Name: Su Sistemleri Virüs Üretim Oranlar tahmin (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Öğrenin su sistemlerinde virüs üretim oranlarını tahmin etme yöntemini. Deniz ve tatlı su örneklerinde mikrobiyal topluluklarda virüs dinamiklerini incelemek için kullanılan bu teknik, ekolojik araştırmalarda önemli bilgiler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu makalenin yayın Tennessee Üniversitesi Araştırma Dairesi bir hibe ile desteklenmiştir. Yazarlar, öğrenciler ve araştırmacılar, bu işlemler rafine için çalıştılar, önceki nesil teşekkür ederim. Araştırma, Ulusal Bilim Vakfı (NSF-0.851.113, NSF 0.825.405 ve NSF 0.550.485) hibe tarafından desteklenmiştir.

1. "Virüs-free" Su (Wilhelm &amp; Poorvin 2001) oluşturun için Deniz Suyu Ultrafiltrasyon <ol><li> Deniz suyu / lakewater yaklaşık 20L mümkün olduğunca aseptik toplanır. </li><li> Su, 142 mm çaplı polikarbonat seri ile toplum analizi için -20 ° C'de muhafaza edilebilir 0,8 mikron filtre prefiltered. Daha büyük gözenek boyutu filtreleri, çok verimli sistemler için bu adımı önce kullanılıyor olabilir. </li><li> 30 kDa kesme spiral kartuşu tüm virüsleri dışlamak için kullanılan bir Amicon M12 sistemi (Millipore), hatta küçük RNA virüsleri Ultra filtre su elde etmek için. </li><li> Yaklaşık 15-16 kPa backpressure örnekleri ile işlenmiş ve ~% 25 hızda yoğunlaşmıştır. </li><li> ~ 500 ml su kalan örnek virüs serbest su, geri kalan 19.5 L viral üretim deneyleri için kullanılan olacak konsantre bir virüs topluluk (diğer deneyler için kaydedilebilir) içerecektir. </li><li> Amicon M12 sistemi kullanımı her gün sonra, membran filtre kartuşunun zarar görmesini önlemek için temizlenmesi gerekir. </li><li> Deniz suyu ile çalışıyorsanız, 30-45 dakika için 0,1 N NaOH çözeltisi ile yıkanması takip Milli-Q su en az 6L membran yıkayın. </li><li> Yine kartuşu en az 6L Milli-Q su ile durulayın. </li><li> M12 sistemini kullanarak bittiğinde, spiral kartuşu, 4 0.05MH 3 PO 4 çözüm ° C saklanmalıdır </li></ol> 2. Viral Üretim Yöntemi Virüs Azaltma (Wilhelm ve ark 2002) <ol><li> Hem de ev sahibi ve virüsler, 0.2 mikron nominal gözenek boyutu düşük protein bağlayıcı filtresi (örneğin, Durapore) üzerine yerleştirilir. Ile elde edilen ve bir sterifilter ünitede yerleştirilir deniz suyu / lakewater örnek 500 ml </li><li> Sürekli olarak, filtre üzerinde yoğunlaşarak bakteri hücrelerinin inhibe etmek için, steril bir transfer pipet kullanarak örnek resuspending örnek hafifçe &lt;200 mmHg basınçlı vakum. </li><li> Yavaş yavaş ultrafiltratında üç ciltlik önemli ölçüde örnek ücretsiz virüs sayısını azaltmak için bakteriyel süspansiyona eklenir. </li><li> Bakteriyel fraksiyonu virüs ücretsiz su ile 500 mL geri seyreltilir ve her biri 150 ml olmak üzere üçe ayrılır çoğaltır ve açık 250ml polikarbonat şişe konur. </li></ol> 3. Viral Üretimi için Teğetsel Akış Filtrasyon (TFF) Yöntemi (Weinbauer ve ark 2002, Winget ve ark 2005) TFF viral azaltma yöntemine alternatif bir yaklaşımı temsil ediyor. <ol><li> Yukarıda açıklandığı gibi, yaklaşık 500 ml doğal örnek toplanır. </li><li> Bu örnek, gözenek boyutu 0.2 mikron nominal teğetsel akış filtrasyon sistemi kullanarak yoğunlaşmıştır. </li><li> Yaklaşık 10-15 ml bakteri fraksiyon azalır, Ultra filtre, virüs serbest su eklenir ve yukarıdaki gibi dağıtılır. </li><li> Çoğaltmak şişe çevre odaları kullanılarak yerinde koşullarda inkübe edilir. <ol><li> Işık seviyeleri net tarama ile mavi renkli akrilik veya şeffaf akrilik kullanarak ışık yoğunluğunu azaltmak için yüzey koşulları değişmiş. </li><li> Ortam yüzey sıcaklıkları genellikle akan deniz suyu güverte inkübatör ile elde edilir. </li></ol></li><li> Cryovials ilave% 2,0-2,5 steril glutaraldehid son bir konsantrasyon ile 0 zamanında bakteriyel ve viral bolluk tahminleri için numuneler alınır. Bu örnekler hemen sıvı nitrojen ile dondurulur flaş ve işlenmiş kadar dondurularak saklanmalıdır. <ol><li> Sıvı azot mevcut değilse, mikroskopi slaytlar (aşağıdaki yordama bakın) hazırlanan ve hemen işleme olabilir </li></ol></li><li> Alınan örnekler, yukarıda anlatılan yöntemi ile en az 10 saat boyunca her 2.5 saatte toplanır. <ol><li> Bu zaman su kantitatif PCR analizi için toplanan olabilir. 