Name: Bir Eski-ovo Tavuk Embriyo Kültürü Sistemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Öğrenin, tavuk embriyolarında uzun süreli ex-ovo kültür sistemi ile embriyogenez sürecini incelemeyi. Bu yöntem mikroenjeksiyon ve mikrocerrahi uygulamaları için tam optik erişim sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1 Ex-ovo Kültür Protokolü: <ol><li> Döllenmiş tavuk yumurta inkübe <ol class="lroman"><li> Döllenmiş tavuk yumurtası 13 saklanabilir ° C inkübasyon 5 gün öncesine kadar geliştirme başlatılması. Bir kırmızı şarap soğutucusu, bu sıcaklıkta muhafaza edebilirsiniz. </li><li> 37.5 sürekli sallanan bir% 60 sabit nem inkübatör ° C de 72 saat inkübe yumurta künt yüzü yukarı. </li></ol></li><li> Hamaklar hazırlayın (Şekil 1a) <ol class="lroman"><li> 9 oz plastik bardak ılık steril su ile doldurun ¾. Düzenli bir 9 oz fincan, 8 cm üst çapa sahip. Biz bu boyutu, burada sunulan uzun süre kültür uygulama için en uygun olduğu bulundu. </li><li> Cut, 20 cm şal sarılmak. Etrafına bir lastik bant koyarak fincan dairesel yapıştırmayın. Plastik su üstüne yayılmış olmalıdır. Grubun etrafında aşırı plastik kesin. Biz taşınması sırasında sarısı bölme ile sonuçlanan, yumurta sarısı yapışmasını önler, bu uygulama için en uygun şal sarılmak bulundu. </li><li> Plastik,% 70 etanol ile ıslatılmış Kimwipes (Kimberly-Clark, Inc.) Ile silin. </li></ol></li><li> Inkübatör inkübasyon 72 saat sonra yumurta çıkarın. </li><li> % 70 etanol ıslak Kimwipes yüzey silerek yumurta sterilize edin. </li><li> Yumurtalar embriyo uygun konumlandırma (Şekil 1b) için 1-2 dakika yatay yatırın. Bir yumurta karton yatay yumurtlayarak için kullanılabilir. Embriyolar 1-2 dakika sonra başına dönecektir. </li><li> Laminer akış kaputu aseptik hamaklar üzerine embriyolar transfer. <ol class="lroman"><li> Yumurta (Şekil 1c) alt kısmında küçük bir göçük kalmayıncaya kadar keskin bir kenarı (metal bir kova veya bir cam beher kenarına gibi) kullanarak, yumurta hafifçe dokunun. Unutmayın, embriyo Üstyaka'da konumlandırılmış. </li><li> Başparmak göçük karşıt taraflarında koyun ve kabukları çekme dışında yatay (Şekil 1d). </li><li> Sarısı embriyo yanı albumin hamak (Şekil 1e) üzerine yerleştirin. Albumin, uzun kültür uygulamalar için embriyo beslenme sağlar yanı sıra hareketli sistem tarafından indüklenen şokları absorbe sarısı etrafında bir nemlendirme bir ortam sağlayacaktır. Su altında hamak, su sirkülasyonu ısıtıcı kullanıldığı takdirde görüntüleme sırasında embriyo taşıma sırasında yere paralel kalır ve ısı iletkeni olarak hizmet sağlayacaktır. </li><li> Embriyo transferi doğru yapılır zaten üstüne yerleştirilmiş olmalıdır. Aksi takdirde, bir keskinlik giderme, steril bir nesne (yani kapalı kavisli makas künt uçlu) ve yönünün okşamak embriyo başına döner böyle sarısı kullanın. </li><li> Embriyo mühür fincan üstünde 10 cm çapında Petri kabı yerleştirin. </li></ol></li><li> 37.5 inkübatör seti içine fincan kültürü Yer ° C Taşınabilir bir inkübatör kullanılması durumunda, distile su ile dolu 1-2 9 oz bardak yerleştirerek ~ az nem tutar% 60 (Şekil 1f). </li><li> Embriyonik gün 7 ötesinde kültür embriyolar, ezilmiş kabuğu parçaları, kemik gelişimi ve olgunlaşması için bir kalsiyum kaynağı olarak embriyo çevre etrafında dağınık olması gerekir. </li></ol> Dış inkübatör görüntüleme / manipülasyon için donatım: Dolaşan su banyosunda inkübasyon sıcaklıkları sürdürmek için ev inşa edildi, görüntüleme veya manipülasyon (Şekil 3). Fincan uygun bir su banyosu için uygun büyüklükte bir su deposu boru ile bağlanır. Bir direnç ısıtıcı, su sıcaklığı takip ederek elle düzenlenir, rezervuar su ısıtır. Bir su pompası, su dolaşır. Grafiksel gösterimi ultrasongraphy / florescent mikroskobu (Şekil 3) ile görüntüleme kolaylığı gösteriyor. <img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Hamak ve hamaklar için tavuk embriyo transferi hazırlanması. <img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Temsilcisi sonuçları - ex ovo kültür tekniği ile yetiştirilen farklı evre tavuk embriyolar HH 17 itibaren Embriyolar bu tekniği ile yetiştirilebilir. <img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Ex-ovo kültür sistemi ile birlikte ideal gelişme sıcaklığında embriyoların tutmak için kullanılan su dolaşım sistemi şematik ve temsili resim. 