 458 nm'de CFP heyecanlandırmak. AOTF kullanarak, YFP emisyon kanal içine CFP üzerinde kayda değer bir sızdırma ortadan kaldırmak için lazer güç ayarlayın. Bu ayarı kaydedin. </li><li> Sadece YFP ifade hücreleri için 514 nm uyarma gücü ayarlayarak CFP kanal YFP karışma (YFP ifade kontrolü kullanarak) aynı kontrol gerçekleştirin. Bu ayarı kaydedin. </li><li> Sonraki yerde hücrelerin ortak ifade, sahne kuvöz içine CFP ve YFP. Leica konfokal yazılımı için sıra ayarını kullanarak, CFP ve YFP uygun membran lokalizasyonu ile benzer seviyelerde ifade hücrelerin bulun. </li><li> Leica yazılım acceptor fotoğraf beyazlatma programı kullanarak, respectably, kaydedilmiş CFP ve YFP ayarları donör ve alıcı ayarlarını. </li><li> Zoomlama hücre, hücre zarının meydana gelen ve programa başlamak için YFP fotoğraf yok olduğu bir yatırım getirisi (faiz bölge) vurgulayın. </li><li> Acceptor fotoğraf imhası için% 100, 514 nm'de AOTF ayarlamak ve YFP emisyonu% 70 tükendiği kadar devam beyazlatma lazer izin. Beyazlatma hızlandırmak için, ROI'ler genellikle lazer tarama ekseni (X-ekseni) seçilir. </li><li> Foto-beyazlatma sırasında, bu ölçümler, sahte verimlilik FRET rapor gibi, hücresel hareketi izlemek ve XY düzleminde kayda değer bir hareketi ile elde edilen ölçümler reddetmek. </li><li> Donör (OBP) ve alıcı (YFP) için, öncesi ve sonrası-bleach görüntüleri kaydedilmiş ve verimlilik gibi hesaplanır FRET: Bütün D Mesaj&gt; D öncesi D ön Verim = (D post-D ön) / D post FRET ve D sonrası sırasıyla photobleaching önce ve sonra donör yoğunluğu. </li><li> JMP Yazılım (SAS), deneysel değişkenlik boyutunu belirlemek için kullanılır. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Transfeksiyon verimleri% 30 ila% 40 arasında genellikle. Başkaları tarafından önceki bulgulara rağmen, bir vektör ve ifade transfeksiyon diğer yana olduğunu görmedim. Gerçekten de, sık sık bir fluorofor chimera veya diğer özel ifade gözlemlemek. Tipik verimleri reseptör sistemleri arasında değişir FRET. Tie reseptör sistemi için tipik değerler için% 20-28 epitel hücreleri ve endotel hücreleri% 19-23. Negatif kontroller için tipik verimliliği% 2-3 altında. Değişkenlik ölçüde deneyimi ile büyük ölçüde azalacak. <img src="/files/ftp_upload/2149/2149fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Transfekte EA.hy 926 hücreler Temsilcisi görüntüler. EA.hy 926 hücre tek tabaka A) DIC görüntü. B) (A) görüntülenen hücreler Floresans görüntüsü. C) Overlay (A) ve (B) gösteren ~% 20-30 transfeksiyon verimliliği. <img src="/files/ftp_upload/2149/2149fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Temsilcisi acceptor CFP YFP arasında bir EA.hy926 hücrede meydana gelen FRET analizi fotoğraf beyazlatma CFP emisyon kanal (üst paneller) ve YFP emisyon kanal (alt iki panel) önce ayrı ayrı izlenir ve yazılan acceptor photobleaching . Photobleaching deneylere sınırlı ve yeşil kutu içinde bölge, hesaplanan değerler FRET edildi. FRET verimliliği sadece yönlendirme amaçlı görüntü birleştirilmiş bir CFP / YFP büyütülmüş bir kaplama düşük (mor-0.0) yüksek mutlak bir aralığı (kırmızı-1.0) olarak görüntülenir.