5 ml numune sıvı nitrojen içinde acil flaş dondurma hiçbir sabitleştirici ajan cryovial eklenebilir. </li></ol></li></ol> 4. Viral Üretim Mikroskobu (Noble ve Fuhrman 1998 Wen ve ark 2004) <ol><li> 0.02-mikron mikroskopi için filtre uygulanmasını Donmuş numuneler buz üzerinde çözdürülmelidir. </li><li> SYBR Green, steril su ile stok solüsyonu 01:10 seyreltilmesi ile bir stok solüsyonu hazırlayın. Sonra, stok solüsyonu, stok solüsyonu 1 ml, 39 ml steril su ekleyerek çalışan bir solüsyon hazırlanır. % 50 gliserol,% 50 fosfat serum fizyolojik tamponlu (PBS, 0.05 M Na 2 HPO 4,% 0.85 NaCl, pH 7.5) ve% 2.5 p-fenilendiamin taze stok solüsyonu başlamadan önce hazırlanmalıdır. 4% 50% glycerol/50 PBS çözüm tutun ° C ve P-phenylenediamine stok -20 ° C başlangıç ​​kadar karanlıkta. Sağ filtreleme önce Antifade çözüm olarak kullanılmak üzere bir final konsantrasyon% 0.1% 50% glycerol/50 PBS p-fenilendiamin ekleyin. </li><li> 25 mm 0.45 mikron MicronStep, selülozik destek filtre üst 0.02 mikron Anodisc filtre koyun. Tamamen kurutulmuş kadar 20 pKa Anodisc ve vakum üst sabit numune 850 mcL ekleyin. 100 steril bir Petri kabı SYBR Green çalışma çözüm mcL ve hala vakum, SYBR Green filtre kulesi ve yerden dikkatlice Anodisc kaldırmak. Örnekleri 20 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edin. Dikkatle SYBR Green çözüm filtreyi kaldırmak ve tüm kalan boya kaldırmak için bir filtre ile Kimwipe arka fitil. İsterseniz, kule filtre dönmek ve aşırı leke durulayın filtre ile 0.02 mikron süzülmüş su veya steril ortam 800 mcL kadar geçmek. </li><li> Bir mikroskop lamı antifade çözüm küçük bir damla ekleyin ve üstüne bir kapak kayma yerleştirin. Kapak kayma çıkarın ve mikroskop lamı antifade çözüm ıslak kuru filtre ekleyin. Yine kapak kayma antifade çözüm küçük bir miktar ekleyin ve yavaş yavaş bu formun herhangi bir kabarcıkları kurtulmak için emin olun, filtrenin üstüne yerleştirin. </li><li> Gereken (bu solmaya önlemek için bir kaç ay içinde kullanılır ve virüs sayıları indirdi olmalıdır) kadar -20 ° C'de hemen slaytlar dondurmak </li><li> Virüsler, geniş bir mavi filtre seti (λ Ex = 450 - 490 nm, λ Em = λ bir bastırma filtresi 510 nm = 510 nm) ile (bizim durumumuzda bir Leica DMRXA mikroskop) floresan mikroskopi kullanılarak numaralandırılır. Her filtre, filtre zarından virüs bile dağılımını sağlamak için her alanda ızgara toplam virüsleri ölçmek için emin olun, en az 20 alan sayılır görünümü olacak. </li><li> Üç bağımsız virüs tekrarını ortalama oranları hesaplanır ve standart sapma üretim oranları belirlenir çoğaltır. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Araştırmacı tarafından toplanan ham veri virüs bolluk tekrarını oranları üretmek için minimal matematiksel işleme gerektirir. Bu çalışmada kaynaklanan birincil veri seti inkubasyon alınan örnekler virüs bolluk tekrarını oranları. Bu sonuçlar, örneklerin her biri için virüs bolluğu vs zaman bağımsız regresyonlar oluşturur. Her bir numune için ayrı ayrı inkubasyon araştırmacı oranlarının yanı sıra bir varyasyon tahmini (örneğin, standart sapma) (bkz. Şekil 1). Hesaplayabilirsiniz üç çoğaltmak-inkubasyon tamamlayarak, bu yüzden bir tedavi olarak hareket Bu sürecin bir ihtar virüs bolluk değişmez bir azalma örnek virüs yükünü taşıyan ana hücrelerinde azalmaya yol açar. Kaynak (filtrelenmemiş deniz suyu veya göl suyu) ve T = 0 inkübasyon örnek, bakteri bolluk sayımı bu kayıp telafi etmek gereklidir. Bu bilgiler, kayıp hücrelerinin yüzdesini hesap kullanılır: virüs bolluk azaltma süreci için ya da herhangi bir mikrobiyal topluluğun üyelerine karşı seçici olduğunu varsayarak, bu faktör daha sonra virüs yerinde üretim hızı tahmin etmek için kullanılır. . <img src="/files/ftp_upload/2196/2196fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Epifloresans mikroskopi kullanılarak in situ koşullarda 10 saat inkübasyon üzerinde parçacıklar gibi virüs Örnekleri üretimi 2008 yılı Eylül ayında Yeni Zelanda'nın kıyılarında çiçek fitoplankton sırasında toplanmıştır. <img src="/files/ftp_upload/2196/2196fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Assaying virüs üretim için iş akış sürecinin şematik diyagramı. Virüssüz su üretmek için numune su ultrafiltrasyon süreci başlar. Bu bir ultrafiltrasyon sistemi kullanılarak tamamlandı. Paralel su örneklerinde mikrobiyal topluluğun (enfekte ve enfekte olmayan hücrelere bir karışımını içeren) muhafaza ederken, bir filtre ile geçti aynı sitede ve serbest virüslerle toplanır. Bu topluluk daha sonra virüs ücretsiz su ile yeniden süspanse ve yerinde koşulları altında inkübe edilir . Virüs tekrarını oranı, önümüzdeki 10 saat sonra virüs üretim oranlarını belirlemek için izlenmektedir.

