Kapak Endotel Hücreleri İzolasyon

Bu video protokolünde, bir aort kalp kapağından yerleşik interstisyel ve tarafa özgü endotel hücrelerin izolasyonu gösterilmektedir. Kapak yaprağı kalpten çıkarılır ve soğuk salin çözeltisine yerleştirilir. Endotel tabakası, tarafa özgü izolasyon için dokunun kollajenaz çözeltisine daldırılmış haldeyken bir pamuklu çubukla nazikçe sıyrılmasıyla yaprağın her iki tarafından uzaklaştırılabilir; kapak yaprağı, endotel yüzey açığa çıkacak şekilde bir parafin yatağına iğnelenir.

Ardından, kapakçığa birkaç damla soğuk kollajenaz eklenir ve kapakçıklar beş ila 10 dakika boyunca inkübe edilir. Kollajenaz ile inkübasyonun ardından, bölgeye özgü endotelyal tabaka, dokunun nazikçe sıyrılmasıyla uzaklaştırılır. Serbest kalan endotelyal hücreler bir pamuklu çubukla toplanır, yıkanır ve ekim yapılır.

Kalan yaprakçıklar, toplanıp yıkanacak olan interstisyel hücreleri izole etmek için gece boyunca sindirilir. İzole edilen tüm hücreler kültüre edilir ve yerel mekanik ve biyolojik sinyallere yanıt olarak kalp kapakçığı onarımı ve yeniden şekillenmesindeki rollerini anlamak için kullanılabilir. Merhaba, ben Russell Gould.

Cornell Üniversitesi biyomedikal mühendisliği bölümündeki Butcher laboratuvarındayım. Bugün size valvüler endotel hücrelerinin nasıl izole edileceğini göstereceğim. Bu tekniğin uygulamaları, yerleşik V hücrelerinin mekanik ve biyolojik sinyallere yanıt olarak kendilerini nasıl sürekli onardığını ve yeniden şekillendirdiğini anlamaya yöneliktir.

Haydi başlayalım. İlk olarak, yerel bir mezbahadan domuz temin edin ve aort kökünü çıkarmak için aseptik koşullarda çalışın. Aort kökünü kandan tamamen arındırın.

Kapakçık endotel hücresi veya VEC ölümünü ve bakteriyel kontaminasyonu sınırlamak için, soğuk ve steril DPBS ile tüm kan bileşenlerinin mümkün olan en kısa sürede uzaklaştırılması zorunludur. Bu aşamada, hücrelere potansiyel olarak zarar verebileceği için antibiyotik ve antimikotik kullanımı önerilmez. Ardından, doğrudan root three kısmından izolasyon yapın.

Her bir kapaktan valv yaprakçıkları. Yaprakçığı izole ederken dikkatli olun, çünkü herhangi bir anüler doku hücre popülasyonunu kontamine edecektir. İzole edilen yaprakçıkları, 12 mililitre soğuk DPBS ile doldurulmuş steril 15 mililitrelik konik tüpe yerleştirin.

Kalıntıları temizlemek için birkaç kez çalkalayın ve taze DPBS ile doldurun. Son olarak, kapakçıkları buz üzerinde laboratuvara geri taşıyın. Laboratuvara ulaştığınızda, dokunun bulunduğu kabı steril kabine yerleştirin ve endotel tabakasını izole etme işlemine geçin; tırtıklı doku penseti, doku makası ve pamuklu çubukları kapalı bir alet tepsisi içinde otoklavlayın.

Ayrıca, ekteki yazılı protokolde detaylandırıldığı üzere, steril kollajenaz çözeltisi, endotelyal ortam ve interstisyel ortam hazırlayın. Steril 35 milimetrelik bir kaba, kapak başına üç mililitre soğuk kollajenaz çözeltisi doldurun ve 15 mililitrelik tüpteki üç yaprağın tamamını kaba yerleştirin.

Dokuyu 37 °C'de beş ila 10 dakika inkübe edin. Ardından, kuru steril bir pamuklu çubuğu yüzey üzerinde döndürerek yaprağın her iki yanındaki endotel tabakasını nazikçe uzaklaştırın. Döndürme yönü ve uygulanan makaslama kuvveti miktarı, örneğin saflığı açısından kritiktir.

