Name: Fare Göz Retina Kök Hücre İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-11T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Keşfedin fare gözünden retina kök hücre izolasyonunu ve kültürde klonal küre oluşturmayı. Bu yöntem, kök hücre özelliklerini incelemek ve retina hastalıkları için rejeneratif tedaviler geliştirmek amacıyla kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Laura Clarke, Biz onu paha biçilmez bir yardım için teşekkür ederim. Kök Hücre Ağı, CIHR ve NIH: Bu çalışma NCE tarafından desteklenmektedir.

1. Diseksiyon Çözümleri ve Enzim Çözümleri hazırlayın <ol><li> Yapay Beyin Omurilik Sıvısı (ACSF) ve vaktinden önce Serum Medya olun ve buzdolabına kaldırın. </li><li> Kynurenic Asit (0.2 mg / ml) tartılır ve kolayca çözülür olmadığından vaktinden 37 ° C su banyosunda 10 ml hilo ACSF içinde çözülür. </li><li> Tripsin (1.33 mg / ml) ve Hyaluronidase (0.67 mg / ml) ve 15 ml tüp içinde yer tartılır ve gerektiği kadar -20 ° C'de tutmak. Bu tüp Kynurenic asit çözeltisi ekleyin ve kullanımdan hemen önce 22 mikron şırınga filtre kullanarak filtre. </li><li> Tripsin inhibitörü tartılır (Ovamucoid: 1 mg / ml) ve ılık serum serbest Medya ve 22μm şırınga filtre kullanarak filtre içinde çözülür. </li><li> FGF2 (10 ng / ml) ve heparin (2 mcg / ml) içeren serum serbest Medya: kaplama medya olun. </li></ol> 2. Fare Göz Retina Kök Hücreler Yalıtımlı <ol><li> Retina kök hücre izolasyonu, primer kültür deneyler adanmış bir özel steril oda yapılır. Bu yordama başlamadan önce, diseksiyon mikroskobu ve soğuk ışık kaynağı kurmak ve daha sonra steril diseksiyon aletleri yatıyordu. Her kaput adımlar arasındaki aletleri sterilize etmek için sıcak bir boncuk sterilizatör vardır. </li><li> Biz, kendi çıkarılmasından sonra onaylanmış hayvan etik protokolleri göre kurban fareler Yapay Beyin Omurilik Sıvısı (ACSF) içeren bir steril Petri kabı hemen konuldu gözleri retina kök hücreleri izole olacak. </li><li> Diseksiyon mikroskobu altında, forseps ile göz temiz saç ve kornea / skleral sınır bağlı bağ dokusu kurtulmak. Daha sonra ACSF yeni bir çanak göz aktarın. </li><li> Nazikçe göz dişli forseps ile sabit tutarken, göz kasları kaldırmak için açılı mikro diseksiyon makas kullanın. Yine de göz bağlıysa aynı zamanda optik sinir çıkarın. Bu işlem sırasında göz ezmek için değil deneyin. ACSF yeni bir çanak gözleri aktarın. </li><li> Sonraki kullanım kavisli mikro diseksiyon makas göz yarısında kesmek için: optik sinir başlar ve korneanın orta kesti, arka kesim başlatılan optik sinir toplantı. Bu bir sonraki adıma daha kolay yapacaktır, çünkü iki adet göz boyutu kabaca eşdeğer idealdir. </li><li> , Iki göz kabuğu hafifçe, iki forseps kullanarak kornealar Holding dışında yarıya indirir. Çıkarın ve objektif, iç organları, göz kabukları nöral retina atın. ACSF yeni bir yemek kabukları aktarın. </li><li> Şimdi siliyer epitel izole etmek için hazırız. Başlamak için, yönlendirmek göz kabuk, sağ ve Retina Pigmente epiteli (RPE) kornea olduğunu solda. Göz kabuğu RPE tarafında düz forseps ile yavaşça aşağı pin. </li><li> Sonra, yavaşça neşter aşağı iterek yerine kesme hareketleri kullanarak, gözün silier epitel uzak kornea ve iris kesmek için bir neşter kullanabilirsiniz. </li><li> Bundan sonra, RPE uzak siliyer epitel kesti. Non-dişli forseps ACSF içeren yeni bir 35 mm çanak siliyer epitelin şerit aktarmak için kullanın. </li><li> Aynı şekilde, diğer göz kabuk siliyer epitel izole eder. </li><li> Hem siliyer epitel şeritler toplanan edildikten sonra, 2 mL Dispase içeren 35 mm çanak içine şeritler aktarın. 10 dakika boyunca 37 ° C inkübatör şeritler ile çanak yerleştirin. </li><li> 10 dakika sonra 2 mL süzülmüş tripsin, Hyaluronidase ve Kynurenic Asit içeren bir çanak içine Dispase şeritler aktarın. 37 çanak yerleştirin ° C 10 dakika. </li><li> Şimdi diseksiyon mikroskobu dönmek. Sklerasına düz forseps ile basılı tutarak, yavaşça sklerasına uzak siliyer epitel kazımak için kavisli olmayan dişli forseps alt kullanın. </li><li> Çanak sklerasına çıkarın. Şimdi çanak bırakılması gerektiğini, ilgi ve enzim çözüm hücrelerdir. </li><li> Bir yangın cilalı pamuk takılı pipet kullanarak bu çözüm, 14 ml'lik bir tüp içine aktarın. Bu çözüm 30 kez Karışım pipet içinde ve dışında çözüm hafifçe zorlayarak epitel hücreleri parçalayın. </li><li> 1500 RPM az 5 dakika boyunca tüp santrifüjleyin. Hücrelerin bu aşamada tüp alt kapalı geliyor eğilimli olduğundan santrifüj yapıldığında, dikkatli bir şekilde santrifüj tüp kaldırmak. </li><li> Yangın cilalı bir pipet kullanarak süpernatantı çoğunluğu yavaşça aspire ve sonra tripsin inhibitörü 1 ml serum serbest Medya hücrelere ekleyin. Bir tek hücre süspansiyonu kadar yaklaşık 50 kez numune çiğnemek için küçük bir kuyu içi pamuk takılı pipet kullanın. </li><li> 1500 RPM az 5 dakika için tekrar tüp santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı ve kaplama orta 1 ml ile değiştirin. Hücrelerin tekrar süspansiyon yangın parlatılmış cam pipet kullanarak hafifçe Karışım. </li><li> Sayımından sonrahücreleri, plaka, 24 plaka istenilen yoğunlukta ing. Biz genellikle plaka 10 hücre / orta her iyi ilk dolum ve ardından hücre süspansiyonu eklenerek son hacim 500 mcL medya almak için mcL. </li><li> 7 gün sonra ortaya çıkan küre sayısı kadar hareket ettirilebilir, 37 ° C CO 2 inkübatör plaka koyun. </li></ol> 3. Retina Kök Hücreler görme Sonuçları <ol><li> Bu işlemi başarıyla yapıldığında, düşük yoğunluklu (Şekil 1) ayrışmış ve kaplama edildikten sonra disseke siliyer epitel hücreleri böyle bakmak gerekir. </li><li> Kültür 7 gün sonra, ortaya çıkan retina kök hücre küre sayılır. Bir kürenin çapı ve kök hücre elde edilen küre olarak sayılmak üzere serbest yüzen 75 mikron üzerinde olmalıdır. (Şekil 2). Ancak, bazı hücreler sınırlı çoğalması ve form parçacıklarının büyüklüğü kriter uymayan ve kök hücre elde edilen küre olarak sayılmayacaktır; böyle bir sfero bir örneği burada gösterilir (Şekil 2). </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2209/2209fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. <img src="/files/ftp_upload/2209/2209fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2.