2. Seçilmiş Uygulamalar: I. Mikroenjeksiyon Bu, embriyo kültürü, mikroenjeksiyon uygulamaları için çözümler kontrast temelli görüntüleme dahil (yani florasan mikroskobu, mikro-bilgisayarlı topografya vb) (Şekil 4) damarsal enjekte gerekir uygundur. Aşağıda mikroenjeksiyon protokolü: <ol><li> Enjeksiyon hazırlayın apparaanlamda <ol class="lroman"><li> Moda, bir microforge kullanarak Eğimli ucu microneedles 0.75 ID kılcal cam tüpler çekti. Size gerekli ucu istenen hedef ven çapı / akış hızı bağlıdır. </li><li> 0.03 inçlik ID silikon tüp şırınga bağlayın. </li><li> Enjekte edilebilir çözüm tüp Yük ve boru microneedle bağlamak. </li><li> Microneedle, şırınga sahibinin veya şırınga pompası mikromanipülatör ve şırınga üzerine yerleştirin. </li></ol></li><li> Fincan böylece embriyo yükseltmek steril su ekleyin. Biz (yani vitelline gemi) bir kan damarı içine iğne uygun penetrasyon için gerekli olduğunu, yatay penetrasyon yaşadı. Bu embriyo fincan kenarları aynı düzlemde gerektirir. <ol class="lroman"><li> Plastik embriyonun altında tutan lastik bant çıkartın. </li><li> Plastik bir tarafı hafifçe kaldırın ve fincan için bazı steril su ekleyin. </li><li> Yeniden plastik lastik bant üzerine sabitleyin. </li></ol></li><li> Embriyonik bir gemi çözüm enjekte edilir. Bizim tecrübelerimize göre, çözüm bir vitelline gemi enjekte edildiğinde, kanamaya neden olmadan verimli perfüzyon korumak için damar çapı yaklaşık 1 / 10 ölçekli inci gereken microneedles. <ol class="lroman"><li> Microneedle hiçbir hava kabarcıklarının oluşumu sağlamak için bir çözüm Pompa. </li><li> Seçilen gemiye microneedle ucu aynı hizaya getirin. Vitellin gemiler için, bir çatal alanı seçerek maksimum alan gemi nüfuz verecektir. </li><li> Iğne gemi doğru itin. Geminin ilk geri çekilecektir. Iğne nüfuz sonra, perfüzyon başlar. Akan kan rengi perfüzyonu ile değiştirmeniz gerekir. Eğer renk değişimi görülür, iğne geminin dışına nüfuz olabilir. Renk değişikliği, geminin aynı anda görüldüğü kadar çözüm pompalama Bu durumda, yavaş yavaş microneedle geri çekmek. Perfüzyon tamamlandıktan sonra, geminin microneedle geri çekin. </li></ol></li></ol><img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4: ex-ovo kültürlü civciv embriyo damar içine floresan boya Mikroenjeksiyon. II. Mikrocerrahi Prosedürü - Sol Atriyal ligasyon Bu eski-ovo kültür kurulum embriyo tam erişilebilirlik sağlar civciv embriyolarının cerrahi uygulamaları gerçekleştirmek için idealdir. Aşağıda bir örnek tekniği için protokol, sol atriyal ligasyonu (LAL) (Şekil 5). Bu prosedür yaklaşık 24 saat kültür dönemi (HH24) yapılır: <ol><li> Knot overhand ~ 0.5 mm çapında 10-0 naylon cerrahi sütür kullanarak hazırlayın. </li><li> Ince forseps ile embriyo üzerinde, yerel ve allantoik koryonik membranlar kaldırmak ve embriyonun sol tarafında görünür olduğunu dikey geri döndürmek için embriyo kaldırın. </li><li> Ince forseps kullanarak, sol atrium içinde perikard kaldırmak. </li><li> Düğüm sol atrium içinde aynı hizaya getirin ve sıkın. ~% 75 sol tarafında orijinal kan akımı yasaklamak gibi düğüm bağlı olmalıdır. Microscissors düğüm kenarları kesin ve fazla dikiş dikkatlice çıkarın ve atın. </li><li> Orijinal oryantasyon (üst sağ tarafı) embriyo geri döndürün. </li><li> Şam kontrolleri aynı prosedürü içerecektir, ancak sütür geçirilir ve bağlı olacaktır. Etkin LAL tedavi (% 75 daralma), ameliyat sonrası 24 saat teyit edilmesi ve diskalifiye embriyolar dışı bırakılacaktır. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2154/2154fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5: Bir kontrolü ve sol atriyal bağlanan civciv embriyo Ok sol kulakçıklar bağlanan embriyo yaklaşık% 75 daha küçük gösterir .