Swabın döndürülme yönü, pamuklu swabı tutan elin doğrusal hareketine zıt yöndedir. Bu işlem, endotel hücrelerini dokudan ayıran kontrollü bir kayma kuvveti oluşturur. Uygulanan kuvvet miktarı, dokunun direncini hissettirecek kadar olmalı, ancak bazal membrana nüfuz etmemelidir; hücrelerin uç liflerden ayrılmasını sağlamak için swabı ara ara kollajenaz solüsyonu içine hafifçe bastırın.

Sıyırma işlemi tamamlandıktan sonra, endotelyal tabakanın dokusu öncekine göre biraz daha pürüzsüz hissedilmelidir. Kollajenaz çözeltisi içinde süspande olan hücreleri toplayın ve yeni, steril bir 15 ml tüpe aktarın. Endotelyal hücreleri yapraklardan sıyırdıktan sonra, interstisyel hücre izolasyonu için yaprakları derhal 10 ml kollajenaz çözeltisi içeren bir 15 ml tüpe yerleştirin.

İzole edilen hücreleri çöktürmek için tüpleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 1000 RPM'de santrifüjleyin ve süpernatantı aspire edin. 15 milliliter tüplere üç milliliters endotelyal besiyeri ekleyin. Daha önce yapıldığı gibi ikinci kez santrifüjleyin ve besiyerini aspire edin.

Bu ikinci santrifüj işlemi, uç lifleri gibi bazı istenmeyen materyallerin filtrelenmesine yardımcı olur. Santrifüj edilen endotel hücrelerini beş mililitre endotel ortamında yeniden süspande edin ve hücreleri kolajen ile önceden kaplanmış bir T 25 flaskına ekleyin. Her santrifüj tüpü için bir flask kullanarak, endotel ortamını değiştirmeden önce hücrelerin en az iki ila üç gün büyümesine izin verin.

Bu, hücrelerin toparlanmasına ve bölünmesine yardımcı olur. İzolasyon süreci oldukça ağır olduğu ve hücre verimi düşük olabileceği için, hücrelerin konfluense yakınken pasajlanması kritik önem taşır. Kontakt inhibisyonu hücre transformasyonuna yol açabileceğinden, endotel hücreler belirli bir bölgeden de izole edilebilir.

Bunun için öncelikle, parafin yatak hattı içeren bir Petri kabı hazırlayın. Alüminyum folyolu 60 milimetrelik cam Petri kapları kullanın. Yaprakçık başına iki cam kap hesaplayın.

Alüminyum folyo, petri kabının yeniden kullanımı için parafinin uzaklaştırılmasına yardımcı olur. Ardından, petri kaplarını yaklaşık yarıya kadar parafin boncuklarla doldurun ve otoklavlama için kapatın. Otoklavlama işlemi tamamlanıp parafin eridiğinde, kap düzeneğini serin ve düz bir yüzeye taşıyın.

Parafin soğudukça sertleşir ve iğne batırmalarını destekleyecek bir tabaka oluşturur. 60 dakika sonra, sterilize edilmiş kap yaprakçık dokusunu sabitlemek için kullanılabilir. Valvden izole edilen yaprakçıkları 15 mililitrelik tüplerden çıkarın ve parafin yatağına yerleştirin.

Ventrikül tarafı parafin yüzeyine gelecek şekilde, fibrozis tarafı açıkta kalacak biçimde yaprakçıkları yerleştirin. Endotel tabakasını açığa çıkarmak için yaprakçık kenarlarını iğneleyin. Ardından, yukarı bakan her endotel yüzeyine birkaç damla soğuk kolajenaz damlatın ve dokuyu 37 °C'de 5 ila 10 dakika inkübe edin.

İnkübasyon tamamlandığında, kuru steril bir pamuklu çubuğu yaprakçık yüzeyinde döndürerek endotel tabakasını daha önce yapıldığı gibi nazikçe uzaklaştırın. Hücrelerin uç liflerden ayrılmasını sağlamak için pamuklu çubuğu ara ara kollajenaz çözeltisine batırın. Süpürme işlemi tamamlandıktan sonra, endotel tabakasının dokusu öncekine göre biraz daha pürüzsüz hissedilmelidir.

Hücre süspansiyonunu toplayın ve yeni, steril bir 15 mililitre tüpe aktarın. Etiket üzerindeki yan özgüllüğünü belirtin; aynı kapaktan gelen yaprakçıklar birlikte havuzlanabilir. Kalan hücreleri veya debrisleri temizlemek için immobilize edilmiş kapağı birkaç damla soğuk DPBS kullanarak durulayın.