<ol><li>Higgins, J. L., Kudo, I., Nishioka, J., Tsuda, A., Wilhelm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+response+of+the+virus+community+to+a+mesoscale+iron+fertilization+in+the+sub-Arctic+Pacific+Ocean%5BTitle%5D)+AND+%22Deep-Sea+Res+II%22%5BJournal%5D)">The response of the virus community to a mesoscale iron fertilization in the sub-Arctic Pacific Ocean.</a> Deep-Sea Res II. 56, 2788-2795 (2009).</li>
<li>Mioni, C. E., Poorvin, L., Wilhelm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+and+siderophore-mediated+transfer+of+available+Fe+between+heterotrophic+bacteria%3A+characterization+using+a+Fe-specific+bioreporter%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat+Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Virus and siderophore-mediated transfer of available Fe between heterotrophic bacteria: characterization using a Fe-specific bioreporter.</a> Aquat Microb Ecol. 41, 233-245 (2005).</li>
<li>Noble, R. T., Fuhrman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+SYBR+Green+I+for+rapid+epifluorescence+counts+of+marine+viruses+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat+Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria.</a> Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).</li>
<li>Parada, V., Herndl, G., Weinbauer, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+burst+size+of+heterotrophic+prokaryotes+in+aquatic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mar+Biol+Assoc+U+K%22%5BJournal%5D)">Viral burst size of heterotrophic prokaryotes in aquatic systems.</a> J Mar Biol Assoc U K. 86, 613-621 (2006).</li>
<li>Poorvin, L., Rinta-Kanto, J. M., Hutchins, D. A., Wilhelm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+release+of+Fe+and+its+bioavailability+to+marine+plankton%5BTitle%5D)+AND+%22Limnol+Oceanogr%22%5BJournal%5D)">Viral release of Fe and its bioavailability to marine plankton.</a> Limnol Oceanogr. 49, 1734-1741 Forthcoming.</li>
<li>Rowe, J. M., Saxton, M. A., Cottrell, M. T., DeBruyn, J. M., Berg, G. M., Kirchman, D. L., Hutchins, D. A., Wilhelm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constraints+on+virus+production+in+the+Sargasso+Sea+and+North+Atlantic%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat+Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Constraints on virus production in the Sargasso Sea and North Atlantic.</a> Aquat Microb Ecol. 52, 233-244 (2008).</li>
<li>Weinbauer, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecology+of+prokaryotic+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Ecology of prokaryotic viruses.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 127-181 (2004).</li>
<li>Weinbauer, M. G., Peduzzi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency%2C+size+and+distribution+of+bacteriophages+in+different+marine+morphotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Mar+Ecol+Prog+Ser%22%5BJournal%5D)">Frequency, size and distribution of bacteriophages in different marine morphotypes.</a> Mar Ecol Prog Ser. 108, 11-20 (1994).</li>
<li>Weinbauer, M. G., Winter, C., H&ouml, fle, G, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconsidering+transmission+electron+microscopy+based+estimates+of+viral+infection+of+bacterioplankton+using+conversion+factors+derived+from+natural+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat+Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Reconsidering transmission electron microscopy based estimates of viral infection of bacterioplankton using conversion factors derived from natural communities.</a> Aquat Microb Ecol. 27, 103-110 (2002).</li>
<li>Wen, K., Ortmann, A. C., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+estimation+of+viral+abundance+by+epifluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Accurate estimation of viral abundance by epifluorescence microscopy.</a> Appl Environ Microbiol. 70, 3862-3867 (2004).</li>
<li>Wilhelm, S. W., Brigden, S. M., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dilution+technique+for+the+direct+measurement+of+viral+production%3A+a+comparison+in+stratified+and+tidally+mixed+coastal+waters%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">A dilution technique for the direct measurement of viral production: a comparison in stratified and tidally mixed coastal waters.</a> Microb Ecol. 43, 168-173 (2002).</li>
<li>Wilhelm, S. W., Matteson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freshwater+and+marine+virioplankton%3A+a+brief+overview+of+commonalities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Freshw+Biol%22%5BJournal%5D)">Freshwater and marine virioplankton: a brief overview of commonalities and differences.</a> Freshw Biol. 53, 1076-1089 (2008).</li>
<li>Wilhelm, S. W., Poorvin, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilhelm%2C+SW+%22Quantification+of+algal+viruses+in+marine+samples%22">Quantification of algal viruses in marine samples</a>. Paul, J. H. , Academic Press. London, UK. 53-66 (2001).</li>
<li>Wilhelm, S. W., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viruses+and+nutrient+cycles+in+the+sea%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%22%5BJournal%5D)">Viruses and nutrient cycles in the sea.</a> Bioscience. 49, 781-788 (1999).</li>
<li>Wilhelm, S. W., Weinbauer, M. G., Suttle, C. A., Jeffrey, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+sunlight+in+the+removal+and+repair+of+viruses+in+the+sea%5BTitle%5D)+AND+%22Limnol+Oceanogr%22%5BJournal%5D)">The role of sunlight in the removal and repair of viruses in the sea.</a> Limnol Oceanogr. 43, 586-592 (1998).</li>
<li>Winget, D. M., Williamson, K. E., Helton, R. R., Wommack, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tangential+flow+diafiltration%3A+an+improved+technique+for+estimation+of+virioplankton+production%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat+Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Tangential flow diafiltration: an improved technique for estimation of virioplankton production.</a> Aquat Microb Ecol. 41, 221-232 (2005).</li>
</ol>

