Sirkadiyen Rhythms Eğitim ve Parametreler Uyku Lokomotor Aktivitesi Assaying Drosophila

Aşağıdaki deneyin genel amacı, lokomotor aktivitenin günlük ritimlerini inceleyerek drosophila'da sirkadiyen ve uyku fenotiplerini karakterize etmektir. Bu, transgenik sinekler üretilerek, spesifik mutantlar elde edilerek veya deney hayvanlarını hazırlamak için gerekli çaprazlamalar yapılarak gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, deney sırasında sineklerin yaşam alanı olarak hizmet edecek ve içinde bir besin kaynağı bulunan cam aktivite tüplerinin hazırlanması gerekir.

Ardından, bir ila beş günlük sinekler, lokomotor aktivite ritimlerini izlemek amacıyla DAM aktivite monitörlerine yerleştirilen aktivite tüplerine konur. DAM sistemi kullanılarak, far sex ve insomniac gibi yazılımlarla günlük lokomotor aktivite ritimlerinin analizi sonucunda, sirkadyen ve uyku parametrelerindeki kusurlar ve varyasyonları gösteren sonuçlar elde edilir. Bu yöntem; uygun ritimlerin oluşturulmasında hangi proteinlerin ve düzenleyici mekanizmaların rol oynadığı ve örneğin ışık ve sıcaklık gibi çevresel faktörlerin davranışsal ritimleri belirli moleküler yolaklar aracılığıyla nasıl modüle ettiği gibi, sirkadyen biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Lokomotor aktivite izleme sistemi; özel izleme cihazları, diyürnal ışık kontrolü kapasitesine sahip çevresel inkübatörler, veri toplama cihazları, bilgisayarlar ve kablolama gibi çevre birimleri gibi çok sayıda ekipman içerir. İnkübatörlerin aşırı yüklenmesini ve sıcaklık korumasında oluşabilecek olası hataları önlemek için lokomotor aktivite izleme sistemini yerleştirmek üzere iyi havalandırılan, sıcaklık kontrollü, karanlık bir oda seçin; odayı dış ışık kaynaklarından izole edin. Meyve sineklerinin sirkadiyen sistemleri kızılötesi ışığa duyarlı olmadığı için tamamen karanlıkta çalışmak gerekli değildir.

Bu nedenle, karanlık odada görmemiz gereken durumlarda, basitçe kırmızı filtre ile kaplanmış standart bir el feneri ile aktivite izleme sisteminin bileşenlerini besleyecek yeterli watt kapasitesine sahip bir kesintisiz güç kaynağı (UPS) acil durum yedekleme ünitesi kullanırız. Binada ani voltaj yükselmesi veya güç kesintisi olması durumunda, UPS acil durum yedekleme ünitesini, eğer mevcutsa binanın acil durum yedekleme devresine bağlayın. İnkübatördeki aydınlatmayı kontrol eden sistem doğrudan inkübatör tarafından düzenlenmiyorsa, inkübatörü UPS olmadan acil durum gücüne takmak yeterlidir; çünkü birkaç saniyelik güç kaybı hazne sıcaklığını etkilemeyecektir.

Ardından, veri toplama ve/veya inkübatörlerin kontrolü için tamamen tahsis edilmiş bir bilgisayar, PC veya Macintosh kurun. Aktivite bağlantı ve koparmayı kolaylaştırmak için telefon hattı ağını, çevre kontrollü inkübatörlerin rafları etrafında düzgünce manuel olarak düzenleyin. Monitörler, birden fazla telefon hattını tek bir ana hatta birleşecek ve inkübatörden dışarı uzanarak bilgisayara bağlanacak şekilde kurun; inkübatörlerin içindeki izleme cihazlarını, aktivite monitörüne telefon hattı üzerinden güç sağlayan bir güç kaynağı arayüz ünitesi aracılığıyla bilgisayara bağlayın.