<ol><li>Tropepe, V., Coles, B. L., Chiasson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells+in+the+adult+mammalian+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells in the adult mammalian eye.</a> Science. 287, 2032-2036 (2000).</li>
<li>Ahmad, I., Tang, L., Pham, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+neural+progenitors+in+the+adult+mammalian+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Identification of neural progenitors in the adult mammalian eye.</a> Biochem Biophys Res Commun. 270, 517-521 (2000).</li>
<li>Coles, B. L., Angenieux, B., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+isolation+and+the+characterization+of+human+retinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Facile isolation and the characterization of human retinal stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15772-15777 (2004).</li>
<li>Cicero, S. A., Johnson, D., Reyntjens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+previously+identified+as+retinal+stem+cells+are+pigmented+ciliary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 6685-6690 (2009).</li>
<li>Lamba, D., Karl, M., Reh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+regeneration+and+cell+replacement%3A+a+view+from+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neural regeneration and cell replacement: a view from the eye.</a> Cell Stem Cell. 2 (6), 538-549 (2008).</li>
<li>Coles, B. L., Horsford, D. J., McInnes, R. R., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+retinal+progenitor+cells+leads+to+an+increase+in+the+retinal+stem+cell+population+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Loss of retinal progenitor cells leads to an increase in the retinal stem cell population in vivo.</a> Eur J Neurosci. 23, 75-82 (2006).</li>
<li>Angénieux, B., Schorderet, F. D., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+is+a+neuronal+differentiation+factor+for+retinal+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor is a neuronal differentiation factor for retinal stem cells in vitro.</a> Stem Cells. 24 (3), 696-706 (2006).</li>
<li>Xu, S., Sunderland, M. E., Coles, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proliferation+and+expansion+of+retinal+stem+cells+require+functional+Pax6%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The proliferation and expansion of retinal stem cells require functional Pax6.</a> Dev Biol. 304, 713-721 (2007).</li>
<li>Canola, K., Angénieux, B., Tekaya, M., Quiambao, A., Naash, M. I., Munier, F. L., Schorderet, D. F., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells+transplanted+into+models+of+late+stages+of+retinitis+pigmentosa+preferentially+adopt+a+glial+or+a+retinal+ganglion+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells transplanted into models of late stages of retinitis pigmentosa preferentially adopt a glial or a retinal ganglion cell fate.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (1), 446-4454 (2007).</li>
<li>Canola, K., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cells+committed+towards+the+photoreceptor+fate+for+retinal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Generation of cells committed towards the photoreceptor fate for retinal transplantation.</a> Neuroreport. 18 (9), 851-855 (2007).</li>
<li>Djojosubroto, M. W., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells%3A+promising+candidates+for+retina+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells: promising candidates for retina transplantation.</a> Cell Tissue Res. 331 (1), 347-357 (2008).</li>
<li>Inoue, T., Coles, B. L., Dorval, K., Bremner, R., Bessho, Y., Kageyama, R., Hino, S., Matsuoka, M., Craft, C. M., McInnes, R. R., Tremblay, F., Prusky, G. T., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+functional+photoreceptor+differentiation+from+adult+human+retinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Maximizing functional photoreceptor differentiation from adult human retinal stem cells.</a> Stem Cells. 28 (3), 489-500 (2010).</li>
<li>Tropepe, V., Sibilia, M., Ciruna, B. G., Rossant, J., Wagner, E. F., Kooy, D. vander <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+neural+stem+cells+proliferate+in+response+to+EGF+and+FGF+in+the+developing+mouse+telencephalon.+Dev+Biol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse telencephalon. Dev Biol.</a> , 208-201 (1999).</li>
<li>Coles-Takabe, B. L., Brain, I., Purpura, K. A., Karpowicz, P., Zandstra, P. W., Morshead, C. M., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Don%27t+look%3A+growing+clonal+versus+nonclonal+neural+stem+cell+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies.</a> Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).</li>
</ol>

