Tüm Yaprak Görüntüleme kullanarak Bakteriyel Hücreler Live Stoma Tepki Değerlendirilmesi

Bu prosedürde, canlı bakteri hücrelerine yanıt olarak bekçi hücresi hareketini değerlendirmek için yaprak görüntüleme kullanılır. İlk olarak, bakteriler gliserol stoktan kültüre edilir ve bir inokülüm hazırlanır. Ardından genç ve sağlıklı yapraklar toplanır ve propidyum iyodür ile boyanır.

Boyanmış yapraklar kesilir ve yaprak parçaları bir bakteri süspansiyonunun üzerinde inkübe edilir. Son olarak, yaprak yüzeyi mikroskop altında incelenir ve stoma açıklıkları ölçülebilir. Floresan mikroskobu kullanılarak elde edilen sonuçlar, bakterilere yanıt olarak stoma açıklığındaki değişimleri göstermektedir.

Bu yöntemin, epidermal soyma gibi mevcut yöntemlere karşı temel avantajı, bakterilerle temas halindeki yaprağın bütünlüğünün korunmasıdır; bu durum, bakterilerin yapraklara girişine yönelik doğal koşulları taklit eder. Bu prosedüre başlamak için, Arabidopsis tohumlarını büyüme ortamı, vermikülit ve perlitin 1:1:1 oranındaki karışımına ekin. Bitkileri bir büyütme odasında yetiştirin ve gerektiğinde sulayın.

Bitkiler, sapa kalkma öncesinde genç ve tamamen gelişmiş yapraklara sahip olduklarında, dört ila altı hafta içinde kullanıma hazır hale gelir. Deneye başlamadan iki gün önce, bakteri kültürü çizgisini hazırlayın. Modifiye LB besiyerinde gliserol stoktan Pseudomonas ringe ekimi yapın ve 28 °C'de 24 saat boyunca inkübe edin.

İnokulumu hazırlamak için taze kültür kullanın ve kültür plaklarını her zaman gliserol stoklarından başlatın. Bakteriler alt kültürleme sonrası daha az virulent hale geldiğinden, 10 mililitre Pseudomonas syringae sıvı kültürü başlatmak için plakta büyümüş bakterileri kullanın. 50 mililitrelik bir erlenmeyer flaskında, kültürü 600 nanometredeki optik yoğunluğu veya od değeri 0,8 ile 1 arasına ulaşana kadar 28 °C'de kuvvetli çalkalama ile gece boyunca inkübe edin.

600 nm'de OD ölçümünü yapın ve hücreleri 1.360 ×g'de 10 dakika santrifüjleyerek toplayın. Hücreleri, nihai OD 0,2 olacak şekilde distile su içerisinde yeniden süspanse edin. Bu OD değeri, mililitre başına 10⁸ koloni oluşturan birime karşılık gelir.

Bakteriler hazır olduğunda, yaprakları hazırlama ve yaprakları boyamak için deneyi gerçekleştirme aşamasına geçin. İlk olarak, su içerisinde 20 µM propidyum iyodür veya PI çözeltisi hazırlayın. 10 mL çözelti, her seferinde üç küçük yaprağı boyamak için yeterlidir.

Bitkileri büyüme odasından çıkarın ve pens yardımıyla tamamen açılmış üç adet genç yaprağı koparın. Yaprakların tamamını beş dakika boyunca PI çözeltisine daldırın. Ardından yaprakları çıkarın ve distile su ile kısaca durulayın.

Ardından, bir yaprağın alt yüzeyi aşağı gelecek şekilde bir mikroskop lamı üzerine yerleştirin. Bakterilerin yapraklarla inkübe edilebilmesi için yaprağın lam üzerinde düz durmasını sağlamak amacıyla, orta damarı hariç tutarak yaprağı keskin bir jiletle dört parçaya bölün. Lam üzerindeki yaprak parçalarının altına 300 µL bakteriyel süspansiyon ekleyin ve yaprağın alt yüzeyinin inokulumla temas ettiğinden emin olun.

Numuneleri, bitkilerin yetiştirilmesinde kullanılan çevresel koşulların aynısında inkübe edin. Yaprakları mikroskop altında gözlemleme zamanı geldiğinde, yaprak parçalarını alt yüzeyi yukarı bakacak şekilde yeni bir lama aktarın. Lamların hazırlanması sırasında lamel kullanılmadığına dikkat edin.

Aynı yaprak örneği inkübasyon sırasında birden çok kez görüntülenebilir ve araştırma amaçlarına göre bir zaman çizelgesi oluşturulabilir. Burada, yaprakları incelemek, aynı yaprak örneklerini kullanarak PI floresanını tespit etmek için yaprakların alt yüzeyini gözlemlemek ve zamanla stomaların görüntülerini yakalamak için bir lazer taramalı konfokal mikroskop kullanılır. Stoma açıklığının genişliğini ölçmek için görüntüleri kaydedin.

Her zaman noktasında ve her işlem için en az 60 stomanın stomatal açıklık genişliğini ölçün. LSM görüntü tarayıcısını kullanarak, stomatal açıklık genişliği için ortalama ve standart hatayı hesaplayın. Sonuçların istatistiksel anlamlılığı, iki kuyruklu eşleştirilmiş ikili Student testi kullanılarak hesaplanabilir.

T-test, bir lazer taramalı konfokal mikroskop altında arabidopsis yaprak yüzeyinin tipik bir mikroskobik görüntüsüdür. Aydınlık alan görünümünde, propidium iodide canlı hücrelerin hücre duvarını boyayarak hasarsız hücrelerin tanımlanmasını sağlamanın yanı sıra bekçi hücrelerin görünürlüğünü artırır. Bu mikrograflarda, tamamen kapalı stomalardan geniş açık stomalara kadar çeşitli stomatal PO açıklıkları görülebilir.

Tamamen kapalı stomalar, bekçi hücrelerinin şekline göre belirlenir. Açık stomalar için açıklık genişliği sıfır mikrometre olarak kabul edilir. Gösterilen açıklık genişliği, stoma gözeneklerinin en geniş alanına çizilen düz bir çizgi kullanılarak ölçülür.

Bunlar, canlı yaprak inokülasyon analizinin tipik deneysel sonuçlarıdır. Arabidopsis yaprakları, karanlıkta üç farklı Pseudomonas syringae suşu ile inkübe edilmiş ve bakteriyel suş başına rastgele seçilen 60 stomannın açıklık genişliği ölçülerek sadece P-S-T-D-C 3000 bakterisinin karanlık stomaları açabildiği görülmüştür. Bu teknik, bitki-bakteri etkileşimleri alanındaki araştırmacıların, bitki türlerinde patojenlere verilen erken yanıt mekanizmalarını keşfetmelerinin önünü açmıştır.