Name: Sirkadiyen Rhythms Eğitim ve Parametreler Uyku Lokomotor Aktivitesi Assaying Drosophila /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-28T17:30:00.000+00:00
Duration: 18 min 8 s
Description: Öğrenin Drosophila'da sirkadiyen ve uyku fenotiplerini lokomotor aktivite ritimleri ölçerek karakterize etme yöntemini. DAM monitörleri kullanılarak genetik mutasyonların davranışsal ritimler üzerindeki etkisi incelenir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, JC I. E ve NS061952 NIH hibe NIH34958 tarafından desteklenen

<ol><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Chen, W. F., Low, K. H., Lim, C., Edery, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermosensitive+splicing+of+a+clock+gene+and+seasonal+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Thermosensitive splicing of a clock gene and seasonal adaptation.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 72, 599-606 (2007).</li>
<li>Chiu, J. C., Vanselow, J. T., Kramer, A., Edery, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phospho-occupancy+of+an+atypical+SLIMB-binding+site+on+PERIOD+that+is+phosphorylated+by+DOUBLETIME+controls+the+pace+of+the+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The phospho-occupancy of an atypical SLIMB-binding site on PERIOD that is phosphorylated by DOUBLETIME controls the pace of the clock.</a> Genes Dev. 22, 1758-1772 (2008).</li>
<li>Dubruille, R., Murad, A., Rosbash, M., Emery, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+constant+light-genetic+screen+identifies+KISMET+as+a+regulator+of+circadian+photoresponses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A constant light-genetic screen identifies KISMET as a regulator of circadian photoresponses.</a> PLoS Genet. 12, e1000787-e1000787 (2009).</li>
<li>Glaser, F. T., Stanewsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+synchronization+of+the+Drosophila+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Temperature synchronization of the Drosophila circadian clock.</a> Curr Biol. 15, 1352-1363 (2005).</li>
<li>Helfrich-Förster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+control+of+morning+and+evening+components+in+the+activity+rhythm+of+Drosophila+melanogaster-+sex-specific+differences+suggest+a+different+quality+of+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Rhythms%22%5BJournal%5D)">Differential control of morning and evening components in the activity rhythm of Drosophila melanogaster- sex-specific differences suggest a different quality of activity.</a> J Biol Rhythms. 15, 135-154 (2000).</li>
<li>Hendricks, J. C., Finn, S. M., Pancleri, K. A., Chavkin, J., Williams, J., Sehgal, A., Pack, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rest+in+Drosophila+is+a+sleep-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rest in Drosophila is a sleep-like state.</a> Neuron. 25, 129-138 (2000).</li>
<li>Ho, K. S., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster%3A+an+insect+model+for+fundamental+studies+of+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster: an insect model for fundamental studies of sleep.</a> Methods Enzymol. 393, 772-793 (2005).</li>
<li>Koh, K., Evans, J. M., Hendricks, J. C., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+for+age-associated+changes+in+sleep%3A+wake+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model for age-associated changes in sleep: wake cycles.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 13843-13847 (2006).</li>
<li>Konopka, R. J., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clock+mutants+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Clock mutants of Drosophila melanogaster.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 68, 2112-2116 (1971).</li>
<li>McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+systems+in+Drosophila%3A+a+synthesis+of+time+and+space%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space.</a> Trends Genet. 20, 384-391 (2004).</li>
<li>Osterwalder, T., Yoon, K. S., White, B. H., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditional+tissue-specific+transgene+expression+system+using+inducible+GAL4%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A conditional tissue-specific transgene expression system using inducible GAL4.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12596-12601 (2001).</li>
<li>Rosato, E., Kyriacou, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+locomotor+activity+rhythms+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analysis of locomotor activity rhythms in Drosophila.</a> Nature Protocols. 1, 559-568 (2006).</li>
<li>Sehadova, H., Glaser, F. T., Gentile, C., Simoni, A., Giesecke, A., Albert, J. T., Stanewsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+entrainment+of+Drosophila%27s+circadian+clock+involves+the+gene+nocte+and+signaling+from+peripheral+sensory+tissues+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Temperature entrainment of Drosophila's circadian clock involves the gene nocte and signaling from peripheral sensory tissues to the brain.</a> Neuron. 64, 251-266 (2009).</li>
<li>Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+video+method+to+study+Drosophila+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">A video method to study Drosophila sleep.</a> Sleep. 31, 1587-1598 (2008).</li>
<li>Zordan, M. A., Benna, C., Mazzotta, G. Monitoring and analyzing Drosophila circadian locomotor activity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZordan%2C+MA+%22In+Circadian+Rhythms+Methods+and+Protocols%22">In Circadian Rhythms Methods and Protocols</a>. Rosato, E. , Methods in Molecular Biology series. Humana. Totowa, New Jersey. (2007).</li>
</ol>