Bu protokol fare göz 1-3 siliyer epitel retina kök hücreleri izole anlatılmaktadır. Siliyer epitelin şeritler izole metodoloji ancak tek bir hücre süspansiyonu ulaşmak için enzimler ve metodoloji bu protokolü optimize edilmiştir değişebilir. Bu toplam sayısı her göz izole edilebilir küre üzerinde olumsuz bir etkisi var görünüyor bu yana izole edilmiştir siliyer epitel şeritler RPE veya korneanın büyük miktarda olmadığını da önemlidir. Buna ek olarak, biz, aslında beyin neurospheres 13 için formüle edildi yaptığınız serum ücretsiz medya retina kök hücre küre yetiştirmek için idealdir. Bir de onlar büyüyen küreler birlikte 14 toplu kalmamanız kaplama ve inkübatöre yerleştirilir sonra hücreler rahatsız olmadığını emin olmalısınız. Retina kök hücreler klonal küreler oluşturmuşlardır sonra, bu kök hücreler göz için ileriye dönük bir numara almak için sayılabilir. Küreler sonra tek hücre içine ayrılamaz ve tespit kendini yenileme yetenekleri geçişli veya büyüme faktörleri farklı kombinasyonları ve / veya protein kullanarak nöral retina ve RPE farklı hücre tipleri ayrılabilir.

