Name: Schwann-astrosit Etkileşimleri Analizi In Vitro Tahliller (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-13T23:59:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Öğrenin, Schwann hücreleri ve astrositler arasındaki etkileşimleri in vitro tahlillerle nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntemler, omurilik yaralanmalarının onarım stratejilerini geliştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Philippa Warren Biz onu türlü yardım için teşekkür etmek istiyorum.

1. Sınır Testi: <ol><li> Temel hazırlık: Poly-D-Lizin gecelik ve steril cam slaytlar Odası slaytlar ile kaplı, deney başlamadan önce hazırlanır. Orta Dulbecco'nun Modifiye Kartal,% 10 fetal buzağı serumu (FCS) ile desteklenmiş Orta (DMEM), ve% 1 Penisilin-Streptomisin-Fungizon (PSF) kullanılarak hazırlanmıştır. Ayrıca kalsiyum / magnezyum ücretsiz Hanks dengeli tuz solüsyonu (HBSS) bir şişe hazırlanmıştır. </li><li> Cam şişe içinde kültür İlköğretim sıçan Schwann hücrelerinin% 0.1 tripsin kullanarak 3 dakika tripsinize. İlköğretim sıçan astrosit kültür,% 0.1 'lik tripsin kullanarak 5 dakika tripsinize. Tripsin DMEM ekleyerek% 10 FCS ve 1% PSF ile desteklenmiş aktif değil. </li><li> Tripsinize Schwann hücreleri ve astrositler, 15 ml şahin tüpler ayrı aktarılır ve 300G 5 dakika santrifüj. </li><li> Schwann hücreleri ve astrositler (hücre yoğunluğu varyasyonları temsilcisi sonuçlar bölümüne bakınız) 2 x 10 6 yoğunlukta yeniden askıya alınır. </li><li> Schwann hücre süspansiyonu 50 mcL damla PDL kaplı oda slayt kuyuların bir ucunda yer alır. Bir cam şeridi düz bir kenar oluşturmak için odanın ortasına doğru açılan smear kullanılmıştır. (Cam kesici kullanarak, dikdörtgen bir cam lamelleri sınır deneyleri için kullanılan odasına slaytlar genişliği uygun olacağını boyuna kadar kesilir) </li><li> Astrosit süspansiyon 50 mcL ikinci bir damla yerleştirilir ve aynı sıra ters sonunda, aralarında küçük bir 0.2mm boşluk ile ilk damla smear paralel düz bir kenar oluşturmak için merkeze doğru bulaşmış oldu. </li><li> Odasına damla 37 inkübatöre yerleştirilir ° C'de 2 saat süreyle içeren slaytlar. </li><li> 2 saat sonra, kültürler bağlı olmayan hücresel enkaz kaldırmak için ve taze orta DMEM /% 10% FCS / 1 PSF eklendi içeren DMEM ile yıkandı. Not: DMEM /% 10 FCS /% 1 PSF forskolin (2μM) ve Sığır hipofiz ekstresi (BPE) (10μg / ml) Schwann hücre proliferasyonu uyaran ile takviye edilebilir. BPE, uzun vadeli Schwann hücre kültürü izin için gerekli olan büyüme faktörleri tedarik edecek ve forskolin proliferasyonunu uyardığı Schwann hücre içindeki siklik adenozin monofosfat düzeylerini artırmaktadır. </li><li> Hücreler 8-10 gün boyunca yaklaşık 37 ° C,% 7 CO 2 inkübatör kültür. Orta 3 günde bir değiştirilmesi gereklidir. Iki hücre cephede sonunda birbirlerine ulaşacak ve iki hücre tipleri arasında keskin bir sınır oluşturacak. Bu aşamada deneyler sınır oluşum katılan faktörler analiz yapılabilir. </li><li> Ko-kültür,% 4 formaldehit ve Schwann hücreleri, ko-kültür hücreleri tanımlamak için anti-P75 antikor ve anti-GFAP antikorları astrositler ile boyanmış olabilir ile tespit edilebilir. P75 antikor astrositler eksikliği Schwann hücreleri üzerinde düşük afinite NGF reseptör tanır. Anti-GFAP antikor astrosit sitoplazmasında lokalize glial firbrillary asidik protein tanır. (Bkz. Şekil 1A temsilcisi sınır) </li></ol> 2. Göç Testi: <ol><li> 4 tane iyi plakalar (15mm kuyu) PDL kaplı gecelik ve astrosit mono tabakaları oluşturmak için hazırlanmıştır. </li><li> İlköğretim astrosit kültür,% 0.1 'lik tripsin kullanarak 5 dakika tripsinize. Tripsin DMEM% 10 FCS ve% 1 PSF ve 300G az 5 dakika santrifüj hücre ile desteklenmiş ekleyerek inaktive olur. (Bakınız Şekil 2) </li><li> Astrositler 1x10 5 hücre / ml tekrar askıya alınır. Bu çözeltinin 1 ml 4 kuyucuğu her PDL kaplamalı eklenir. Tek tabaka tamamen konfluent kadar Astrositler 24-48 saat kültüre. </li><li> Paralel, dairesel PDL kaplı cam lamelleri 50 ml tüp yerleştirilir ve küçük cam parçaları oluşturmak için plastik bir pipet kullanarak ezilmiş astrosit mono tabakaları oluşturmak için, astrosit mono tabakaları Schwann hücre göçü değerlendirmek için. </li><li> Cam parçaları 6 plaka çanağı bir kuyunun içine transfer edilir ve büyüklükteki parçaları uygun bir forseps kullanılarak seçilen ve diğer kuyularda yerleştirilir. 