Name: -Cell Hücre makromoleküler Ulaştırma Testi Planta Biyolistik Bombardıman kullanımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-27T17:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Öğrenin, bitki epidermisinde floresan etiketli proteinlerin hücreler arası hareketini konfokal mikroskopi ile nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem, protein dinamiklerini in vivo çalışmak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bizim işimiz, VC NIH / NIGMS, NSF, USDA / NIFA ve BARD hibe tarafından desteklenmektedir.

Arkaplan Bitki hücrelerarası bağlantıları aracılığıyla makromoleküllerin Symplastic ulaşım, plasmodesmata, birçok bitki patologlar ve biyologlar ilgi. Örneğin, bazı viral proteinler, viral hareketi 1-3 etkinleştirmek için plasmodesmal boyut dışlama sınırlarını düzenlemek için bilinmektedir . Ayrıca, önemli gelişim düzenleyiciler arasında bazı endojen proteinler, 4-hücreli olmayan-özerk çalışması için, muhtemelen plasmodesmata aracılığıyla hücreden hücreye geçmek için varsayılır. Bu nedenle, bitki hücreleri arasındaki makromoleküler taşımacılığı tanımlamak ve görselleştirmek için güvenilir bir yöntem çok talep. 1) Hedef bitkiler büyümek Dönüşüm verimliliği yüksek, sağlıklı, sağlam bitkiler kullanılmalıdır. 1. Arabidopsis bitkiler Çevre kontrollü bir odasında kısa bir fotoperiyodun (130-150 μE m -2 s -1 ışık 8 saat 23 ° Grow bir tencerede Pro-Mix BX bir Arabidopsis bitkisi (10 cm x 10 cm x 10 cm ) C/16 saat karanlık 20 ° C) ve 6 ila 8 hafta 5 için% 40-65 bağıl nem. 5 açıklandığı gibi piyasada bulunan ürünleri ile zaman zaman onları Gübreleme . 15 mm x 35 mm (uzunluk ölçümü sapı dahil olmak üzere) daha büyük boyutu ile Yapraklar deneyler için seçilir. 2. N. benthamiana ve N. tabacum Pro-Mix BX bir bitki yetiştirmek uzun bir fotoperiyodun (23 ° C'de 16 saat 130-150 μE m -2 s -1 ışık çevre kontrollü bir odasında bir pot (20 cm x 20 cm x 20 cm ) / 8 karanlık saat 20 ° C) ve 7 ila 10 hafta boyunca% 40-65 bağıl nem. Tarif olarak piyasada bulunan ürünleri ile zaman zaman onları gübreleyin. N. boyutu 50 mm daha büyük x 70 mm ile yaprak N. benthamiana, ya da 100 mm x 125 mm tabacum (bu uzunluk ölçümleri sapı dahil değildir) deneyler için seçilir. 2), DNA-kaplı Altın Gen Tabancası Kartuşu Hazırlık Mikroküreler Bu deneysel bir adım için protokol daha önce 6 ayrıntılı olarak tarif edilmiştir . Yüksek konsantrasyonlarda (~ 1 mcg / ml) Deneyin sonraki aşamalarında konfokal mikroskopi analiz kolaylığı açısından en yüksek dönüşüm verimi elde etmek için iyi arıtılmış plazmid DNA kullanımı çok önemlidir. Bu testte için, floresan sinyal kümesi ile ilişkilendirerek hücrelerinin sayıları symplastic taşıma ölçüde (yani bir göstergesi olarak kullanılması nedeniyle, hazırlanan kartuş, yüksek frekansta aynı anda iki veya daha fazla bitişik hücre dönüşümü yaptığı tespit etmek önemlidir. , çok hücreli sinyal kümesi) hareketi gösterir iken sinyal içeren tek bir hücre, herhangi bir hareketi gösterir. Her bir kartuş kaliteli protein 16-20 saat bombardımanı ifade analiz ederek kontrol edilebilir. Bizim protokol 6 sadece böylece bu deney için uygun olan bu zaman dilimi içinde bütün ifade olaylar &lt;% 3, çok hücreli ifade kümeleri kapasiteli kartuşlar üretir . 3) DNA kaplı Mikroküreler Biyolistik Teslimat <ol><li> Keskin bir jilet ile aynı gelişim aşamasında (yani aynı boyutta ve aynı yaş, adım 1) yaprakları çıkarın ve hemen eksen dışı tarafı yukarı bakacak şekilde, düz bir strafor yüzeye koyun. Yaprak eksen dışı tarafında nispeten küçük boyutu nedeniyle Arabidopsis yaprakları, pencere perde mesh bir parça ile kaplanmış olmalıdır. Alt trikom yoğunluğu ve ince kütikül nedeniyle bombardımanı için daha iyi bir substrat temsil eder ve sonra mesh pushpins ile güvence strafor yüzey. Bakımı düz parçacık teslim verimliliği artırır ve microbombardment sırasında doku hasarı en aza indirir bırakır. </li><li> Tabanca içine DNA kaplı mikro (adım 1 hazırlanan) kartuşu takın. Arabidopsis, çekim, 0.6 mikron mikro 1 mikron mikro ve 140-160 psi için 80-110 psi