-Cell Hücre makromoleküler Ulaştırma Testi Planta Biyolistik Bombardıman kullanımı

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bitki epidermisindeki floresan işaretli proteinin hücreden hücreye hareket düzeyini analiz etmektir. Bu, ilgilenilen füzyon proteinini bitki epidermisinde geçici olarak eksprese etmek için DNA kaplı altın partiküller elde edilerek gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, test edilen füzyon proteininin ekspresyonuna ve hareketine olanak tanıyan DNA, bitki epidermis replicatedine iletilir.

Ardından, floresan işaretli test proteinlerinin ekspresyonunu ve lokalizasyonunu izlemek amacıyla, eksprese edilen füzyon proteini konfokal mikroskop altında gözlemlenir. Konfokal mikroskopi ile floresan sinyalinin dağılımının analizi sonucunda, floresan işaretli proteinin hücreden hücreye taşınma düzeyini gösteren sonuçlar elde edilir. Merhaba, ben New York Eyalet Üniversitesi Stony Brook kampüsü, Biyokimya ve Hücre Biyolojisi Bölümü'ndeki KY laboratuvarından Ben Myers.

Bugün size, bitki epidermisindeki hücreden hücreye hareketin veya floresan işaretli proteinlerin yayılım düzeyinin analizine yönelik bir prosedürü göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda, çeşitli bitki arka planlarında bitki viral hareket proteinlerinin hücreden hücreye taşınımını incelemek ve farklı protein türlerinin hücreler arası hareketliliğini karşılaştırmak için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Bu protokole başlamak için, bir arabidopsis bitkisini Promix bx üzerinde yetiştirin. Uygun büyüklükte bir saksıda, nicotiana hamana ve nicotiana tobacco bitkileri için kısa fotoperiyoda ve %40 ila %65 bağıl neme sahip, çevresel olarak kontrollü bir oda kullanın; her bir bitkiyi daha büyük bir saksıda Promix BX üzerinde yetiştirin. Tekrar olarak, uzun fotoperiyoda ve %40 ila %65 bağıl neme sahip çevresel kontrollü bir oda sağlayın.

Bitkiyi, daha önce açıklandığı şekilde, piyasada bulunan ticari ürünlerle ara ara gübreleyin. Opsis bitkisini altı ila sekiz hafta boyunca büyüttükten sonra, deney için boyutları 15 mm x 35 mm'den büyük yapraklar seçin; burada uzunluk ölçümüne peole dahildir. n benanna ve NAC bitkileri için bitkileri yedi ila 10 hafta boyunca büyütün. Ardından, end benanna için 50 mm x 70 mm'den, nac için ise 100 mm x 125 mm'den daha büyük yapraklar seçin.

Bu durumlarda, uzunluk ölçümleri peolleri içermez. DNA kaplı mikropartiküllerin BIC ile iletimi başlamadan önce, DNA kaplı altın mikropartiküller içeren gen tabancası kartuşunu daha önce ayrıntılı olarak açıklandığı şekilde hazırlayın. Ardından, aynı gelişim aşamasındaki yaprakları keskin bir jiletle çıkarın ve AAL tarafları yukarı bakacak şekilde hemen düz bir strafor yüzeye yerleştirin.

Yaprağın ABA tarafı, daha düşük trikom yoğunluğu ve daha ince kütikül yapısı nedeniyle bombardıman için daha uygun bir substrattır. Rapid opsis gibi küçük yapraklar, bir parça pencere sineklik teli ile örtülüp telin strafor yüzeye raptiyelerle sabitlenmesiyle immobilize edilebilir. Parçacık iletim verimliliğini artırmak ve mikro bombardıman sırasında doku hasarını en aza indirmek için yaprakları düz tutun.

Ardından DNA kaplı mikropartiküllerin bulunduğu kartuşu tabancaya yerleştirin. Tavşan opsisi için, 0.6 mikron mikropartiküllerle 140 ile 160 PSI basınçlarda atış işlemini gerçekleştirin.

