Name: Yeşil Floresan Protein ifade Rev-bağımlı lentiviral Vector kullanarak HIV-1 Olumlu Hücreler Özgül İşareti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-23T18:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Keşfedin HIV-1 pozitif hücreleri GFP ifadesiyle belirlemek için Rev-bağımlı lentiviral vektör kullanımını. Bu yöntem, akış sitometrisi ile canlı hücrelerde replike eden HIV'i tespit ederek gen tedavisi uygulamaları için kritik öneme sahiptir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Iş NIAID gelen YW Halk Sağlığı Servisi hibe 1R01AI081568 ve cömert bağışlar M. Rosen ve Day2 A.Ş. tarafından düzenlenen 2009 NYCDC AIDS Ride donörler ve biniciler tarafından kısmen desteklenmiştir.

1. Rev-bağımlı lentiviral Parçacıklar üretimi için Plazmidler, Transfeksiyon Set up: Rev-bağımlı GFP lentiviral vektörü, PNL-GFP-RRE-SA, daha önce açıklanan 4,5,6 . Viral bir parçacık içinde bir araya getirmek için, HIV-1 ambalaj inşa, pCMVΔ8.2 (kibarca Dr Diğer Trono tarafından sağlanan) HEK293 T hücrelerinin içine plazmid contransfected ve VSV-G glikoprotein (pHCMV-G) taşıyan bir plazmid . Transfeksiyon kalsiyum fosfat yöntemi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Tamponlar Hazırlanması: 10 X HBS (HEPES Tamponlu Salin) HEPES 5 g eriterek tarafından hazırlanan, 8 g NaCl, Na 2 HPO 4 (susuz) 100 ml KCl Dekstroz 1 g, 0.103 g, 0.37 g H 2 O Kısım the10 X HBS 1 ml alikotları içine tampon ve -20 ° C'de saklayın Transfeksiyon zaman, H 2 O (1: 5 seyreltme), 2 X HBS 10 X HBS dönüştürmek ve pH ayarlamak arasında 7.05 - 7.12 . (10 ml 2 X HBS, genellikle 1M NaOH yaklaşık 50 mcL gerektirir). Filtre 0.22 mcM Millipore filtre geçerek 2X HBS tampon sterilize. CaCl 2 tampon, nihai konsantrasyonu 2M 10 mM HEPES CaCl 2 eriterek yapıldı . PH 5.8 ayarlayın, 4 tampon ve mağaza sterilize filtre ° C Prosedür: <ol><li> Bir gün önce transfeksiyon, tohum 2 x 10 6 HEK293T 100 mm Petri-çanak hücreleri, ve 37 ° 10 ml DMEM +% 10 FBS geceleme hücrelerin büyümesine ° C,% 5 CO 2. </li><li> Ertesi gün, hücreleri süpernatant kaldırmak ve 5 ml taze DMEM +% 10 FBS, 4 saat boyunca sürekli olarak kültür hücreleri ile değiştirin. </li><li> 5 ml polistiren tüp, 480 mcL 2X HBS tampon ekleyin. </li><li> Ikinci bir 5 ml polistiren tüp, 480 mcL toplam hacmi 60 mcL 2M CaCl 2 tampon, plazmid DNA ve transfeksiyon TE tamponu (1 mM Tris, 25 mM EDTA, pH 8.0) ekleyin. Her Petri yemek için plazmidler PNL-GFP-RRE-SA, pCMVΔR8.3, 7.5 mg, 2.5 mg ve pHCMV-G 10 mikrogram oranında ilave edilmelidir. </li><li> 2 X HBS tüp damla damla plazmid DNA CaCl 2 karışımı ekleyin ve 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. A fine çökelti oluşacaktır. </li><li> Pipet tarafından hücrelere damla damla karışım 960 mcL ekleyin. Bir gecede 37 ° C,% 5 CO 2 inkübe edin. </li><li> Ertesi gün, süpernatantı kaldırmak ve 10 ml taze DMEM +% 10 FBS eklemek ve hücrelerin sürekli olarak 37 ° C,% 5 CO 2 gece boyunca inkübe edin. </li><li> 48 saat transfeksiyon anda, hasat süpernatantı kaldırılması ve 50 ml steril tüpler içine transfer virüs. 10 ml taze taze DMEM +% 10 FBS her Petri yemek ve gece boyunca kültür devam. 