Virüsler deniz mikrobiyal topluluklar nasıl etkilediğini anlamada önemli bir bileşeni virüs parçacık üretilmektedir hızını belirlemek için. Bollukları çoğu sistemlerde statik (Wilhelm &amp; Suttle 1999, Weinbauer 2004) (daha fazla veya daha az) ve sucul sistemlerde bu virüsler hızla kaldırıldı veya non-enfeksiyöz işlenen göz önüne alındığında (Wilhelm ve ark 1998), daha sonra üretim oranları olmalıdır görece hızlı bir kayıp parçacıkları yerine. Mikrobiyal topluluğun neden ölüm virüsleri tahmin, bir virüs, bir hücreye (&quot;patlama boyutu&quot;) lyses her zaman birçok virüs nasıl üretildiği bir bilgi gerektirir. Doğal örneklerinde Virüs patlama boyutları büyük ölçüde değişebilir. Burst boyutları doğrudan transmisyon elektron mikroskobu (örneğin, Weinbauer &amp; Peduzzi 1994) tarafından belirlenen, ancak bu her zaman pratik değil, belirli bir laboratuvar kapasitesinin ötesindeki sık sık ya da olabilir. Ampirik olarak tespit edilemediği durumlarda, parçalayıcı olay başına 24 virüs edebiyat değerleri, tatlı su sistemleri için deniz sistemleri ve 34 için kullanılan (Parada ve ark 2006 ). Bu sayıya bölündüğü virüs üretim oranı ise, sonuç, günlük bazda virüsler tarafından tahrip hacim başına hücre bolluğu. Sonra, söz konusu sistem için virüs kaynaklı ölüm ile sonuçlanan bakteriyel bolluk ayakta stok değeri parçalanmış mikropların ayrılabilir: mevcut tahminleri aralığı az yüzde neredeyse tüm nüfusu ve sık sık söz konusu sistem diğer faktörlere bağlıdır. (Wilhelm &amp; Matteson 2008). Toplam mortalite yüzdesi belirlemek için bu sayı genellikle iki (% 50 hücrelerin yeniden gidin ve hücrelerin% 50, Weinbauer 2004 kayıp olduğunu varsayım çalışan) ile çarpılır. Haline gelmiştir besin ve iz element biyoyararlanım (örneğin, N, P, Fe) birincil üretkenlik oranı sınırı, ve karbon akı olarak, sucul sistemleri aracılığıyla, ve bu süreç içinde, virüs kaynaklı mikrobiyal ölüm rolü anlaşılması için verilen deniz jeokimyacılar ilgi. Çeşitli tahminlere şimdi (2009 2008, Higgins ve ark. Rowe ve ark) virüsler günlük bazda önemli bir besin elementi konsantrasyonları serbest su sütunu geri öneririz var ve bu unsurların hızla mikrobiyal toplum tarafından asimile (Poorvin et diğerleri, 2004, Mioni ve ark 2005). Miktarda besin hücre başına (başlar &quot;kotaları) tarafından tahrip hücrelerinin sayısı çarpılarak ortamda besin akı oranı tespit edilebilir. Bu bilgiler, mikrobiyal gıda ağları su sistemleri arasında nasıl işlediğini anlamak için kritik bir bileşen sağlayabilir. Devam eden gelişmeler: Şimdiki çabalar, bir dizi araştırma grupları gibi belirli organizmaların virüs aktivitesi tarafından nasıl etkilendiğini belirlemek için, toplum içinde belirli virüsleri numaralandırılamadı Yukarıda ifade edilen stratejinin uyarlanması ve içerir. Bunu yapmak için araştırmacılar, toplam virüs toplumun tahminlerine paralel olarak belirli virüslere gruplar veya aileler bolluğu tahmin etmek için kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) kullanın. Sonuçlar daha sonra doğrudan belirli plankton gruplar için virüs ölüm, besin ciro, vb tahminleri sağlamak için uygulanır. Bu yeni ve güçlü bir yaklaşım, önümüzdeki yıllarda araştırmacılar, virüslerin ekoloji ile ilgili süreçlere çok daha derin kazmak ve ilk kez, laboratuar sistemleri kısıtlamaları ötesinde belirli virüs host toplulukların etkileşimi ölçmek için izin verecektir.

