Yeşil Floresan Protein ifade Rev-bağımlı lentiviral Vector kullanarak HIV-1 Olumlu Hücreler Özgül İşareti

Bu prosedürün genel amacı, yeşil floresan protein taşıyan bir HIV-1 rev bağımlı lentiviral vektör kullanarak HIV pozitif hücreleri tanımlamaktır. Bu işlem, önce kotransfeksiyon yoluyla rev bağımlı lentiviral partiküller üretilerek gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise insan CD4 T hücrelerini HIV-1 ile enfekte etmektir.

Ardından, HIV pozitif insan CD4 T hücreleri, GFP geni taşıyan lentiviral partiküller ile süper enfekte edilir. Son adım, akış sitometrisi ile GFP pozitif hücreleri ölçerek HIV pozitif hücreleri tanımlamaktır. Nihayetinde, akış sitometrisi aracılığıyla GFP pozitif hücrelerin yüzdesini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Rev bağımlı vektörün, HIV enfekte hücrelerde terapötik genleri iletebilmesi ve seçici olarak eksprese ederek HIV pozitif hücrelerin öldürülmesini tetikleyebilmesi nedeniyle, bu tekniğin etkileri HIV enfeksiyonu tedavisine kadar uzanmaktadır. Prosedür, laboratuvarımızdan araştırma yardımcı profesörü gi tarafından rev bağımlı lentiviral partiküller üretilerek gösterilecektir. HEK 293T hücreleri; rev bağımlı GFP lentiviral vektörü, HIV-1 paketleme konstrüktü ve VSVG glikoproteinini taşıyan bir plazmid olmak üzere üç plazmid ile transfekte edilir; plazmid transfeksiyonundan bir gün önce, 10 mililitre besiyerine 2 × 10⁶ HEK 293T hücresi ekilir.

100 mm'lik bir Petri kabında, hücreleri 37 °C ve %5 CO₂ ortamında gece boyunca büyütün. Ertesi gün, hücrelerin süpernatantını 5 mL taze besiyeri ile değiştirin.

Ardından hücreleri 37 °C'de, %5 karbondioksit altında dört saat boyunca kültüre etmeye devam edin. Transfeksiyon reaktiflerini dört saatlik inkübasyon süresi dolmadan önce hazırlayın. HEK 293 T hücreleri; 10 µg rev bağımlı GFP lentiviral vektör, 7.5 µg HIV-1 paketleme konstrüktü ve 2.5 µg VSVG glikoproteini oranında üç plazmit ile transfekte edilecektir.

Öncelikle üç plazmit DNA'sını istenen oranda önceden karıştırın. Ardından beş mililitrelik iki polistiren tüp hazırlayın. Birinci tüpe ve ikinci tüpe 480 µL iki katı HBS tamponu ekleyin.

Plazma DNA'ları ve transfeksiyon tamponu içeren toplam 480 µL hacme 60 µL 2 M kalsiyum klorür tamponu ekleyin. Ardından, plazma DNA kalsiyum klorür karışımını, oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilen 2x HPS tüpüne damla damla ekleyin.

Kademeli olarak ince bir çökelek oluşacaktır. Şimdi, karışımın tüm 960 µL'sini damla damla pipet yardımıyla HEK 2 9 3 T hücrelerine ekleyin. 37 °C'de, %5 karbon dioksit ortamında gece boyunca inkübe edin.

Ertesi gün S süpernatantını uzaklaştırın ve 10 mililitre taze besiyeri ekleyin. Hücreleri tekrar 37 °C'de, %5 karbondioksit ortamında gece boyunca inkübe edin. Transfeksiyondan 48 saat sonra, süpernatantı uzaklaştırıp 50 mililitrelik steril bir tüpe aktararak virüsü hasat edin.

Petri kabına 10 mililitre taze besiyeri ekleyin ve bir gece boyunca kültürlemeye devam edin. Virüs süpernatantını dört derece Celsius'ta saklayın. Transfeksiyondan 72 saat sonra, süpernatantı toplayıp daha önce hasat edilen süpernatantla birleştirerek hasat işlemine devam edin.

Ardından, hücre artıklarını çöktürmek ve uzaklaştırmak için S süpernatantını 500 ×g'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, S süpernatantını toplayın ve yeni bir tüpe aktarın. Daha sonra süpernatantı 0,22 µm'lik bir millipore filtreden süzün.

Virüs, viral partikülleri yoğunlaştırmak için bir sonraki adımda gösterilecek olan boyut dışlama kolonu aracılığıyla daha fazla konsantre edilecektir. Viral süpernatantı boyut dışlama kolonuna yükleyin ve 4 °C'de 15 dakika boyunca 6,000 ×g'de santrifüjleyin. Viral titreyi belirlemek için yaklaşık 100 µL'yi ayırarak konsantre viral süpernatantı toplayın.