basınçta yapılır . N. benthamiana ve tütün 0.6 mikron mikro için, çekim 1 mikron mikro ve 160-180 psi 100-120 psi basınçta yapılır. Arabidopsis için her yaprak sadece bir atış mikro 10-12 mm çapında bir alana yayılır için yeterli yüzey alanına sahip olduğundan, genellikle, yaprak başına tek bir kartuş kullanmaktadır. Büyük N. ile benthamiana ve tütün yaprakları, aynı yaprak birden fazla bombardımanları mümkündür, ancak, onlar (Tartışma), aynı gelişimsel aşamada yaprak alanları hedef orta kaburga her iki tarafta simetrik pozisyonlarda yapılması gerekir . </li><li> Strafor yüzey yaprakları çıkarın ve onları i yerdeıslak Whatman filtre kağıdı 3 kat üzerinde bir Petri kabı, Parafilm Petri kabı mühür ve protein ürünleri teslim transgenlerin ve hücre-hücre hareketi potansiyel ifade izin oda sıcaklığında 36-48 saat süreyle inkübe . </li></ol> 4) Görüntüleme Protein Ekspresyonu Geçici olarak ifade etiketli proteinlerin floresan sinyal konfokal mikroskobu ile görüntülenmiştir. Bakım her test protein tespiti için en uygun mikroskopi ayarları bulmak için alınmalıdır. Örneğin, proteinler, Tütün mozaik virüsü hareket protein (TMV MP) 1-3,6 plasmodesmal yerelleştirme gibi zayıf sinyal intensitesi ile sınırlı intrasellüler birikimi, yüksek çözünürlük ve tanıyor 40X objektif lens altında gözlenen olmalıdır hassasiyet, oysa ücretsiz YFP gibi güçlü bir sinyal yoğunlukları, sitoplazmik dağılım gösterir proteinler daha hızlı görüntüleme için konfokal zoom fonksiyonu ile 10X objektif lens (bkz. Şekil 1) altında görüntülenmiştir olabilir. Symplastic ulaşım, floresan sinyal içeren çok hücreli kümeleri görünümünü anlaşılmaktadır. Her küme, kümeler ve hücrelerin sayısı sayısı, hücre-hücre taşıma ölçüde göstergesidir. Güvenilir veri elde etmek için, her bir deneysel sistem başına en az 100 ekspresyonu kümeleri kayıt altına alınmalıdır. Örneğin, bir proteinin hücre-hücre hareketi toplam 200 ifade kümeleri iki farklı genetik geçmişleri (örneğin, vahşi tip ve transgenik bitkiler), karşılaştırıldığında ise kayıt altına alınmalıdır. Önemlisi, deneyler,, birbirlerine göre hangi sonuçları eşzamanlı olarak yürütülen olmalıdır. 5. Temsilcisi Sonuçlar Aşağıdaki şekil, floresan etiketli proteinlerin symplastic ulaşım tespiti için temsili deneyler göstermektedir. Paneller A ve B bir N. aşağıdaki microbombardment elde edilen tipik konfokal resimleri gösterir. TMV MP-YFP-ifade benthamiana yaprak oluşturun. Panelinde TMV MP-YFP symplastic hareket YFP sinyal çok hücreli kümeleri görünümünü dayalı görülmektedir. Tüm geçici olarak ifade TMV MP-YFP bazı microbombardments (panel B) tek hücreli sinyal kanıtladığı gibi hareket etmek mümkün değildir. İstatistiksel olarak, içinde &lt;% 40 sayılır sinyal kümeleri, TMV MP-YFP ise hücreler arasında hareket edemez&gt; kümelerin% 60, protein, iki hücre yayılmasını en sık olmak üzere, 2-5 hücreler arasında hareket eder (yaklaşık ~ 50 Olguların%) (Şekil 1C). Doğuştan hareket aktivite olmadan, nispeten küçük moleküler boyutu ile proteinlerin hücre-hücre taşımak için PD yoluyla diffüz. Örneğin, ücretsiz YFP veya 1xYFP (yaklaşık 27 kDa, panel D) sayılır kümeleri (panel C)% 30 çeşitli hücreler arasında yayılır. Bu non-spesifik difüzyon TMV MP-YFP füzyon proteini (57 kDa) boyutu karşılaştırılabilir ve tamamen hücre özerk olduğu bir translasyonel YFP sönük veya 2xYFP (54 kDa, panel E) oluşmaz (Şekil 1C). <img src="/files/ftp_upload/2208/2208fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> N. symplastic taşıma testte elde edilen Şekil 1. Tipik sonuçlar benthamiana yaprak dokuları. (A, B) Görselleştirme TMV MP-YFP. (C) sinyal kümeleri kantitasyonu. 1xYFP ve 2xYFP, ücretsiz YFP ve sırasıyla translasyonel YFP dimer. (D) 1xYFP Görselleştirme. (E) 2xYFP Görselleştirme. Mikrograflar, sol paneller YFP sinyal göstermiyor ve sağ panelleri birleştirilmiş YFP görüntüleri (yeşil) ve kloroplast otofloresans (beyaz) sinyalleri gösteriyor. Görüntüler tek konfokal bölümleridir. Mikrograflar Asteriskler YFP sinyali gösteren epidermal hücreler göstermektedir. Barlar = 50 mm.