6 kuyucuğu her kuyuda 5 cam parçaları yerleştirilir. </li><li> Cam şişe içinde kültür İlköğretim Schwann hücrelerinin% 0.1 tripsin kullanarak 3 dakika tripsinize. Tripsinize Schwann hücreleri, 15 ml şahin tüp ayrı transfer ve 300 G 5 dakika santrifüj. Schwann hücreleri DMEM/10% FCS / 1% PSF 2x 10 6 hücre / mL yeniden askıya alınır. </li><li> Schwann hücrelerinin süspansiyon 20 mcL damlacıkları, 6 kuyu plakaları ve hücreleri yerleştirilen her 5 lamel parçalarının 37 ° C,% 7 2 saat boyunca CO 2 inkübe üzerine eklenir . </li><li> 2 saat sonra, Schwann hücreleri lamel parçaları eklenir ve DMEM/10% FCS /% 1 PSF (forskolin ve 10μg / mL BPE 2μM içerir parçaları tamamen orta ile kaplıdır, böylece her bir kuyunun eklenir) . </li><li> Cam parçaları tamamen con kadar parçaları içeren 6 kuyucuğu 24-48 saat sonra inkübatöre yerleştirilir.Schwann hücreleri ile bilmektedir. </li><li> Bir kez parçaları Schwann hücreleri ile konfluent, her parça dikkatlice keskin forseps kullanarak kaldırdı ve astrosit tek tabaka üzerinde ters yüz aşağı sonra unattached hücreleri çıkarmak ve HBSS batırılmış. </li><li> Her kuyu sonra 1 mL% FCS / 1% PSF ve Schwann hücreleri 24 - 48 dönem için göç etmeye izin verilir DMEM/10 ile kaplıdır. Bu dönemde büyüme faktörleri gibi deneysel reaktifler, Schwann hücrelerinin göç sayısı ve mesafe üzerindeki etkileri değerlendirmek için eklenebilir. </li><li> Geçiş dönemini takiben, cam parçaları, 30 dakika için% 4 paraformaldehid (PFA) ekleyerek her bir kuyunun dibine sabitlenir. Aşağıdaki fiksasyon, P75 Schwann hücreleri (düşük afinite NGF reseptör tanıma), ardından ABC strepavidin kiti-diaminobenzidin (DAB) kullanarak bunları leke Schwann hücrelerinin ışık mikroskobu altında görselleştirme izin immunostain. </li></ol> 3. Temsilcisi Sonuçlar: Schwann astrosit ortak kültürler, 8-10 gün sonra iki hücre tipleri arasında keskin bir sınır göstermektedir. Bu sınır, Schwann hücre proliferasyonu gelişmiş forskolin ve BPE kültür kullanılırsa daha belirgindir. Hiçbir sınır 10 günlük süre içinde görülürse, sınırları kuruluncaya kadar, kültür zaman daha da artmaktadır. Hücre yoğunluğu oranının değiştirilmesi sınır oluşumunu arttırmak için alternatif bir yol. 03:01 Schwann oranı: hücre süspansiyonları 8,18 hazırlarken astrosit hücre yoğunluğunda kullanılabilir. Schwann hücreleri ve astrositler belirlemek için sınır kurulmuş olduğu bir çizgi çizilebilir astrosit topraklarına göç Schwann hücrelerinin sayısı ve floresan mikroskop altında sayılabilir karışmasının hücre değerlendirmek için, immün ardından. Aşağıda, elde edilen görüntüleri iki örnek sınırları, Schwann hücreleri ve astrositler (Şekil 1A) ve hücrelerin, zayıf tekniği (Şekil 1B) nedeniyle farklı toprakları içine de ayrı ayrı değil bir iyi biçimli segregasyon bir. <img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig2.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1: Sınır tahlil: Schwann astrosit etkileşim. Schwann hücre proliferasyonu uyarmak için forskolin ve BPE varlığı A) 10 gün co-kültür tahlil, iki hücre tipleri (kırmızı = P75, yeşil = GFAP) arasında keskin bir sınır göstermektedir. B) 10 günlük sınır oluşturduğu bir ortak kültür tahlil ve iki hücre cephede karıştırılır. (Kırmızı = P75, yeşil = GFAP) sınır hazırlanması sırasında birbirlerine sonraki astrosit ve Schwann hücresi damlacıkları yerleştirerek Bu iki damlacıklarının karıştırma nedeniyle oldu. <img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig1.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 konfluent astrosit tek tabaka Temsilcisi görüntü Göç testleri yüzey üzerinde başka bir hücre tipi, tek bir hücre tipi hareketi değerlendirmek ve bu nedenle sınır oluşum farklı bir fenomen değerlendirmek. Uygulama mono tabakaları üzerine tersini lamelleri sağlamak için gerekli olan Schwann hücre, keskin forseps cam parçaları ve astrosit mono tabakaları kaplı. Zarar yol açmaz Schwann hücreleri, maksimum mesafe göç ve lamel kenarına göç hücrelerinin sayısı göç değerlendirmek için ışık mikroskobu altında ölçülebilir. Aşağıda astrosit tek tabaka yüzeyinde (Şekil 3) DAB boyama P75 antikor ile boyandı Schwann hücrelerinin görüntü. <img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 ters lamel assay kullanarak Göç tahlil. A) Schwann hücresi (kahverengi, P75 antikor ile boyanmış) lamel kenarından uzak göç. Ok lamel uzak hücre göç yönüne işaret eder.