4 virüs süpernatant Mağaza ° C. </li><li> Süpernatantı toplayarak 72 saat transfeksiyon hasat devam edin. Süpernatantlar birleştirin ve pelet ila 15 dakika boyunca 500 xg'de süpernatantlar santrifüj ve hücre artıkları çıkarın. </li><li> Süpernatant 0.22 mcM Millipore filtre aracılığıyla toplanan ve süzülür. Bu virüs, daha fazla boyut dışlama sütun yoluyla konsantre oldu. </li></ol> 2. Viral Parçacıklar Konsantre ve Viral titresi tespit <ol><li> Viral parçacıkların bir boyut dışlama sütun (100.000 MW kesti, Centricoin) yoğunlaşmıştır. Viral süpernatant sütuna yüklenen ve 4 ° C 15 dakika boyunca 6.000 xg'de santrifüj edildi. </li><li> Konsantre viral süpernatant, toplanan aliquoted ve -80 ° C'de saklanır oldu </li><li> Viral titresi TNF tedavi, HIV-1 pozitif Ceket hücre hattı, J1.1 7 enfeksiyon tespit edildi. Hücreler 96 plaka ml başına 2.5 x 10 5 hücreleri (100 ml toplam hacim) kültür ve bir hafta boyunca seri olarak seyreltilmiş VNL-GFP-RRE-SA 100 ml ile enfekte edildi. Reed ve Muench 8 yöntemi takip GFP pozitif kuyu sayarak parçacığın titresi (TCID50) tahmin edilmiştir. </li></ol> 3. Markalama HIV-1 lentiviral Tane Pozitif Hücreler, VNL-GFP-RRE-SA Set up: bir insan CD4 T hücre hattı, CEM-SS, ilk HIV-1 ile enfekte oldu. 48 saat enfeksiyonu, hücreler lentiviral parçacıklar, VNL-GFP-RRE-SA ile süperenfekte. Bir iki gün süperenfeksiyonu sonra, GFP pozitif hücreler flow sitometri ile analiz edildi. Kontrol olarak, HIV-1 enfekte olmamış CEM-SS hücreleri aynı VNL-GFP-RRE-SA ile enfekte edildi. Sadece HIV-1 ile enfekte CEM-SS hücreleri, HIV-1 enfekte olmamış CEM-SS hücreleri GFP pozitif hücreler doğurdu değil. Prosedür: <ol><li> Enfeksiyon iki saat önce, nihai konsantrasyonu 4 mg / ml polybrane ekleyin. Hücre sayımı ve her enfeksiyon için 2 x 10 5 hücreleri alır. 2 saat boyunca 200 ng (p24), HIV-1 NL4-3 hücreleri enfekte. </li><li> Tekrar süspansiyon, 10 dakika boyunca 300 xg'de santrifüj hücreleri Yıkama37 2 x 10 5 hücre / mL ve kültür içine hücreleri ° C 48 saat boyunca. </li><li> Hücre sayımı ve VNL-GFP-RRE-SA ile enfeksiyon başına 2 x 10 5 hücre almak. ° C gecede 37 VNL-GFP-RRE-SA ve inkübe 100 ml ekleyin. Hücreleri yıkayın ve 2 x 10 5 hücre / ml içine tekrar süspansiyon. </li><li> 48 saat yazılan süperenfeksiyon flow sitometri analizi gerçekleştirin. Enfekte hücrelerin pelet ve 20 dakika oda sıcaklığında inkübe 500 ml% 1 paraformaldehede, içine yeniden süspanse edildi ve daha sonra bir FACScan analizörü (Becton Dickenson) analiz. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Deneyleri başarıyla yapılmaktadır kontrolü, GFP pozitif hücreler, HIV-1 enfekte olmamış CEM-SS tespit edilebilir, ancak, kayda değer bir GFP nüfus, akış sitometresinin tarafından HIV-1 ile enfekte CEM-SS hücreleri tespit olacaktır hücreleri. Deneyleri başarıyla yapılmaktadır, Rev-bağımlı lentiviral vektör, VNL-GFP-RRE-SA, yeşil floresan protein (GFP) ifade ölçümü yoluyla, hücre popülasyonlarının yaşayan kopyalayan HIV son derece özel bir algılama izin verecektir. Bu örnekte, hasat CEM-SS hücreleri fare CD24, HSA karşı PE-etiketli sıçan monoklonal antikor ile boyandı ve daha sonra HSA ve GFP ifade hem de bir akış sitometresinin analiz. <img src="/files/ftp_upload/2198/2198fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1'de görüldüğü gibi, oldukça büyük bir GFP nüfus VNL-GFP-RRE-SA (Şekil 1c) süperenfekte HIV-1 ile enfekte olan hücreleri tespit edildi. Buna karşılık, GFP pozitif hücrelerin lentiviral süperenfeksiyon (Şekil 1a) veya HIV-1 enfekte olmamış hücrelerdeki lentiviral süperenfeksiyon (Şekil 1b). Olmadan ya HIV-1 enfekte olmamış CEM-SS hücreleri tespit edildi