<ol><li>Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ins+and+outs+of+non-destructive+cell-to-cell+and+systemic+movement+of+plant+viruses.+%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">The ins and outs of non-destructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. </a> Crit Rev Plant Sci. 23, 195-250 (2004).</li>
<li>Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+viral+movement+proteins%3A+agents+for+cell-to-cell+trafficking+of+viral+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Plant viral movement proteins: agents for cell-to-cell trafficking of viral genomes.</a> Virology. 344, 169-184 (2006).</li>
<li>Epel, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+viruses+spread+by+diffusion+on+ER-associated+movement-protein-rafts+through+plasmodesmata+gated+by+viral+induced+host+beta-1%2C3-glucanases%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Plant viruses spread by diffusion on ER-associated movement-protein-rafts through plasmodesmata gated by viral induced host beta-1,3-glucanases.</a> Semin Cell Dev Biol. 20, 1074-1081 (2009).</li>
<li>Zambryski, P. C., Crawford, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata%3A+gatekeepers+for+cell-to-cell+transport+of+developmental+signals+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata: gatekeepers for cell-to-cell transport of developmental signals in plants.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 393-421 (2000).</li>
<li>Rivero-Lepinckas, L., Crist, D., Scholl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+plants+and+presercation+of+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth of plants and presercation of seeds.</a> Methods Mol Biol. 323, 3-12 (2006).</li>
<li>Ueki, S., Lacroix, B., Krichevsky, A., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+transient+genetic+transformation+of+Arabidopsis+leaves+by+biolistic+bombardment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Functional transient genetic transformation of Arabidopsis leaves by biolistic bombardment.</a> Nat Protoc. 4, 71-77 (2009).</li>
<li>Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple%2C+but+not+branched%2C+plasmodesmata+allow+the+nonspecific+trafficking+of+proteins+in+developing+tobacco+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Simple, but not branched, plasmodesmata allow the nonspecific trafficking of proteins in developing tobacco leaves.</a> Cell. 97, 743-754 (1999).</li>
<li>Imlau, A., Truernit, E., Sauer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+and+long-distance+trafficking+of+the+green+fluorescent+protein+in+the+phloem+and+symplastic+unloading+of+the+protein+into+sink+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell and long-distance trafficking of the green fluorescent protein in the phloem and symplastic unloading of the protein into sink tissues.</a> Plant Cell. 11, 309-322 (1999).</li>
<li>Gisel, A., Barella, S., Hempel, F. D., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+regulation+of+symplastic+trafficking+during+development+in+Arabidopsis+thaliana+apices%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial regulation of symplastic trafficking during development in Arabidopsis thaliana apices.</a> Development. 126, 1879-1889 (1999).</li>
<li>Kim, I., Cho, E., Crawford, K. M., Hempel, F. D., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+movement+of+GFP+during+embryogenesis+and+early+seedling+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell movement of GFP during embryogenesis and early seedling development in Arabidopsis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 102, 2227-2231 (2005).</li>
<li>Crawford, K. M., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-targeted+and+targeted+protein+movement+through+plasmodesmata+in+leaves+in+different+developmental+and+physiological+states%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Non-targeted and targeted protein movement through plasmodesmata in leaves in different developmental and physiological states.</a> Plant Physiol. 125, 1802-1812 (2001).</li>
<li>Roberts, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+unloading+in+sink+leaves+of+Nicotiana+benthamiana%3A+comparison+of+a+fluorescent+solute+with+a+fluorescent+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Phloem unloading in sink leaves of Nicotiana benthamiana: comparison of a fluorescent solute with a fluorescent virus.</a> Plant Cell. 9, 1381-1396 (1997).</li>
<li>Guenoune-Gelbart, D., Elbaum, M., Sagi, G., Levy, A., Epel, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+mosaic+virus+%28TMV%29+replicase+and+movement+protein+function+synergistically+in+facilitating+TMV+spread+by+lateral+diffusion+in+the+plasmodesmal+desmotubule+of+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Tobacco mosaic virus (TMV) replicase and movement protein function synergistically in facilitating TMV spread by lateral diffusion in the plasmodesmal desmotubule of Nicotiana benthamiana.</a> Mol Plant Microbe Interact. 21, 335-345 (2008).</li>
</ol>