<ol><li>Assouline, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+astrocytes+and+Schwann+cells+in+culture+synthesize+nerve+growth+factor-like+neurite-promoting+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Rat astrocytes and Schwann cells in culture synthesize nerve growth factor-like neurite-promoting factors.</a> Brain Res. 428, 103-118 (1987).</li>
<li>Taylor, J. S., Bampton, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+secreted+by+Schwann+cells+stimulate+the+regeneration+of+neonatal+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Factors secreted by Schwann cells stimulate the regeneration of neonatal retinal ganglion cells.</a> J Anat. 204, 25-31 (2004).</li>
<li>Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+and+cell+adhesion+molecules%3A+neuronal+receptors+that+regulate+axon+growth+on+extracellular+matrices+and+cell+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Integrins and cell adhesion molecules: neuronal receptors that regulate axon growth on extracellular matrices and cell surfaces.</a> Dev Neurosci. 11, 332-347 (1989).</li>
<li>Chiu, A. Y., Monteros,, Espinosa de los, A., Cole, R. A., Loera, S., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+and+s-laminin+are+produced+and+released+by+astrocytes%2C+Schwann+cells%2C+and+schwannomas+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Laminin and s-laminin are produced and released by astrocytes, Schwann cells, and schwannomas in culture.</a> Glia. 4, 11-24 (1991).</li>
<li>Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination+of+CNS+axons+by+Schwann+cells+transplanted+from+the+sciatic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Remyelination of CNS axons by Schwann cells transplanted from the sciatic nerve.</a> Nature. 266, 68-69 (1977).</li>
<li>Andrews, M. R., Stelzner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+olfactory+ensheathing+and+schwann+cells+after+implantation+into+a+dorsal+injury+of+adult+rat+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Evaluation of olfactory ensheathing and schwann cells after implantation into a dorsal injury of adult rat spinal cord.</a> J Neurotrauma. 24, 1773-1792 (2007).</li>
<li>Iwashita, Y., Fawcett, J. W., Crang, A. J., Franklin, R. J., Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cells+transplanted+into+normal+and+X-irradiated+adult+white+matter+do+not+migrate+extensively+and+show+poor+long-term+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Schwann cells transplanted into normal and X-irradiated adult white matter do not migrate extensively and show poor long-term survival.</a> Exp Neurol. 164, 292-302 (2000).</li>
<li>Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+ensheathing+cells+and+Schwann+cells+differ+in+their+in+vitro+interactions+with+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes.</a> Glia. 32, 214-225 (2000).</li>
<li>Lakatos, A., Barnett, S. C., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+ensheathing+cells+induce+less+host+astrocyte+response+and+chondroitin+sulphate+proteoglycan+expression+than+Schwann+cells+following+transplantation+into+adult+CNS+white+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Olfactory ensheathing cells induce less host astrocyte response and chondroitin sulphate proteoglycan expression than Schwann cells following transplantation into adult CNS white matter.</a> Exp Neurol. 184, 237-246 (2003).</li>
<li>Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-Schwann+cell+interactions+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-Schwann cell interactions in culture.</a> Glia. 11, 367-377 (1994).</li>
<li>Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondroitin+sulfate+proteoglycan+staining+in+astrocyte-Schwann+cell+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Chondroitin sulfate proteoglycan staining in astrocyte-Schwann cell co-cultures.</a> Glia. 14, 145-152 (1995).</li>
<li>Plant, G. W., Bates, M. L., Bunge, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+proteoglycan+immunoreactivity+is+higher+at+the+caudal+than+the+rostral+Schwann+cell+graft-transected+spinal+cord+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibitory proteoglycan immunoreactivity is higher at the caudal than the rostral Schwann cell graft-transected spinal cord interface.</a> Mol Cell Neurosci. 17, 471-487 (2001).</li>
<li>Fishman, P. S., Nilaver, G., Kelly, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrogliosis+limits+the+integration+of+peripheral+nerve+grafts+into+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Astrogliosis limits the integration of peripheral nerve grafts into the spinal cord.</a> Brain Res. 277, 175-180 (1983).</li>
<li>Fok-Seang, J., Mathews, G. A., ffrench-Constant, C., Trotter, J., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+oligodendrocyte+precursors+on+astrocytes+and+meningeal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Migration of oligodendrocyte precursors on astrocytes and meningeal cells.</a> Dev Biol. 171, 1-15 (1995).</li>
<li>Wilby, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Cadherin+inhibits+Schwann+cell+migration+on+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">N-Cadherin inhibits Schwann cell migration on astrocytes.</a> Mol Cell Neurosci. 14, 66-84 (1999).</li>
<li>Grimpe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+proteoglycans+in+Schwann+cell%2Fastrocyte+interactions+and+in+regeneration+failure+at+PNS%2FCNS+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of proteoglycans in Schwann cell/astrocyte interactions and in regeneration failure at PNS/CNS interfaces.</a> Mol Cell Neurosci. 28, 18-29 (2005).</li>
<li>Afshari, F. T., Kwok, J. C., White, L., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+migration+is+integrin-dependent+and+inhibited+by+astrocyte-produced%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Schwann cell migration is integrin-dependent and inhibited by astrocyte-produced.</a> Glia. , (2010).</li>
<li>Santos-Silva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF%2Fheparin+differentially+regulates+Schwann+cell+and+olfactory+ensheathing+cell+interactions+with+astrocytes%3A+a+role+in+astrocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FGF/heparin differentially regulates Schwann cell and olfactory ensheathing cell interactions with astrocytes: a role in astrocytosis.</a> J Neurosci. 27, 7154-7167 (2007).</li>
<li>Afshari, F. T., Kwok, J. C., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-produced+ephrins+inhibit+schwann+cell+migration+via+VAV2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-produced ephrins inhibit schwann cell migration via VAV2 signaling.</a> J Neurosci. 30, 4246-4255 (2007).</li>
</ol>

