JoVE Journal
Neuroscience

This content is Free Access.

JoVE Journal Neuroscience

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

Sirkadiyen Rhythms Eğitim ve Parametreler Uyku Lokomotor Aktivitesi Assaying Drosophila

Full Text

47,705 Views

18:08 min

September 28, 2010

DOI: 10.3791/2157-v

Joanna C. Chiu^1,2, Kwang Huei Low^1,3, Douglas H. Pike¹, Evrim Yildirim^1,3, Isaac Edery^1,3

¹Center for Advanced Biotechnology and Medicine,Rutgers University, ²Current Address: Department of Entomology, College of Agricultural and Environmental Sciences,University of California, Davis, ³Department of Molecular Biology and Biochemistry,Rutgers University

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

Biz günlük lokomotor aktivite ritimleri kayıt için prosedürler tarif

Transcript

Aşağıdaki deneyin genel amacı, lokomotor aktivitenin günlük ritimlerini test ederek drosophila'daki sirkadiyen ve uyku fenotiplerini karakterize etmektir. Bu, hendek genci sinekler üreterek, spesifik mutantlar elde ederek veya deney hayvanlarını hazırlamak için gerekli haçları ayarlayarak elde edilir. İkinci adım olarak, deney sırasında sinek yaşam alanı olarak görev yapacak bir besin kaynağı içeren cam aktivite tüplerinin hazırlanması gerekmektedir.

Daha sonra bir ila beş günlük sinekler, lokomotor aktivite ritimlerini izlemek için DAM aktivite monitörlerine yüklenen aktivite tüplerine yerleştirilir. DAM sistemi kullanılarak, uzak seks ve uykusuzluk gibi yazılımlar kullanılarak günlük lokomotor aktivite ritimlerinin analizine dayalı olarak sirkadiyen ve uyku parametrelerinde kusurlar ve varyasyonlar gösteren sonuçlar elde edilmiştir. Bu yöntem, sirkadiyen biyoloji alanında, uygun ritimlerin üretilmesinde hangi proteinlerin ve düzenleyici mekanizmaların yer aldığı ve örneğin, ışık ve sıcaklık gibi çevresel faktörlerin belirli moleküler yollar aracılığıyla davranışsal ritimleri nasıl modüle ettiği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Lokomotor aktivite izleme sistemi, özel izleme cihazları, günlük ışık kontrolü kapasitesine sahip çevresel inkübatörler, veri toplama cihazları, bilgisayarlar ve kablolama gibi çevresel malzemeler gibi çok sayıda ekipman içerir, iyi havalandırılan bir sıcaklık kontrolü seçin, inkübatörler üzerindeki aşırı yükü önlemek için lokomotor aktivite izleme sistemini barındırmak için karanlık oda ve sıcaklığın korunmasında olası bir başarısızlık yoktur. karanlık odanın içindeki ışık kaynakları. Meyve uçarken tamamen karanlıkta çalışmak gerekli değildir. Sirkadiyen sistem kızılötesi ışığa duyarlı değildir.

Bu nedenle, karanlık odada görmemiz gereken durumlarda, sadece kırmızı filtre satın alma ile kaplı standart bir el feneri, aktivite izleme sisteminin bileşenlerine güç sağlamak için yeterli watt kapasitesine sahip kesintisiz bir güç kaynağı acil durum yedekleme ünitesi kullanıyoruz. Binada bir aşırı gerilim yükselmesi veya elektrik kesintisi olması durumunda, varsa UPS acil durum Yedekleme Ünitesini binanın acil durum yedekleme devresine bağlayın. İnkübatördeki aydınlatmayı kontrol eden sistem inkübatör tarafından doğrudan düzenlenmiyorsa, birkaç saniye güç kaybı oda sıcaklığını etkilemeyeceğinden, inkübatörü UPS olmadan acil durum gücüne takmak yeterlidir.