<ol><li>Zamir, E. A., Czirok, A., Cui, C., Little, C. D., Rongish, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesodermal+cell+displacements+during+avian+gastrulation+are+due+to+both+individual+cell-autonomous+and+convective+tissue+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mesodermal cell displacements during avian gastrulation are due to both individual cell-autonomous and convective tissue movements.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19806-19811 (1980).</li>
<li>Ehrman, L. A., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+regulation+in+the+heart+forming+region+of+avian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Lack of regulation in the heart forming region of avian embryos.</a> Dev Biol. 207, 163-175 (1999).</li>
<li>Clark, E. B., Hu, N., Rosenquist, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+conotruncal+constriction+on+aortic-mitral+valve+continuity+in+the+stage+18%2C+21+and+24+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Effect of conotruncal constriction on aortic-mitral valve continuity in the stage 18, 21 and 24 chick embryo.</a> Am J Cardiol. 53, 324-327 (1984).</li>
<li>deAlmeida, A., McQuinn, T., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+ventricular+preload+is+compensated+by+myocyte+proliferation+in+normal+and+hypoplastic+fetal+chick+left+ventricle%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Increased ventricular preload is compensated by myocyte proliferation in normal and hypoplastic fetal chick left ventricle.</a> Circ Res. 100, 1363-1370 (2007).</li>
<li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Methods. 24, 43-48 (2001).</li>
<li>Butcher, J. T., McQuinn, T. C., Sedmera, D., Turner, D., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+in+early+embryonic+atrioventricular+valvular+function+correspond+with+changes+in+cushion+biomechanics+that+are+predictable+by+tissue+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Transitions in early embryonic atrioventricular valvular function correspond with changes in cushion biomechanics that are predictable by tissue composition.</a> Circ Res. 100, 1503-1511 (2007).</li>
<li>McQuinn, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+ultrasonographic+imaging+of+avian+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">High-frequency ultrasonographic imaging of avian cardiovascular development.</a> Dev. Dyn. 236, 3503-3513 (2007).</li>
<li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+procedure+for+the+long-term+cultivation+of+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos.</a> Dev Biol. 41, 391-394 (1974).</li>
</ol>