Yukarıda anlatılan testlerin Schwann astrositler ve astrositik ortamda sınırlı Schwann hücre göçü arasındaki sınır oluşumu dahil çoklu faktörlerin rolünü gösteren çeşitli çalışmalarda kullanılmıştır. Stratejilerinin geliştirilmesi optimize etmek için izin ve Schwann hücre greft transplantasyonu takip entegrasyonu geliştirmek ve bunu yaparken de yenileyici aksonlar sağlayan ana dokusu içine greft arka çıkış kolaylaştırmak olduğu gibi bu olayların altında yatan mekanizmaların anlaşılması şartt...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Invitrogen</td><td>10091-148</td><td></td></tr><tr><td>PSF</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>BPE</td><td>Invitrogen</td><td>13028-014</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Calbiochem</td><td>344273</td><td></td></tr><tr><td>Lameller</td><td>VWR international</td><td>631-0149</td><td></td></tr><tr><td>Lameller (dikdörtgen)</td><td>Menzel-Glaser</td><td>BB022050A1</td><td></td></tr><tr><td>Kameralı lamlar</td><td>Nalge Nunc international</td><td>177380</td><td></td></tr><tr><td>4 kuyucuklu plakalar, 6 kuyucuklu plakalar</td><td>Nalge Nunc international</td><td></td><td>4 kuyucuklu plakalar6 kuyucuklu plakalar</td></tr><tr><td>sıçan p75 antikoru</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB365</td><td></td></tr><tr><td>GFAP antikoru</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>Sekonder antikorlar (Alexa-konjuge)</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004 A-11034</td><td>Keçi anti-fare 568Keçi anti-tavşan 488</td></tr><tr><td>Sekonder biotinillenmiş</td><td>Vector Laboratories</td><td></td><td>Keçi anti-fare</td></tr><tr><td>DAB tabletleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4418</td><td></td></tr><tr><td>ABC elite kiti</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>Hassas Pens</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6168</td><td></td></tr><tr><td>Fluorosave</td><td>Calbiochem</td><td>345789</td><td></td></tr></tbody></table>