<table><tbody><tr><td>Stemi 2000 Mikroskobu</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soğuk Işık Kaynağı</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>KL1500</td><td>çift kollu optik ışık</td></tr><tr><td>Kavisli Mini Vannas makaslar</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-10</td><td></td></tr><tr><td>Açılı Vannas makaslar</td><td>Fine Science Tools</td><td>15005-08</td><td></td></tr><tr><td>#7 Dumont pens</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-30</td><td>tırtıksız</td></tr><tr><td>#5 Dumont pens</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>düz</td></tr><tr><td>İnce pens</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td>tırtıklı kavisli</td></tr><tr><td>#3 Bisturi sapı</td><td>Almedic</td><td>2586-M36-10</td><td></td></tr><tr><td>#10 Bisturi uçları</td><td>Almedic</td><td>2580-M90-10</td><td></td></tr><tr><td>Sıcak Boncuk Sterilizatörü</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>VWR international</td><td>CACB354235</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1005</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6254</td><td></td></tr><tr><td>Kynurenic Asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3375</td><td>1000 IU</td></tr><tr><td>Trypsin İnhibitörü</td><td>Roche Group</td><td>10109878001</td><td></td></tr><tr><td>35 mm kaplar</td><td>VWR international</td><td>CA354235</td><td></td></tr><tr><td>24 kuyucuklu plaka</td><td>VWR international</td><td>CA73521-004</td><td></td></tr><tr><td>Pamuk tıpalı pipetler</td><td>VWR international</td><td>14672-400</td><td>ateşte cilalanmış</td></tr><tr><td>14 mL Tüpler</td><td>Falcon BD</td><td>352057</td><td>Polistiren</td></tr><tr><td>Serumsuz Besiyeri</td><td></td><td></td><td>formülasyon için Ref# 13</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td>100 IU</td></tr></tbody></table>

fare göz retina kök hücre İzolasyonu

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Yetişkin fare retina kök hücre (RSC), memeli göz 1,2,3 siliyer epitel (CE) içinde bulunan nadir bir sükunet hücre . Tüm form CE pigmentli olmayan, iç ve pigmentli dış hücre tabakaları oluşur, ve CE tek bir pigmente hücreden ortaya çıkan klonal RSC koloniler ayırt edilebilir hem pigmente ve non-pigmentli hücreler oluşur nöral retina ve RPE hücre türleri. Küreler içindeki tüm hücreleri en azından bazı pigment 4 içerip içermediğine ilişkin bazı tartışmalar vardır, ancak hücreleri hala 1-3 nöral retina içinde bulunan farklı hücre tiplerini oluşturma yeteneğine sahiptirler. Amfibiler ve balık gibi bazı türler, ikisinin de gözleri, ancak, 5 yaralanma sonrası rejenerasyon yeteneğine sahip memeli gözü böyle bir rejeneratif özelliklerini gösterir. Hatta yaralanma sonrası yanı sıra, göz hasarı tamir fiziksel veya genetik modeller yardım için potansiyel bir hücre kaynağı olarak kullanarak, in vivo kök hücre tespit etmek ve 6-8 memeli retina kök hücreler sükunet devam mekanizmaları anlamak isteyen 9-12 yoluyla nakli. Burada klonal retina kök hücre küre oluşturmak için fare göz siliyer epitel hücreleri izole ve kültür alanında büyümek nasıl açıklar. In vivo kök hücre hiçbir bilinen marker olduğu için, bu alanlarda ileriye dönük göz siliyer epitel içinde kök hücre popülasyonunu belirlemek için tek bilinen yolu.

Bu video, siliyer epitelden fare gözün retina kök hücreleri izole kültür ve klonal retina küreler oluşturacak şekilde büyümeye nasıl göstereceğiz. Izole edilmiş kök hücre küre kardinal özelliklere sahip: kendini yenileme ve multipotentiality.

