Enzim-linked immünospot Testi (ELISPOT): Th-1 Mikrobiyal antijenlere karşı hücresel immün cevaplar Kantitasyonu

Bu prosedürün genel amacı, ilgi duyulan antijenlere karşı gelişen T hücresi yanıtlarını tespit etmektir. Bu işlem, öncelikle yakalama antikorları ile kodlama yapılarak gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, hücrelerin ve ilgi duyulan antijenlerin eklenmesi ve ardından gece boyunca inkübe edilmesidir.

Prosedürün üçüncü adımı deteksiyon antikorlarının eklenmesidir. Prosedürün son adımı, plakların substrat reaktifleri ile geliştirilmesi ve lekelerin analiz edilmesidir. Nihayetinde, leke oluşturan birimlerin analizi yoluyla ilgilenilen sitokinlerin seçildiği sonuçlar elde edilebilir.

Merhaba, ben Dr. Ki Richter; Vanderbilt Üniversitesi Bulaşıcı Hastalıklar bölümünde, Dr. Wonder Drake'in laboratuvarında araştırma eğitmeni olarak görev yapıyorum. Bugün, enzimle bağlantılı immünospot testi olarak da bilinen ELISpot tekniğini gösteriyoruz. Dr. Isfahan Chambers ve Tiffany Cone, tekniği bugün sizlere uygulamalı olarak gösterecekler.

Hücre kültürü standartlarını korumak için, manipülasyonları steril koşullar altında çeker ocak içinde gerçekleştirin, bir ally spot plakası açın ve PBS ile üç kez yıkayın. PBS içinde yakalama antikorundan oluşan bir kaplama çözeltisi hazırlayın. Kolaylık sağlamak için vorteksleyerek iyice karıştırın.

Antikor çözeltisini çok kanallı pipet için bir rezervuara aktarın ve her bir kuyucuğa 100 µL kaplama çözeltisi ekleyin. Plakayı parafilm ile kapatın ve gece boyunca buzdolabında bekletin. Antikorla kaplanmış bu plakalar haftalarca saklanabilir.

Genel kural, kuyucuklarda hala sıvı kaldığı sürece bir plakanın kullanılabileceğini belirtir. Hücreleri bu analiz için hazırlamak amacıyla, yeni izole edilmiş periferik kan mononükleer hücrelerini canlılık analizi için tripan mavisi ile boyayın ve sayın. PBMC'leri 10 medya içerisinde mililitre başına 2 milyon hücre olacak şekilde plakaya ekin ve 37 °C'de, %5 karbondioksit ile gece boyunca inkübe edin. Deneyi takip edebilmek için, Ali spot plaka kapağını numune tanımlama numarası, kuyucuk koşulları ve tarihle etiketleyin.

Plakayı boşaltma ve kurutma yöntemini kullanarak steril PBS ile altı kez yıkayın. Boşaltma işlemi sırasında plağı sıçratmamaya dikkat edin, çünkü bu durum plaka kuyucuklarının mora dönmesine neden olabilir. Her kuyucuğa 20 µL besiyeri ekleyin ve plağı 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.

Plaka inkübe olurken, gece boyunca dinlendirilen hücreleri sayın. PBMC'leri santrifüj ile hasat edin. Süpernatantı dökün ve pelletini 10 medya içerisinde mililitre başına 1 milyon hücre konsantrasyonunda yeniden süspanse edin.

Ally spot plakalarının bir saatlik inkübasyonundan sonra, R 20 besiyerini dökme ve kurulama yöntemiyle uzaklaştırın. Dökme işlemi sırasında plağa sıçratmamaya dikkat edin. Her birine 100 µL hücre süspansiyonu ekleyin.

Peptitlerin ve antijenlerin ilgili test kuyucuklarına eklenmesiyle deneysel tasarıma devam edilecektir. Her zaman peptit içermeyen hücrelerden oluşan bir negatif kontrol ve ayrıca fitohemaglutinin eklenmiş pozitif kontrol kuyucukları ekleyin. Plakayı 37 °C'de, %5 karbon dioksit içeren ortamda gece boyunca inkübe edin.

Plakayı, dökme ve kurulama yöntemiyle 150 µL 1x PBS ile altı kez yıkayın. Plakanın her kuyucuğuna 100 µL PBS ekleyin ve plakayı 15 dakika boyunca buzdolabında veya oda sıcaklığında bekletin. Bu sırada, PBS içinde biotinli antikor çözeltisini hazırlayın.

ALI spot plakasını buzdolabından çıkarın ve PBS'yi çöp kutusuna silkeleyerek boşaltın. Her kuyucuğa biotinli antikor çözeltisinden bir alikot eklerken plağı sıçratmamaya dikkat edin ve plağı doku kültürü davlumbazında oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Plağı PBS ile altı kez yıkayın ve son yıkamada boşaltma ve kurutma (dump and blot) yöntemini kullanın.

PBS'yi şimdi plaka üzerinde bırakın. Çözeltiyi karıştırmak için vortekslediğinizden emin olarak, PBS içinde STREPTAVIDIN antikor çözeltisini hazırlayın. Kuyucuklardaki son PBS yıkamasını boşaltın ve ALI spot plakasını yerleştirin.

Her bir kuyucuğa streptavidin antikor çözeltisi ekleyin ve plakayı doku kültürü davlumbazında, oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Fazla streptavidin antikoru uzaklaştırmak için plakayı altı kez PBS ile yıkayın; son yıkamada dökme ve kurutma yöntemini kullanın ve plakada PBS bırakın. B-C-I-P-M-B-T alkalin fosfataz substrat çözeltisinin ışığa duyarlılığı göz önünde bulundurulmalıdır.

Alkali fosfataz substrat kiti talimatlarında üreticiler tarafından açıklandığı şekilde stok çözeltiyi hazırlarken karanlıkta çalışın; kuyucuklarda kalan PBS'yi boşaltın ve ly spot plakasını kurulayın. Her kuyucuğa substrat çözeltisi ekleyin ve ışığı açın. Beş ila 10 dakikalık renk gelişimi sonrası, lekeler morarmaya başlayıp iyice koyulaşana kadar reaktiflerin plakada kalmasını sağlayın.

Bu işlem 20 dakikaya kadar sürer. Ali spot plakasını musluk suyuyla üç kez yıkayın ve havada kurumaya bırakın. Her plaka; bir pozitif kontrol, bir negatif kontrol ve ilgilenilen peptidin en az çift örneğini (duplicate) içerir.

Pozitif kontrol kuyucukları, konfluent bir hücre tabakasını yansıtan koyu mor bir renge sahiptir ve neredeyse hiç beyaz arka plan görülmez. Negatif kontrol kuyucuklarında, beklendiği üzere mor arka plan ve leke bulunmamaktadır. Test örneği kuyucukları ise buradaki mikrobiyal peptitlere karşı verilen hücresel yanıtları göstermektedir.

LA spot tekniği uygulandığında, mor lekeler ilgili sitokini eksprese eden tek bir yanıt veren hücreyi temsil eder. Lütfen pipet uçlarıyla membranı delmemeye veya plakanızın kurumasına izin vermemeye dikkat edin; çünkü bu durum yüksek arka plan gürültüsüne yol açacaktır.