schwann-astrosit etkileşimleri analizi in vitro tahliller

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann hücreleri, omurilik yaralanması sonrasında onarım stratejileri yaygın olarak kullanılan hücre biridir. Schwann hücreleri, aksonal rejenerasyon salgılayan büyüme faktörleri 1,2 destekleyen ve çimlenme ve büyümeyi teşvik adezyon molekülleri 3 ve ekstraselüler matriks molekülleri 4 sağlayarak yeteneğine sahiptir . Buna ek olarak 5 yaralanma yerinde demyelinated aksonlar myelinate. Ancak, Schwann hücrelerinin nakli aşağıdaki implant sitesinden göç yoktur ve ev sahibi astrositler 6,7 ile karışmaz. Bu sonuç, Schwann hücreleri ve astrosit arasında keskin bir sınır oluşumu proksimale ve distale ana dokusu içine greft arka çıkmak için çalışıyor büyüyen aksonlar için bir engel oluşturmak. Schwann hücreleri ile temas Astrositler da hipertrofisi geçmesi ve inhibitör molekülleri 8-13 up-regüle. In vitro tayinlerde modeli Schwann hücre astrosit etkileşimleri kullanılmış olan ve hücresel davranışın altında yatan mekanizma anlaşılmasında önemli olmuştur. In vitro tayinlerde Bu sınır tayini, bir ko-kültür, sadece küçük bir boşluk iki hücre cephede ayıran farklı toprakları işgal her hücre tipi ile iki farklı hücre kullanılarak yapılır . Hücrelere bölmek ve göç gibi, hücresel iki cephede birbirlerine yakın ve nihayet çarpışır olsun. Bu davranış sınırında analiz edilecek iki hücre popülasyonlarının sağlar. Aynı tekniğin başka bir varyasyonu iki hücre popülasyonları kültür karışımı ve zamanla iki hücre tipleri ayırınız Schwann hücreleri ile birlikte birden fazla Schwann astrosit sınırları astrositler arasındaki adalar olarak bir araya clumped. Iki hücre tipleri etkileşim eğitim kullanılan ikinci tahlil, hücresel hareketi diğer hücre tipi tek tabaka 14,15 yüzey üzerinde takip edilebilir göç testtir . Bu testte ters lamel testinin yaygın olarak bilinir. Schwann hücreleri, küçük cam parçaları üzerinde kültür ve astrosit mono tabakaları yüzey üzerine yüzü aşağı gelecek şekilde ters düz ve göç lamel kenarında değerlendirilir. Her iki deneyleri hücresel dışlanma ve sınır oluşum yer altında yatan mekanizmaları inceleyerek etkili olmuştur. Bazı moleküllerin bu teknikleri N-Cadherins 15, Kondroitin Sülfat proteoglikanların (CSPGs) 16,17, FGF / Heparin 18, Efesliler / Ephrins 19 kullanılarak belirlendi. Bu makale, kademeli moda sınır tahlil ve göç tahlil tanımlamak ve meydana gelebilecek olası teknik sorunları aydınlatmak için niyetindedir.

Bu makale niyetinde kademeli biçimde tanımlamak için yaygın olarak kullanılan<em&gt; In vitro</emSchwann hücre asrtocyte etkileşimleri inceleyerek kullanılan deneyleri.

Schwann-astrosit Etkileşimleri Analizi In Vitro Tahliller

Schwann hücreleri, omurilik yaralanmaları sonrası onarım stratejilerinde yaygın olarak kullanılan hücrelerden biridir. Schwann hücreleri, aksonal destek sağlama kapasitesine sahiptir...