<ol><li>Kim, M., Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+transmembrane+signaling+by+cytoplasmic+domain+separation+in+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bidirectional transmembrane signaling by cytoplasmic domain separation in integrins.</a> Science. 301, 1720-1725 (2003).</li>
<li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+of+lipidmodified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Partitioning of lipidmodified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296, 913-916 (2002).</li>
<li>Seegar, T. C. M., Eller, B., Tzvetkova-Robev, D., Kolev, M., Henderson, S. C., Nikolov, D. B., Barton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tie1-Tie2+interactions+mediate+functional+differences+between+angiopoietin+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Tie1-Tie2 interactions mediate functional differences between angiopoietin ligands.</a> Molecular Cell. 37 (5), 643-655 (2010).</li>
<li>Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+cell+line+expressing+human+factor+VIII-related+antigen+established+by+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (12), 3734-3737 (1983).</li>
</ol>

Başarısı için kritik olan birkaç adım vardır. Bunların arasında en belirgin iki kimerik reseptörleri arasında ifade göreli seviyeleri. Bu sorunu aşmak için, bir iki ilgi proteinleri ifade stabil hücre hatları yapmak veya eşdeğer ifade izin vektör DNA en iyi oranlar tespit edebilir. Benzer şekilde, bir yemek boyunca üniform olmayan transfeksiyon nedeniyle, protein düzeyleri nadiren hücreler arasındaki eşdeğer olacaktır. Bu nedenle, dikkat, &#39;düşük&#39;, &#39;yüksek&#39; expressors ayırt ödenmelidir. Ekran &#39;ortalama&#39; protein düzeyleri genellikle güvenilir ve tekrarlanabilir sonuç veren bu verimliliğin FRET. Laboratuarımızda bu konuda rahatlatmak için peşine düşmüş bir yöntem &#39;, hatta&#39; gen ekspresyonu adeno ve Lenti-virüs. Ayrıca, alternatif bir yöntem belirlemek için acceptor fotoğraf beyazlatma etkinlikleri sensitize emisyon FRET. Gerçek zamanlı olarak tek hücre izlemek için sensitize emisyon potansiyeline rağmen, biz acceptor fotoğraf beyazlatma daha duyarlı ve daha güvenilir olmak için bulduk rağmen. Son olarak, protein etkileşimleri izlemek için FRET kullanarak zor ve membran bağlı reseptörleri için linker uzunlukları dikkatli seçimi gerektirir. Ayrıca, C / YFP yanı sıra, sık sık büyük endoplazmik retikulum ve golgi aygıtı agregasyonunda protein ekspresyon düzeyleri ve sonuçları etkiler. Ancak, geçici, ya da dengesiz etkileşimleri, FRET kullanmak için ideal bir yöntem.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11960-069</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin- Streptomisin</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovin Serum</td><td>Hyclone</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>FUGENE 6</td><td>Roche Group</td><td>11814443001</td><td></td></tr><tr><td>Lam Kaplı Kaplar</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G014C</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1(+)</td><td>Invitrogen</td><td>V790&amp;#8208;20</td><td></td></tr><tr><td>Mach 1 Kompetan Hücreler</td><td>Invitrogen</td><td>C862003</td><td></td></tr></tbody></table>

görüntüleme protein-protein etkileşimleri in vivo</em

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein etkileşimleri, gerekli tüm hücresel süreçlerin bir işaretidir. Ancak, bu etkileşimlerin birçok co-immunoprecipitation gibi geleneksel biyokimyasal yöntemlerle belirlenmesi ve analiz önlenmesi, geçici ya da enerjik zayıf. Bu bağlamda, genetik encodable floresan proteinleri (GFP, TTT, vs) ve floresans spektrumu örtüşen ilişkili Förster rezonans enerji transferi (FRET) 1-3 kullanarak in vivo olarak zayıf etkileşimleri izlemek için yeteneğimizi devrim yarattı. Burada, endotel hücre yüzeyinde reseptör-reseptör etkileşimlerinde izlenmesi için bir FRET tabanlı yakınlık testinin detaylı kullanımı.

Bu protokol bir FRET tabanlı yakınlık tahlil kullanarak nasıl görüntü protein-protein etkileşimleri açıklar.