Symplastic taşıma testinin başarı için anahtar, yüksek dönüşüm verimliliği, istatistiksel olarak anlamlı ve kolayca detectible sinyal kümeleri üretimini sağlar elde etmektir. Bu, sağlıklı, sağlam bitkiler hasat yapraklar kullanılarak, saf ve yoğun bir DNA hazırlığı ile kaplı altın parçacıkları hazırlanması sağlanabilir. Aynı büyüme aşamasında yaprakları kullanarak da testin güvenilirliği için hayati önem taşımaktadır. Plasmodesmal diyafram farklı doku 7-11 gelişim aşamasına bağlı ...

<table><tbody><tr><td>Altın mikropartiküller, 1,0 &amp;mu;m çapında</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2262</td><td></td></tr><tr><td>Altın mikropartiküller, 0,6 &amp;mu;m çapında</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2263</td><td></td></tr><tr><td>Spermidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0266-1G</td><td></td></tr><tr><td>Tefzel tüp</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2441</td><td></td></tr><tr><td>Helios kartuş hazırlama istasyonu</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2420</td><td></td></tr><tr><td>Tüp kesici</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2422</td><td></td></tr><tr><td>Helios gen tabancası</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2432</td><td></td></tr><tr><td>Helyum gaz regülatörü</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2413</td><td></td></tr></tbody></table>

-cell hücre makromoleküler ulaştırma testi planta biyolistik bombardıman kullanımı

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

Burada, planta içinde hücre-hücre makromoleküler taşıma kapsamını tespit etmek ve değerlendirmek için basit ve hızlı bir protokol mevcut. Bu protokol, geçici bir ilgi floresan etiketli protein kodlama DNA Biyolistik teslim inşa aşağıdaki bitki doku ifade edilir. Etiketli protein içi ve hücreler arası dağılımı sonra konfokal mikroskobu ile analiz edilir. Biz detaylı olarak tahlil için adım adım protokoller sağlayarak, bu teknoloji tanımlayan ve üç bitki türlerinin symplastic protein taşıma ölçüde, Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana ve N. değerlendirmek tabacum (tütün).

Bitki hücreleri arasındaki makromoleküler ticareti, geçici bir ilgi floresan etiketli protein ifade ve konfokal mikroskobu ile içi ve hücreler arası dağılımı analiz değerlendirilebilir.

-Cell Hücre makromoleküler Ulaştırma Testi Planta Biyolistik Bombardıman kullanımı