Fare Göz Retina Kök Hücre İzolasyonu

Yetişkin fare retinal kök hücresi (RSC), memeli gözünün siliyer epitelyumu (CE) içinde bulunan nadir bir kiyesent hücredir1,2,3. CE, ...'den oluşur

Bu prosedürün genel amacı, gözün siliyer epitelinden retinal kök hücreleri izole etmektir. Bu işlem; önce gözün temizlenip optik sinirden başlanarak, korneadan geçilip tekrar optik sinirde birleşecek şekilde ikiye bölünmesi ve ardından nöral retinanın ve lensin çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise kornea, iris ve retinal pigment epitelinin kesilip çıkarılmasıyla siliyer epitelin ayrıştırılmasıdır.Prosedürün üçüncü adımı, siliyer epitelyumun enzimatik olarak işlenmesi, skleranın uzaklaştırılması ve epitelyumun mekanik olarak tekil hücrelere ayrıştırılmasıdır. Prosedürün son adımı, hücrelerin serumsuz ortamda yeniden süspanse edilmesi ve büyüme faktörleri içeren serumsuz ortamlı doku kültürü plaklarına ekilmesidir. Nihayetinde, in vitro klonal küre oluşumu aracılığıyla gözün siliyer epitelyumunda bulunan kök hücre sayısını prospektif olarak gösteren sonuçlar elde edilebilir.Merhaba, benim adım Brenda Coles. Laboratuvarımız, amfibilerin ve balıkların gözlerindeki rejenerasyon yetenekleri üzerine makaleler araştırırken bu yöntemi geliştirdi ve memeli gözünde de benzer yeteneklere sahip bir hücre olabileceği hipotezini kurdu. Retinal kök hücrelerin izolasyonu, primer kültür deneylerine ayrılmış özel bir steril odada gerçekleştirilmektedir.Bu prosedüre başlamadan önce, diseksiyon mikroskobunu ve soğuk ışık kaynağını kurun ve ardından steril diseksiyon aletlerini hazırlayın. Her kabin, adımlar arasında aletleri sterilize etmek için bir sıcak boncuk sterilizatöre sahiptir. Onaylanmış hayvan etiği protokollerine göre sakrifiye edilen farelerden alınan ve hemen yapay serebrospinal sıvı içeren steril bir Petri kabına yerleştirilen gözlerden retinal kök hücreleri izole edeceğiz. Bu prosedürün en zor yönü, mikroskop altında yuvarlak bir nesnenin diseksiyonunu yapmaktır.İlgilenilen dokuya zarar vermemek için büyük özen gösterilmelidir. Diseksiyon mikroskobu altında, gözü pensle temizleyin. Kornea sklera sınırına tutunmuş olan kılları ve bağ dokusunu uzaklaştırın. Ardından, gözü tırtıklı pensle sabit tutarak A CSF içeren yeni bir kaba aktarın.Oküler kasları çıkarmak için açılı mikro disseksiyon makası kullanın. Optik sinir hâlâ göze bağlıysa onu da çıkarın; bu işlem sırasında göze baskı uygulamamaya dikkat edin. Gözleri, CSF içeren yeni bir kaba aktarın.Ardından, gözü ikiye bölmek için kavisli mikro diseksiyon makasları kullanıldı. Optik sinirden başlayarak korneanın ortasından kesin ve kesimin başladığı yer olan optik sinirde tekrar birleştirin. İki göz parçasının yaklaşık olarak eşit büyüklükte olması idealdir, çünkü bu durum bir sonraki adımı kolaylaştıracaktır.Korneaları iki pens yardımıyla tutarak, iki göz yarısını nazikçe birbirinden ayırın. Göz kabuklarındaki lens viseralarını ve nöral retinayı çıkarıp atın. Kabukları A CSF içeren yeni bir kaba aktarın.Artık siliyer epitelyumu izole etmeye hazırız. Başlamak için, kornea sağınızda ve retinal pigment epitelyumu solunuzda olacak şekilde göz kabuğunu yönlendirin. Göz kabuğunu, RPE tarafında düz pens yardımıyla