Ardından, veri toplama ve/veya inkübatörlerin benzer şekilde kontrol edilmesi için tamamen ayrılmış bir bilgisayar, PC veya Macintosh kurun. Aktivitenin takılmasını ve çıkarılmasını kolaylaştırmak için telefon hattı ağını, çevre kontrollü inkübatörlerin raflarının etrafına düzgün bir şekilde manuel olarak yerleştirin. Monitörler, tek bir ana hatta birleşecek ve bilgisayara bağlanmak için inkübatörden dışarı çıkacak şekilde birden fazla telefon hattı kurar, inkübatörlerin içindeki izleme cihazlarını, telefon hattı üzerinden aktivite monitörüne güç sağlamaya yarayan bir güç kaynağı arabirim birimi aracılığıyla bilgisayara bağlar.

Son olarak, elektronik cihazların LED'lerinden veya yanlış kapatılmış bir inkübatör kapısından gelen olası ışık kaynaklarını koli bandı veya siyah bir bezle maskeleyin. İstenmeyen ışık yokluğunda serbest koşu ritimlerinin ölçülmesini sağlamak için. Bu fenotipleri, aynı çevre koşullarında ve aynı yaşta yetiştirilen uygun kontrol hayvanları kullanarak değerlendirmek çok önemlidir.

Ek olarak, sirkadiyen ritmiklikte cinsel dimorfizm vardır. Genel uygulama, 25 santigrat derecede ve bir ila beş günlük olan bu tahliller için yetişkin erkek sineklerin kullanılmasıdır, çünkü dişi sineklerde yumurtlama aktivitesi, lokomotor aktivitenin gerçek ölçümünü etkileyecektir. İlgilenilen belirli mutant sineklerin sirkadiyen ve uyku dinlenme parametrelerini incelerken, mutant stoğu aynı genetik geçmişe sahip vahşi tip suşla geçmek akıllıca olacaktır.

Örneğin, W 1118 veya yw. Drosophila erkeklerinde çaprazlama olmadığından, mutant dişileri hem yabani tip kontrolü hem de mutant sinekleri aynı anda tohumlayan yabani tip erkeklerle çaprazlama yapmak daha iyidir. Standart drosophila mamalarında, döllerin kabulü üzerine lokomotor aktivite ritim deneyinden yaklaşık 10 ila 14 gün önce, bir ila beş günlük erkek sinekleri toplayın ve deneyler için kullanılmak üzere bir kenara koyun.

Aktivite tüpleri sinek habitatını temsil eder. Deney sırasında, bir ucunda gıda maddesi bulunan ve diğer ucunda iplik veya plastik bir tıkaç ile tıkanan beş milimetrelik ince cam tüplerdir. Taze yapılmış aktivite tüplerinin kullanılması tercih edilir.

Genellikle deneye başlamadan birkaç gün ila bir hafta önce hazırlanırlar. Cam aktivite tüpleri birden çok kez tekrar kullanılabildiğinden, aşağıdaki hazırlama prosedürleri, başlangıç noktası olarak daha önce kullanılmış ve temiz olmayan aktivite tüplerinin kullanılmasını açıklar. Yeni aktivite tüpleri kullanıyorsanız, daha sonra gösterildiği gibi tüplerin otoklavlanmasına geçmeniz yeterlidir.

Tapaları kullanılmış aktivite tüplerinden çıkarın ve büyük cam kabın içine koyun. Tüp, beherin sadece yarısına kadar doldurmalıdır. Beheri musluk suyuyla doldurun ve tüpleri suya batırdığınızdan emin olun.

Su tam ve hızlı bir şekilde kaynayana kadar cam tüplerle doldurulmuş beheri mikrodalgada pişirin. Balmumu ve agar yemini eritmek için su sıcak olduğu için dikkatli olun. Beheri mikrodalgadan çıkarın ve tüpleri bir spatula veya plastikle karıştırın.

Sıkışan balmumunun üste çıkmasına izin vermek için 10 milimetre pipet. Ardından mikrodalgada pişirme adımını tekrarlayın. Beheri mikrodalgadan çıkarın ve soğumasını bekleyin.

Beheri soğuk odaya koymak işlemi hızlandıracaktır. Su soğudukça, balmumu suyun yüzeyinde toplanacak ve yavaş yavaş katılaşacaktır. Katılaşmış balmumu elle çıkarın.