Ventriküler taraf açıkta kalacak şekilde yaprakçıkları yeni bir kültür kabına aktarın ve az önce gösterildiği gibi endotel hücrelerini toplayın. G yaprakçığından endotel hücrelerinin sürüntüyle alınması işlemi tamamlandığında, yaprakçıkları derhal 10 mL kollajenaz çözeltisi içeren 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin. Hücreleri yıkayın, süspande edin ve endotel hücrelerinin yan spesifik olmayan izolasyonu için gösterildiği şekilde büyütün.

Hücre verimi çok düşükse, daha küçük bir flaska geçmeyi veya bir kuyucuk plakası kullanmayı değerlendirin. Hücre-hücre adezyonu hücre büyümesini desteklediği için, hücreleri konfluense yakın olduğunda pasajlamayı unutmayın. Kontakt inhibisyonu hücre transformasyonuna yol açabileceğinden, endotel hücreleri santrifüj edilirken interstisyel hücre izolasyonuna başlayın ve yaprakçıkları içeren tüpleri yaklaşık 12 ila 18 saat inkübe edin.

İsteğe bağlı olarak nazikçe çalkalayarak kolajenaz çözeltisi içinde tutun. İnkübasyon süresinin sonunda, hücre süspansiyonu homojenleşene kadar sindirilmiş dokuyu nazikçe karıştırmak için bir serolojik pipet kullanın. Bu homojenizasyon, dokunun parçalanmasına ve interstisyel hücrelerin serbest kalmasına yardımcı olur; hücreleri endotel hücreleri için gösterildiği gibi santrifüjleyin ve yıkayın.

Beş mililitre interstisyel ortam resus kullanmak dışında, santrifüj edilen interstisyel hücreleri 15 mililitre interstisyel ortamda süspande edin ve her bir santrifüj tüpü için bir flask kullanarak hücreleri T 75 flasklara ekleyin. İnterstisyel ortamı değiştirmeden önce hücrelerin en az bir ila iki gün büyümesine izin verin; endotel hücrelere kıyasla daha fazla doku debrisi beklenmelidir. Ayrıca, interstisyel hücreler doğaları gereği endotel hücrelerden daha hızlı konfluense ulaşırlar ve bu temsili görüntülerde daha yüksek hücre verimi sağlarlar.

Kültürlenmiş V Cs valvüler endotel hücrelerinin ve valvüler interstisyel hücrelerin morfolojisi iki ila üç gün sonunda gösterilmiştir. Bec'ler, hücrelerin parke taşı görünümü sergilediği ve kümeler oluşturmaya başladığı tipik bir endotel morfolojisi sergiler.

VS hücreleri, konfluense kadar kültüre edildiklerinde hücrelerin genellikle iğ şeklinde olduğu ve seyrek popüle edildiği, miyofibroblastlara benzer bir morfoloji sergiler; ECS ise hücrelerin parke taşı deseninde olduğu ve büyümenin kontak inhibisyonuyla sınırlandığı tipik bir endotelyal morfoloji sergiler. VI CS, hücrelerin genellikle iğ şeklinde olduğu ve kontak inhibisyonu göstermediği, miyofibroblastlara benzer bir morfoloji sergiler. Hem VEC hem de VIC'in fonksiyonel özellikleri boyama yoluyla çıkarılabilir. Ated LDL alımı için.

VEC hücreleri yüksek düzeyde asetillenmiş LDL alımı ile ilişkilidir. VIC hücreleri düşük düzeyde asetillenmiş LDL alımı ile ilişkiliyken, VEC ve VIC'in hücre belirteçleri burada gösterilmiştir. ECS'ler von Willebrand faktörü için pozitif boyanırken karşılaştırılmıştır.

von Willebrand faktörü boyanması göstermezler. Ayrıca, V CS boyaması alfa düz kas aktini için negatiftir, buna karşılık V CS boyaması alfa düz kas aktini için pozitiftir. Umarım bugünkü izolasyonlarımızdan çok şey öğrenmişsinizdir.

Ancak, endotel hücre bazal membranının oldukça hassas olduğunu ve alttaki matriste meydana gelen herhangi bir bozulmanın genellikle dokunun geri kalanından kontamine hücrelerin salınmasına yol açtığını unutmamak önemlidir. Başarılı bir izolasyonu doğrulamak için, izolasyonlarınızın saflığını değerlendirmek amacıyla karakterizasyon yapılması kritik öneme sahiptir. Başarılar dileriz.