<ol><li>Garcia, J. A., Wu, F. K., Mitsuyasu, R., Gaynor, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+cellular+proteins+involved+in+the+transcriptional+regulation+of+the+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Interactions of cellular proteins involved in the transcriptional regulation of the human immunodeficiency virus.</a> EMBO Journal. 6, 3761-3770 (1987).</li>
<li>Merzouki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+gp120%2F160+expressing+cells+upregulate+HIV-1+LTR+directed+gene+expression+in+a+cell+line+transfected+with+HIV-1+LTR-reporter+gene+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Biol+%28Noisy-le-grand%22%5BJournal%5D)">HIV-1 gp120/160 expressing cells upregulate HIV-1 LTR directed gene expression in a cell line transfected with HIV-1 LTR-reporter gene constructs.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand. 41, 445-452 (1995).</li>
<li>Aguilar-Cordova, E., Chinen, J., Donehower, L., Lewis, D. E., Belmont, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+reporter+cell+line+for+HIV-1+tat+activity%2C+HIV-1+inhibitors%2C+and+T+cell+activation+effects%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res+Hum+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">A sensitive reporter cell line for HIV-1 tat activity, HIV-1 inhibitors, and T cell activation effects.</a> AIDS Res Hum Retroviruses. 10, 295-301 (1994).</li>
<li>Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rev-dependent+lentiviral+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Rev-dependent lentiviral expression vector.</a> Retrovirology. 4, 12-12 (2007).</li>
<li>Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rev-dependent+indicator+T+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Current+HIV+Research%22%5BJournal%5D)">Rev-dependent indicator T cell line.</a> Current HIV Research. 5, 395-403 (2007).</li>
<li>Young, J., Tang, Z., Yu, Q., Yu, D., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+killing+of+HIV-1-positive+macrophages+and+T+Cells+by+the+Rev-dependent+lentivirus+carrying+anthrolysin+O+from+Bacillus+anthracis%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Selective killing of HIV-1-positive macrophages and T Cells by the Rev-dependent lentivirus carrying anthrolysin O from Bacillus anthracis.</a> Retrovirology. 5, 36-36 (2008).</li>
<li>Perez, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+HIV-1-infected+T+cell+clone+defective+in+IL-2+production+and+Ca2%2B+mobilization+after+CD3+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">An HIV-1-infected T cell clone defective in IL-2 production and Ca2+ mobilization after CD3 stimulation.</a> Journal of Immunology. 147, 3145-3148 (1991).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).</li>
</ol>

Önceki gelişmiş Tat bağımlı ekspresyon vektörleri olduğu gibi, Rev sistemi gelişmiş bir HIV sürecinin bir sömürü burada anlatılan. Rev-bağımlılık dahil LTR tabanlı ifade vektör kopyalayan HIV varlığı son derece bağımlı hale getirir. Burada bildirilen bu vektör uygulama, HIV-bağımlı bir muhabir virüs, HIV-pozitif hücrelerin tanımlamak için yeni bir yeni bir yaklaşım sunuyor. Vektör canlı hücrelerin incelenmesine izin veren, temel veya klinik deneyler için herhangi bir gen ifade ve bir sözde-daktilo lentivirüs olarak, en hücre tipleri ve dokulara erişimi vardır.