Bu protokol, Drosophila lokomotor aktivite ritimleri, saat fonksiyonu standart okuma olarak kullanılan sinek gündelik saatler güvenilir bir davranış çıkış ölçmek için prosedürler nitelendirdi. Bu testte roman saat mutantlar (örneğin Konopka ve Benzer 1971; Dubruille ve ark 2009) büyük ölçekli ekranlarında kullanılan ve sürekli olarak, in vivo olarak saat fonksiyonu incelemek ve anlamak için kullanılır . Ayrıca, son raporlar, video sayısal lokomotor aktivite ritimleri kullanarak daha uyku miktarının belirlenmesi çok daha güvenilir olduğunu göstermektedir rağmen sinekler uyku uyanıklık döngüsü çalışma olmuştur (Zimmerman ve ark 2008) . Uyku analiz lokomotor aktivite ritimleri kullanırken, gündüz uyku yüzdesi abartmış olma eğilimindedirler. Çok hassas bir meyve gibi davranışsal fenotipleri sirkadiyen rhythmicity ve uyku / dinlenme faaliyetleri gibi uçar gibi bu protokolün başarı ve tekrarlanabilirliği sağlamak için, yaş, genetik arka plan benzer tahlil sinekler için kritik, ve aynı koşullar altında yetiştirilen Tüm bu faktörler. Tek bir deneme için birden fazla inkübatörler kullanırken, bazı sirkadiyen parametreler sıcaklığın bir fonksiyonu olarak değişebilir bu yana tüm inkübatörler beklenen sıcaklıkta emin olmak için önemlidir. Bir uyarı sinekler ile çalışmak için inkübatörler satın almayı düşünen herkesin eşit oluşturulur. Birçok seçenek vardır herhangi bir özel birim tavsiye tereddüt ederken. Drosophila iş için inkübatörler satmak şirketler bulmak için iyi bir kaynak &lt;www.flybase.org&gt; sağlanmaktadır. Bazı şirketler bile, zaten Trikinetics sistemi ve sıcaklık tırmanışı (örneğin, TriTech) kablolu olarak, ek özellikler mevcuttur, neyin &quot;Drosophila sirkadiyen&quot; inkübatörler satmak. Önemli özellikleri, gündüz ışık kontrolü ve Drosophila fizyolojik aralığında iyi bir sıcaklık kontrolü için yeteneği (~ 15-30 ° C ). Fiyatlar ve inkübatörler boyutları çok değişir ama Trikinetics gelen yeni etkinliğini izler, hatta küçük inkübatörler bu cihazların oldukça çok sayıda barındırabilir. Ayrıca, nem (% 50-70 ince) sağlamak için küçük bir tencerede su ile yer olarak nem kontrolü ile inkübatörler kullanılabilir olsa da, bu eklenen özellik sürece gerekli değildir. Son olarak, biz rutin olarak bu protokolü, veri analizi FaasX ve Insomniac kullanılmasına rağmen, alternatif programlar ve yazılımlar vardır (2006 Rosato ve Kyriacou), örneğin ClockLab (ActiMetrics), Brandeis Ritim Paketi (D. Wheeler, Baylor College of Medicine, Houston ), MAZ (Zordan ve ark 2007).

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; aktivite monitörü (DAM)</td><td>Trikinetics Inc.; Waltham, MA</td><td>DAM2 veya DAM5</td><td>DAM2 monitörleri daha kompakttır ve tek bir inkübatöre daha fazlası sığabilir</td></tr><tr><td>Güç kaynağı arayüz ünitesi (DAM sistemi için)</td><td>Trikinetics Inc.; Waltham, MA</td><td>PSIU9</td><td>PS9-1 AC Güç Kaynağını içerir</td></tr><tr><td>Işık kontrol cihazı</td><td>Trikinetics Inc.; Waltham, MA</td><td>LC6</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex cam tüpler</td><td>Trikinetics Inc.; Waltham, MA</td><td>PGT5, PGT7 ve PGT10</td><td></td></tr><tr><td>Plastik aktivite tüpü kapakları</td><td>Trikinetics Inc.; Waltham, MA</td><td>CAP5</td><td>Plastik kapaklar yerine iplik kullanılabilir.</td></tr><tr><td>DAM Sistemi veri toplama yazılımı</td><td>Trikinetics Inc.; Waltham, MA</td><td></td><td>Hem Mac hem de PC için mevcut sürümler</td></tr><tr><td>FaasX yazılımı</td><td>Centre National de la Recherche Scientifique</td><td></td><td>Yalnızca Mac için</td></tr><tr><td>Insomniac 2.0 yazılımı</td><td>University of Pittsburgh School of Medicine</td><td></td><td>Matlab üzerinde çalışır. Hem PC hem de Macintosh üzerinde kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Sıcaklık ve diurnal kontrole sahip çevresel inkübatör, örn. Percival inkübatörü</td><td>Percival Scientific, Inc.</td><td>I-30BLL</td><td>İç hacim boyutları: Genişlik: 65cm; Yükseklik: 86cm; Derinlik: 55cm</td></tr><tr><td>Sıcaklık ve diurnal kontrole sahip çevresel inkübatör, örn. Sirkadiyen Zamanlı Aydınlatma ve Zamanlı Sıcaklık özellikli DigiTherm Isıtma/Soğutma İnkübatörü</td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>05DT2CIRC001</td><td>İç hacim boyutları: Genişlik: 36m; Yükseklik: 56m; Derinlik: 28cm</td></tr><tr><td>APC Smart-UPS 2200VA 120V (Acil durum güç yedekleme ünitesi)</td><td>APC</td><td>SU2200NET</td><td>1600 Watt Çıkış Güç Kapasitesi</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>TissuePrep Parafin peletleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>T565</td><td>Erime noktası 56&amp;#x00B0;C-57&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Blok ısıtıcı </td><td>VWR international</td><td>12621-014</td><td></td></tr></tbody></table>