Schwann hücreleri, spinal kord yaralanmalarının onarımında kullanılan periferik sinir sisteminin glial hücreleridir. Temel olarak, aksonal rejenerasyonu destekleyen ve büyümeyi teşvik eden adezyon ve hücre dışı matris molekülleri sağlayan büyüme faktörleri içerirler. Ayrıca, yaralanma bölgesindeki aksonları miyelinize ederler.Maalesef, transplant edilen swan hücreleri implant bölgelerinden göç etmemekte ve konak astrositleri ile karışmamaktadır. Bu durum, keskin bir sınır oluşumuyla sonuçlanmakta ve büyüyen aksonların konak dokusuyla entegre olmasını engellemektedir. Bu videoda, swan hücreleri ve astrositlerin in vitro etkileşimlerini incelemek için iki yöntem kullanılmaktadır.İlk olarak, bir lam üzerinde swan hücresi ve astrosit bölgelerinin oluşturulduğu ve kültürü yapıldığı bir sınır testi gösterilmektedir. Ardından lam üzerine farklı reaktifler eklenir ve ek kültür süreci takip edilir. Daha sonra, reaktiflerin swan hücrelerinin astrositik bölgeye veya tersi yöndeki göçü üzerindeki etkisini belirlemek için lamlar görüntülenir ve analiz edilir.Ardından, üzerinde Schwann hücresi yuvaları bulunan lamel cam parçalarının astrosit monokatmanları üzerine ters çevrildiği bir migrasyon deneyi gösterilmektedir. Yine, kültür ortamına farklı reaktifler eklenir ve ardından Schwann hücrelerinin astrosit monokatmanları üzerindeki migrasyon düzeyini ve mesafesini değerlendirmek için kültür görüntüleme işlemi gerçekleştirilir. Nihayetinde, bu tür bir deney, transplantasyon sonrası Schwann hücresi greftlerinin entegrasyonunu optimize etmek ve geliştirmek için stratejilerin geliştirilmesini kolaylaştırmalıdır.Saf substratlar üzerindeki göçün değerlendirildiği mevcut yöntemlere kıyasla bu in vitro analizlerin avantajı, nakledilen hücrelerin astrositlerle temas ettiği in vivo analizlerle daha ilişkili olmasıdır. Ayrıca, bu in vitro analizler, tümör hücresi invazyonu ve göçü gibi temel soruları yanıtlamak için hücre biyolojisi gibi diğer alanlarda da kullanılabilir. Analize başlamadan önce şu malzemeleri hazır bulundurun: poli-D-lizin kaplı oda slaytları, steril cam slaytlar, hücre kültür ortamı ve bir şişe kalsiyum.Magnezyum içermeyen Hanks dengeli tuz çözeltisiyle başlayarak, primer rat Schwann hücrelerini üç dakika, primer rat astrositlerini ise beş dakika boyunca tripsinize edin. Hücreler ayrıldıktan sonra, hücre kültürü ortamı ekleyerek tripsini inaktive edin. Ardından, Schwann hücrelerini ve astrositleri ayrı 15 mililitrelik falcon tüplerine aktarın ve 300 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.Bu sırada, bir cam kesici kullanarak dikdörtgen cam lamelleri, sınır analizleri için kullanılan oda slaytlarının genişliğine uygun olacak şekilde boyuna kesin; böylece hücre süspansiyon damlasının yayılması kolaylaşacaktır. Spin Resus işleminin ardından, Schwann hücrelerini ve astrositleri mL başına 2 x 10⁶ hücre yoğunluğunda süspande edin. Poli-lizinin kaplı bir oda slaytının bir ucuna, 50 µL'lik bir Schwann hücresi süspansiyon damlası yerleştirin.Düz bir kenar oluşturmak için cam bir lam şeridi kullanarak damlayı haznenin merkezine doğru yayın. Ardından, aynı kuyucuğun karşı ucuna 50 µL'lik ikinci bir astrosit süspansiyonu damlası yerleştirin ve bunu merkeze doğru yayın. İlkiyle paralel bir düz kenar oluşturmak için, iki damla arasında 0,2 mm boşluk kalmalıdır.Damlacıkları içeren oda slaytını iki saat boyunca 37 °C'deki inkübatörde bekletin. İki saatin ardından, yapışmamış hücresel kalıntıları temizlemek için kültürleri DMEM ile yıkayın.Schwann hücresi proliferasyonunu stimüle etmek için chamber slide'lara besiyeri ekleyin. Bu besiyeri, four galin ve sığır hipofiz özütü (BPE) ile takviye edilmiştir. Four galin, proliferasyonu indüklemek için Schwann hücreleri içindeki döngüsel AMP seviyelerini yükseltirken, BPE uzun süreli kültür için gerekli olan büyüme faktörlerini sağlayacaktır.Lamı sekiz ila 10 gün boyunca inkübe edin. İki hücre önü sonunda birbirine ulaşacak ve iki hücre tipi arasında keskin bir sınır oluşacaktır. Bu aşamada deneyler gerçekleştirilebilir.Sınırı incelemek için sınır oluşumunda yer alan faktörleri analiz ederken, ko-kültürü %4 formaldehit ile sabitleyin. Schwann hücrelerini ve astrositleri ayırt etmek için sırasıyla anti P 75 antikoru ve anti GFAP antikoru ile immün boyama yapın. P 75 antikoru, astrositlerde bulunmayan ve Schwann hücreleri üzerindeki düşük afiniteli NGF reseptörünü tanır; anti GFAP antikoru ise migrasyon deneyi gerçekleştirmek için astrositlerde yerelleşen glial fibriler asidik proteini tanır.Plaklama işlemine başlayın. 