Son olarak, elektronik cihazların LED'lerinden gelen olası ışık kaynaklarını veya düzgün şekilde kapatılmamış inkübatör kapısını koli bandı veya siyah bir bezle maskeleyin. Bu, serbest çalışan ritimlerin istenmeyen ışık yokluğunda ölçülmesini sağlamak içindir. Bu fenotiplerin, aynı çevresel koşullarda yetiştirilmiş ve aynı yaşta olan uygun kontrol hayvanları kullanılarak değerlendirilmesi kritik öneme sahiptir.

Buna ek olarak, sirkadiyen ritmde cinsel dimorfizm mevcuttur. Dişi sineklerdeki yumurta bırakma aktivitesi lokomotor aktivitenin gerçek ölçümünü etkileyeceği için, bu analizlerde 25 °C'de yetiştirilmiş ve bir ila beş günlük olan yetişkin erkek sineklerin kullanılması genel uygulamadır. İlgilenilen spesifik mutant sineklerin sirkadiyen ve uyku-dinlenme parametreleri incelenirken, mutant stokun aynı genetik arka plana sahip vahşi tip suşuyla geri çaprazlanması yerinde olacaktır.

Örneğin, W 1118 veya yw. Drosophila erkeklerinde crossing over gerçekleşmediği için, dış çaprazlamayı mutant dişileri yabanıl tip erkeklerle çaprazlayarak gerçekleştirmek daha uygundur; hem yabanıl tip kontrol hem de mutant sinekleri aynı anda ekimleyin. Lokomotor aktivite ritmi deneyinden yaklaşık 10 ila 14 gün önce standart drosophila besiyerinde tutun; döller çıktıktan sonra bir ila beş günlük erkek sinekleri toplayın ve deneylerde kullanılmak üzere ayırın.

Aktivite tüpleri sinek habitatını temsil eder. Deney sırasında bunlar, bir ucunda besin maddesi bulunan ve diğer ucu iplik veya plastik bir tıpayla kapatılmış beş milimetrelik ince cam tüplerdir. Yeni hazırlanmış aktivite tüplerinin kullanılması tercih edilir.

Bunlar genellikle deneyin başlatılmasından birkaç gün veya bir hafta önce hazırlanır. Cam aktivite tüpleri defalarca yeniden kullanılabildiğinden, aşağıdaki hazırlık prosedürleri başlangıç noktası olarak önceden kullanılmış ve temizlenmemiş aktivite tüplerinin kullanımını tanımlamaktadır. Eğer yeni aktivite tüpleri kullanıyorsanız, doğrudan daha sonra gösterilen tüplerin otoklavlanması adımına geçebilirsiniz.

Kullanılmış aktivite tüplerindeki tıkaçları çıkarın ve tüpleri büyük bir cam behere yerleştirin. Tüpler, beher hacminin yalnızca yarısını doldurmalıdır. Tüplerin tamamen suya gömüldüğünden emin olarak beheri musluk suyuyla doldurun.

Cam tüplerle dolu beheri, su tam ve hızlıca kaynayana kadar mikrodalga fırında ısıtın. Balmumu ve agar besiyerini eritirken su sıcak olduğu için dikkatli olun. Beheri mikrodalga fırından çıkarın ve tüpleri bir spatula veya plastik çubukla karıştırın.

Sıkışmış balmumunun üste çıkmasını sağlamak için 10 milimetre pipet kullanın. Ardından mikrodalga işlemini tekrarlayın. Beheri mikrodalgadan çıkarın ve soğumasını bekleyin.

Beherin soğuk odaya konulması işlemi hızlandıracaktır. Su soğudukça, mum suyun yüzeyinde toplanacak ve kademeli olarak katılaşacaktır. Katılaşan mumu elinizle alın.

Bu işlem, tüplerin üzerindeki mumun çoğunu temizlemelidir. Aktivite tüplerini taze musluk suyu içeren yeni bir behere aktarın ve mikrodalga ile mum temizleme işlemini tekrarlayın. Mumun çoğu önceki adımda temizlendiği için, mumun katılaşmasını beklemeye gerek yoktur.