Bu, tüplerdeki balmumunun çoğundan kurtulmalıdır. Aktivite tüplerini taze musluk suyu ile yeni bir behere aktarın ve mikrodalga ve balmumu çıkarma işlemini tekrarlayın. Balmumunun çoğu önceki adımda çıkarıldığından, balmumunun katılaşmasını beklemek gerekli değildir.

Suyu beherden boşaltın ve tüpleri yeni bir behere aktarın. Su hala sıcak olduğu için dikkatli olun. Mikrodalga işlemini son kez tekrarlayın.

Suyu beherden boşaltın ve aktivite tüplerinin soğumasını bekleyin. Ardından, aktivite tüplerini dikey olarak 250 mililitre veya 500 mililitrelik cam beherlere yükleyin. Çok sıkı paketlenmediklerinden emin olun.

Kuru döngülü bir otoklav kullanarak bunları sterilize edin veya aktivite tüplerine yüklenecek yiyecekleri hazırlamak için tüpleri bir kurutma fırınında kurutun. Damıtılmış veya musluk suyu otoklavında agar'a% 5 sükroz ve% 2 bact çözeltisi hazırlayın. Otoklav yemi hemen kullanılabilir veya uzun bir süre boyunca dört santigrat derecede saklanabilir.

İdeal olarak, yiyecek yaklaşık 65 santigrat derece dolum aktivitesi tüplerinde olmalıdır. Sıvı gıda solüsyonunu cam kabın iç duvarı boyunca pipetlemek için 10 mililitrelik bir pipet kullanın ve tüpleri aşağıdan yukarıya doğru üçte biri dolana kadar doldurun. Tüm tüplerin gıda çözeltisi ile eşit şekilde doldurulduğundan emin olmak için kabı hafifçe şişirin.

Yiyeceklerin oda sıcaklığında veya dört santigrat derecede tamamen katılaşmasını bekleyin. Cam tüplerin içindeki yoğuşma dağıldıktan sonra, tüpler beherden çıkarılabilir. Aktivite tüplerini beherden çıkarmak için, tüpleri beherin dibine doğru itin ve tüpleri aynı anda bükün, böylece tüplerin içindeki katılaşmış gıda ve beherin tabanı ayrılacaktır.

Tüpleri, tercihen tek bir demet olarak beherden çıkarın. Daha sonra, tüplerin dış yüzeyindeki fazla yiyecekleri çıkarmak için tüpleri tek tek kağıt havlularla temizleyin. Tüpleri temiz bir kapta bir kenara koyun.

Tüp tutucusu olmayan bir genel laboratuvar blok ısıtıcısı alın ve ısıtmayı dikkatlice kapatın. Birkaç kat güçlü alüminyum folyo ile, eritmek için alüminyum kaplı ısıtma kuyusuna parafin peletleri ekleyin, tüpleri gıda dışı uçta tutun ve yiyecek ucunu erimiş balmumuna batırın. Balmumu katılaşmasını hızlandırmak için balmumu kısmını soğuk suyla dolu bir cam behere batırın. Yinelemek.

Balmumu tüplerini suya batırdıktan sonra, tüplerin birbirine yapışmasını önleyecektir. Tüpler hemen kullanılabilir veya kullanım için dört santigrat derecede hava geçirmez bir kapta saklanabilir. Bir hafta içinde, uzun süreli depolama, yiyeceğin aşırı kurumasına neden olacaktır.

Tüpler dört santigrat derecede saklanıyorsa, kullanmadan önce tezgah üzerinde bırakarak ortam sıcaklığına kadar ısıtın. Sinekleri aktivite tüplerine yüklemeden önce, aktivite monitörlerini barındırmak için kullanılacak inkübatörleri açın. İnkübatör kontrollerini kullanarak sıcaklığı ayarlayın ve istenen deneysel tasarıma göre DAM sistem ışık kontrolörünü veya inkübatörün kendi ışık kontrol sistemini kullanarak açık karanlık rejimini ayarlayın.