sirkadiyen rhythms eğitim ve parametreler uyku lokomotor aktivitesi assaying drosophila</em

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

En çok yaşam formları endojen sirkadiyen tarafından tahrik hücresel, fizyolojik ve davranışsal fenomenler (≡ 24 saat) Kalp pili veya saatler günlük ritimlerin sergilerler. Arızalar insan sirkadiyen sistemi çeşitli hastalıklar veya bozukluklar ile ilişkili. Sirkadiyen ritimleri altında yatan mekanizmaları anlayışımıza karşı çok büyük ilerleme kolayca ölçülen davranış ritmi saat fonksiyonu bir okuma olarak kullanılmasını sağlayan genetik ekranlarından ortaya çıkmıştır. Drosophila kullanılarak yapılan çalışmalar sirkadiyen ritimler altında yatan hücresel ve biyokimyasal temelleri anlayışımıza yeni ufuklar açan katkılar yaptık. Drosophilia&#39;daki okuma ölçülen standart sirkadiyen davranışsal lokomotor aktivite. Genel olarak, izleme sistemi, özel olarak tasarlanmış cihazlar Drosophila lokomotor hareketin ölçebilirsiniz içerir . Bu cihazlar, bir karanlık oda bulunur ve kızılötesi ışık demetinin kesinti kullanarak, küçük tüpler içinde bulunan bireysel sineklerin lokomotor aktivite kayıt dayalı çevre kontrol inkübatörlerde yerleştirilmiştir. Pek çok gün içinde ölçülen zaman, Drosophila günlük aktivite ve hareketsizlik döngüleri, hayvan endojen sirkadiyen sistemi tarafından yönetilir davranışsal bir ritim gösterirler . Genel prosedür ticari lokomotor aktivite izleme cihazları ve veri analizi için yazılım programlarını geliştirme gelişiyle ile basitleştirilmiş oldu. Biz burada açıklanan usul ve şu anda, dünya çapında kullanılan en popüler bir sistemdir Trikinetics A.Ş., sistem kullanır. Daha yakın zamanlarda, aynı izleme cihazları Drosophila uyku davranışlarını incelemek için kullanılmıştır. Birçok sinek günlük uyku uyanıklık döngüleri eş zamanlı olarak ölçülür ve sürekli lokomotor aktivite verileri sadece 1 ila 2 hafta değer genellikle yeterlidir, çünkü bu sistem, Drosophila tezahür değişmiş sirkadiyen veya uyku özelliklerini belirlemek için büyük ölçekli ekranlar için idealdir.

Biz günlük lokomotor aktivite ritimleri kayıt için prosedürler tarif<em&gt; Drosophila</em&gt; Ve daha sonraki veri analizi. Lokomotor aktivite ritimleri hayvan gündelik saatler güvenilir bir davranış çıkış ve sirkadiyen mutantlar okuyan veya çevre sirkadiyen sistemini düzenler inceleyerek, saat fonksiyonu standart okuma olarak kullanılır.

Sirkadiyen Rhythms Eğitim ve Parametreler Uyku Lokomotor Aktivitesi Assaying Drosophila</em