<table><tbody><tr><td>Biyogüvenlik Kabini</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C %5CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; inkübatör</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Akış sitometresi</td><td></td><td>FACSCalibur</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Allega&amp;#174;6KR</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;#x00B0;C buzdolabı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20&amp;#x00B0;C dondurucu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> -80&amp;#x00B0;C dondurucu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hücre sayıcı</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>Cellometer&amp;#174; AutoT4</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T hücre hattı</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CEM-SS hücre hattı</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jurkat hücre hattı J1.1</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>21870</td><td></td></tr><tr><td>HI FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10438-018</td><td></td></tr><tr><td>HIV-1&lt;sub&gt;NL4-3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>klonlanmış proviral DNA ile HeLa hücrelerinin transfeksiyona tabi tutulmasıyla hazırlanmıştır</td></tr><tr><td>pNL-GFP-RRE</td><td></td><td></td><td>pNL4-3'teki tüm HIV ORF'lerinin tamamen silinmesi</td></tr><tr><td>pNL-GFP-RRE-SA</td><td></td><td></td><td>HIV-1 A5 ve D4'ün pNL-GFP-RRE'ye eklenmesi</td></tr><tr><td>pCMV&amp;#916;8.2</td><td></td><td></td><td>Dr. Dider Trono tarafından sağlanmıştır</td></tr><tr><td>pHCMV-G</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 x HBS (Hepes Tamponlu Salin)</td><td>Invitrogen</td><td>11344-041</td><td></td></tr><tr><td>2M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; tamponu</td><td>Invitrogen</td><td>S-013-154-10</td><td></td></tr><tr><td>%1 paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Çamaşır suyu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50ml Falcon tüpleri</td><td>BD Biosciences</td><td>358206</td><td></td></tr><tr><td>5ml yuvarlak tabanlı tüpler</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>0.45&amp;mu;M Millipore filtre</td><td>EMD Millipore</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>0.20&amp;mu;M Millipore filtre</td><td>EMD Millipore</td><td>SLFG85000</td><td></td></tr><tr><td>100mm Petri kabı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430588</td><td></td></tr><tr><td>Boyut dışlama kolonu (100,000MW kesme sınırı)</td><td>Sartorius AG</td><td>VS2041</td><td></td></tr><tr><td>2ml dondurma tüpü</td><td>Axygen Scientific</td><td>SCT-200</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyucuklu plaka</td><td>BD Biosciences</td><td>353227</td><td></td></tr><tr><td>1.7mL Mikrosantrifüj Tüpü</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT- 175-C</td><td></td></tr></tbody></table>

yeşil floresan protein ifade rev-bağımlı lentiviral vector kullanarak hiv-1 olumlu hücreler Özgül İşareti

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

HIV duyarlı ifade vektörlerin çoğu HIV organizatörü, uzun terminal tekrar (LTR) dayanmaktadır. LTR erken HIV protein, Tat duyarlı iken, hücresel aktivasyon devletler ve entegrasyonu oluştu yerel kromatin aktivite duyarlı. Bu yüksek HIV bağımsız aktivite neden olabilir ve işareti HIV pozitif hücreler 1,2,3 LTR-tabanlı muhabiri yararlılığı sınırlı. Burada, Tat duyarlı LTR, Rev-yanıt elemanı ve HIV ekleme siteleri 4,5,6 olmak üzere pek çok HIV DNA dizilerinin yanı sıra, sahip bir ifade lentiviral vektör inşa edilmiştir. Vektör yaşayan hücre popülasyonlarının kopyalayan HIV son derece özel bir algılama izin lentiviral bir muhabir virüs içine dahil oldu. Vektör aktivitesi yeşil floresan proteininin (GFP) ifadesi ile ölçüldü. Burada bildirilen bu vektör uygulama, HIV-pozitif hücreleri belirlemek için mevcut yöntemlere in situ PCR veya HIV antijeni boyama gibi bir roman alternatif bir yaklaşım, sunuyor . Vektör aynı zamanda HIV-pozitif hücreleri hedef için temel veya klinik deneyler için terapötik genleri ifade edebilir.