Beherdeki suyu basitçe dökün ve tüpleri yeni bir behere aktarın. Su hâlâ sıcak olduğu için dikkatli olun. Mikrodalga işlemini son kez tekrarlayın.

Suyu beherden boşaltın ve aktivite tüplerinin soğumasını bekleyin. Ardından, aktivite tüplerini 250 mililitre veya 500 mililitre hacmindeki cam beherlerin içine dikey olarak yerleştirin. Tüplerin birbirine çok sıkışık olmadığından emin olun.

Aktivite tüplerine yüklenecek besiyerini hazırlamak için kuru çevrimli bir otoklav kullanarak sterilize edin veya tüpleri basitçe bir kurutma fırınında kurutun. Distile veya musluk suyunda %5 sükroz ve %2 bakteriyel agar çözeltisi hazırlayın ve çözeltiyi otoklavlayın. Otoklavlanmış besiyeri hemen kullanılabilir veya uzun bir süre boyunca dört derece Celsius'ta saklanabilir.

İdeal olarak, aktivite tüplerini doldururken besiyeri yaklaşık 65 °C olmalıdır. 10 mL'lik bir pipet kullanarak, sıvı besiyeri çözeltisini cam beherin iç duvarı boyunca pipetleyin ve tüpleri aşağıdan yukarıya doğru üçte bir oranında dolana kadar doldurun. Tüm tüplerin besiyeri çözeltisiyle eşit şekilde dolduğundan emin olmak için beheri nazikçe sallayın.

Besinin oda sıcaklığında veya dört santigrat derecede tamamen katılaşmasını bekleyin. Cam tüplerin içindeki yoğuşma dağıldığında, tüpler beherden çıkarılabilir. Aktivite tüplerini beherden çıkarmak için, tüpleri beherin tabanına doğru itin ve tüplerin içindeki katılaşmış besin ile beherin tabanı birbirinden ayrılsın diye aynı anda tüpleri döndürün.

Tüpleri, tercihen tek bir grup halinde beherden çıkarın. Ardından, tüplerin dış yüzeyindeki fazla besiyerini temizlemek için tüpleri kağıt havluyla tek tek silin. Tüpleri temiz bir kaba yerleştirerek kenara alın.

Tüp tutucu olmayan genel bir laboratuvar blok ısıtıcısını alın ve ısıtma kuyusunu dikkatlice kapatın. Birkaç kat güçlü alüminyum folyo ile kaplanmış ısıtma kuyusuna eritmek üzere parafin peletleri ekleyin; tüpleri gıda ile temas etmeyen uçlarından tutun ve gıdanın bulunduğu ucu eritilmiş muma daldırın. Mumun katılaşmasını hızlandırmak için mumlu kısmı soğuk suyla dolu bir cam behere daldırın. İşlemi tekrarlayın.

Balmumu tüplerin bir kez suya daldırılması, tüplerin birbirine yapışmasını önleyecektir. Tüpler hemen kullanılabilir veya kullanım için dört derece santigrat sıcaklıkta hava geçirmeyen bir kapta saklanabilir. Bir haftalık süreyi aşan uzun süreli saklama, gıdanın aşırı kurumasına neden olacaktır.

Tüpler dört santigrat derecede saklanmışsa, kullanmadan önce tezgah üzerinde bekleterek oda sıcaklığına getirin. Sinekleri aktivite tüplerine yerleştirmeden önce, aktivite monitörlerini barındırmak için kullanılacak inkübatörleri açın. İnkübatör kontrollerini kullanarak sıcaklığı ayarlayın ve istenen deney tasarımına göre DAM sistemi ışık kontrol cihazı veya inkübatörün kendi ışık kontrol sistemi üzerinden ışık-karanlık rejimini belirleyin.

Ardından, sinekleri karbondioksit ile anestezi edin. Daha sonra ince bir resim fırçası kullanarak, tek bir sineği nazikçe bir aktivite tüpüne aktarın. Yaklaşık yarım inç uzunluğunda tek bir ip parçasının ortasını ince pensle tutun ve açılığı kapatıp sineğin deney sırasında kaçmasını önlemek için ipi aktivite tüpünün besin bulunmayan ucuna yerleştirin.