Burada, in planta hücreden hücreye makromoleküler taşınımı saptamak ve kapsamını değerlendirmek için basit ve hızlı bir protokol sunuyoruz. Bu protokolde, bir ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bitki epidermisindeki floresan işaretli proteinin hücreden hücreye hareket düzeyini analiz etmektir. Bu, ilgilenilen füzyon proteinini bitki epidermisinde geçici olarak eksprese etmek için DNA kaplı altın partiküller elde edilerek gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, test edilen füzyon proteininin ekspresyonuna ve hareketine olanak tanıyan DNA, bitki epidermis replicatedine iletilir.Ardından, floresan işaretli test proteinlerinin ekspresyonunu ve lokalizasyonunu izlemek amacıyla, eksprese edilen füzyon proteini konfokal mikroskop altında gözlemlenir. Konfokal mikroskopi ile floresan sinyalinin dağılımının analizi sonucunda, floresan işaretli proteinin hücreden hücreye taşınma düzeyini gösteren sonuçlar elde edilir. Merhaba, ben New York Eyalet Üniversitesi Stony Brook kampüsü, Biyokimya ve Hücre Biyolojisi Bölümü'ndeki KY laboratuvarından Ben Myers.Bugün size, bitki epidermisindeki hücreden hücreye hareketin veya floresan işaretli proteinlerin yayılım düzeyinin analizine yönelik bir prosedürü göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda, çeşitli bitki arka planlarında bitki viral hareket proteinlerinin hücreden hücreye taşınımını incelemek ve farklı protein türlerinin hücreler arası hareketliliğini karşılaştırmak için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.Bu protokole başlamak için, bir arabidopsis bitkisini Promix bx üzerinde yetiştirin. Uygun büyüklükte bir saksıda, nicotiana hamana ve nicotiana tobacco bitkileri için kısa fotoperiyoda ve %40 ila %65 bağıl neme sahip, çevresel olarak kontrollü bir oda kullanın; her bir bitkiyi daha büyük bir saksıda Promix BX üzerinde yetiştirin. Tekrar olarak, uzun fotoperiyoda ve %40 ila %65 bağıl neme sahip çevresel kontrollü bir oda sağlayın.Bitkiyi, daha önce açıklandığı şekilde, piyasada bulunan ticari ürünlerle ara ara gübreleyin. Opsis bitkisini altı ila sekiz hafta boyunca büyüttükten sonra, deney için boyutları 15 mm x 35 mm'den büyük yapraklar seçin; burada uzunluk ölçümüne peole dahildir. n benanna ve NAC bitkileri için bitkileri yedi ila 10 hafta boyunca büyütün. Ardından, end benanna için 50 mm x 70 mm'den, nac için ise 100 mm x 125 mm'den daha büyük yapraklar seçin.Bu durumlarda, uzunluk ölçümleri peolleri içermez. DNA kaplı mikropartiküllerin BIC ile iletimi başlamadan önce, DNA kaplı altın mikropartiküller içeren gen tabancası kartuşunu daha önce ayrıntılı olarak açıklandığı şekilde hazırlayın. Ardından, aynı gelişim aşamasındaki yaprakları keskin bir jiletle çıkarın ve AAL tarafları yukarı bakacak şekilde hemen düz bir strafor yüzeye yerleştirin.Yaprağın ABA tarafı, daha düşük trikom yoğunluğu ve daha ince kütikül yapısı nedeniyle bombardıman için daha uygun bir substrattır. Rapid opsis gibi küçük yapraklar, bir parça pencere sineklik teli ile örtülüp telin strafor yüzeye raptiyelerle sabitlenmesiyle immobilize edilebilir. Parçacık iletim verimliliğini artırmak ve mikro bombardıman sırasında doku hasarını en aza indirmek için yaprakları düz tutun.Ardından DNA kaplı mikropartiküllerin bulunduğu kartuşu tabancaya yerleştirin. Tavşan opsisi için, 0.6 mikron mikropartiküllerle 140 ile 160 PSI basınçlarda atış