Su Sistemleri Virüs Üretim Oranlar tahmin

Bu prosedürün genel amacı, sucul mikrobiyal topluluklarda virüslerin üretim hızını belirlemektir. Bu, öncelikle yerli mikrobiyal topluluğu korurken ilgili örnekteki serbest virüslerin bolluğunu azaltarak gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, örnekleri uygun koşullarda inkübe etmek ve 10 saate kadar her iki ila üç saatte bir alt örnekler toplamaktır.

Prosedürün üçüncü adımı, her bir zaman noktasından toplanan alt örneklerdeki virüslerin sayımını yapmaktır. Prosedürün son adımı, örnekteki virüs partikül bolluğunun artış hızını belirlemek ve virüs üretim hızlarını saptamaktır. Sonuç olarak, sayımlar üzerinden mikrobiyal topluluk içerisinde virüslerin hangi hızlarda üretildiğini gösteren sonuçlar elde edilebilir ve bu sayede araştırmacılar, virüs aktivitesine bağlı mikrobiyal mortalite hızları hakkında çıkarımlarda bulunabilirler.

Herkese merhaba. Benim adım Audrey Madison; Dr. Steven Milham'ın laboratuvarında ve Tennessee Üniversitesi Mikrobiyoloji Bölümü'nde çalışıyorum. Bugün Charles Budoff ve Claire Campbell'ın yardımıyla, virüslerin sucul sistemlerde üretilme hızlarını analiz etmeye yönelik bir prosedürü size göstereceğiz.

Bunu yapmak için, örneklerdeki serbest virüslerin sayısını azaltıyoruz ve virüsle enfekte olmuş mikroorganizmaların lize olmasıyla yeniden ortaya çıkma oranlarını sayıyoruz. Şu anda laboratuvarımızda bu prosedürü, virüslerin ekolojisini ve mikrobiyal toplulukları nasıl şekillendirebileceklerini incelemek için kullanıyoruz. Giriş bölümünü tamamladığımıza göre, hadi başlayalım.

Bu prosedüre başlamadan önce, mümkün olduğunca aseptik bir şekilde yaklaşık 20 litre deniz suyu toplayın. Numune toplandıktan sonra, suyu 142 milimetre çapında 0.8 mikronluk bir filtreden ön filtrelemeden geçirin. Biyolojik olarak üretken sistemler için, bu işlemden önce daha büyük gözenek boyutuna sahip bir filtre veya cam elyaf filtre ile filtrasyon yapılabilir.

Ultrafiltre edilmiş su elde etmek için, tüm virüsleri dışarıda bırakacak sarmal sarımlı bir membran kartuşuna sahip AmCon M 12 sistemi gibi bir ultrafiltrasyon sistemi kurun. Numunedeki virüsler daha sonra maksimum hızın yaklaşık %25'inde ve 15 ila 16 kilo paskal geri basınçla uzaklaştırılır ve konsantre edilir. Yaklaşık 500 mililitrelik retentat, diğer çalışmalar için saklanabilecek konsantre virüs topluluğunu içerirken, virüs içermeyen permeat viral üretim analizleri için kullanılacaktır.

Filtre kartuşunun membranının zarar görmesini önlemek için Omicron M 12 sistemini her kullanım gününün ardından temizleyin. Deniz suyu ile çalışırken, membranı önce en az altı litre Milli Q su ile durulayın, ardından 30 ila 45 dakika boyunca 0.1 molar sodyum hidroksit çözeltisi ile yıkayın. Daha sonra kartuşu en az altı litre daha Milli Q su ile durulayın.

İşlem tamamlandığında, spiral kartuş dört santigrat derecede 0,05 molar fosforik asit çözeltisi içinde saklanabilir. Viral azaltma yöntemine başlamak için, virüssüz su elde ettiğimiz konumla aynı yerden alınan 500 mililitre deniz suyu örneği, 0,2 mikro nominal gözenek boyutuna sahip, düşük protein bağlayan bir filtre içeren stereo filtre ünitesine yerleştirilir. Bu aşamada, başlangıç suyundaki virüs ve bakterilerin toplam bolluğunu belirlemek için bir alt örnek de toplayın.

Bakteri hücrelerinin filtre üzerinde yoğunlaşmasını önlemek için steril bir transfer pipetiyle örneği sürekli olarak yeniden süspanse ederken, örneğe 200 milimetre cıva'dan daha düşük bir vakum basıncı uygulayın. Bakteriyel popülasyonları sabit bir yoğunlukta tutarken örnekteki serbest virüslerin bolluğunu azaltmak için, bakteriyel süspansiyona ultrafiltrattan üç hacim olacak şekilde 500 mililitre yavaşça ekleyin. Son olarak, bakteriyel fraksiyonu virüssüz ultrafiltre edilmiş su ile tekrar 500 mililitreye seyreltin. Ardından, bunu 150 mililitrelik üç replikata halinde bölün ve replikataları şeffaf 250 mililitrelik polikarbonat şişelere yerleştirin.

Bu, sıfırıncı zaman örnek setinizi temsil eder. Sıfırıncı zaman örneklerinizden bakteriyel ve viral bolluk tahminleri için örnekler alın. Örnekleri, final konsantrasyonu %2,0 ila %2,5 steril glutaraldehit olan kriyoviyallere aktarın.