Sonra, sinekleri karbondioksit ile uyuşturun. Daha sonra ince bir boya fırçası kullanarak, tek bir sineği nazikçe bir aktivite tüpüne aktarın. İnce forseps ile yaklaşık yarım inç olan tek bir iplik parçasının ortasını tutun ve açıklığı tıkamak ve deney sırasında sineğin kaçmasını önlemek için ipliği aktivite tüpünün gıda olmayan ucuna yerleştirin.

Aynı zamanda tüpün içine hava akışına izin verirken, sinek uyanana kadar tüpü yan yatırın Sineğin yiyeceğe yapışmasını önlemek için tüpleri aktivite monitörlerine yerleştirin. Tri Kinetics monitörlerin daha yeni, daha kompakt modelinde, kızılötesi ışının tüpü merkez konumda geçmesini sağlamak için tüpleri lastik bantlarla yerinde tutmak gerekir. Son olarak, aktivite monitörlerini inkübatörlere yerleştirin ve telefon kabloları kontrolü yoluyla veri toplama sistemine bağlayın.

Tüm monitörlerin düzgün bir şekilde bağlandığı ve her birinden veri toplandığı DAM sistem toplama yazılımını kullanma. Artık sinekler aktivite tüplerine yüklendiğine ve lokomotor aktivite izleme sistemi hazır olduğuna göre, veriler artık kaydedilebilir. Sinekler, iki ila beş tam gün boyunca istenen aydınlık, karanlık veya LD ve sıcaklık rejimine maruz bırakılarak senkronize edilir ve sürüklenir.

En sık kullanılan sürüklenme durumu, 12 saat aydınlık, 25 santigrat derecede 12 saat karanlık bir döngüdür. Bu protokole göre sirkadiyen ritimlerin incelenmesi için, inkübatörde ışıkların yandığı zaman Zeke GABA çarpı sıfır olarak tanımlanır ve diğer tüm zamanlar bu değere göredir. Standart 12 ila 12 LD koşulları altında, yazılan roso melano gasta tipik olarak iki aktivite nöbeti sergilerken, biri sabah zirvesi olarak adlandırılan ZT sıfır etrafında ve diğeri ZT 12 civarında merkezlenmiş, akşam zirvesi olarak adlandırılan serbest çalışan lokomotor aktivite Ritimler sabit karanlık ve sıcaklık koşulları altında ölçülür, eğitim dönemidir.

Işık döngüsünün ayarı, ld'nin son gününde karanlık fazda herhangi bir zamanda değiştirilebilir, böylece deneyin sonraki günü dd'nin ilk gününü temsil eder. Sineklerin sirkadiyen periyodu ve ritminin genliğini veya gücünü hesaplamak için yedi günlük DD veri toplama yeterlidir. Genel olarak, belirli bir genotip için güvenilir serbest çalışma süreleri elde etmek için en az 16 sinekten oluşan bir örneklem büyüklüğü gereklidir.

Deneyin sonunda, DAM sistem yazılımı kullanılarak toplanan ham ikili veriler, taşınabilir bir veri depolama aygıtına indirilir. Örneğin, bir USB anahtarı. Ham ikili veriler, DAM dosya taraması 1, 0, 2 x kullanılarak işlenir ve sirkadiyen parametreleri analiz ederken 15 ve 30 dakikalık bölmelere veya uyku analiz edilirken bir ila beş dakikalık bölmelere toplanır.

Dinlenme parametreleri. Şu anda, beş bitişik dakika hareketsizlik, drosophila'da uyku dinlenmesinin standart tanımıdır. Bu protokolün tamamlanmasının ardından, deney ve kontrol hayvanlarının sirkadiyen ve uyku parametrelerini sirkadiyen parametreler için karşılaştırmak için aynı veri seti kullanılabilir.

LD veya DD koşullarında birkaç gün boyunca sineklerin günlük lokomotor aktivitelerini veya ortalama aktivitelerini gösteren indüksiyon grafikleri, hızlı x oph melanogaster kullanılarak oluşturulabilir, genellikle biri sabah zirvesi olarak adlandırılan ZT sıfır ve diğeri akşam zirvesi olarak adlandırılan ZT 12 etrafında merkezlenen iki aktivite nöbeti sergiler. Bu iki aktivite nöbeti endojen saat tarafından kontrol edilir ve serbest çalışan DD koşullarında bile gözlemlenebilir. Bu aktivite zirvelerinin zamanlamasındaki değişiklikler indüksiyon grafiklerinde kolayca gözlemlenebilir ve endojen saatin özelliklerinde bir değişiklik olduğunu gösterebilir.