işlemini gerçekleştirin.Mikropartikülleri 10 ila 12 milimetre çapındaki bir yüzey alanına yaymak için yaprak başına bir kartuş kullanarak örneği bombardımana tutun. end benanna ve end baum için. Daha büyük end benanna ve end tobacco yaprakları ile 0.6 mikron mikropartiküller için atışı 160 ila 180 PSI basınçlarda gerçekleştirin.Aynı yaprağa birden fazla bombardıman uygulanması mümkündür; ancak, yaprağın aynı gelişim evresindeki bölgelerini hedeflemek için bu işlemler ana damarın her iki yanındaki simetrik konumlarda gerçekleştirilmelidir. Geçici olarak ifade edilen etiketli proteinlerin floresan sinyali konfokal mikroskopi ile görüntülenir. Test edilen her bir proteinin tespiti için optimal mikroskopi ayarlarının belirlenmesine özen gösterilmelidir.Tütün mozaik virüsü plazma desal lokalizasyonu, hareket proteini veya T-M-V-M-P gibi zayıf sinyal yoğunlukları ile sınırlı hücre içi birikim gösteren proteinleri gözlemlemek için 40 x objektif lens kullanın. Bu, daha yüksek çözünürlük ve artırılmış hassasiyet sağlar. Bununla birlikte, serbest sarı floresan protein veya YFP gibi güçlü sinyal yoğunlukları ile sitoplazmik dağılım gösteren proteinlerin daha hızlı görüntülenmesi için konfokal zoom fonksiyonuna sahip 10 x objektif lens kullanılabilir. Basit taşıma, floresan sinyali içeren çok hücreli kümelerin görünümünden çıkarılır.Bu tür kümelerin sayısı ve her kümedeki hücre sayısı, hücreden hücreye transportun kapsamını göstermektedir. Güvenilir veriler elde etmek için deneysel sistem başına en az 100 ekspresyon kümesi kaydedin ve deneyleri eş zamanlı olarak gerçekleştirmeye özen gösterin.Karşılaştırmalar yapıldığında, burada floresan işaretli proteinlerin basit transportu tespit edilmiştir. A TMV mp YFP ekspres eden bir konstrükt ile end hamana yaprağına mikro bombardıman uygulanmasının ardından elde edilen tipik konfokal görüntüler gösterilmektedir.TMV MP YFP'nin basit hareketi, YFP sinyalinin çok hücreli kümeler şeklinde görünmesiyle gözlemlenir. Ancak, bazı mikro bombardımanlarda tek hücreli sinyallerin görülmesi, geçici olarak eksprese edilen tüm TMV MP YFP'lerin hareket edebildiğini kanıtlamamaktadır.İstatistiki olarak, sayılan sinyal kümelerinin %40'ından daha azında TMV MP YFP hücreler arasında hareket edemez. Öte yandan kümelerin %60'ından fazlasında protein, iki ile beş hücre arasında hareket eder. İki hücrelik yayılımın en sık görülen durum olmasıyla birlikte, doğuştan hareket aktivitesi olmayan nispeten küçük moleküler boyutlu proteinler, hücreden hücreye geçmek için plazma SMA üzerinden difüze olabilir.Örneğin, serbest YFP veya tek bir XYFP, birkaç hücre arasında ve sayılan kümelerin %30'undan fazlasına yayılır. Buna karşılık, TMV MP YFP füzyon proteini ile benzer boyutta olan ve tamamen hücreye özgü olan translasyonel YFP dimerleri veya iki XYFP için bu spesifik olmayan difüzyon gerçekleşmez. Bitki epidermisinde bir gen tabancası sistemi aracılığıyla geçici ekspresyon kullanarak, floresan işaretli proteinlerin hücreden hücreye hareketinin nasıl analiz edileceğini göstermiş olduk.Bu prosedür uygulanırken; sağlıklı ve güçlü bitkilerin hazırlanması, DNA iletimi için yüksek kaliteli DNA kaplı altın partiküllerin kullanılması ve istatistiksel olarak güvenilir sonuçlar elde etmek için yeterli sayıda ekspresyon kümesinin analiz edilmesi önemlidir. Şimdilik bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