Çoğu yaşam formu, endojen sirkadiyen (≈24 saat) saatler tarafından yönlendirilen hücresel, fizyolojik ve davranışsal fenomenlerde günlük ritimler sergilemektedir...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, lokomotor aktivitenin günlük ritimlerini inceleyerek drosophila'da sirkadiyen ve uyku fenotiplerini karakterize etmektir. Bu, transgenik sinekler üretilerek, spesifik mutantlar elde edilerek veya deney hayvanlarını hazırlamak için gerekli çaprazlamalar yapılarak gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, deney sırasında sineklerin yaşam alanı olarak hizmet edecek ve içinde bir besin kaynağı bulunan cam aktivite tüplerinin hazırlanması gerekir.Ardından, bir ila beş günlük sinekler, lokomotor aktivite ritimlerini izlemek amacıyla DAM aktivite monitörlerine yerleştirilen aktivite tüplerine konur. DAM sistemi kullanılarak, far sex ve insomniac gibi yazılımlarla günlük lokomotor aktivite ritimlerinin analizi sonucunda, sirkadyen ve uyku parametrelerindeki kusurlar ve varyasyonları gösteren sonuçlar elde edilir. Bu yöntem; uygun ritimlerin oluşturulmasında hangi proteinlerin ve düzenleyici mekanizmaların rol oynadığı ve örneğin ışık ve sıcaklık gibi çevresel faktörlerin davranışsal ritimleri belirli moleküler yolaklar aracılığıyla nasıl modüle ettiği gibi, sirkadyen biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Lokomotor aktivite izleme sistemi; özel izleme cihazları, diyürnal ışık kontrolü kapasitesine sahip çevresel inkübatörler, veri toplama cihazları, bilgisayarlar ve kablolama gibi çevre birimleri gibi çok sayıda ekipman içerir. İnkübatörlerin aşırı yüklenmesini ve sıcaklık korumasında oluşabilecek olası hataları önlemek için lokomotor aktivite izleme sistemini yerleştirmek üzere iyi havalandırılan, sıcaklık kontrollü, karanlık bir oda seçin; odayı dış ışık kaynaklarından izole edin. Meyve sineklerinin sirkadiyen sistemleri kızılötesi ışığa duyarlı olmadığı için tamamen karanlıkta çalışmak gerekli değildir.Bu nedenle, karanlık odada görmemiz gereken durumlarda, basitçe kırmızı filtre ile kaplanmış standart bir el feneri ile aktivite izleme sisteminin bileşenlerini besleyecek yeterli watt kapasitesine sahip bir kesintisiz güç kaynağı (UPS) acil durum yedekleme ünitesi kullanırız. Binada ani voltaj yükselmesi veya güç kesintisi olması durumunda, UPS acil durum yedekleme ünitesini, eğer mevcutsa binanın acil durum yedekleme devresine bağlayın. İnkübatördeki aydınlatmayı kontrol eden sistem doğrudan inkübatör tarafından düzenlenmiyorsa, inkübatörü UPS olmadan acil durum gücüne takmak yeterlidir; çünkü birkaç saniyelik güç kaybı hazne sıcaklığını etkilemeyecektir.Ardından, veri toplama ve/veya inkübatörlerin kontrolü için tamamen tahsis edilmiş bir bilgisayar, PC veya Macintosh kurun. Aktivite bağlantı ve koparmayı kolaylaştırmak için telefon hattı ağını, çevre kontrollü inkübatörlerin rafları etrafında düzgünce manuel olarak düzenleyin. Monitörler, birden fazla telefon hattını tek bir ana hatta birleşecek ve inkübatörden dışarı uzanarak bilgisayara bağlanacak şekilde kurun; inkübatörlerin içindeki izleme cihazlarını, aktivite monitörüne telefon hattı üzerinden güç sağlayan bir güç kaynağı arayüz ünitesi aracılığıyla bilgisayara bağlayın.Son olarak, elektronik cihazların LED'lerinden gelen olası ışık kaynaklarını veya düzgün şekilde kapatılmamış inkübatör kapısını koli bandı veya siyah bir bezle maskeleyin. Bu, serbest çalışan ritimlerin istenmeyen ışık yokluğunda ölçülmesini sağlamak içindir. Bu fenotiplerin, aynı çevresel koşullarda yetiştirilmiş ve aynı yaşta olan uygun kontrol hayvanları kullanılarak değerlendirilmesi kritik öneme sahiptir.Buna ek olarak, sirkadiyen ritmde cinsel dimorfizm mevcuttur. Dişi sineklerdeki yumurta bırakma aktivitesi lokomotor aktivitenin gerçek ölçümünü etkileyeceği için, bu analizlerde 25 °C'de yetiştirilmiş ve bir ila beş günlük olan yetişkin erkek sineklerin kullanılması genel uygulamadır. İlgilenilen spesifik mutant sineklerin sirkadiyen ve uyku-dinlenme parametreleri incelenirken, mutant stokun aynı genetik arka plana sahip vahşi tip suşuyla geri çaprazlanması yerinde olacaktır.