Görüntüleme Protein-protein etkileşimleri In vivo</em

Protein-protein etkileşimleri, tüm temel hücresel süreçlerin ayırt edici bir özelliğidir. Bununla birlikte, bu etkileşimlerin çoğu geçicidir veya enerjik olarak zayıftır...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hücre yüzeyindeki protein-protein etkileşimlerinin varlığını değerlendirmektir. Bu, öncelikle ilgilenilen iki reseptörün klonlanması ve ikinci bir adım olarak, emisyon spektrumları örtüşen iki florofora myo terminal üzerinden bağlanmasıyla gerçekleştirilir. Reseptör ekspresyonu için iki vektör, endotel hücrelerine eş zamanlı olarak transfekte edilir.Bu noktada floroforlar, reseptör lokalizasyonunun yanı sıra genel ekspresyon düzeyinin değerlendirilmesine yardımcı olur. Ardından, konfokal mikroskopta kontrol olarak tekli transfeksiyon kullanılarak görüntüleme parametreleri belirlenir. Transfekte edilen hücreler, reseptör ekspresyon ve lokalizasyonlarının göreceli düzeylerine göre tek tek seçilir.Ardından, FRET sonuçlarının kapsamını değerlendirmek amacıyla bu hücreler içindeki bölgeler görüntülenir. Bu sonuçlar, FRET ve konfokal mikroskopiye dayanarak endotel hücre yüzeyindeki tie1 ve tie2 etkileşimlerini göstermektedir. Merhaba, ben Virginia Commonwealth Üniversitesi Biyokimya ve Moleküler Biyoloji Bölümü'ndeki Dr. William Barton'ın laboratuvarından Tom Seger.Bugün sizlere, FRET tabanlı konfokal mikroskopi ile endotel hücrelerdeki protein-protein etkileşimlerinin değerlendirilmesine yönelik bir prosedürü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu yöntemi, anjiyogenez sırasındaki reseptör etkileşimlerini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.FRET tabanlı bir yakınlık testi kullanarak protein-protein etkileşimlerini görüntülemek için, ilgilendiğiniz reseptörleri monomerik CFP veya YFP içeren pcd, a 3.1 hydro veya neo vektörünün NHE one eco R one bölgelerine klonlayarak başlayın. FRET tayini ampiriktir ve transmembran bölgesi ile floroforun başlangıcı arasındaki bağlayıcı (linker) uzunluğuna kritik derecede bağlıdır. Bu nedenle, incelenen her yeni reseptör çifti için farklı uzunluklarda birkaç bağlayıcı denenmelidir; vektörleri ekteki protokole uygun olarak transforme edin ve amplifiye edin.Ardından, beraberindeki protokole uygun olarak transfeksiyon düzeyinde DNA hazırlayın, vektörleri transforme edin ve amplifiye edin. Daha sonra, transfeksiyon düzeyinde DNA hazırlayın ve hücreleri transfeksiyona hazırlamak için bunu mikrolitre başına bir mikrogramlık bir çalışma konsantrasyonuna seyreltin; doku kültürü ön kaportası altında, komple DMEM içerisinde büyütülen EAHY 92 6 hücrelerini iki mililitre medyum içeren lamel yerleştirilmiş 35 milimetrelik kaplara bölün. Her bir tekil reseptörün ekspresyonunu değerlendirmek için bir kap ve her bir reseptör çifti için bir kap hazırlayın.Hücreleri ertesi güne kadar %95 karbondioksit atmosferi altında 37 °C'de inkübe edin. Transfeksiyon gününde kültür, yaklaşık %70 ila %90 konfluens düzeyinde olmalıdır. İki µg kimerik reseptör vektör DNA'sını, 200 µL önceden ısıtılmış Optimum-RF içinde sekiz µL Fuji N HD ile karıştırarak nükleolipid komplekslerini hazırlayın. Reseptör çiftleri için her bir reseptörden birer µg olmak üzere toplam iki µg ile transfekte edin; karışımı ters çevirerek nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.