Uygun saat fonksiyonunun göstergesi olan bir başka özellik, gerçek karanlıktan aydınlığa veya aydınlıktan karanlığa geçişlerden önce meydana gelen LD döngülerinde gözlenen lokomotor aktivitede beklenen artıştır. Bu davranış, vahşi tip sineklerde açıkça görülür, ancak sıfır mutant başına yoktur ve aritmiktir. Bu mutantta.

LD'de gözlenen sabah ve akşam zirveleri, aydınlık karanlık koşullardaki ani değişiklikler nedeniyle tamamen ürkütücü tepkilerdir. Saatsiz sinekler çevresel değişiklikleri öngörmezler, sadece onlara tepki verirler. Davranışsal ritmiklik kaybı DD'de çok daha belirgindir ve genellikle sıfır sinekte görüldüğü gibi lokomotor aktivitenin sabah veya akşam zirvelerinin toplam kaybıyla kendini gösterir.

İndüksiyon grafiklerine ek olarak, lokomotor aktivite verileri, her bir satırda iki günlük verinin sırayla çizildiği her bir sinek veya sinek genotipi için bir çift çizim gramı olarak temsil edilebilir, ancak son günün profili, iki günlük aktivitenin bir sonraki satırına başlar. Örneğin, LD bir ve iki, ACTO gramının ilk satırına çizilir. Bir sonraki satır LD iki'nin tekrarı ile başlar ve ardından LD üç gelir ve bu böyle devam eder.

Bu formatı takiben, tüm deneyi kapsayan lokomotor aktivite verileri, ACTO gramlarının indirgeme grafiklerine göre bir avantajı olan ACTO gramında gösterilmektedir. Bu, günlük aktivitenin dönem uzunluğunda bir değişiklik mi? Ritimler, indüksiyon grafikleri ve ACTO gramları oluşturmanın yanı sıra kolayca gözlemlenebilir.

DD koşulundan elde edilen lokomotor aktivite verileri, uyku analizi için P döngüsü, beş bitişik hareketsizlik dakikası olarak tanımlanan dinlenme parametreleri de dahil olmak üzere bir dizi farklı program kullanılarak periyot uzunluğunu hesaplamak için uzak X'e gönderilebilir. Lokomotor aktivite tahlillerinden kaydedilen veriler analiz edilebilir ve MATLAB tabanlı bir program olan insomniac kullanılarak birden fazla uyku parametresi incelenebilir, sineklerin uyumak için harcadıkları sürenin yüzdesi farklı zaman aralıklarında hesaplanabilir. Örneğin, her saat veya her 12 saatte bir uyku yüzdesi.

İncelenebilecek diğer daha yaygın uyku parametreleri arasında, uykunun ne kadar konsolide olduğunun bir ölçüsü olan ve uyku kalitesini gösterebilen ortalama dinlenme süresi uzunluğu bulunur. Bir diğeri, sinekler uyanık olduğunda aktivite oranının bir ölçüsü olan uyanıklık aktivitesi sayısıdır. Bu parametre, uykuda gerçekten etkilenen sinekleri, dinlenme davranışlarını hasta veya hiperaktif olanlara karşı ayırt etmeye yardımcı olur.

Örneğin, sadece hasta olan sinekler, hareketli olmadıkları için daha fazla uyuyor gibi görünebilir Bu sinekler için, uyanıklık aktiviteleri kontrol hayvanlarına göre daha düşük olacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, drosophila'da sirkadiyen ve uyku fenotiplerinin tahlil ile nasıl karakterize edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Lokomotor aktivitenin günlük ritimleri.

Explore More Videos

Nörobilim Sayı 43 sirkadiyen ritim lokomotor aktivite Drosophila süre uyku Trikinetics