Biz Tat duyarlı LTR ek olarak, bu tür bir lentiviral vektör geliştirdik, HIV-1 Tat ve Rev-bağımlı bir moda muhabiri gen ekspresyonu düzenleyen Rev-yanıt elemanı (RRE). Vektör GFP ifadesi üzerinden canlı hücreler kopyalayan HIV özel algılama izin verir.

Yeşil Floresan Protein ifade Rev-bağımlı lentiviral Vector kullanarak HIV-1 Olumlu Hücreler Özgül İşareti

HIV'ye yanıt veren ekspresyon vektörlerinin çoğu, HIV promotörü olan uzun terminal tekrar (LTR) üzerine kuruludur. Erken bir HIV proteini olan Tat'e yanıt verse de...

Bu prosedürün genel amacı, yeşil floresan protein taşıyan bir HIV-1 rev bağımlı lentiviral vektör kullanarak HIV pozitif hücreleri tanımlamaktır. Bu işlem, önce kotransfeksiyon yoluyla rev bağımlı lentiviral partiküller üretilerek gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise insan CD4 T hücrelerini HIV-1 ile enfekte etmektir.Ardından, HIV pozitif insan CD4 T hücreleri, GFP geni taşıyan lentiviral partiküller ile süper enfekte edilir. Son adım, akış sitometrisi ile GFP pozitif hücreleri ölçerek HIV pozitif hücreleri tanımlamaktır. Nihayetinde, akış sitometrisi aracılığıyla GFP pozitif hücrelerin yüzdesini gösteren sonuçlar elde edilebilir.Rev bağımlı vektörün, HIV enfekte hücrelerde terapötik genleri iletebilmesi ve seçici olarak eksprese ederek HIV pozitif hücrelerin öldürülmesini tetikleyebilmesi nedeniyle, bu tekniğin etkileri HIV enfeksiyonu tedavisine kadar uzanmaktadır. Prosedür, laboratuvarımızdan araştırma yardımcı profesörü gi tarafından rev bağımlı lentiviral partiküller üretilerek gösterilecektir. HEK 293T hücreleri; rev bağımlı GFP lentiviral vektörü, HIV-1 paketleme konstrüktü ve VSVG glikoproteinini taşıyan bir plazmid olmak üzere üç plazmid ile transfekte edilir; plazmid transfeksiyonundan bir gün önce, 10 mililitre besiyerine 2 × 10⁶ HEK 293T hücresi ekilir.100 mm'lik bir Petri kabında, hücreleri 37 °C ve %5 CO₂ ortamında gece boyunca büyütün. Ertesi gün, hücrelerin süpernatantını 5 mL taze besiyeri ile değiştirin.Ardından hücreleri 37 °C'de, %5 karbondioksit altında dört saat boyunca kültüre etmeye devam edin. Transfeksiyon reaktiflerini dört saatlik inkübasyon süresi dolmadan önce hazırlayın. HEK 293 T hücreleri; 10 µg rev bağımlı GFP lentiviral vektör, 7.5 µg HIV-1 paketleme konstrüktü ve 2.5 µg VSVG glikoproteini oranında üç plazmit ile transfekte edilecektir.Öncelikle üç plazmit DNA'sını istenen oranda önceden karıştırın. Ardından beş mililitrelik iki polistiren tüp hazırlayın. Birinci tüpe ve ikinci tüpe 480 µL iki katı HBS tamponu ekleyin.Plazma DNA'ları ve transfeksiyon tamponu içeren toplam 480 µL hacme 60 µL 2 M kalsiyum klorür tamponu ekleyin. Ardından, plazma DNA kalsiyum klorür karışımını, oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilen 2x HPS tüpüne damla damla ekleyin.Kademeli olarak ince bir çökelek oluşacaktır. Şimdi, karışımın tüm 960 µL'sini damla damla pipet yardımıyla HEK 2 9 3 T hücrelerine ekleyin. 37 °C'de, %5 karbon dioksit ortamında gece boyunca inkübe edin.Ertesi gün S süpernatantını uzaklaştırın ve 10 mililitre taze besiyeri ekleyin. Hücreleri tekrar 37 °C'de, %5 karbondioksit ortamında gece boyunca inkübe edin. Transfeksiyondan 48 saat sonra, süpernatantı uzaklaştırıp 50 mililitrelik steril bir tüpe aktararak virüsü hasat edin.Petri kabına 10 mililitre taze besiyeri ekleyin ve bir gece boyunca kültürlemeye devam edin. Virüs süpernatantını dört derece Celsius'ta saklayın. Transfeksiyondan 72 saat sonra, süpernatantı toplayıp daha önce hasat edilen süpernatantla birleştirerek hasat işlemine devam edin.Ardından, hücre artıklarını çöktürmek ve uzaklaştırmak için S süpernatantını 500 ×g'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, S süpernatantını toplayın ve yeni bir tüpe aktarın. Daha sonra süpernatantı 0,22 µm'lik bir millipore filtreden süzün.Virüs, viral partikülleri yoğunlaştırmak için bir sonraki adımda gösterilecek olan boyut dışlama kolonu aracılığıyla daha fazla konsantre edilecektir. Viral süpernatantı boyut dışlama kolonuna yükleyin ve 4 °C'de 15 dakika boyunca 6,000 ×g'de santrifüjleyin. Viral