a-cell-to-cell-macromolecular-transport-assay-planta-utilizing

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz bitki protein-protein etkileşimleri test etmek için bir teknik geliştirdik. Sarı floresan protein (YFP) örtüşmeyen iki parça halinde bölünmüş durumda. Her parçası füzyon proteinleri ifade sağlayan, Gateway sistemi üzerinden ilgi bir gen-frame klonlanmış. YFP sinyal Sulandırma sadece tahkikat proteinler etkileşime girdiğinde oluşur.

Ağ Geçidi Uyumlu Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) kullanarak Bitki Protein Etkileşimleri Tespiti

Biz endomembran kopma izleme için bir yöntem açıklanmaktadır, hücre içi bakteri tarafından ortaya...

Vakuolar Kopma Tek Hücre ölçümleri Hücre içi patojenlerin neden

Hedeflenen protein yıkımı, hücre fonksiyonu için önemli bir düzenleyici mekanizmasını temsil eder. Daha sonra, 26S proteazomu için moleküler "etiketleri" hizmet hedef proteine ​​bağlanan bir Poliübikütin zincirleri korunmuş ubikitin-proteazom süreci yoluyla gerçekleşir. Burada, proteinlerin proteozomal indirgenmesi için basit ve güvenilir bir hücre içermeyen tahlili tarif eder.

Bitkilerde bir Cell-serbest Sistemde proteozomal indirgenme Assaying

In vivo protein komplekslerinin oluşumu bimoleküler floresan tamamlanmasıyla görselleştirilebilir. Etkileşim ortakları floresan etiketler tamamlayıcı bölümlerine bağlı ve geçici olarak tütün yaprakları olarak ifade edilen iki protein arasında yakın üzerine yeniden flüoresan sinyal elde edilir.