Örneğin, W 1118 veya yw. Drosophila erkeklerinde crossing over gerçekleşmediği için, dış çaprazlamayı mutant dişileri yabanıl tip erkeklerle çaprazlayarak gerçekleştirmek daha uygundur; hem yabanıl tip kontrol hem de mutant sinekleri aynı anda ekimleyin. Lokomotor aktivite ritmi deneyinden yaklaşık 10 ila 14 gün önce standart drosophila besiyerinde tutun; döller çıktıktan sonra bir ila beş günlük erkek sinekleri toplayın ve deneylerde kullanılmak üzere ayırın.Aktivite tüpleri sinek habitatını temsil eder. Deney sırasında bunlar, bir ucunda besin maddesi bulunan ve diğer ucu iplik veya plastik bir tıpayla kapatılmış beş milimetrelik ince cam tüplerdir. Yeni hazırlanmış aktivite tüplerinin kullanılması tercih edilir.Bunlar genellikle deneyin başlatılmasından birkaç gün veya bir hafta önce hazırlanır. Cam aktivite tüpleri defalarca yeniden kullanılabildiğinden, aşağıdaki hazırlık prosedürleri başlangıç noktası olarak önceden kullanılmış ve temizlenmemiş aktivite tüplerinin kullanımını tanımlamaktadır. Eğer yeni aktivite tüpleri kullanıyorsanız, doğrudan daha sonra gösterilen tüplerin otoklavlanması adımına geçebilirsiniz.Kullanılmış aktivite tüplerindeki tıkaçları çıkarın ve tüpleri büyük bir cam behere yerleştirin. Tüpler, beher hacminin yalnızca yarısını doldurmalıdır. Tüplerin tamamen suya gömüldüğünden emin olarak beheri musluk suyuyla doldurun.Cam tüplerle dolu beheri, su tam ve hızlıca kaynayana kadar mikrodalga fırında ısıtın. Balmumu ve agar besiyerini eritirken su sıcak olduğu için dikkatli olun. Beheri mikrodalga fırından çıkarın ve tüpleri bir spatula veya plastik çubukla karıştırın.Sıkışmış balmumunun üste çıkmasını sağlamak için 10 milimetre pipet kullanın. Ardından mikrodalga işlemini tekrarlayın. Beheri mikrodalgadan çıkarın ve soğumasını bekleyin.Beherin soğuk odaya konulması işlemi hızlandıracaktır. Su soğudukça, mum suyun yüzeyinde toplanacak ve kademeli olarak katılaşacaktır. Katılaşan mumu elinizle alın.Bu işlem, tüplerin üzerindeki mumun çoğunu temizlemelidir. Aktivite tüplerini taze musluk suyu içeren yeni bir behere aktarın ve mikrodalga ile mum temizleme işlemini tekrarlayın. Mumun çoğu önceki adımda temizlendiği için, mumun katılaşmasını beklemeye gerek yoktur.Beherdeki suyu basitçe dökün ve tüpleri yeni bir behere aktarın. Su hâlâ sıcak olduğu için dikkatli olun. Mikrodalga işlemini son kez tekrarlayın.Suyu beherden boşaltın ve aktivite tüplerinin soğumasını bekleyin. Ardından, aktivite tüplerini 250 mililitre veya 500 mililitre hacmindeki cam beherlerin içine dikey olarak yerleştirin. Tüplerin birbirine çok sıkışık olmadığından emin olun.Aktivite tüplerine yüklenecek besiyerini hazırlamak için kuru çevrimli bir otoklav kullanarak sterilize edin veya tüpleri basitçe bir kurutma fırınında kurutun. Distile veya musluk suyunda %5 sükroz ve %2 bakteriyel agar çözeltisi hazırlayın ve çözeltiyi otoklavlayın. Otoklavlanmış besiyeri hemen kullanılabilir veya uzun bir süre boyunca dört derece Celsius'ta saklanabilir.İdeal olarak, aktivite tüplerini doldururken besiyeri yaklaşık 65 °C olmalıdır. 10 mL'lik bir pipet kullanarak, sıvı besiyeri çözeltisini cam beherin iç duvarı boyunca pipetleyin ve tüpleri aşağıdan yukarıya doğru üçte bir oranında dolana kadar doldurun. Tüm tüplerin besiyeri çözeltisiyle eşit şekilde dolduğundan emin olmak için beheri nazikçe sallayın.Besinin oda sıcaklığında veya dört santigrat derecede tamamen katılaşmasını bekleyin. Cam tüplerin içindeki yoğuşma dağıldığında, tüpler beherden çıkarılabilir. Aktivite tüplerini beherden çıkarmak için, tüpleri beherin tabanına doğru itin ve tüplerin içindeki katılaşmış besin ile beherin tabanı birbirinden ayrılsın diye aynı anda tüpleri döndürün.Tüpleri, tercihen tek bir grup halinde beherden çıkarın. Ardından, tüplerin dış yüzeyindeki fazla besiyerini temizlemek için tüpleri kağıt