titreyi belirlemek için yaklaşık 100 µL'yi ayırarak konsantre viral süpernatantı toplayın.Geriye kalanı alikotlayın ve -80 °C'de saklayın. Viral titrenin belirlenmesi, bu prosedürün en kritik aşamalarından biridir. Hücrelerin GFP VIR vektörü ile yüksek düzeyde enfekte edilmesi için daha yüksek bir enfeksiyon çoğaltma oranı gereklidir.Viral titreyi belirlemek amacıyla, akış sitometrisi ile saptanabilir GFP pozitif hücre yüzdesini elde etmek için; TNF ile işlem görmüş HIV V1 pozitif Jerk kedi hücre hattı, viral süpernatant ile enfekte edilecektir. Bu HIV V1 pozitif hücreler kültüre edilir.96 kuyucuklu bir plakada, toplam 100 µL hacimde mililitrede 2,5 × 10⁵ hücre konsantrasyonunda hazırlayın. HIV-1 pozitif hücreleri enfekte etmek için rev-bağımlı lentiviral partiküllerin altı seri on katlı dilüsyonunu hazırlayın; virüsün her bir seri dilüsyonundan 100 µL'yi hücrelerin bulunduğu her bir kuyucuğa ekleyin. 37 °C'lik bir CO₂ inkübatöründe yedi gün boyunca inkübe edin.Parçacık titresi, floresan mikroskobu altında GFP pozitif hücrelerin gözlemlenmesiyle tahmin edilir. Hesaplamalar Reid ve MU yöntemine göre yapılır ve titre, GFP pozitif kuyucuklar oluşturabilen dilüsyon noktası olarak belirlenir. Rev bağımlı lentiviral parçacıklarla enfekte edilen kuyucukların %50'sinde, işaret IV için tek bir pozitif hücre saptanmıştır.Bir insan CD4 T hücresi hattı öncelikle HIV-1 ile enfekte edilecektir. Her enfeksiyon için 2×10⁵ hücre kullanıyoruz. Enfeksiyondan iki saat önce.Hücrelere, nihai konsantrasyonu 4 µg/mL olacak şekilde poly brain ekleyin. 37 °C'de iki saat boyunca inkube edin. Ardından, HIV çözeltisini beş mililitrelik tüplerden birine damlatarak hücreleri enfekte edin.Hücrelerin bulunduğu diğer iki tüp enfekte edilmemiştir ve kontrol olarak kullanılacaktır. Tüm hücreleri 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. İki saat sonra, hücreleri 300 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatantı atarak hücre dışı virüsleri yıkayın ve hücreleri 2 × 10⁵ hücre/mL konsantrasyonunda taze besiyerinde resüspande ederek 37 °C'de 48 saat boyunca kültüre edin.48 saat sonra, HIV enfekte hücreler enfeksiyon için hazır hale gelir. Rev bağımlı lentiviral partiküllerle, kontrol grubu olarak 100 µL lentiviral partikül ile HIV V1 enfekte hücrelere enfeksiyon yapmak için 2 × 10⁵ hücre kullanın; aynı şekilde, HIV V1 enfekte olmamış insan CD4 T hücrelerini de 100 µL lentiviral partikül ile enfekte edin. Hücreleri 37 °C'de gece boyunca inkübe edin ve işlemi ertesi gün sürdürün.Kullanılmış besiyerini taze besiyeri ile değiştirin ve hücreleri mililitre başına 2x10⁵ hücre konsantrasyonunda yeniden süspande edin. Enfeksiyondan 48 saat sonra, hücreleri santrifüj ile çöktürün ve ardından 500 µL %1 paraformaldehit içerisinde yeniden süspande edin; süspande edilen hücreleri akış sitometrisi analizi için bir akış sitometrisi tüpüne aktarın. Oda sıcaklığında 20 dakikalık inkübasyonun ardından, hücreler GFP pozitifliği için bir FACS scan analizöründe analiz edilebilir.Deneyler başarıyla gerçekleştirilirse, rev bağımlı lentiviral vektör V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A, yeşil floresan protein GFP ekspresyonunun ölçümü yoluyla canlı hücre popülasyonlarında replike olan HIV'nin oldukça spesifik bir şekilde tespit edilmesini sağlayacaktır. Bu örnekte, hasat edilen C-E-M-S-S hücreleri, mouse CD 24 HSA'ya karşı PE işaretli sıçan monoklonal antikoru ile boyanmış ve ardından burada gösterildiği gibi hem HSA hem de GFP ekspresyonu için bir akış sitometresinde analiz edilmiştir. V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A ile süper enfekte edilmiş HIV 1 enfekte hücrelerinde önemli miktarda bir GFP popülasyonu tespit edilmiştir.Buna karşılık, ne lentiviral süper enfeksiyon uygulanmamış HIV V one enfekte olmamış C-E-M-S-S hücrelerinde ne de lentiviral süper enfeksiyon uygulanmış HIV one enfekte olmamış hücrelerde GFP pozitif hücreler tespit edilmemiştir. HIV ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken biyogüvenlik düzeyleri gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