nazikçe sabitleyin.Ardından, testere benzeri hareketler yapmak yerine bistüriyi nazikçe aşağı doğru bastırarak, korneayı ve irisi gözün siliyer epitelyumundan kesin. Bundan sonra, siliyer epitelyumu RPE'den ayırın. Siliyer epitelyum şeridini A CSF içeren yeni bir 35 milimetrelik kaba aktarmak için tırtıksız pens kullanın.Aynı şekilde, siliyer epitelyumu diğer göz kabuğundan izole edin. Siliyer epitelyum şeritleri toplandıktan sonra, şeritleri iki mililitre dis space içeren 35 milimetrelik bir kaba aktarın. Şeritlerin bulunduğu kabı 10 dakika boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin.10 dakika sonra, şeritleri dis alanından, iki mililitre filtrelenmiş drips in Halle ur haase ve kind reic acid içeren bir kaba aktarın. Kabı 10 dakika boyunca 37 °C'de bekletin. Şimdi, düz pensle sklerayı aşağıda tutarak diseksiyon mikroskobuna geri dönün.Siliyer epiteli skleradan nazikçe sıyırmak için kavisli uçlu dişsiz pensin alt kısmını kullanın. Sklerayı kapstan çıkarın. Kapta sadece epitelyum kalmalıdır.Şimdi ilgilenilen hücreler ve enzim çözeltisi hazır. Ateşte sterilize edilmiş, pamuk tıpalı bir pipet kullanarak çözeltiyi 14 litrelik bir tüpe aktarın. Epitel hücrelerini ayırmak için çözeltiyi pipetin içine ve dışına nazikçe iterek bu çözeltiyi 30 kez trite edin ve ardından tüpü 1500 RPM hızda beş dakika boyunca santrifüjleyin.Santrifüj işlemi tamamlandığında, tüpü santrifüjden dikkatlice çıkarın. Hücreler tüpün tabanından ayrılmaya meyillidir. Bu aşamada, SuperNet'in büyük kısmını ateşle uçları düzeltilmiş bir pipet kullanarak nazikçe aspire edin ve ardından hücrelere serumsuz besiyeri içinde bir mililitre tripsin inhibitörü ekleyin.Örneği tek hücreli bir süspansiyon haline gelene kadar, küçük delikli ve pamuk tıpalı bir pipet kullanarak yaklaşık 50 kez trite edin. Tüpü beş dakika boyunca tekrar santrifüjleyin. 1500 RPM hızda, süpernatanı uzaklaştırın ve yerine bir mililitre ekim ortamı ekleyin.Hücreleri yeniden süspanse etmek için alevle cilalanmış bir cam pipet kullanarak besiyerini nazikçe karıştırın. Hücreleri saydıktan sonra, istenen yoğunlukta plakaya ekin. 24 kuyucuklu bir plakada, genellikle önce her kuyucuğu besiyeri ile doldurup ardından hücre süspansiyonunu ekleyerek, toplam 500 µL besiyeri hacminde mikrolitre başına 10 hücre olacak şekilde ekim yaparız.Plakayı, bu prosedür başarıyla uygulandığında yedi gün sonra ortaya çıkan küreleri sayana kadar hareket ettirilmeyeceği 37 °C karbon dioksit inkübatörüne yerleştirin. Diseke edilmiş siliyer epitelyal hücreler, dissosiye edilip düşük yoğunlukta plakaya ekildikten sonra bu şekilde görünmelidir. Kültürde yedi gün geçtikten sonra, ortaya çıkan retinal kök hücre küreleri sayılır.Bir kürenin kök hücre türevli küre olarak sayılabilmesi için çapının 75 mikrondan fazla olması ve serbestçe yüzmesi gerekir. Ancak, bazı hücrelerin proliferasyonu sınırlı kalacak ve boyut kriterlerini karşılamayan PHE'ler oluşturacaktır; bunlar kök hücre türevli küre olarak sayılmayacaktır. Bu tür bir asteroidin gelişiminden sonraki örneği burada gösterilmiştir.Bu teknik, görme bilimleri alanındaki araştırmacıların retinal hastalıkların tedavisinde retinal kök hücreleri kullanma olasılığını keşfetmelerinin önünü açmıştır.