havluyla tek tek silin. Tüpleri temiz bir kaba yerleştirerek kenara alın.Tüp tutucu olmayan genel bir laboratuvar blok ısıtıcısını alın ve ısıtma kuyusunu dikkatlice kapatın. Birkaç kat güçlü alüminyum folyo ile kaplanmış ısıtma kuyusuna eritmek üzere parafin peletleri ekleyin; tüpleri gıda ile temas etmeyen uçlarından tutun ve gıdanın bulunduğu ucu eritilmiş muma daldırın. Mumun katılaşmasını hızlandırmak için mumlu kısmı soğuk suyla dolu bir cam behere daldırın. İşlemi tekrarlayın.Balmumu tüplerin bir kez suya daldırılması, tüplerin birbirine yapışmasını önleyecektir. Tüpler hemen kullanılabilir veya kullanım için dört derece santigrat sıcaklıkta hava geçirmeyen bir kapta saklanabilir. Bir haftalık süreyi aşan uzun süreli saklama, gıdanın aşırı kurumasına neden olacaktır.Tüpler dört santigrat derecede saklanmışsa, kullanmadan önce tezgah üzerinde bekleterek oda sıcaklığına getirin. Sinekleri aktivite tüplerine yerleştirmeden önce, aktivite monitörlerini barındırmak için kullanılacak inkübatörleri açın. İnkübatör kontrollerini kullanarak sıcaklığı ayarlayın ve istenen deney tasarımına göre DAM sistemi ışık kontrol cihazı veya inkübatörün kendi ışık kontrol sistemi üzerinden ışık-karanlık rejimini belirleyin.Ardından, sinekleri karbondioksit ile anestezi edin. Daha sonra ince bir resim fırçası kullanarak, tek bir sineği nazikçe bir aktivite tüpüne aktarın. Yaklaşık yarım inç uzunluğunda tek bir ip parçasının ortasını ince pensle tutun ve açılığı kapatıp sineğin deney sırasında kaçmasını önlemek için ipi aktivite tüpünün besin bulunmayan ucuna yerleştirin.Tüpe hava akışına izin verirken, sinek uyanana kadar tüpü yan yatırılmış şekilde tutun. Sineğin yeme yapışmasını önlemek için tüpleri aktivite monitörlerine yerleştirin. Tri Kinetics monitörlerinin daha yeni ve daha kompakt modelinde, kızılötesi ışının tüpün merkez konumundan geçtiğinden emin olmak için tüplerin lastik tokalarla sabitlenmesi gerekir. Son olarak, aktivite monitörlerini inkübatörlere yerleştirin ve telefon kabloları aracılığıyla veri toplama sistemine bağlayıp kontrol edin.Tüm monitörlerin düzgün şekilde bağlandığı ve her birinden veri toplandığı DAM sistemi toplama yazılımı kullanılarak kontrol edilir. Sinekler aktivite tüplerine yerleştirildiğine ve lokomotor aktivite izleme sistemi hazır olduğuna göre, artık veriler kaydedilebilir. Sinekler, istenen ışık, karanlık veya LD ve sıcaklık rejimine iki ila beş tam gün boyunca maruz bırakılarak senkronize edilir ve entrain edilir.En yaygın kullanılan entrainment koşulu, 25 °C sıcaklıkta 12 saat ışık ve 12 saat karanlıktan oluşan ışık-karanlık döngüsüdür. Bu protokolle ilişkili sirkadiyen ritimlerin incelenmesinde, inkübatördeki ışıkların açıldığı an ZT 0 olarak tanımlanır ve diğer tüm zamanlar bu değere göre belirlenir. Standart 12:12 LD koşulları altında, vahşi tip *Drosophila melanogaster* genellikle biri ZT 0 civarında merkezlenen ve sabah pik noktası olarak adlandırılan, diğeri ise ZT 12 civarında merkezlenen ve akşam pik noktası olarak adlandırılan iki aktivite dönemi sergiler; serbest yürüyüş lokomotor aktivite ritimleri, entrainment döneminden sonra sabit karanlık ve sıcaklık koşulları altında ölçülür.Işık döngüsü ayarı, ld'nin son günündeki karanlık evrede herhangi bir zamanda değiştirilebilir; böylece deneyin bir sonraki günü dd'nin ilk gününü temsil eder. Sineklerin sirkadiyen periyodunu ve ritmin genliğini veya gücünü hesaplamak için yedi günlük DD veri toplama süreci yeterlidir. Genel olarak, belirli bir genotip için güvenilir serbest çalışan periyotlar elde etmek amacıyla en az 16 sinekten oluşan bir örneklem büyüklüğü gereklidir.Deneyin sonunda, DAM sistem yazılımı kullanılarak toplanan ham ikili veriler, taşınabilir bir veri depolama cihazına, örneğin bir USB belleğe indirilir. Ham ikili veriler DAM file scan 1 0 2 x kullanılarak işlenir ve sirkadyen parametreler analiz edilirken 15 ve 30 dakikalık aralıklara, uyku analiz edilirken ise bir ila beş dakikalık aralıklara göre toplanır.Dinlenme