Optik erişim ve kuş embriyolarında deney yumurta kabuğu kısıtlamaları nedeniyle zordur. Pencereleme enjeksiyon ve mikrocerrahi yaklaşımları 8 için erişilebilir mikrodamarlar sayısı önemli ölçüde sınırlar . Sonuç olarak sadece erken embriyolar manipüle ve sürekli gözlem mümkün değildir. Embriyo üzerinde yüzey gerilimi yetersiz denetim nedeniyle uzun süreli kültür 9 engelledi Petri kutularına kullanarak Erken ex ovo kültürleri sınırlı kullanım. Yakın zamanda kabul edilebilir yüzey tenstion <...

<table><tbody><tr><td>Döllenmiş beyaz Leghorn tavuk yumurtaları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Model GB1, Avery İnkübatörleri, Hugo CO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saran Wrap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lastikler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ilık steril su</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>9 oz plastik bardak</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm çapında Petri kabı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1602N termal hava</td><td>GQF Üretimi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Florescein konjugatlı dekstran (2 MDa, fosfat tamponlu salinde %1 w/v)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikro dövme</td><td>Glassworx, Inc, St Louis MO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cam kılcal tüpler (0,75 mm iç çap)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipülatör</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>Model M3301L</td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroskobu</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Z20</td><td></td></tr><tr><td>İnce uçlu 55-pens</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10-0 naylon cerrahi sütur</td><td>Ethicon Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hortumlar</td><td>VWR International</td><td></td><td>1 mm dış çap</td></tr><tr><td>3 mL'lik şırınga</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;L pipetleyici ve pipet uçları</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bir eski-ovo</emgörüntüleme ve mikrocerrahi uygulamaları için uygundur> tavuk embriyo kültürü sistemi

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Normal ve kusurlu embriyonik gelişim sürücü ve genetik microenvironmental faktörler arasındaki ilişkilerin anlaşılması ve yeni tedavi stratejileri keşfetmek için esastır. Görüntüleme teknolojisindeki gelişmeler, organizasyon ve vücut planı olgunlaşması kantitatif araştırma etkin, ancak daha sonraki bir aşamada embriyonik morfolojilerinden daha az açıktır. Tavuk embriyolar kültür ve cerrahi manipülasyon kolaylığı nedeniyle bu uygulama için cazip bir omurgalı hayvan model sistem. Erken embriyolar, hücre desenlendirme ve kader çalışmaları 1,2 tam optik erişim sağlayan filtre kağıdı yüzük, kısa bir süre için kültür olabilir . Kalp morfolojilerinden gibi incelenmesi ileri gelişim süreçleri, geleneksel yumurta kabuğu 3-5 bir pencere üzerinden, ama bu tekniği pencere boyutu nedeniyle optik erişimi sınırlar . Daha önce 10 gün, ultrasonografi 6,7 ile yüksek çözünürlüklü görüntüleme etkin altıgen tartmak teknelerde eski-ovo kültürünün bütün embriyolar için basit bir yöntem geliştirdi. Bu kültürler canlı deneyleri için mevcut görüntüleme araçları türleri sınırlayarak, ulaşım zor. Biz burada bir maliyet-etkili, taşınabilir çevre haznesi ile geliştirilmiş bir kabuk daha az kültür sistemi mevcut. Yumurta kısmen steril su ile dolu bir plastik bardak, dairesel yapıştırılmış bir poliüretan membran (wrap sarılmak) tarafından oluşturulan bir hamak üzerine kırık. Mekaniği altındaki hamak ve su taşıma araçları ile indüklenen titreşim yardımcı hamak çevresi ve derinlik boyutları, hem yüzey gerilimi korumak için kritik bir rol oynadı. Su banyosu dolaşan küçük bir ayak izi de deney sırasında sürekli sıcaklık kontrolü sağlamak için geliştirilmiştir. Biz morfojenik kusur olmadan en az 14 gün boyunca bu şekilde embriyoların kültürü için yeteneğini göstermek ya da bu sistemin birçok mikrocerrahi ve görüntüleme uygulamaları gecikme ve istihdam.

Bu makalede, biz uzun vadeli sağlamak için basit bir yöntem mevcut<em&gt; Eski-ovo</em&gt; Kuş embriyo kültürü. Bu teknik, tam optik erişilebilirlik ve / veya kuş embriyolar steril taşıma gerektiren uzunlamasına deneyler için idealdir.