Tütün protoplastlarında ve Yapraklar Bimoleküler Floresan tamamlama tarafından Visualized protein-protein etkileşimleri

Patojen büyümesinin niceliksel olarak belirlenmesi, çeşitli Arabidopsis thaliana (bundan böyle Arabidopsis olarak anılacaktır) bağışıklık tepkilerini karakterize etmek için güçlü bir araçtır. Burada açıklanan yöntem, Pseudomonas syringae pv'yi ölçmek için optimize edilmiş bir şırınga infiltrasyon testi sunar. maculicola ES4326 yetişkin Arabidopsis yapraklarında büyüme.

Kullanarak Bitki Savunma Yanıtları ince Karakterizasyonu için Bakteriyel Yaprak Sızma Deneyi<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

Hücre altı düzeyde, sinyal olayları gelişimsel ve çevresel ipuçları tarafından dinamik olarak modüle edilir. Burada, dinamik protein-protein etkileşimini izlemek ve bitki hücrelerinde sinyal iletiminin uzamsal organizasyonunu açıklamak için tütün geçici ekspresyon sistemini kullanan bir protokolü açıklıyoruz.

Tütün Geçici İfade Sisteminin Kullanılması bir MAPK sinyal yolu Mekansal Reorganizasyon Görüntüleme

Bitkilerin modifikasyonu için mevcut yöntemlerin uygulanabilirliği sınırlıdır. Burada önerilen yeni peptit türevi teknoloji, eksojen protein veya genlerin bozulmamış bitkilerin istenen hücre içi bölmelerine sokulmasında hem basitlik hem de verimlilik vaat ediyor.

Peptit kaynaklı Yöntem Bitkiler Genler ve Proteinler Hücresel karşısında ve Organel Engeller Transport

Bitki hücreler arası bağlantıları, plasmodesmata (Pd), Fizyoloji ve bitki-virüs etkileşimleri bitki merkezi rol oynarlar. Kritik Pd taşıma olarak proteinler Pd için doğrudan sinyalleri sıralama. Ancak, bu DNA dizileri hakkında bilgimizi henüz emekleme aşamasında olduğunu. Pd yerelleştirme sinyalleri Pd hedeflenmiş proteinler tanımlamak için bir strateji tanımlarlar.

Proteinlerin içinde Planta serilerinde Plasmodesmal yerelleştirme tanımlaması

Gelişmiş bir iletişim kuralı muhabir yapıları arpa aleurone hücrelerdeki geçici gen ifadeden sonra partikül bombardımanı ölçümü için sunulmaktadır. Otomatik tahıl 96-şey plaka enzim deneyleri ile bileme yordamı için yüksek üretilen iş sağlar.

Gen ifadesinin artan işlem hacmi ile alı arpa Aleurone katmanlarında ölçme

Birden çok chimeric floresan füzyon protein geleneksel yöntemlerle zorlukları aşmak tesislerinde ortak ifade etmek için yeni bir yöntem geliştirdik. Kaset protein ortak ifade ulaşmak için ifade birden çok fonksiyonel olarak bağımsız protein içeren bir tek ifade plazmid kullanarak yararlanır.

Bitkilerde etkin bir şekilde birden fazla Chimeric floresan Fusion proteinlerin ortak ifade

Bu protokol, aynı örnekte bitki iyon sızıntısı, peroksidaz aktivitesi ve kallos üretimini değerlendirmek için yüksek verimli bir yaklaşımı tanımlar.

Mikrobiyal İkincil Metabolitlere Yaprak Yanıtlarının Yüksek Verimlilikli Bir Formatla Değerlendirilmesi

Öğrenin, bitki epidermisinde floresan etiketli proteinlerin hücreler arası hareketini konfokal mikroskopi ile nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem, protein dinamiklerini in vivo çalışmak için kullanılır.

-Cell Hücre makromoleküler Ulaştırma Testi Planta Biyolistik Bombardıman kullanımı

Daha fazla video keşfet