parametreleri. Şu anda drosophila'da uyku dinlenmesinin standart tanımı, beş dakikalık kesintisiz hareketsizliktir. Bu protokol tamamlandığında, sirkadiyen parametreler için deney ve kontrol hayvanlarının sirkadiyen ve uyku parametrelerini karşılaştırmak amacıyla aynı veri seti kullanılabilir.LD veya DD koşullarında, sineklerin günlük lokomotor aktivitelerini veya birkaç gün boyunca ortalama aktivitelerini gösteren indüksiyon grafikleri fast x oph melanogaster kullanılarak oluşturulabilir; bunlar genellikle biri ZT sıfır civarında merkezlenen ve sabah zirvesi olarak adlandırılan, diğeri ise ZT 12 civarında gerçekleşen ve akşam zirvesi olarak adlandırılan iki aktivite dönemi sergilerler. Bu iki aktivite dönemi endojen saat tarafından kontrol edilir ve serbest koşan DD koşullarında bile gözlemlenebilir. Bu aktivite zirvelerinin zamanlamasındaki değişiklikler indüksiyon grafiklerinde kolayca gözlemlenebilir ve endojen saatin özelliklerinde bir değişikliğe işaret edebilir.Doğru saat fonksiyonunun göstergesi olan bir diğer özellik, LD döngülerinde gerçek karanlıktan aydınlığa veya aydınlıktan karanlığa geçişlerden önce gözlemlenen lokomotor aktivitedeki önleyici artıştır. Bu davranış yabanıl tip sineklerde açıkça görülürken, per zero mutantlarında mevcut değildir ve aritmiktir. Bu mutantta.LD'de gözlemlenen sabah ve akşam pikleri, tamamen ışık-karanlık koşullarındaki ani değişimlere bağlı irkilme tepkileridir. Saat geni bulunmayan sinekler çevresel değişimleri önceden tahmin etmezler, sadece onlara tepki verirler. Davranışsal ritmikliğin kaybı DD'de çok daha belirgindir ve genellikle per zero sineklerinde görüldüğü gibi, lokomotor aktivitenin sabah veya akşam piklerinin tamamen kaybolması şeklinde ortaya çıkar.İndüksiyon grafiklerine ek olarak, lokomotor aktivite verileri, her bir bireysel sinek veya sinek genotipi için çiftli çizim grafiği (actogram) şeklinde temsil edilebilir; burada iki günlük veri her satıra ardışık olarak çizilir, ancak son günün profili iki günlük aktiviteyi içeren bir sonraki satırı başlatır. Örneğin, ACTO gramının ilk satırına LD bir ve iki çizilir. Bir sonraki satır LD ikinin tekrarıyla başlar ve ardından LD üç ve sonrası gelir.Bu formatı takip ederek, tüm deneyi kapsayan lokomotor aktivite verileri ACTO gramda gösterilmiştir; ACTO gramların redüksiyon grafiklerine göre bir avantajı, günlük aktivite ritimlerinin periyot uzunluğundaki değişimin kolayca gözlemlenebilmesidir; ayrıca indüksiyon grafikleri ve ACTO gramlar da oluşturulmaktadır.DD koşulundan elde edilen lokomotor aktivite verileri, beş ardışık dakikalık inaktivite olarak tanımlanan uyku ve dinlenme parametrelerinin analizi için kullanılan cycle P dahil olmak üzere birçok farklı program aracılığıyla periyot uzunluğunu hesaplamak üzere far X'e gönderilebilir. Lokomotor aktivite analizlerinden kaydedilen veriler analiz edilebilir ve MATLAB tabanlı bir program olan insomniac kullanılarak birden fazla uyku parametresi incelenebilir; sineklerin uyuyarak geçirdiği sürenin yüzdesi farklı zaman aralıklarında hesaplanabilir. Örneğin, her saat başı veya her 12 saatteki uyku yüzdesi belirlenebilir.İncelenebilecek diğer daha yaygın uyku parametreleri arasında, uykunun ne kadar konsolide olduğunu ölçen ve uyku kalitesini ortaya koyabilen ortalama dinlenme süresi yer alır. Bir diğeri ise, sinekler uyanıkken aktivite hızının bir ölçüsü olan uyanıklık aktivite sayısıdır. Bu parametre, uyku ve dinlenme davranışları gerçekten etkilenen sinekler ile hasta veya hiperaktif olan sineklerin ayırt edilmesine yardımcı olur.Örneğin, sadece hasta olan sinekler, hareket kabiliyetleri azaldığı için daha fazla uyuyor gibi görünebilirler. Bu sinekler için uyanıklık aktivitesi, kontrol hayvanlarına kıyasla daha düşük olacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, drosophila'da sirkadiyen ve uyku fenotiplerinin deney yoluyla nasıl karakterize edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Lokomotor aktivitenin günlük ritimleri.