Mikropartikülleri 10 ila 12 milimetre çapındaki bir yüzey alanına yaymak için yaprak başına bir kartuş kullanarak örneği bombardımana tutun. end benanna ve end baum için. Daha büyük end benanna ve end tobacco yaprakları ile 0.6 mikron mikropartiküller için atışı 160 ila 180 PSI basınçlarda gerçekleştirin.

Aynı yaprağa birden fazla bombardıman uygulanması mümkündür; ancak, yaprağın aynı gelişim evresindeki bölgelerini hedeflemek için bu işlemler ana damarın her iki yanındaki simetrik konumlarda gerçekleştirilmelidir. Geçici olarak ifade edilen etiketli proteinlerin floresan sinyali konfokal mikroskopi ile görüntülenir. Test edilen her bir proteinin tespiti için optimal mikroskopi ayarlarının belirlenmesine özen gösterilmelidir.

Tütün mozaik virüsü plazma desal lokalizasyonu, hareket proteini veya T-M-V-M-P gibi zayıf sinyal yoğunlukları ile sınırlı hücre içi birikim gösteren proteinleri gözlemlemek için 40 x objektif lens kullanın. Bu, daha yüksek çözünürlük ve artırılmış hassasiyet sağlar. Bununla birlikte, serbest sarı floresan protein veya YFP gibi güçlü sinyal yoğunlukları ile sitoplazmik dağılım gösteren proteinlerin daha hızlı görüntülenmesi için konfokal zoom fonksiyonuna sahip 10 x objektif lens kullanılabilir. Basit taşıma, floresan sinyali içeren çok hücreli kümelerin görünümünden çıkarılır.

Bu tür kümelerin sayısı ve her kümedeki hücre sayısı, hücreden hücreye transportun kapsamını göstermektedir. Güvenilir veriler elde etmek için deneysel sistem başına en az 100 ekspresyon kümesi kaydedin ve deneyleri eş zamanlı olarak gerçekleştirmeye özen gösterin.

Karşılaştırmalar yapıldığında, burada floresan işaretli proteinlerin basit transportu tespit edilmiştir. A TMV mp YFP ekspres eden bir konstrükt ile end hamana yaprağına mikro bombardıman uygulanmasının ardından elde edilen tipik konfokal görüntüler gösterilmektedir.

TMV MP YFP'nin basit hareketi, YFP sinyalinin çok hücreli kümeler şeklinde görünmesiyle gözlemlenir. Ancak, bazı mikro bombardımanlarda tek hücreli sinyallerin görülmesi, geçici olarak eksprese edilen tüm TMV MP YFP'lerin hareket edebildiğini kanıtlamamaktadır.

İstatistiki olarak, sayılan sinyal kümelerinin %40'ından daha azında TMV MP YFP hücreler arasında hareket edemez. Öte yandan kümelerin %60'ından fazlasında protein, iki ile beş hücre arasında hareket eder. İki hücrelik yayılımın en sık görülen durum olmasıyla birlikte, doğuştan hareket aktivitesi olmayan nispeten küçük moleküler boyutlu proteinler, hücreden hücreye geçmek için plazma SMA üzerinden difüze olabilir.

Örneğin, serbest YFP veya tek bir XYFP, birkaç hücre arasında ve sayılan kümelerin %30'undan fazlasına yayılır. Buna karşılık, TMV MP YFP füzyon proteini ile benzer boyutta olan ve tamamen hücreye özgü olan translasyonel YFP dimerleri veya iki XYFP için bu spesifik olmayan difüzyon gerçekleşmez. Bitki epidermisinde bir gen tabancası sistemi aracılığıyla geçici ekspresyon kullanarak, floresan işaretli proteinlerin hücreden hücreye hareketinin nasıl analiz edileceğini göstermiş olduk.

Bu prosedür uygulanırken; sağlıklı ve güçlü bitkilerin hazırlanması, DNA iletimi için yüksek kaliteli DNA kaplı altın partiküllerin kullanılması ve istatistiksel olarak güvenilir sonuçlar elde etmek için yeterli sayıda ekspresyon kümesinin analiz edilmesi önemlidir. Şimdilik bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.