Bir Eski-ovo</emGörüntüleme ve Mikrocerrahi Uygulamaları için uygundur> Tavuk Embriyo Kültürü Sistemi

Normal ve malformasyonlu embriyonik gelişimi yönlendiren genetik ve mikroçevresel faktörler arasındaki ilişkilerin anlaşılması, ... için temel teşkil etmektedir.

X ovo tavuk embriyosu kültür sisteminde, kabuksuz civciv embriyosu kültürlerinin hazırlanması embriyogenezin incelenmesine olanak tanır. Prosedür, döllenmiş tavuk yumurtalarının temin edilmesi ve 37.5 °C'de 72 saat boyunca inkübe edilmesiyle başlar. Büyüyen embriyoları içeren yumurta sarılarını tutmak için hamaklar hazırlanır.Ardından yumurta sarıları hamaklara aktarılabilir ve embriyogenez kabuğun dışında devam eder. Bu teknik, damar sistemine mikroenjeksiyon, ultrasonografi ve mikrocerrahi için uygulanabilir ve elde edilen sonuçlar embriyoların normal ve bozulmuş koşullar altında nasıl geliştiğini gösterebilir. Merhaba, benim adım Akshay Shaker; Cornell Üniversitesi Biyomedikal Mühendisliği Bölümü'nde Jonathan Butcher tarafından yönetilen kardiyovasküler gelişimsel biyomühendislik laboratuvarında yüksek lisans öğrencisiyim.Tekniğimizin in ovo yumurta kültürü gibi önceki yöntemlere göre temel avantajı, embriyoya tam optik erişim sağlamasının yanı sıra hasar vermeden taşıma kolaylığı sunmasıdır. Merhaba, benim adım Char Hin. Cornell Üniversitesi Biyomedikal Mühendisliği Bölümü'ndeki Jonathan Chu Laboratuvarı, Kardiyovasküler Gelişimsel Biyomühendislik Laboratuvarı'nda doktora sonrası araştırmacıyım.Bu yöntem, kalp kusurlarının embriyogenez sırasında nasıl geliştiği gibi gelişimsel biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedüre başlamadan önce, tüm malzemeleri %70 ethanol ile silerek sterilize edin. Prosedüre başlamak için, dokuz onsluk plastik bir bardağın dörtte üçünü ılık steril su ile doldurun.Gerekli olduğu kadar kap için işlemi tekrarlayın. Standart dokuz onsluk bir kabın üst çapı sekiz santimetredir ve bu boyut, burada sunulan uzatılmış kültür uygulaması için en uygun olanıdır. Ardından, 20 santimetre uzunluğunda bir streç film parçası kesin.Sıcak steril su ile doldurulmuş dokuz onsluk plastik bardağın üzerini bir parça streç film ile kapatın ve streç filmi sabitlemek için bir paket lastiği kullanın. Sarının yapışmasını ve buna bağlı olarak sarının yırtılmasını önlediği için bu uygulama için en uygun olanı streç filmdir. Taşıma sırasında, plastiğin suyun yüzeyine değecek şekilde yayılmış olması gerekir.Band etrafındaki fazla plastiği kesin ve plastiği silin. %70 ethanol ile ıslatılmış Kim wipe'lar kullanıldığında, hamaklar artık embriyoları desteklemeye hazırdır. Döllenmiş tavuk yumurtaları, inkübasyon öncesinde beş güne kadar 13 degrees Celsius'ta saklanabilir.Gelişimi aktive etmeden, yumurtaları kültürleme için hazır tutmak amacıyla kırmızı şarap soğutucusu bu sıcaklığı koruyabilir. Yumurtaları, 37.5 °C sıcaklıkta, sürekli sallantılı hareketle %60 sabit nemli bir inkübatörde, bir tarafı yukarı gelecek şekilde 72 saat inkübe ederek embriyonun gelişimini aktive edin. Yumurtalar hazır olduğunda onları inkübatörden çıkarın.Yumurtaları, %70 etanol ile ıslatılmış Kim wipe ile silerek sterilize edin. Embriyonun doğru konumlanması için yumurtaları bir yumurta kartonuna bir ila iki dakika boyunca yan şekilde yatay olarak yerleştirin. Tek seferde altıdan fazla yumurtayı kırmaya çalışmak zor olabileceğinden, aynı anda en fazla altı yumurta ile çalışın.