Fiksatif olarak, bu örnekleri sıvı azot ile derhal hızlıca dondurun ve işlenene kadar -80 °C'de saklayın. Alternatif olarak, deniz mikroplarını konsantre etmek için teğetsel akış sistemi kullanılabilir. TFF yöntemini kullanmak için yaklaşık 500 mL doğal örnek elde edin.

Viral azaltma yöntemi için açıklandığı üzere, bakteriyel fraksiyon ultra-filtre edilmiş virüssüz su ile yaklaşık 10 ila 15 mililitreye düşürülene kadar, 0,2 mikron nominal gözenek boyutuna sahip bir tanjansiyel akış filtrasyon sistemi kullanarak bu örneği konsantre edin ve ortaya çıkan replika şişeleri in situ koşullarında inkübe edin. Denizdeki çevre odalarını kullanarak, ortam sıcaklıklarını koruyan bir yüzey suyu kaynağına bağlı olan akışkan deniz suyu inkübatörleri kullanıyoruz. Işık seviyeleri, ışık yoğunluğunu azaltmak için mavi tonlu akrilik veya nötr yoğunluklu bir gölgeleme ağı kullanılarak yüzey koşullarına uygun hale getirilebilir.

Saha istasyonunda veya laboratuvarda çalışırken ya da deniz suyuna erişimin olmadığı durumlarda, ışıklı bir büyüme inkübatörü kullanılabilir. Sıfırıncı saatte numune için uygulanan yöntemle, en az 10 saat boyunca her 2,5 saatte bir alt numuneler toplamaya devam edin. Bazı araştırmacılar, mikroskopi numunelerine ek olarak, belirli virüslerin kantitatif PCR analizi için su toplamak isteyecektir.

QPCR örnekleri için, beş mililitre örneği fiksatör madde içermeyen bir kriyoviyale ekleyin ve viral üretim mikroskopisi hazırlığı için hemen sıvı azot ile şok dondurun; dondurulmuş örnekleri buz üzerinde çözdürün ve çözeltileri yazılı protokolde açıklandığı şekilde taze olarak hazırlayın. Ardından, 25 milimetrelik 0,02 mikron gözenek boyutuna sahip bir disk filtreyi 0,45 mikronluk selülozik destek filtresinin üzerine yerleştirin. Daha sonra, 850 mikrolitre fikse edilmiş örneği anadi filtrenin üzerine ekleyin ve tamamen kuruyana kadar 20 kilo Pascal'ın altındaki bir basınçta vakumlayın.

Ano disk filtresi kuruduğunda, steril bir petri kabına 100 µL cyber green çalışma çözeltisi pipetleyin. Vakum hala açıkken, ano diski dikkatlice filtre kulesinden çıkarın ve cyber green üzerine yerleştirin. Örnekleri oda sıcaklığında, karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe edin.

Filtreyi cyber green çözeltisinden dikkatlice çıkarın ve tüm artık boyayı temizlemek için filtrenin arkasını bir Kim wipe ile kurulayın. Ardından, bir mikroskop lamına küçük bir damla Antifa çözeltisi ekleyin ve üzerine bir lameller kapatın. Lameli kaldırın ve kurutulmuş filtreyi mikroskop lamına yerleştirin.

Tekrar, lamellele küçük bir miktar Antifa solüsyonu ekleyin ve oluşan her türlü kabarcığı giderdiğinizden emin olarak lameli yavaşça filtrenin üzerine yerleştirin; geniş mavi filtreli floresan mikroskobu kullanarak virüsleri sayın; virüslerin filtre membranı boyunca eşit dağılımını sağlamak için her bir alan ızgarasındaki toplam virüsleri nicelendirdiğinizden emin olarak her filtre için en az 20 görüş alanını sayın. Üç bağımsız tekrardan virüs tekrarlama oranlarının ortalamasını hesaplayın ve üretim oranlarından bir standart sapma belirleyin. Son olarak, bu oranları, başlangıç bolluğundan virüs azaltılmış örnekteki seyreltilmiş bolluğa kadar olan mikroorganizma seyrelmesine göre düzeltin.

Bu çalışmadan elde edilen temel veri seti, inkübasyonlardan alınan alt örneklerdeki virüs bolluğunun tekrarlama oranlarıdır. Bu sonuçlar, her bir örnek için virüs bolluğuna karşı zamanın bağımsız regresyonlarını oluşturmaktadır. Virüs benzeri partiküllerin üretimi, epi-floresans mikroskopi kullanılarak, belirlenen koşullar altında 10 saatlik bir inkübasyon boyunca izlenmiştir.

Bu örnekler, 2008 yılı Eylül ayında Yeni Zelanda kıyılarındaki bir fitoplankton patlaması sırasında toplanmıştır. Size virüs üretim hızlarının nasıl tahmin edileceğini göstermiş olduk. Bu süreç, farklı ultrafiltrasyon sistemlerinin kullanımını ve virüs üretim hızlarını ölçmek için deneylerin gerçekleştirilmesini içermektedir.

Ayrıca, bu virüslerin epi floresans mikroskobu ile nasıl sayılacağını gösterdik. Bu prosedürü uygularken temiz ekipman kullanmayı, boyanmış virüsleri dikkatli taşımayı, ışığı azaltmayı, numunelerinizi hızlıca işlemeyi ve ultrafiltrasyon kartuşlarını her kullanımdan sonra uygun şekilde temizlemeyi hatırlamanız önemlidir. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.