specific-marking-hiv-1-positive-cells-using-rev-dependent-lentiviral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu görüntülenmiştir deney canlı konfokal görüntüleme deneyleri için HIV floresan moleküler klon kullanan için bir rehber.

HIV ve Live Konfokal Mikroskop Floresan Klonlar kullanılarak HIV görselleştirme Hücre-hücre Transferi

Lentiviral ifade vektörlerinin stably memeli hücreleri ve tüm organizma bölünmesi ve non-bölünmesi farklı efektör moleküller ya da reporter yapıları ifade etmek için en etkili araçlardır. Burada pseudoviral parçacıklar lentivector ifade yapıları paketlemek için ve pseudoviral parçacıkları kullanarak hedef hücreleri transdüksiyonu için nasıl bir protokol sağlar.

Ambalaj HIV veya FIV tabanlı Lentivector İfade Yapıları &amp; VSV-G Pseudotyped Viral Parçacıklarının İletimi

Biz, GFP ifade eden ve tam olarak bulaşıcı olan Maedi-visna virüs bir moleküler klon tanımlamak. Bu virüs çoğaltma floresan mikroskopisi ve akış sitometrisi ile tespit edilebilir.

Çoğaltım ve Yeşil floresan proteini ifade Maedi-visna Virüs bir Enfeksiyöz Moleküler Clone algılama

Floresans tarafından viral RNA tespit edilmesi<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Bu protokolü biz üretim, saflaştırma ve lentiviral vektörlerin titrasyonu açıklar. Biz primer kültürlerinde nöronlar ve astrositlerde lentiviral vektör aracılıklı gen aktarımının bir örnek oluşturmaktadır. Bizim yöntemleri diğer hücre türleri için de geçerli...