Tüpe hava akışına izin verirken, sinek uyanana kadar tüpü yan yatırılmış şekilde tutun. Sineğin yeme yapışmasını önlemek için tüpleri aktivite monitörlerine yerleştirin. Tri Kinetics monitörlerinin daha yeni ve daha kompakt modelinde, kızılötesi ışının tüpün merkez konumundan geçtiğinden emin olmak için tüplerin lastik tokalarla sabitlenmesi gerekir. Son olarak, aktivite monitörlerini inkübatörlere yerleştirin ve telefon kabloları aracılığıyla veri toplama sistemine bağlayıp kontrol edin.

Tüm monitörlerin düzgün şekilde bağlandığı ve her birinden veri toplandığı DAM sistemi toplama yazılımı kullanılarak kontrol edilir. Sinekler aktivite tüplerine yerleştirildiğine ve lokomotor aktivite izleme sistemi hazır olduğuna göre, artık veriler kaydedilebilir. Sinekler, istenen ışık, karanlık veya LD ve sıcaklık rejimine iki ila beş tam gün boyunca maruz bırakılarak senkronize edilir ve entrain edilir.

En yaygın kullanılan entrainment koşulu, 25 °C sıcaklıkta 12 saat ışık ve 12 saat karanlıktan oluşan ışık-karanlık döngüsüdür. Bu protokolle ilişkili sirkadiyen ritimlerin incelenmesinde, inkübatördeki ışıkların açıldığı an ZT 0 olarak tanımlanır ve diğer tüm zamanlar bu değere göre belirlenir. Standart 12:12 LD koşulları altında, vahşi tip *Drosophila melanogaster* genellikle biri ZT 0 civarında merkezlenen ve sabah pik noktası olarak adlandırılan, diğeri ise ZT 12 civarında merkezlenen ve akşam pik noktası olarak adlandırılan iki aktivite dönemi sergiler; serbest yürüyüş lokomotor aktivite ritimleri, entrainment döneminden sonra sabit karanlık ve sıcaklık koşulları altında ölçülür.

Işık döngüsü ayarı, ld'nin son günündeki karanlık evrede herhangi bir zamanda değiştirilebilir; böylece deneyin bir sonraki günü dd'nin ilk gününü temsil eder. Sineklerin sirkadiyen periyodunu ve ritmin genliğini veya gücünü hesaplamak için yedi günlük DD veri toplama süreci yeterlidir. Genel olarak, belirli bir genotip için güvenilir serbest çalışan periyotlar elde etmek amacıyla en az 16 sinekten oluşan bir örneklem büyüklüğü gereklidir.

Deneyin sonunda, DAM sistem yazılımı kullanılarak toplanan ham ikili veriler, taşınabilir bir veri depolama cihazına, örneğin bir USB belleğe indirilir. Ham ikili veriler DAM file scan 1 0 2 x kullanılarak işlenir ve sirkadyen parametreler analiz edilirken 15 ve 30 dakikalık aralıklara, uyku analiz edilirken ise bir ila beş dakikalık aralıklara göre toplanır.

Dinlenme parametreleri. Şu anda drosophila'da uyku dinlenmesinin standart tanımı, beş dakikalık kesintisiz hareketsizliktir. Bu protokol tamamlandığında, sirkadiyen parametreler için deney ve kontrol hayvanlarının sirkadiyen ve uyku parametrelerini karşılaştırmak amacıyla aynı veri seti kullanılabilir.

LD veya DD koşullarında, sineklerin günlük lokomotor aktivitelerini veya birkaç gün boyunca ortalama aktivitelerini gösteren indüksiyon grafikleri fast x oph melanogaster kullanılarak oluşturulabilir; bunlar genellikle biri ZT sıfır civarında merkezlenen ve sabah zirvesi olarak adlandırılan, diğeri ise ZT 12 civarında gerçekleşen ve akşam zirvesi olarak adlandırılan iki aktivite dönemi sergilerler. Bu iki aktivite dönemi endojen saat tarafından kontrol edilir ve serbest koşan DD koşullarında bile gözlemlenebilir. Bu aktivite zirvelerinin zamanlamasındaki değişiklikler indüksiyon grafiklerinde kolayca gözlemlenebilir ve endojen saatin özelliklerinde bir değişikliğe işaret edebilir.