Çıkış oda sıcaklığında çok uzun süre kalmaya neden olabilir ve bu durum canlılığı etkileyebilir. Bir ila iki dakikanın sonunda embriyo yumurtanın üst kısmına kaymış olur. Her bir embriyoyu bir hamak düzeneğine transfer etmek için, laminer akışlı kabinde aseptik olarak çalışın.Öncelikle, metal bir kovanın kenarı veya cam bir beher gibi keskin bir kenar kullanarak yumurtanın alt kısmını nazikçe çatlatın. Embriyonun üst tarafta olduğunu unutmayın. İki başparmağınızla yanlara doğru çekerek yumurta kabuğunun iki yarısını nazikçe ayırın.Ardından embriyoyu, vitellusu ve albumini hamak üzerine yerleştirin. Albumin, sistemin hareketinden kaynaklanan şokları emerek vitellusun etrafında sönümleyici bir ortam sağlar. Ayrıca albumin, uzun kültür süresi boyunca embriyoya besin desteği sağlar.Embriyo transferi uygun şekilde gerçekleştirildiyse, embriyo halihazırda üst kısımda konumlanmış olmalıdır. Embriyo dipteyse, yumurta sarısını ovalayarak kendi etrafında dönmesini ve embriyonun üste çıkmasını sağlamak için kapalı eğri uçlu küçük makas veya benzeri başka bir künt alet kullanın. Embriyoları embriyonik yedinci günün ötesinde kültüre edecekseniz, kemik gelişimi ve olgunlaşması için kalsiyum kaynağı olarak embriyonun çevresine ezilmiş yumurta kabuğu parçaları serpiştirin.Embriyo transferi tamamlandıktan sonra, embriyoyu mühürlemek için bardağın üzerine 10 santimetre çapında bir Petri kabı yerleştirin. Hamak düzeneğini 37.5 °C'ye ayarlanmış inkübatöre yerleştirin. Eğer taşınabilir bir inkübatör kullanılıyorsa, inkübatörün içerisine suyla doldurulmuş bir veya iki adet dokuz onsluk bardak da yerleştirin.Nem oranını yaklaşık %60'ta tutmak amacıyla embriyolar gelişmeye devam eder ve mikrosirürjikal uygulamalarda mikroenjeksiyon için kullanılabilir. Bu embriyo kültürü, çözeltilerin damar sistemine enjekte edilmesi gereken mikroenjeksiyon uygulamaları için uygundur. İlk olarak, mikro dövme (micro forge) yöntemiyle cam kılcal tüpleri eğimli uçlu mikroiğnelere dönüştürerek enjeksiyon düzeneğini hazırlayın.Uç boyutu, istenen akış hızına bağlıdır. Mikroiğne şırıngasını 0.03 inch iç çaplı silikon tübe bağlayın. Şırınga tüpünü enjekte edilecek solüsyonla doldurun ve şırınga mikroiğnesini tübe bağlayın.Mikroiğneyi mikro manipülatöre ve şırıngayı şırınga tutucusuna veya şırınga pompasına yerleştirin. Enjeksiyon düzeneği hazır olduğunda embriyoları alın. İğnenin vital damar gibi bir kan damarına doğru şekilde girmesi için iğnenin yatay penetrasyonu gereklidir.Bu nedenle embriyo, içinde bulunduğu kabın kenarlarıyla aynı seviyede