assaying-locomotor-activity-to-study-circadian-rhythms-sleep

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu makalede, farelerde sirkadiyen fonksiyonu ve ışık yanıt belirlemek için kullanılan yöntemleri gözden geçirilecektir.

Tekerlek Koşu Aktivitesi kullanarak Fare Sirkadiyen ve Akut Işık Yanıtları Ölçüm

Bu videoda, lokomotor aktiviteyi izlemek için kullanılan Drosophila aktivite monitörü (DAM) sistemi açıklanmaktadır. Araştırmacılar, meyve sineklerinde sirkadiyen ritimleri incelemek için DAM'dan toplanan aktivite verilerini kullanıyorlar. Öne çıkan protokol klibi, cihaza sineklerin nasıl yükleneceğini ve sirkadiyen deneyler için etkinlik verilerinin nasıl kaydedileceğini gösterir.

Drosophila Aktivite monitörü (DAM): Sineklerde lokomotor aktiviteyi ölçmek için bir yöntem

Drosophila melanogaster gibi spontan lokomotor aktivite gibi davranışları etkileyen genetik veya çevresel manipülasyonlar okuyan yararlıdır. Burada kızılötesi ışınları ve spontan lokomotor aktivitesini ölçmek için veri analiz yazılımı ile monitör kullanan bir protokol açıklar.

Olarak spontan lokomotor aktivitenin belirlenmesi<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Parkinson hastalığı hareket yeteneği etkilere neden, merkezi sinir sistemindeki dopaminerjik nöronların dejenerasyonu ile sonuçlanan bir nörodejeneratif hastalıktır. Rotenon modelleri Drosophila Parkinson hastalığı bulunmaktadır. Bu kağıt rotenone neden spontan ve irkilme-kaynaklı hem lokomosyon eksiklikleri niteleyen iki deneyleri özetliyor.

Yöntem Spontan Karakterizasyonu Ürkütme kaynaklı hareket yeteneği bir Rotenon ile uyarılan Parkinson Hastalığı Modeli için<em&gt; Drosophila</em

Bu rapor, TriKinetics Drosophila Activity Monitor kullanılarak Drosophila larva aktivitesini ölçmek için bir yöntemi açıklar. Cihaz, 16 adede kadar bireysel hayvanın hareketlerini algılamak için kızılötesi ışınlar kullanır. Veriler, oranlar ve hayvanların tahlil odaları içindeki konumları dahil olmak üzere hareket parametrelerini temsil etmek için analiz edilebilir.

Larvaların Faaliyet Ölçümü<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Sinek sirkadiyen Lokomotor ritimleri olarak görülen başlıca zamansal özellikleri ölçmek için bir yöntem sunulur. Miktar çok parametrik modeli dalga sinek aktivitesiyle yaklaştırarak elde edilir. Şekli ve boyutu sabah ve akşam doruklarına günlük aktivite modeli parametreler açıklanmaktadır.

Sinek sirkadiyen etkinliği ölçmek için bir hesaplama yöntemi

Burada, Drosophila'yı sirkadiyen bir güne nasıl senkronize edebileceğimizi anlatıyoruz. Bu biyolojik ritim ve kronobiyoloji eğitimi için gerekli ilk ve en önemli adımdır.

Drosophila Melanogaster Sirkadiyen Entrainment

Mevcut protokol, Drosophila'nın lokomotor aktivitesini, hız, mesafe vb. parametreleri hesaplamak için yüksek tanımlı video kaydına dayalı olarak her karenin piksellerini segmentlere ayırmak için eklentilerle uyumlu açık kaynaklı yazılım Fiji'yi kullanarak el yapımı bir arenada sineklerin hareketini izleyerek ve analiz ederek değerlendirir.

Drosophila'da Lokomotor Aktiviteyi Test Etmek İçin Basit Bir Teknik

Sunulan, yaşlı bir Drosophila modelinde meyve sineklerinin uyku davranışını izleyerek uykuyu iyileştirmek için yüksek verimli ilaç taraması için bir protokoldür.

Drosophila melanogaster Kullanarak Yaşa Bağlı Uyku Bozuklukları İçin Yüksek Verimli Küçük Moleküllü İlaç Taraması

Bu protokol, Drosophila melanogaster'de stres kaynaklı davranış değişikliklerini değerlendirmek için bir çerçeve sağlar. Tamamlayıcı testlerin birleştirilmesi, bireysel sinekler için aktivite, keşif ve karar verme süreçlerinin nicelendirilmesini sağlar. Yaklaşım esnektir ve stres biyolojisi, metabolizması ve nörodavranışsal fonksiyonları inceleyen geniş bir çalışma yelpazesine uyarlanabilir.

Drosophila melanogaster'de Stres Kaynaklı Depresyona Benzer Durumların Çok Modlu Davranışsal Fenotiplenmesi

Öğrenin Drosophila'da sirkadiyen ve uyku fenotiplerini lokomotor aktivite ritimleri ölçerek karakterize etme yöntemini. DAM monitörleri kullanılarak genetik mutasyonların davranışsal ritimler üzerindeki etkisi incelenir.

Sirkadiyen Rhythms Eğitim ve Parametreler Uyku Lokomotor Aktivitesi Assaying Drosophila

Daha fazla video keşfet