Fare Göz Retina Kök Hücre İzolasyonu

Bu video, siliyer epitelden fare gözün retina kök hücreleri izole kültür ve klonal retina küreler oluşturacak şekilde büyümeye nasıl göstereceğiz. Izole edilmiş kök hücre küre kardinal özelliklere sahip: kendini yenileme ve multipotentiality.

Bu prosedürün genel amacı, retina kök hücrelerini gözün siliyer epitelinden izole etmektir. Bu, önce gözün temizlenmesi ve ikiye bölünmesi, optik sinirden başlayarak korneayı kesip optik sinirde tekrar buluşması ve ardından nöral retina ve lensi çıkarmasıyla gerçekleştirilir. İşlemin ikinci adımı, kornea, iris ve retina pigmentli epiteli keserek siliyer epitelin kesilmesidir.

Prosedürün üçüncü adımı, siliyer epiteli enzimatik olarak tedavi etmek, sklerayı çıkarmak ve epiteli mekanik olarak tek hücrelere ayırmaktır. İşlemin son adımı, hücrelerin serum serbest besiyerinde yeniden süspanse edilmesi ve büyüme faktörleri içeren serum serbest besiyeri içeren doku kültürü plakalarında plakalandırılmasıdır. Sonuç olarak, klonal küre yoluyla gözün siliyer epitelinde bulunan kök hücrelerin sayısını in vitro olarak gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Merhaba, benim adım Brenda Coles. Laboratuvarımız bu yöntemi ilk olarak amfibilerin ve gözlerindeki balıkların rejeneratif yetenekleri üzerine makaleler araştırırken buldu ve belki de memeli gözünde aynı yeteneklere sahip bir hücre olduğunu varsaydı. Retina kök hücrelerinin izolasyonu, primer kültür deneyleri için ayrılmış özel bir steril odada gerçekleştirilir.

Bu prosedüre başlamadan önce, diseksiyon mikroskobunu ve soğuk ışık kaynağını kurun ve ardından steril diseksiyon aletlerini yerleştirin. Her davlumbazda, aletleri adımlar arasında sterilize etmek için bir sıcak vuruş sterilizatörü bulunur. Yapay beyin omurilik sıvısı içeren steril bir Petri kabına hemen yerleştirilen gözlerden retina kök hücrelerini izole edeceğiz Onaylanmış hayvan etiği protokollerine göre kurban edilen farelerden çıkarıldıktan sonra, Bu prosedürün en zor yönü, yuvarlak bir nesnenin mikroskop altında diseksiyonudur.

İlgilenilen dokuyu tahrip etmemek için büyük özen gösterilmelidir Diseksiyon mikroskobu altında, gözü forseps ile temizleyin. Kornea skleral sınırına bağlı saçtan ve bağlı dokudan kurtulun. Ardından, gözü tırtıklı forseps ile sabit tutarken gözü BOS ile yeni bir tabağa aktarın.

Oküler kasları çıkarmak için açılı mikro diseksiyon makası kullanın. Optik siniri de çıkarın, eğer hala göze bağlıysa, bu işlem sırasında gözü ezmemeye çalışın. Gözleri BOS ile yeni bir yemeğe aktarın.

Daha sonra gözü ikiye bölmek için kavisli mikro diseksiyon makası kullandı. Optik sinirden başlayın ve korneanın ortasından kesin, kesiğin başlatıldığı optik sinirde geri buluşun. İki göz parçasının kabaca eşit boyutta olması idealdir çünkü bu, bir sonraki adımı kolaylaştıracaktır.

Korneaları iki forseps kullanarak tutarak, iki göz yarısını nazikçe soyun. Lensleri, iç organları ve nöral retinayı göz kabuklarından çıkarın ve atın. Kabukları CSF ile yeni bir kaba aktarın.

Şimdi siliyer epiteli izole etmeye hazırız. Başlamak için, göz kabuğunu, kornea sağınızda ve retina pigmentli epitel solunuzda olacak şekilde yönlendirin. RPE tarafındaki düz forseps ile göz kabuğunu nazikçe aşağı doğru sabitleyin.