olmalıdır. Embriyoyu yükseltmek için, embriyoyu destekleyen streç filmi tutan lastiği çıkarın. Streç filmin bir kenarını nazikçe kaldırın ve embriyoyu çok fazla hareket ettirmeden kaba bir miktar su ekleyin.Ardından lastiği tekrar plastiğin üzerine yerleştirin. Embriyo yükseltildiğine göre, solüsyon artık embriyonik bir damara enjekte edilebilir. Hayati bir damara enjeksiyon yaparken, mikroiğnenin boyutunun damar çapının yaklaşık 10'da biri olması gerektiğine dikkat edin.Kanama meydana gelmeden verimli bir perfüzyon sağlamak için, öncelikle solüsyonu mikroiğneye, içeride hava kalmayacak şekilde pompalayın. Ardından, mikroiğnenin ucunu hayati damarlar için seçilen bir damarla hizalayın. Bir alan seçmek, damarı hedeflemek için maksimum alan sağlar.Enjeksiyon alanı belirlendikten sonra, iğneyi damara doğru itin. Damar önce geri çekilir. İğne penetre olduğunda perfüzyonu başlatın; akan kanın rengi perfüzyonla birlikte değişir.Renk değişimi görülmezse, iğne damarın içinden geçmiş olabilir. Bu durumda, damarda renk değişimi görünene kadar çözeltiyi pompalarken aynı zamanda mikroiğneyi yavaşça geri çekin. Perfüzyon tamamlandığında, mikroiğneyi nazikçe damardan çıkarın. Bu embriyo kültürü, inkübasyonun dördüncü gününde gerçekleştirilen sol atriyum ligasyonu gibi mikrocerrahi uygulamalar için de uygundur.Öncelikle, 10 sıfır naylon cerrahi süturdan 0,5 milimetre çapında kullanılacak düğümleri hazırlayın. İnce pens kullanarak, embriyodan koriyonik ve LAN toik membranları çıkarın. Embriyoyu arkasından kaldırın ve sol tarafı üstte ve erişilebilir olacak şekilde dikey olarak döndürün.Ardından, sol atrium üzerindeki perikardiyumu çıkarın. Düğümü sol atrium üzerine hizalayın ve penset yardımıyla yanlardan tutup çekerek sıkın; düğüm, sol tarafa giden orijinal kan akışının yaklaşık %75'ini engelleyecek şekilde bağlanmalıdır. Düğümün uçlarını mikro makasla kesin, ardından fazla sütürü dikkatlice çıkarıp atın.Son olarak, embriyoyu sağ tarafı üstte kalacak şekilde orijinal yönüne geri döndürün. Burada, az önce gösterildiği gibi X ovo olarak kültürlenen farklı evrelerdeki embriyolar görülmektedir; bir su sirkülasyon ısıtıcısı, görüntüleme ve mikrocerrahi uygulamalar sırasında gerekebilecek çevresel koşulları uzun süreler boyunca koruyabilir.Ex ovo kültüre edilen civciv embriyoları mikroenjeksiyon için uygundur. Bu deneyde, ex ovo kültüre edilen bir civciv embriyosunun damar sistemine floresan boya enjekte edilmiştir. Ex ovo kültüre edilen civciv embriyoları mikrocerrahi için uygundur.Bu deneyde, X ovo kültüründeki civciv embriyosu üzerinde sol atriyum ligasyonu prosedürü uygulanmıştır. X ovo civciv embriyolarını kültüre alma işlemi uzmanlaşıldığında, embriyo başına yaklaşık beş dakikada tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, görüntüleme ve mikrocerrahi uygulamaları ile kültürlerin taşınmasının gerekli olduğu durumlar için uygun XO civciv embriyosu kültürlerinin nasıl oluşturulacağı konusunda iyi bir anlayış kazanılmış olmalıdır.