İnkübasyon süresi boyunca, hücreleri transfeksiyona hazırlamak için taze medyumu aspire edin ve iki mililitre önceden ısıtılmış, antibiyotiksiz complete DMEM eklemeden önce her plakayı ılık PBS ile nazikçe ve kısaca yıkayın. Penisilin ve streptomisin, FU gene HD tedavisi sırasında hücreler için önemli ölçüde daha toksik olduğundan, bunların bulunmasından kaçınmak önemlidir. Kompleksi hücrelere damla damla ekleyin ve 20 ila 24 saat daha inkübe edin. 24 saat sonra, medyumu hücrelerden dikkatlice aspire edin ve transfeksiyon sonrası taze, antibiyotikli complete DMEM pipetleyin.Hücre canlılığı nispeten yüksek kalmalıdır. Çok az sayıda yüzen hücre görülmeli veya hiç görülmemelidir. Canlı hücre görüntüleme yapmak için; mavi diyot argon ile yeşil, turuncu ve kırmızı helyum neon lazerlerle donatılmış A-T-C-S-P two A OBS konfokal lazer tarama mikroskobu, H-C-X-P-I-A-O 63 x 1.3 NA gliserin immersiyon objektifi, motorlu bir XY tablası ve sıcaklık, nem ve karbondioksit kontrollü bir tabla inkübatörü kullanıyoruz.Emisyon kanalları arasındaki florokrom çapraz etkileşimini (crosstalk) ortadan kaldırmanın yanı sıra ekspresyon sorunlarını ve spesifik olmayan florokrom tutunmasını değerlendirmek için deneysel kontroller kritik öneme sahiptir. Bu doğrultuda, CFP ve YFP emisyon kanalları arasındaki çapraz etkileşimi önlemek amacıyla, her görüntüleme oturumunun kurulumunda tekli florokrom transfekte hücreler kullanılır. CFP ekspresyon kontrolünü beyaz ışık altında sahne inkübatörüne yerleştirin.Hücrelere odaklanmak için Z tablasını ayarlayın. Her iki emisyon kanalını izlerken, CFP emisyon tespiti için SP pencere ayarlarını 465 ila 505 nanometreye, YFP için ise 525 ila 600 nanometreye ayarlayın ve CFP'yi 458 nanometrede uyarın. A OTF'yi kullanarak, CFP'nin YFP emisyon kanalına belirgin bir sızıntı yapmasını önleyecek şekilde lazer gücünü ayarlayın.Bu ayarı kaydedin. 514 nanometredeki uyarım gücünü ayarlayarak, CFP kanalındaki YFP çapraz konuşması (crosstalk) için aynı kontrolü gerçekleştirin. Yalnızca YFP eksprese eden hücreler için bu ayarı kaydedin.Ardından, CFP ve YFP eksprese eden hücreler sahne inkübatörüne yerleştirilir. LICO konfokal yazılımının dizi ayarları kullanılarak, yazılımın kabul edilebilir fotobleyking programı hariç, uygun membran lokalizasyonuna sahip ve benzer düzeylerde CFP ve YFP eksprese eden hücreler LICO yazılımı ile tespit edilir.Donör ve akseptör ayarlarını sırasıyla kayıtlı CFP ve YFP ayarlarınıza getirin. Hücreye yakınlaştırarak, hücresel membran üzerinde YFP'nin fotoyıkımının gerçekleşeceği bir