Doğru saat fonksiyonunun göstergesi olan bir diğer özellik, LD döngülerinde gerçek karanlıktan aydınlığa veya aydınlıktan karanlığa geçişlerden önce gözlemlenen lokomotor aktivitedeki önleyici artıştır. Bu davranış yabanıl tip sineklerde açıkça görülürken, per zero mutantlarında mevcut değildir ve aritmiktir. Bu mutantta.

LD'de gözlemlenen sabah ve akşam pikleri, tamamen ışık-karanlık koşullarındaki ani değişimlere bağlı irkilme tepkileridir. Saat geni bulunmayan sinekler çevresel değişimleri önceden tahmin etmezler, sadece onlara tepki verirler. Davranışsal ritmikliğin kaybı DD'de çok daha belirgindir ve genellikle per zero sineklerinde görüldüğü gibi, lokomotor aktivitenin sabah veya akşam piklerinin tamamen kaybolması şeklinde ortaya çıkar.

İndüksiyon grafiklerine ek olarak, lokomotor aktivite verileri, her bir bireysel sinek veya sinek genotipi için çiftli çizim grafiği (actogram) şeklinde temsil edilebilir; burada iki günlük veri her satıra ardışık olarak çizilir, ancak son günün profili iki günlük aktiviteyi içeren bir sonraki satırı başlatır. Örneğin, ACTO gramının ilk satırına LD bir ve iki çizilir. Bir sonraki satır LD ikinin tekrarıyla başlar ve ardından LD üç ve sonrası gelir.

Bu formatı takip ederek, tüm deneyi kapsayan lokomotor aktivite verileri ACTO gramda gösterilmiştir; ACTO gramların redüksiyon grafiklerine göre bir avantajı, günlük aktivite ritimlerinin periyot uzunluğundaki değişimin kolayca gözlemlenebilmesidir; ayrıca indüksiyon grafikleri ve ACTO gramlar da oluşturulmaktadır.

DD koşulundan elde edilen lokomotor aktivite verileri, beş ardışık dakikalık inaktivite olarak tanımlanan uyku ve dinlenme parametrelerinin analizi için kullanılan cycle P dahil olmak üzere birçok farklı program aracılığıyla periyot uzunluğunu hesaplamak üzere far X'e gönderilebilir. Lokomotor aktivite analizlerinden kaydedilen veriler analiz edilebilir ve MATLAB tabanlı bir program olan insomniac kullanılarak birden fazla uyku parametresi incelenebilir; sineklerin uyuyarak geçirdiği sürenin yüzdesi farklı zaman aralıklarında hesaplanabilir. Örneğin, her saat başı veya her 12 saatteki uyku yüzdesi belirlenebilir.

İncelenebilecek diğer daha yaygın uyku parametreleri arasında, uykunun ne kadar konsolide olduğunu ölçen ve uyku kalitesini ortaya koyabilen ortalama dinlenme süresi yer alır. Bir diğeri ise, sinekler uyanıkken aktivite hızının bir ölçüsü olan uyanıklık aktivite sayısıdır. Bu parametre, uyku ve dinlenme davranışları gerçekten etkilenen sinekler ile hasta veya hiperaktif olan sineklerin ayırt edilmesine yardımcı olur.

Örneğin, sadece hasta olan sinekler, hareket kabiliyetleri azaldığı için daha fazla uyuyor gibi görünebilirler. Bu sinekler için uyanıklık aktivitesi, kontrol hayvanlarına kıyasla daha düşük olacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, drosophila'da sirkadiyen ve uyku fenotiplerinin deney yoluyla nasıl karakterize edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Lokomotor aktivitenin günlük ritimleri.