Ardından, testere hareketleri kullanmak yerine neşteri hafifçe aşağı doğru iterek kornea ve irisi gözün siliyer epitelinden kesmek için neşteri kullanın. Bundan sonra, siliyer epiteli RPE'den kesin. Siliyer epitel şeridini A BOS içeren 35 milimetrelik yeni bir tabağa aktarmak için tırtıksız forseps kullanın.

Aynı şekilde, siliyer epiteli diğer göz kabuğundan izole edin. Siliyer epitel şeritleri toplandıktan sonra, şeritleri iki mililitre dis boşluğu içeren 35 milimetrelik bir tabağa aktarın. Çanağı şeritlerle birlikte 10 dakika boyunca 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin.

10 dakika sonra, şeritleri dis boşluğundan Halle ur haase ve kind reic acid'de iki mililitre filtrelenmiş damla içeren bir tabağa aktarın. Çanağı 10 dakika boyunca 37 santigrat dereceye yerleştirin. Şimdi sklerayı düz forseps ile tutarken diseksiyon mikroskobuna geri dönün.

Siliyer epiteli skleradan nazikçe kazımak için eğrinin alt kısmını, derecelendirilmemiş forsepsleri kullanın. Sklerayı tabaktan çıkarın. Bütün bunlar tabakta bırakılmalı.

Şimdi ilgilenilen hücreler ve enzim çözeltisi. Ateşle parlatılmış pamuk tıkalı bir pipet kullanarak, çözeltiyi 14 litrelik bir tüpe aktarın. Epitel hücrelerini parçalamak için bu çözeltiyi 30 kez tritrate edin, çözeltiyi pipetin içine ve dışına hafifçe zorlayarak tüpü 1500 RPM'de beş dakika santrifüjleyin.

Santrifüjleme tamamlandığında, tüpü santrifüjden dikkatlice çıkarın. Hücreler tüpün dibinden çıkmaya meyilli olduğundan. Bu aşamada, SuperNet'in çoğunu ateşle parlatılmış bir pipet kullanarak nazikçe aspire edin ve ardından hücrelere serum içermeyen ortamda bir mililitre tripsin inhibitörü ekleyin.

Numuneyi tek hücreli bir süspansiyon olana kadar yaklaşık 50 kez denemek için küçük bir sondaj deliği pamuk tıkalı pipet kullanın. Tüpü tekrar beş dakika santrifüjleyin. 1500 RPM'de süpernatanı çıkarın ve kaplamanızın bir mililitresi ile değiştirin.

Orta: Hücreleri yeniden süspanse etmek için ateşle parlatılmış bir cam pipet kullanarak nazikçe soğutun. Hücreleri saydıktan sonra, onları istenen yoğunlukta kaplayın. 24 oyuklu bir plakada, genellikle her bir oyuğu önce ortamla doldurarak ve ardından 500 mikrolitre ortamın nihai hacmini elde etmek için hücre süspansiyonunu ekleyerek mikrolitre başına 10 hücre kaplarız.

Plakayı, bu prosedür başarıyla gerçekleştirildiğinde yedi gün sonra ortaya çıkan küreleri sayana kadar hareket etmeyeceği 37 santigrat derecelik bir karbondioksit inkübatörüne yerleştirin. Diseke edilen siliyer epitel hücreleri, ayrıştıktan ve düşük yoğunlukta kaplandıktan sonra bu şekilde görünmelidir. Kültürde yedi gün sonra ortaya çıkan retina kök hücre küreleri sayılır.

Bir kürenin kök hücre türevi küre olarak sayılabilmesi için çapı 75 mikrondan büyük ve serbest yüzer olması gerekir. Bununla birlikte, bazı hücreler sınırlı çoğalmaya sahip olacak ve boyut kriterini karşılamayan PHE'yi oluşturacak ve kök hücre türevi küreler olarak sayılmayacaktır. Böyle bir asteroitin bir örneği burada gösterilmektedir Geliştirilmesinden sonra.

Bu teknik, görme bilimleri alanındaki araştırmacıların retina hastalığının tedavisinde retina kök hücrelerini kullanma olasılığını keşfetmelerinin yolunu açtı.