Geriye kalanı alikotlayın ve -80 °C'de saklayın. Viral titrenin belirlenmesi, bu prosedürün en kritik aşamalarından biridir. Hücrelerin GFP VIR vektörü ile yüksek düzeyde enfekte edilmesi için daha yüksek bir enfeksiyon çoğaltma oranı gereklidir.

Viral titreyi belirlemek amacıyla, akış sitometrisi ile saptanabilir GFP pozitif hücre yüzdesini elde etmek için; TNF ile işlem görmüş HIV V1 pozitif Jerk kedi hücre hattı, viral süpernatant ile enfekte edilecektir. Bu HIV V1 pozitif hücreler kültüre edilir.

96 kuyucuklu bir plakada, toplam 100 µL hacimde mililitrede 2,5 × 10⁵ hücre konsantrasyonunda hazırlayın. HIV-1 pozitif hücreleri enfekte etmek için rev-bağımlı lentiviral partiküllerin altı seri on katlı dilüsyonunu hazırlayın; virüsün her bir seri dilüsyonundan 100 µL'yi hücrelerin bulunduğu her bir kuyucuğa ekleyin. 37 °C'lik bir CO₂ inkübatöründe yedi gün boyunca inkübe edin.

Parçacık titresi, floresan mikroskobu altında GFP pozitif hücrelerin gözlemlenmesiyle tahmin edilir. Hesaplamalar Reid ve MU yöntemine göre yapılır ve titre, GFP pozitif kuyucuklar oluşturabilen dilüsyon noktası olarak belirlenir. Rev bağımlı lentiviral parçacıklarla enfekte edilen kuyucukların %50'sinde, işaret IV için tek bir pozitif hücre saptanmıştır.

Bir insan CD4 T hücresi hattı öncelikle HIV-1 ile enfekte edilecektir. Her enfeksiyon için 2×10⁵ hücre kullanıyoruz. Enfeksiyondan iki saat önce.

Hücrelere, nihai konsantrasyonu 4 µg/mL olacak şekilde poly brain ekleyin. 37 °C'de iki saat boyunca inkube edin. Ardından, HIV çözeltisini beş mililitrelik tüplerden birine damlatarak hücreleri enfekte edin.

Hücrelerin bulunduğu diğer iki tüp enfekte edilmemiştir ve kontrol olarak kullanılacaktır. Tüm hücreleri 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. İki saat sonra, hücreleri 300 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatantı atarak hücre dışı virüsleri yıkayın ve hücreleri 2 × 10⁵ hücre/mL konsantrasyonunda taze besiyerinde resüspande ederek 37 °C'de 48 saat boyunca kültüre edin.

48 saat sonra, HIV enfekte hücreler enfeksiyon için hazır hale gelir. Rev bağımlı lentiviral partiküllerle, kontrol grubu olarak 100 µL lentiviral partikül ile HIV V1 enfekte hücrelere enfeksiyon yapmak için 2 × 10⁵ hücre kullanın; aynı şekilde, HIV V1 enfekte olmamış insan CD4 T hücrelerini de 100 µL lentiviral partikül ile enfekte edin. Hücreleri 37 °C'de gece boyunca inkübe edin ve işlemi ertesi gün sürdürün.

Kullanılmış besiyerini taze besiyeri ile değiştirin ve hücreleri mililitre başına 2x10⁵ hücre konsantrasyonunda yeniden süspande edin. Enfeksiyondan 48 saat sonra, hücreleri santrifüj ile çöktürün ve ardından 500 µL %1 paraformaldehit içerisinde yeniden süspande edin; süspande edilen hücreleri akış sitometrisi analizi için bir akış sitometrisi tüpüne aktarın. Oda sıcaklığında 20 dakikalık inkübasyonun ardından, hücreler GFP pozitifliği için bir FACS scan analizöründe analiz edilebilir.

Deneyler başarıyla gerçekleştirilirse, rev bağımlı lentiviral vektör V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A, yeşil floresan protein GFP ekspresyonunun ölçümü yoluyla canlı hücre popülasyonlarında replike olan HIV'nin oldukça spesifik bir şekilde tespit edilmesini sağlayacaktır. Bu örnekte, hasat edilen C-E-M-S-S hücreleri, mouse CD 24 HSA'ya karşı PE işaretli sıçan monoklonal antikoru ile boyanmış ve ardından burada gösterildiği gibi hem HSA hem de GFP ekspresyonu için bir akış sitometresinde analiz edilmiştir. V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A ile süper enfekte edilmiş HIV 1 enfekte hücrelerinde önemli miktarda bir GFP popülasyonu tespit edilmiştir.

Buna karşılık, ne lentiviral süper enfeksiyon uygulanmamış HIV V one enfekte olmamış C-E-M-S-S hücrelerinde ne de lentiviral süper enfeksiyon uygulanmış HIV one enfekte olmamış hücrelerde GFP pozitif hücreler tespit edilmemiştir. HIV ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken biyogüvenlik düzeyleri gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.