<table><tbody><tr><td>2.5% &lt;em&gt;p&lt;/em&gt;-fenilendiamin</td><td>Acros Organics</td><td>130575000</td><td>Sönümleme (Antifade) stoğu</td></tr><tr><td>Amicon Proflux M12 sistemi</td><td>EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>Bu adım için herhangi bir ultrafiltrasyon cihazı kullanılabilir</td></tr><tr><td>SYBR Green I nükleik asit jel boyası</td><td>Invitrogen</td><td>S-7563</td><td></td></tr><tr><td>Helicon S10 30kDa Filtre</td><td>EMD Millipore</td><td>CDUF010LT</td><td></td></tr><tr><td>Pelicon XL filtreler 0.22 &amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>PXGVPPC50</td><td></td></tr><tr><td>GE 0.2 &amp;mu;m PCTE membran filtreler (47mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-732-35</td><td></td></tr><tr><td>Millipore Labscale Tanjansiyel Akış Filtrasyon Sistemi</td><td>EMD Millipore</td><td>XX42LSS11</td><td>Bu adım için diğer TFF sistemleri kullanılabilir</td></tr><tr><td>0.45 &amp;mu;m Micronstep, Selülozik, beyaz düz filtreler (25mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>E04WP02500</td><td></td></tr><tr><td>GE Whatman 0.02 &amp;mu;m Anodisc filtreler (25mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>68-09-6002</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMRXA mikroskobu</td><td></td><td></td><td>Mavi filtre setine sahip herhangi bir epifloresan mikroskop kullanılabilir</td></tr><tr><td>20L polikarbonat damacanalar</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>PBS (0.05 M Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0.85% NaCl, pH 7.5)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP329-500, S640-500</td><td></td></tr><tr><td> %50 Glutaraldehit </td><td>Fisher Scientific</td><td>G151-1</td><td></td></tr><tr><td>Corning 2 mL Kriyotüpler-Dış Dişli polipropilen</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-71</td><td>Herhangi bir kriyotüp kullanılabilir</td></tr><tr><td>Corning 5 mL Kriyotüpler-Dış Dişli polipropilen</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-74</td><td>Herhangi bir kriyotüp kullanılabilir</td></tr><tr><td> %85 H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A242-212</td><td>Sarmal Membran saklama</td></tr><tr><td>NaOH peletleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-3</td><td>M12 temizliği</td></tr><tr><td>Dereceli Silindirler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopore 0.8-&amp;mu;m gözenek boyutlu membran filtre (142mm)</td><td>EMD Millipore</td><td>ATTP14250</td><td></td></tr><tr><td>Millipore Paslanmaz Çelik Basınçlı Filtre Tutucu (142mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>YY30 090 00</td><td></td></tr></tbody></table>

su sistemleri virüs Üretim oranlar tahmin

Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

Virüsler, deniz ve tatlı su sistemlerinin yaygın bileşenleri ve mikrobiyal ölüm önemli ajanları olduğu bilinmektedir. Sonra mikrobiyal toplum yapısı ve işlevi daha iyi modelleri geliştirmek gibi virüsler sucul biyojeokimyasal döngülerini değiştirmeye nasıl çalıştığını anlayışımızı ilerletmek gibi bu sürecin niceliksel tahminler geliştirilmesi kritik öneme sahiptir. Virüs azaltma tekniği araştırmacıları virüs parçacıkları endemik mikrobiyal topluluk yayımlanan hızını tahmin etmek sağlar. Mikrobiyal topluluk yakın bir ortam konsantrasyon korunurken Kısacası, ücretsiz (ekstraselüler) virüslerin bolluğu bir örnek azalır. Mikrobiyal topluluk, daha sonra ücretsiz virüs olmaması ve virüsler kantitatif (topluluk zaten bulaşmış üyelerinin lizis yoluyla) örnek reoccur Epifloresans mikroskobu ile belirlenebilir veya belirli virüslere durumda, hangi oranı inkübe PCR. Bu oranlar daha sonra virüs aracılı hücre erimesi nedeniyle mikrobiyal ölüm oranını tahmin etmek için kullanılabilir.

Deniz ve tatlı su sistemlerinin virüslerin ciro oranı bir azalma ve yeniden oluşmaları tekniği ile tahmin edilebilir. Veriler araştırmacılar, su sistemlerinde virüs aracılı mikrobiyal ölüm oranları anlaması için izin verir.

Su Sistemleri Virüs Üretim Oranlar tahmin

Virüsler, deniz ve tatlı su sistemlerinin yaygın bileşenleridir ve mikrobiyal ölümlerde önemli etkenler oldukları bilinmektedir. Kantitatif yöntemler geliştirmek...