ilgi alanı veya ROI belirleyin ve akseptörün fotoyıkımı için programı başlatın. AOTF'yi 514 nanometrenin %100'üne ayarlayın ve lazer ağartması, YFP emisyonunun %70'i tükenene kadar devam etsin.Ağartmayı hızlandırmak için fotobleaching sırasında genellikle lazerin raster ekseninde ROI'ler seçilir. Hücresel hareketi izleyin ve XY düzleminde belirgin hareketle elde edilen ölçümleri reddedin. Bu ölçümler yanlış FRET verimlilikleri bildirebileceğinden, hem donör hem de akseptör için ağartma öncesi ve sonrası görüntüler kaydedilir ve FRET verimliliği, tüm Dpost > Dpre durumları için FRET verimliliği = (post - DLO) / depost olarak hesaplanır; burada Dpre ve Dpost sırasıyla fotobleaching öncesi ve sonrası donör şiddetleridir.Deneysel değişkenliğin boyutunu belirlemek için JMP kullanılır. Bireysel reseptörler, farklı uzunluklardaki juxtamembran dizileriyle birlikte hem CFP hem de YFP ile füzyonlanmalıdır. Mümkün olan en iyi reseptör FRET partneri çiftini belirlemek için, diğerleri tarafından elde edilen önceki bulgulara rağmen, transfeksiyon verimlilikleri tipik olarak %30 ile %40 arasındadır.Bir vektörün transfeksiyonunun ve ekspresyonunun diğerini desteklediğini gözlemlemedik. Hatta, sıklıkla flora birinin veya diğerinin özel ekspresyonunu gözlemliyoruz. Bu temsili görüntüler, bir EAHY 9 26 hücresinde CFP ve YFP arasında gerçekleşen fret'in akseptör fotobeyazlatma analizini göstermektedir.CFP ve YFP emisyon kanalları, fotoblökleme öncesinde ve sonrasında ayrı ayrı izlenmiş ve hesaplamalar ilgili bölgeyle sınırlandırılmıştır. T reseptör sistemi için yönlendirme amacıyla A-C-F-P-Y-F-P birleştirilmiş görüntüsünün büyütülmüş üst katmanında, kırmızı kutu içerisinde FRET verimliliği, 1,0'da yüksek (kırmızı renkli) ile sıfırda düşük (mor renkli) arasında mutlak bir aralık olarak gösterilmektedir. Burada gösterildiği üzere, tipik FRET verimlilik değerleri epitel hücreler için %20 ila %28, endotel hücreler için ise %19 ila %23'tür.Bu teknikte uzmanlaşıldığında, işlem uygun şekilde gerçekleştirilirse genellikle üç ila dört gün sürer. Bu prosedür uygulanırken, hedef proteininiz ile füzyon floresan protein arasındaki bağlayıcı uzunluğunun yanı sıra, bunların ekspresyon seviyelerinin ve hücresel hareketlerinin, işlem sonrası FRET ölçümünü doğrudan etkilediğini unutmamak önemlidir. Ayrıca, gelişimin ardından sinyal iletim yolakları hakkında bilgi edinmek amacıyla sinyal aktivasyonuna yönelik biyokimyasal analizler gerçekleştirilebilir.Bu teknik, zayıf veya geçici protein-protein etkileşimlerinin incelenebileceği bir analiz yöntemi sunar. Bu videoyu izledikten sonra, canlı hücrelerde kendi FRET tabanlı yakınlık analizlerinizi nasıl gerçekleştireceğiniz konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Doku kültüründeki hücrelerle çalışırken, uygun güvenlik önlemlerinin her zaman takip edilmesi gerektiğini unutmayın.İzlediğiniz için teşekkür eder, gelecekteki fret deneylerinizde başarılar dileriz.