Merkezi sinir sisteminin transducing Hücreleri için lentiviral Vektörler Üretimi

Yeşil floresan protein geninin keşfinden bu yana, floresan proteinler moleküler hücre biyolojisini etkilemiştir. Bu protokol, genetik mühendisliği yoluyla farklı floresan proteinlerin ekspresyonunun, tek tek hücreleri barkodlamak için nasıl kullanıldığını açıklar. Prosedür, çoğullanmış uygulamalar için ideal olan bir hücre karışımındaki farklı popülasyonların izlenmesini sağlar.

Multiplexed Uygulamaları için Floresan Proteinleri ile Genetik Barkodlama

Açıklanan 96 genlerin ifade quantitate için bir metodoloji olduğunu ve 18 yüzey proteinler tarafından tek hücreleri ex vivodifferentially tanımlanması için izin, genler ve proteinler kandan hücrelere göre virüs enfeksiyonlu hücrelerdeki dile getirdi. Yaklaşım+ T çalışma SIV-enfekte CD4 için uyguladığımız rhesus makak izole hücreler.

Tek hücreli Nefelometri mRNA ve yüzey Protein Simian virüs, immün yetmezlik enfekte CD4 ifadede+ T hücreleri izole Rhesus makak üzerinden

HIV-1 füzyon yoluyla üzerinde akış sitometresi veya floresan mikroskopi tarafından algılanabilir yeşil flüoresan proteinin ifade bildirmek için bir hücre tabanlı tahlil açıklar. İnhibitörleri (füzyon aşamada özellikle) viral girdisinin boş hücre ve hücre-hücre enfeksiyonu sistemlerinde test etmek için kullanılabilir.

Bir yüksek-den geçerek Cre-Lox Viral membran Fusion tahlil inhibitörleri HIV-1 Viral membran füzyon tanımlamak için aktive

HIV verimli yeniden etkinleştirme işlev değerlendirmesi ve gizli proviruses boşluk için yüksek aktarım protokolü açıklanan ve müdahaleler HIV transkripsiyon üzerinde etkisini test ve yapıştırma uygulanır. Soldan sağa dayalı transkripsiyon ajanlara geri ve yapıştırma gecikme etkisi temsilcisi sonuçları sağlanır.

Vitro değerlendirme HIV transkripsiyon ve yapıştırma ajanları geri gecikme süresi yüksek işlem hacmi

DNA epigenome temsil düzenleme güçlü bir tedavi yaklaşımı hedef. Bu iletişim kuralı üretim, arıtma ve toplama tüm-içinde-bir lentiviral vektörlerin İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre (hiPSC)'epigenome düzenleme uygulamaları için CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene yataklık açıklar-nöronlar türetilmiş.

Pluripotent kök hücre kaynaklı hastalık modelleri lentiviral vektör platformu için Epigenome düzenleme araçları verimli bir şekilde teslim insan içine indüklenen

Burada floresan görüntüleme yaklaşımı için bir protokol, D NA, RNA ve protein'in (MICDDRP) multiplex immunofloresan cell bazlı detectionu, viral protein ve farklı tip ve karaya oturmuş nükleik asitlerin eşzamanlı floresan tek hücreli görselleştirmesini yapabilen bir yöntemdir. Bu yaklaşım çok çeşitli sistemlere uygulanabilir.

Viral Nükleik Asitleri ve Proteinleri Görselleştirmek ve HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virüsü ve İnfluenza Enfeksiyonunu İzlemek için Tek Hücreli Çoklanmış Floresan Görüntüleme

Keşfedin HIV-1 pozitif hücreleri GFP ifadesiyle belirlemek için Rev-bağımlı lentiviral vektör kullanımını. Bu yöntem, akış sitometrisi ile canlı hücrelerde replike eden HIV'i tespit ederek gen tedavisi uygulamaları için kritik öneme sahiptir.

Yeşil Floresan Protein ifade Rev-bağımlı lentiviral Vector kullanarak HIV-1 Olumlu Hücreler Özgül İşareti

Daha fazla video keşfet