Bu prosedürün genel amacı, sucul mikrobiyal topluluklarda virüslerin üretim hızını belirlemektir. Bu, öncelikle yerli mikrobiyal topluluğu korurken ilgili örnekteki serbest virüslerin bolluğunu azaltarak gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, örnekleri uygun koşullarda inkübe etmek ve 10 saate kadar her iki ila üç saatte bir alt örnekler toplamaktır.Prosedürün üçüncü adımı, her bir zaman noktasından toplanan alt örneklerdeki virüslerin sayımını yapmaktır. Prosedürün son adımı, örnekteki virüs partikül bolluğunun artış hızını belirlemek ve virüs üretim hızlarını saptamaktır. Sonuç olarak, sayımlar üzerinden mikrobiyal topluluk içerisinde virüslerin hangi hızlarda üretildiğini gösteren sonuçlar elde edilebilir ve bu sayede araştırmacılar, virüs aktivitesine bağlı mikrobiyal mortalite hızları hakkında çıkarımlarda bulunabilirler.Herkese merhaba. Benim adım Audrey Madison; Dr. Steven Milham'ın laboratuvarında ve Tennessee Üniversitesi Mikrobiyoloji Bölümü'nde çalışıyorum. Bugün Charles Budoff ve Claire Campbell'ın yardımıyla, virüslerin sucul sistemlerde üretilme hızlarını analiz etmeye yönelik bir prosedürü size göstereceğiz.Bunu yapmak için, örneklerdeki serbest virüslerin sayısını azaltıyoruz ve virüsle enfekte olmuş mikroorganizmaların lize olmasıyla yeniden ortaya çıkma oranlarını sayıyoruz. Şu anda laboratuvarımızda bu prosedürü, virüslerin ekolojisini ve mikrobiyal toplulukları nasıl şekillendirebileceklerini incelemek için kullanıyoruz. Giriş bölümünü tamamladığımıza göre, hadi başlayalım.Bu prosedüre başlamadan önce, mümkün olduğunca aseptik bir şekilde yaklaşık 20 litre deniz suyu toplayın. Numune toplandıktan sonra, suyu 142 milimetre çapında 0.8 mikronluk bir filtreden ön filtrelemeden geçirin. Biyolojik olarak üretken sistemler için, bu işlemden önce daha büyük gözenek boyutuna sahip bir filtre veya cam elyaf filtre ile filtrasyon yapılabilir.Ultrafiltre edilmiş su elde etmek için, tüm virüsleri dışarıda bırakacak sarmal sarımlı bir membran kartuşuna sahip AmCon M 12 sistemi gibi bir ultrafiltrasyon sistemi kurun. Numunedeki virüsler daha sonra maksimum hızın yaklaşık %25'inde ve 15 ila 16 kilo paskal geri basınçla uzaklaştırılır ve konsantre edilir. Yaklaşık 500 mililitrelik retentat, diğer çalışmalar için saklanabilecek konsantre virüs topluluğunu içerirken, virüs içermeyen permeat viral üretim analizleri için kullanılacaktır.Filtre kartuşunun membranının zarar görmesini önlemek için Omicron M 12 sistemini her kullanım gününün ardından temizleyin. Deniz suyu ile çalışırken, membranı önce en az altı litre Milli Q su ile durulayın, ardından 30 ila 45 dakika boyunca 0.1 molar sodyum hidroksit çözeltisi ile yıkayın. Daha sonra kartuşu en az altı litre daha Milli Q su ile durulayın.İşlem tamamlandığında, spiral kartuş dört santigrat derecede 0,05 molar fosforik asit çözeltisi içinde saklanabilir. Viral azaltma yöntemine başlamak için, virüssüz su elde ettiğimiz konumla aynı yerden alınan 500 mililitre deniz suyu örneği, 0,2 mikro nominal gözenek boyutuna sahip, düşük protein bağlayan bir filtre içeren stereo filtre ünitesine yerleştirilir. Bu aşamada, başlangıç suyundaki virüs ve bakterilerin toplam bolluğunu belirlemek için bir alt örnek de toplayın.Bakteri hücrelerinin filtre üzerinde yoğunlaşmasını önlemek için steril bir transfer pipetiyle örneği sürekli olarak yeniden süspanse ederken, örneğe 200 milimetre cıva'dan daha düşük bir vakum basıncı uygulayın. Bakteriyel popülasyonları sabit bir yoğunlukta tutarken örnekteki serbest virüslerin bolluğunu azaltmak için, bakteriyel süspansiyona ultrafiltrattan üç hacim olacak şekilde 500 mililitre yavaşça ekleyin. Son olarak, bakteriyel fraksiyonu virüssüz ultrafiltre edilmiş su ile tekrar 500 mililitreye seyreltin. Ardından, bunu 150 mililitrelik üç replikata halinde bölün ve replikataları şeffaf 250 mililitrelik polikarbonat şişelere yerleştirin.Bu, sıfırıncı zaman örnek setinizi temsil eder. Sıfırıncı zaman örneklerinizden bakteriyel ve viral bolluk tahminleri için örnekler alın. Örnekleri, final konsantrasyonu %2,0 ila %2,5 steril glutaraldehit olan kriyoviyallere aktarın.Fiksatif olarak, bu örnekleri sıvı azot ile derhal hızlıca dondurun ve işlenene kadar -80 °C'de