15 mm kuyucuklara sahip dört kuyucuklu bir plağın her kuyucuğuna, 1 ml besiyeri içinde 1 × 10⁵ astrosit ekleyin. Monotabaka tamamen konfluens olana kadar plağı 24 ila 48 saat boyunca 37 °C'lik inkübatörde bekletin.Bu sırada, astrosit monokatmanları üzerindeki migrasyonu değerlendirmek için swan hücrelerini hazırlamak amacıyla, dairesel polilizin kaplı cam lamelleri 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin ve bunları ezmek için plastik bir pipet kullanarak küçük cam parçaları oluşturun. Cam parçalarını pens yardımıyla altı kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğuna aktarın. Yaklaşık beş milimetre genişliğindeki parçaları seçin ve diğer kuyucukların her birine beşer adet aktarın.Schwann hücrelerini üç dakika boyunca tripsin I ile inkübe edin. Ardından hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 300 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Schwann hücrelerini kültür ortamında 2 × 10⁶ hücre/mL konsantrasyonda yeniden süspande edin.Ardından, her fragmanın üzerine 20 µL Schwann hücresi süspansiyonu ekleyin ve 37 °C'de %7 CO2 ortamında iki saat boyunca inkübe edin. İki saat sonra, Schwann hücrelerini inkübatörden çıkarın. Her kuyucuğa 2 µM, dört scale in ve 10 µg/mL BPE ile desteklenmiş yeterli miktarda kültür ortamı ekleyin.Böylece, hücrelerin yapıştığı fragmanlar tamamen besiyeri ile kaplanır ve cam fragmanlar tamamen swan hücreleriyle kaplanana kadar 24 ila 48 saat boyunca inkübe edilir. Fragmanlar swan hücreleriyle kaplandığında, hem swan hücrelerini hem de astrositleri inkübatörden çıkarın. Swan hücrelerinin yapıştığı her bir fragmanı dikkatlice almak için penset kullanın.Bağlanmamış hücreleri uzaklaştırmak için fragmanı HBSS'ye daldırın ve ardından yüzeyi aşağı gelecek şekilde astrosit monokatmanının üzerine ters çevirin. Tüm fragmanlar aktarıldıktan sonra, her bir kuyucuğa bir mililitre hücre kültür medyumu ekleyin.Büyüme faktörleri gibi deneysel reaktiflerin etkileri değerlendirilecekse, bunlar besiyerine eklenmelidir. Plaka inkübatöre geri yerleştirilmeli ve migrasyon süresini takiben Schwann hücrelerinin 24 ila 48 saat boyunca migrasyon yapmasına izin verilmelidir. Fiksasyon işleminin ardından %4 paraformaldehit eklenerek 30 dakika boyunca her kuyucuğun tabanındaki cam fragmanlar fikse edilir.Schwann hücrelerini P 75 için immün boyayın, ardından 10 gün sonra Schwann hücrelerinin ışık mikroskobu altında görüntülenmesini sağlamak için DIAM benadine tarafından sağlanan ABC Strept ADIN kiti ile boyayın. Schwann-astrosit ko-kültürü, iki hücre tipi arasında keskin bir sınır gösterir. Burada Schwann hücreleri P 75 ile tanımlanmıştır.Düşük afiniteli NGF reseptörünün boyanması kırmızı renkte görülmektedir ve GFAP boyaması ile tanımlanan astrositler yeşil renkte gösterilmiştir. Kültürde forskolin ve BPE kullanıldığında, Schwann hücresi proliferasyonu arttığı için bu hücreler arasındaki sınır daha belirgindir. Buna karşın, bu 10 günlük ko-kültür deneyinde hücreler farklı bölgelere iyi bir şekilde ayrışmamıştır.Bu durum, iki hücre tipinin karıştırılmasındaki ve uygulanan teknikteki yetersizlikten kaynaklanmıştır. Sınır deneyi hazırlanırken, migrasyon deneyleri bir hücre tipinin başka bir hücre tipinin yüzeyi üzerindeki hareketini değerlendirir ve bu nedenle sınır oluşumundan farklı bir fenomeni değerlendirmiş olur. Bu görüntü, lamellenin kenarından uzaklaşan kuğu hücrelerini göstermektedir; ok, hücre migrasyonunun yönünü belirtmektedir.Bu in vitro deneyler uygulanırken, reaktiflerin etkisinin astrositler veya Schwann hücreleri üzerinde olabileceğini hatırlamak önemlidir; bu nedenle, gözlemlenen artmış veya azalmış migrasyondan tam olarak hangi hücre tipinin sorumlu olduğunu göstermek için takip eden deneylerin yapılması gerekir. Ayrıca, özellikle sınır deneyinde, Schwann hücreleri ile astrositler arasındaki sınırda hangi moleküllerin yukarı veya aşağı regüle olduğunu göstermek için immünokimya gibi diğer teknikler uygulanabilir.