isolation-of-retinal-stem-cells-from-the-mouse-eye

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, akış sitometrisi kullanarak murin primer retinal ganglion hücrelerini (RGC'ler) izole etme prosedürünü gösterir. Bu yöntem, nörodejeneratif hastalıklarda fonksiyonel RGC'lerin kaybından kaynaklanan görme keskinliğindeki büyük düşüşü daha iyi anlamak amacıyla RGC'lerin gelecekteki çalışmalarına izin verir.

Floresanla Aktive Edilen Hücre Sıralaması Kullanılarak Murin Retinal Ganglion Hücrelerinin İzole Edilmesi

Milyonlarca insan irreversibl körlüğe neden olan retinal dejeneratif hastalıklardan muzdarip. Bu hastalıkların birçoğunun ortak bir unsuru retinal gangliyon hücrelerinin kaybıdır (RGC'ler). Bu ayrıntılı protokol, primer murin RGC'lerin akış sitometrisi ile pozitif ve negatif seçilim yoluyla izole edilmesini açıklar.

Akış Sitometresi ile Primer Sıçan Retinalı Ganglion Hücrelerinin (RGC) İzolasyonu

Retina pigment epiteli (RPE) çok fonksiyonlu bir epitel göz olduğunu. Burada bir iletişim kuralı fare RPE türetilmiş birincil hücre kültürleri kurmak için mevcut.

Fare retina Pigment epiteli birincil hücre kültürleri

Bu el yazması arteriyoller elektrofizyolojik, kalsiyum görüntüleme ve baskı myography çalışmalarda kullanılan fare retina üzerinden yalıtım için basit bir protokol açıklar.

Retina arteriyoller yalıtım Ex Vivo Hücre fizyolojisi çalışmaları için

Bu protokol, protein analizi için murin çubuk fotoreseptörlerinin hücre altı bölmelerini izole etmek için iki teknik sunar. İlk yöntem, çubuk dış segmentlerini ayırmak için canlı retina ve selüloz filtre kağıdı kullanırken, ikincisi çubuk iç ve dış segment katmanlarını soymak için liyofilize retina ve yapışkan bant kullanır.

Protein Analizi için Fare Retinasındaki Fotoreseptör Hücre Bölmelerinin İzolasyonu İçin İki Peeling Yöntemi

Bu protokol, hücre verimi, saflığı ve canlılığı için optimize edilmiş murin doğum sonrası retinal endotel hücrelerinin izolasyonu için bir yöntemi açıklar. Bu hücreler yeni nesil dizileme yaklaşımları için uygundur.

Yeni Nesil Dizileme için Murin Retinal Endotel Hücrelerinin İzolasyonu

Bu yazıda retinal pigmente epitel (RPE) hücrelerinin fare gözlerinden kademeli olarak izole edilmesi için basitleştirilmiş bir protokol anlatılmaktadır. Protokol, fare gözlerinin enükleasyonunu ve diseksiyonunu, ardından RPE hücrelerinin izolasyonunu, tohumlanmasını ve kültürlenmesini içerir.

Primer Fare Retinal Pigmentli Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

Retinal pigment epitel (RPE) hücrelerinin hücrelerini genç pigmentli kobayların gözlerinden izole etmek için basit ve etkili bir yöntem sunuyoruz. Bu prosedür, gen ekspresyon analizleri de dahil olmak üzere izole RPE üzerinde moleküler biyoloji çalışmalarının izlenmesine izin verir.

Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin Guinea Pig Gözlerinden İzolasyonu

Bu el yazması, fare gözlerinden retinal glial Müller hücrelerini izole etmek için ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır. Protokol, fare gözlerinin enükleasyonu ve diseksiyonu ile başlar, ardından Müller hücrelerinin izolasyonu, tohumlanması ve kültürlenmesi ile devam eder.

Primer Fare Retinal Glial Müller Hücrelerinin İzolasyonu

Retina pigment epiteli (RPE), koroid ve retina arasında çok önemli bir bariyer görevi görür ve fotoreseptörler gibi retina hücre tiplerinin sağlığını ve işlevini destekler. Burada, yetişkin murin RPE'yi izole etmek ve kültürlemek için basit ve etkili bir protokol açıklıyoruz.

Yetişkin Farelerden Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü için Basitleştirilmiş Bir Yöntem

Burada, genişletilmiş ex vivo deneyler için retinayı fare gözünden izole etmek için ayrıntılı bir metodoloji sunuyoruz. Bu protokol, retinal glia'yı canlı dokuda yerinde tutmanın sağladığı araştırma yollarından yararlanmak isteyen araştırmacılar için bu teknik olarak zorlu yaklaşımı erişilebilir kılmayı vurgulamaktadır.

Fare retinasındaki glial etkileşimleri incelemek için bir ex vivo eksplant modeli

Keşfedin fare gözünden retina kök hücre izolasyonunu ve kültürde klonal küre oluşturmayı. Bu yöntem, kök hücre özelliklerini incelemek ve retina hastalıkları için rejeneratif tedaviler geliştirmek amacıyla kullanılır.

Fare Göz Retina Kök Hücre İzolasyonu

Daha fazla video keşfet