an-ex-ovo-chicken-embryo-culture-system-suitable-for-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video Yeni kültür, civciv embriyolarının 24 saat kadar yumurta dışında kültür olan bir yöntem gösteriyor. Bu yöntem, erken gelişme (14 som ilkel bir çizgi.) Fare E7-9 karşılık gelen bir süre çalışma sağlar. In situ hibridizasyon ve immünohistokimya, bu tekniğin Uygulamaları elektroporasyon içerir.

Erken Civciv Embriyolar ex vivo (Kültür) Kültür Yöntemi

Civciv chorioallantoic membran (CAM), anjiyogenez ve tümörogenez çalışmak için eşsiz bir doğal bağışık yetmezliği olan, destekleyici bir kültür ortamı. Bu video makale piliç farklı adımları gösteriyor.

Civciv Ex ovo Kültür ve Ex ovo CAM Testi: Gerçekten Nasıl Çalışır?

Bu video, transgenik fare embriyolarından alınan okülomotor dilimlerin ex vivo kültürünü ve görüntülemesini göstermektedir. Embriyolar izole edilir ve agaroza gömülür. Bir vibratom kullanılarak, okülomotor çekirdekleri ve gözleri içeren dilimler elde edilir. Dilimler kültürde tutulur ve bir floresan mikroskobu kullanılarak görüntülenir.

Transgenik Fare Embriyolarından Okülomotor Kesitlerin Ex Vivo Kültürü ve Görüntülenmesi

Dilim kültürleri gen ve farmakolojik tedirginliklerin tarafından embriyo gelişiminin manipülasyonu kolaylaştırır. Ancak, kültür koşullarının normal gelişim dilim azalır ortamında devam edebilirsiniz emin olmalısınız. Biz en az 24 saat süreyle devam etmek omurilikteki normalde gelişimi kolaylaştıran bir protokol göstermektedir.

Tavuk embriyo Omurilik Dilim Kültür Protokolü

Nöral progenitör mitoz nöron kritik bir parametredir. Nöral progenitör mitoz anlayışımızın çok sabit doku analizine dayanmaktadır. Embriyonik beyin dilimleri Canlı görüntüleme, kontrollü bir ortamda, yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile mitoz değerlendirmek için çok yönlü bir tekniktir.

Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

Gelişim sırasında tavuk embriyosunu görüntülemek ve ona erişmek zor olabilir. Basit, uygun maliyetli ve bir sınıfta veya araştırma ortamında kolayca kullanılabilecek bir ex ovo yöntemi geliştirdik. Bu yöntem, embriyonik gelişimin geç aşamalarına kadar embriyoya erişim sağlar (HH 40).

Optimize Ex-ovo Kalkınma Gelişmiş Aşamaları Chick Embriyolar ekimi

Burada, iletilen ışık ve floresan mikroskobu kullanarak hızlandırılmış görüntüleme için civciv embriyolarını ex ovo kültürlemek için yeni bir teknik sunuyoruz. Batık filtre kağıdı sandviçi, sıvı bir kültür ortamına tamamen batırılmış civciv embriyolarının kültürlenmesine izin veren, iyi bilinen filtre kağıdı taşıyıcı tekniğinin1 bir çeşididir.

Uzun vadede bir Batık Filtre Kağıdı Sandviç Ex Ovo Time-lapse Görüntüleme

Bu protokol, kontrastlı ultrason görüntüleme ve mikrokabarcık aracılı ilaç dağıtımını incelemek için 5 ila 8 günlük tavuk embriyolarının ve bunların koryoallantoik membranının (CAM) in vivo bir model olarak nasıl elde edileceği ve kullanılacağına dair üç yöntemi açıklamaktadır.

Kontrastlı Ultrason Görüntüleme ve Mikrokabarcık Aracılı İlaç Dağıtım Çalışmaları için Tavuk Ex Ovo Embriyolarının ve Korioallantoik Membran Damarlarının In Vivo Model Olarak Hazırlanması

Bu makalenin genel amacı, tavuk embriyolarına eksojen materyallerin hücre içi enjeksiyonunda nasıl gerçekleştirileceğini tanımlamaktır. Bu yaklaşım, tavuk embriyolarının gelişimsel biyolojisini incelemek için çok yararlıdır.

Burada: Ovo Tavuk Embriyolarında İntravasküler Enjeksiyon

Bu protokol, civciv embriyo nörülasyonu sırasında nöral plak dokusunun mekanik özelliklerini uzunlamasına izlemek için geliştirilmiştir. Bir Brillouin mikroskobu ve bir sahne inkübasyon sisteminin entegrasyonuna dayanır ve ex ovo kültürlenmiş civciv embriyolarında nöral plaka dokusunun canlı mekanik görüntülemesini sağlar.

Civciv Embriyosunun Nöral Tüp Kapanması Sırasında Dokunun Mekanik Gelişiminin İzlenmesi

Öğrenin, tavuk embriyolarında uzun süreli ex-ovo kültür sistemi ile embriyogenez sürecini incelemeyi. Bu yöntem mikroenjeksiyon ve mikrocerrahi uygulamaları için tam optik erişim sağlar.

Bir Eski-ovo Tavuk Embriyo Kültürü Sistemi

Daha fazla video keşfet