analysis-of-schwann-astrocyte-interactions-using-in-vitro-assays

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu makale, bir roman protokol ve reaktif bileşikler ve tedavilerin yüksek içerik analizi kullanarak nöronlar ve astrositler ortak kültürleri üzerinde nörotoksik etkileri hassas ölçümü için tasarlanmıştır ayarlamak açıklamaktadır. Sonuçlar yüksek bir içerik analizi nörotoksisite değerlendirmesi için heyecan verici yeni bir teknoloji temsil ettiğini göstermektedir.

Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi

Bu çalışma, bir roman nöronal akson ve (astro) glia ko-kültür platformu kurma prosedürleri açıklar. Bu ko-kültür sisteminde, bir tek akson (ve tek bir glial hücre) arasındaki doğrudan etkileşim manipülasyon glial sinyalleşme karşılıklı nöronların mekanik analiz izin veren, uygun olur.

Mikroakışkan Kültür Platformu Glia Etkileşimi (MCP) tabanlı Nöronal Akson ve Glia Co-kültür Sistemi Nöron görüntülenmesi Analizi

Burada SC'ler uzanan aksonlar boyunca geliştirmek için mümkün olduğu bir Schwann hücresi (SC) göç tahlil tarif.

Büyüyen Aksonlar boyunca murin Schwann Hücresi Kalkınma Analizi

Floklanmış, koşullu onkojenik alellerle tasarlanmış ve viral Cre aracılı rekombinasyon yoluyla transforme edilmiş farelerden toplanan fenotipik vahşi tip astrositler ve nöral kök hücreler, astrositom patogenezini modellemek için kullanılabilir in vitro ve in vivo dönüştürülmüş hücrelerin sinjeneik, bağışıklığı yetkin yavruların beyinlerine ortotopik enjeksiyonu ile.

Modelleme Astrositom Patogenez İn Vitro Ve In Vivo Kortikal Astrositler veya Şartlı, Genetiği fareler ile Nöral Kök Hücreler kullanma

Bu protokol nöron glia etkileşimlerinin bölümlere analizi için dolaylı nöron astrosit kokültürü açıklar.

Dolaylı nöron astrosit Coculture Deneyi: Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Nöron glia Etkileşimleri Detaylı Soruşturma Set-up

Kan-beyin bariyerinin korunması, merkezi sinir sisteminin homeostazı için kilit unsurdur. Bu protokol, kan-beyin bariyerinin kapsamını düzenleyen temel ve patolojik süreçleri tanımlamak için in vitro teknikleri tanımlamaktadır.

Kan-beyin Bariyeri Mesh Benzeri Gemi Oluşumu ve Kesintisini Değerlendiren İn Vitro Tahliller

Burada açıklanan AWESAM iletişim kuralı diğer beyin hücreleri izolasyonu fare astrocytes bir hızlı, basit ve ucuz şekilde kültür için en iyi yöntemdir. AWESAM astrocytes spontan Ca2 + sinyal, morfoloji ve gen ifade profilleri için astrocytes vivo içindebenzer sergi.

Vivokültür-tarihlerde hızlı, basit ve ucuz AWESAM iletişim kuralını kullanarak fare Astrocytes

Burada, nörovasküler birim bozulma deneysel otoimmun ensefalomiyelit içinde vivo sırasında araştırmak için protokolleri mevcut. Biz özellikle kan - beyin bariyerini geçirgenliği ve gelatinase etkinlik lökosit göç dahil glia limitans belirlemek nasıl adres.

Nörovasküler biriminin endotel ve gliyal engelleri bozulma Vivo deneysel otoimmun ensefalomiyelit sırasında görüntülenmesi

Burada, organellerin hücre içi naklini ve murine astrositlerinde plazma membran proteinlerinin ticaretini görselleştirmek için in vitro canlı görüntüleme yöntemini açıklıyoruz. Bu protokol aynı zamanda kargo taşımacılığı güzergahları ve kinetik belirlemek için bir görüntü analizi metodolojisi sunar.

Astrositlerde Organeller ve Diğer Kargoların Hücre İçi Taşınmasının Görselleştirilmesi ve Analizi

Bu protokol, nöro (immüno) loji araştırması için embriyonik gün 17 fare beyinlerinden merkezi sinir sistemi hücre kültürleri üretmenin benzersiz bir yolunu sunar. Bu model, RT-qPCR, mikroskopi, ELISA ve akış sitometrisi dahil olmak üzere çeşitli deneysel teknikler kullanılarak analiz edilebilir.

Embriyonik Fare Beyinlerinden Enfeksiyonu ve Doğuştan Gelen Bağışıklığı İncelemek için Karışık Nöronal ve Glial Hücre Kültürleri Oluşturmak

Burada, genişletilmiş ex vivo deneyler için retinayı fare gözünden izole etmek için ayrıntılı bir metodoloji sunuyoruz. Bu protokol, retinal glia'yı canlı dokuda yerinde tutmanın sağladığı araştırma yollarından yararlanmak isteyen araştırmacılar için bu teknik olarak zorlu yaklaşımı erişilebilir kılmayı vurgulamaktadır.

Fare retinasındaki glial etkileşimleri incelemek için bir ex vivo eksplant modeli

Öğrenin, Schwann hücreleri ve astrositler arasındaki etkileşimleri in vitro tahlillerle nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntemler, omurilik yaralanmalarının onarım stratejilerini geliştirmeye yardımcı olur.

Schwann-astrosit Etkileşimleri Analizi In Vitro Tahliller

Daha fazla video keşfet