saklayın. Alternatif olarak, deniz mikroplarını konsantre etmek için teğetsel akış sistemi kullanılabilir. TFF yöntemini kullanmak için yaklaşık 500 mL doğal örnek elde edin.Viral azaltma yöntemi için açıklandığı üzere, bakteriyel fraksiyon ultra-filtre edilmiş virüssüz su ile yaklaşık 10 ila 15 mililitreye düşürülene kadar, 0,2 mikron nominal gözenek boyutuna sahip bir tanjansiyel akış filtrasyon sistemi kullanarak bu örneği konsantre edin ve ortaya çıkan replika şişeleri in situ koşullarında inkübe edin. Denizdeki çevre odalarını kullanarak, ortam sıcaklıklarını koruyan bir yüzey suyu kaynağına bağlı olan akışkan deniz suyu inkübatörleri kullanıyoruz. Işık seviyeleri, ışık yoğunluğunu azaltmak için mavi tonlu akrilik veya nötr yoğunluklu bir gölgeleme ağı kullanılarak yüzey koşullarına uygun hale getirilebilir.Saha istasyonunda veya laboratuvarda çalışırken ya da deniz suyuna erişimin olmadığı durumlarda, ışıklı bir büyüme inkübatörü kullanılabilir. Sıfırıncı saatte numune için uygulanan yöntemle, en az 10 saat boyunca her 2,5 saatte bir alt numuneler toplamaya devam edin. Bazı araştırmacılar, mikroskopi numunelerine ek olarak, belirli virüslerin kantitatif PCR analizi için su toplamak isteyecektir.QPCR örnekleri için, beş mililitre örneği fiksatör madde içermeyen bir kriyoviyale ekleyin ve viral üretim mikroskopisi hazırlığı için hemen sıvı azot ile şok dondurun; dondurulmuş örnekleri buz üzerinde çözdürün ve çözeltileri yazılı protokolde açıklandığı şekilde taze olarak hazırlayın. Ardından, 25 milimetrelik 0,02 mikron gözenek boyutuna sahip bir disk filtreyi 0,45 mikronluk selülozik destek filtresinin üzerine yerleştirin. Daha sonra, 850 mikrolitre fikse edilmiş örneği anadi filtrenin üzerine ekleyin ve tamamen kuruyana kadar 20 kilo Pascal'ın altındaki bir basınçta vakumlayın.Ano disk filtresi kuruduğunda, steril bir petri kabına 100 µL cyber green çalışma çözeltisi pipetleyin. Vakum hala açıkken, ano diski dikkatlice filtre kulesinden çıkarın ve cyber green üzerine yerleştirin. Örnekleri oda sıcaklığında, karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe edin.Filtreyi cyber green çözeltisinden dikkatlice çıkarın ve tüm artık boyayı temizlemek için filtrenin arkasını bir Kim wipe ile kurulayın. Ardından, bir mikroskop lamına küçük bir damla Antifa çözeltisi ekleyin ve üzerine bir lameller kapatın. Lameli kaldırın ve kurutulmuş filtreyi mikroskop lamına yerleştirin.Tekrar, lamellele küçük bir miktar Antifa solüsyonu ekleyin ve oluşan her türlü kabarcığı giderdiğinizden emin olarak lameli yavaşça filtrenin üzerine yerleştirin; geniş mavi filtreli floresan mikroskobu kullanarak virüsleri sayın; virüslerin filtre membranı boyunca eşit dağılımını sağlamak için her bir alan ızgarasındaki toplam virüsleri nicelendirdiğinizden emin olarak her filtre için en az 20 görüş alanını sayın. Üç bağımsız tekrardan virüs tekrarlama oranlarının ortalamasını hesaplayın ve üretim oranlarından bir standart sapma belirleyin. Son olarak, bu oranları, başlangıç bolluğundan virüs azaltılmış örnekteki seyreltilmiş bolluğa kadar olan mikroorganizma seyrelmesine göre düzeltin.Bu çalışmadan elde edilen temel veri seti, inkübasyonlardan alınan alt örneklerdeki virüs bolluğunun tekrarlama oranlarıdır. Bu sonuçlar, her bir örnek için virüs bolluğuna karşı zamanın bağımsız regresyonlarını oluşturmaktadır. Virüs benzeri partiküllerin üretimi, epi-floresans mikroskopi kullanılarak, belirlenen koşullar altında 10 saatlik bir inkübasyon boyunca izlenmiştir.Bu örnekler, 2008 yılı Eylül ayında Yeni Zelanda kıyılarındaki bir fitoplankton patlaması sırasında toplanmıştır. Size virüs üretim hızlarının nasıl tahmin edileceğini göstermiş olduk. Bu süreç, farklı ultrafiltrasyon sistemlerinin kullanımını ve virüs üretim hızlarını ölçmek için deneylerin gerçekleştirilmesini içermektedir.Ayrıca, bu virüslerin epi floresans mikroskobu ile nasıl sayılacağını gösterdik. Bu prosedürü uygularken temiz ekipman kullanmayı, boyanmış virüsleri dikkatli taşımayı, ışığı azaltmayı, numunelerinizi hızlıca işlemeyi ve ultrafiltrasyon kartuşlarını her kullanımdan sonra uygun şekilde temizlemeyi hatırlamanız önemlidir. Hepsi bu kadar.İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