imaging-protein-protein-interactions-in-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video kullanımı ile mikro-desenli yüzeyler, protein-protein etkileşimleri sonraki analizi ile deneyler gösterir. Bu yaklaşım, canlı hücreler protein etkileşimleri tespit etmek imkanı sunar ve kantitatif bilgileri ayıklamak imkanı ile yüksek verimlilik özellikleri bir araya getiriyor.

Mikro desenli Yüzeyler, protein-protein etkileşimleri-vivo Algılama

Işıksal çözülmesi iki foton mikroskobu görüntüleme sistemi kullanılarak, piksel düzeyinde Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) verimlilik haritaları, homo-oligomerik komplekslerini oluşturmak için hipotez membran reseptörleri hücre elde edilir. Verimlilik haritaları FRET, çalışma kapsamında oligomer kompleksi hakkında stokiyometrik bilgi tahmin etmek mümkün.

Işıksal Çözülmüş İki foton Mikroskop kullanarak G Protein Coupled Reseptör Etkileşmeleri in vivo Niceleme

Test protein-protein etkileşim protein işlevsellik diseksiyon için vazgeçilmezdir. Burada, bir...

Protein Membran Kaplama Testi: Çözünür ve çözünmez Proteinler Arasında Etkileşim Test Protokolü In vitro</em

In vivo protein komplekslerinin oluşumu bimoleküler floresan tamamlanmasıyla görselleştirilebilir. Etkileşim ortakları floresan etiketler tamamlayıcı bölümlerine bağlı ve geçici olarak tütün yaprakları olarak ifade edilen iki protein arasında yakın üzerine yeniden flüoresan sinyal elde edilir.

Tütün protoplastlarında ve Yapraklar Bimoleküler Floresan tamamlama tarafından Visualized protein-protein etkileşimleri

Protein-protein etkileşimleri bir hücrenin hem çekirdeğinde hem de sitoplazmasında meydana gelebilir. Bu etkileşimleri araştırmak için geleneksel ko-immünopresipitasyon ve modern yakınlık ligasyon testi uygulanır. Bu çalışmada, NF90-RBM3 etkileşimlerinin çekirdek ve sitoplazmadaki dağılımını görselleştirmek için bu iki yöntemi karşılaştırıyoruz.

Co-immunoprecipitation tarafından Nükleer ve Sitoplazmik Kesirler Protein-protein Etkileşim görselleştirme ve<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity ligasyon Testi

Bu el yazması luciferase etkinlik ölçümü temel protein-protein etkileşimleri belirlenmesi için kolay ve hızlı deneysel bir işlem açıklanır.

Luciferase tamamlayıcı Imaging tahlil Nicotiana benthamiana yaprakları Protein-protein etkileşim Dynamics geçici belirlenmesi için

Burada, kütle spektrometresi için numunelerin hazırlanması için bir on-membran sindirim tekniği için bir protokol sunuyoruz. Bu teknik, protein-protein etkileşimlerinin uygun analizini kolaylaştırır.

Bir on-membran sindirim tekniği kullanılarak protein-protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi

Kantitatif Multipleks İmmünopantü (QMI), iki örnek arasındaki hedeflenen protein-protein etkileşimlerinin bolluğundaki farklılıkların hassas tespiti için akış sitometrisini kullanır. QMI biyomalzeme küçük bir miktar kullanılarak yapılabilir, genetiği değiştirilmiş etiketleri gerektirmez, ve daha önce tanımlanmış herhangi bir protein etkileşim ağı için adapte edilebilir.

Multipleksed Co-İmmünopreyağış Kullanarak Protein Etkileşim Ağı Dinamiğinin Ölçülmesi

Membran temas bölgelerini (MCS'ler) incelemek için yeni yaklaşımlara duyulan ihtiyaç, bu hücresel yapıları ve bileşenlerini incelemeye olan ilginin artması nedeniyle artmıştır. Burada, MCS'lerde bulunan organel içi ve organeller arası protein komplekslerini tanımlamak ve ölçmek için önceden mevcut olan mikroskopi teknolojilerini entegre eden bir protokol sunuyoruz.

ER-Mitokondri Temas Bölgelerinde Endojen Organel İçi Protein Etkileşimlerinin Yakınlık Ligasyon Testleri ile Görselleştirilmesi ve Miktarının Belirlenmesi

Protokol, ilgilenilen bir proteine kaynaşmış bir biyotin ligaza yakınlıklarına dayalı olarak biyotinin proteinlere in vivo kovalent bağlanması için bir yöntem sunar. Bu modifikasyon, protein etkileşim çalışmalarında gerektiği gibi streptavidin boncukları kullanılarak proteinlerin seçici olarak zenginleştirilmesine izin verir.

İn vivo Paramecium tetraurelia'da Protein Etkileşim Çalışmaları için Yakınlık Biyotinilasyonu

Öğrenin, FRET tabanlı yakınlık analizi ile endotelyal hücrelerdeki protein-protein etkileşimlerini canlı hücre görüntüleme kullanarak nasıl değerlendireceğinizi. Bu yöntem, anjiyogenez sırasında reseptör dinamiklerini incelemek için güvenilir bir araç sunar.

Görüntüleme Protein-protein etkileşimleri In vivo

Daha fazla video keşfet