estimating-virus-production-rates-in-aquatic-systems

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Lentiviruses yapmak için, DNA vektörleri insan 293 hücrelerine transfekte. Hasattan sonra ve supernatant yoğunlaşarak, virüs titresi bir akış sitometresi ile floresan ifade tarafından belirlenir.

Lentivirüs Üretim

Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Quantifying Infectious Viruses in Water Samples Using an In Vitro Total Culturable Virus Assay

Bu spektral farklı raportör florofor safha spesifik ifadesi ile bir viral enfeksiyon ve gen ifadesinin gerçek zaman ölçümünü sağlayan bir flüoresan raportör ineklerdeki çiçek hastalığı virüsünün kullanımını tarif eder. Bu detay doğru virüs çoğaltma, küçük moleküllü inhibisyonuna yanıt olarak etkilendiği aşama belirlenmesi için, bir plaka-bazlı yöntem.

Gen İfade Tüm Dönemlerinde Viral Fonksiyonu sayısallaştırabilmek için vaksiniya Reporter Virüsler

İnsan adenovirüsünün sivri uçları kullanılarak küçük hacimli su örnekleri için optimal viral konsantrasyon koşullarını belirlemek için bir yaklaşım geliştirilmiştir. Burada açıklanan teknikler, diğer viral hedefler için konsantrasyon parametrelerini tanımlamak için kullanılır ve büyük ölçekli viral konsantrasyon deneylerine uygulanır.

Sudan Viral Konsantrasyon için Küçük Bir Ses Prosedürü

Bu makale, otomatik ve manuel sıvı işleyiciler kullanarak çeşitli RNA ve DNA virüslerini titre etmek için yüksek verimli lusiferaz ifadesine dayalı bir yöntem sunar.

Lusiferaz ifade eden rekombinant virüsler yüksek verimlilik Titrasyon

Burada in vitro Homalodisca vitripennis hücreleri ve HoCV-1 yaymak için bir protokol mevcut. Orta HoCV-1 pozitif kültürlerden çıkarıldı ve RNA 168 saat süre ile, her 24 saat ekstre edilmiştir. Hücre yaşayabilirliği tripan mavi ile nicelendirildi. Tüm virüs parçacıkları sonrası enfeksiyon ekstre edildi. Çıkarılan RNA QRT-PCR ile belirlenmiştir.

Yayılması<em&gt; Homalodisca coagulata virüs 01</em&gt; Yoluyla<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Hücre Kültürü

EPA Metod 1615, çevre ve içme sularındaki enterovirüsleri ve norovirüsleri konsantre etmek için elektropozitif bir filtre kullanır. Bu el yazması, Yöntem 1615 analizleri için numune toplama prosedürünü açıklamaktadır.

Enterovirus Kültür ve RT-qPCR Su Norovirüs Oluşum EPA Metot 1615 Ölçüm. Virüs Örneklerinin I. Koleksiyonu

Burada, Buffalo Green Monkey böbrek hücresi hattını kullanarak toplam kültürlenebilir virüsleri ölçmek için bir prosedür sunuyoruz. Prosedür, çevresel ve içme sularında bulaşıcı virüslerin oluşumunu ölçmek için standartlaştırılmış bir araç sağlar.

Enterovirus Kültür ve RT-qPCR Su Norovirus Oluşum EPA Metot 1615 ölçülmesi. II. Toplam kültürlenebilir virüs Deneyi

Çevresel su ve atık su örneklerinden virüs konsantrasyonu, öncelikle virüslerin tanımlanması ve miktarının belirlenmesi için gerçekleştirilen zorlu bir görevdir. Çeşitli virüs konsantrasyon yöntemleri geliştirilmiş ve test edilmiş olsa da, burada farklı numune tiplerine sahip RNA virüsleri için ultrafiltrasyon ve yağsız süt topaklaşmasının etkinliğini gösteriyoruz.

Yağsız Süt Flokülasyonu ve Ultrafiltrasyon Kullanılarak Çevresel Su ve Atık Su Numunelerinden Virüs Partiküllerinin Konsantrasyonu

Burada bildirilen TCID50 testi, etiketsiz gerçek zamanlı empedans ölçümlerini ve sistemin Viroloji modülünü kullanarak virüsle tetiklenen sitopatik etkileri (CPE) gerçek zamanlı olarak objektif olarak izler. Bu sade test, yüksek verimlilikte, nicel kinetik CPE ölçümlerini desteklerken uygulamalı zamanı önemli ölçüde azaltır ve otomatik, gerçek zamanlı TCID50 hesaplamalarını mümkün kılar.

Otomatik Virüs Titri Nic Ification için Empedans kullanarak Etiketsiz Gerçek Zamanlı 50% Doku Kültürü Enfeksif Doz (TCID50) Testi

Burada, siyanofajları (ve konakçılarını) izole etmek için deniz ve tatlı su ekosistemlerinin öfotik bölgelerinden örnekleme yöntemlerini ve tek genotipleri zenginleştiren ve virüs-konak etkileşim dinamiklerini karakterize eden örnekleme sonrası süreçleri açıklıyoruz.

Fotosentetik Mikropların ve Virüslerinin Çevresel Örneklemesi: Tarladan Laboratuvara

Öğrenin su sistemlerinde virüs üretim oranlarını tahmin etme yöntemini. Deniz ve tatlı su örneklerinde mikrobiyal topluluklarda virüs dinamiklerini incelemek için kullanılan bu teknik, ekolojik araştırmalarda önemli bilgiler sağlar.

Su Sistemleri Virüs Üretim Oranlar tahmin

Daha fazla video keşfet