Name: Enzim-linked immünospot Testi (ELISPOT): Th-1 Mikrobiyal antijenlere karşı hücresel immün cevaplar Kantitasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Öğrenin ELISPOT yöntemiyle T hücre yanıtlarını mikrobiyal antijenlere karşı nasıl kantite edeceğinizi. Bu teknik idiyopatik hastalıklarda adaptif bağışıklık hedeflerini belirlemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Vanderbilt CTSA hibe 1 UL1 RR024975, Ulusal Araştırma Kaynakları, Ulusal Sağlık Enstitüleri için Merkezi tarafından kısmen desteklenir. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, R01 HL 83.839 tarafından finanse edildi; R01 AI 65.744.

Aşağıdaki protokolü için, ilgi hücreleri gibi periferik kan mononükleer hücreleri (hücre) kullanın. Ancak, bu protokol, diğer hücre tipleri ile kullanılabilir . Steril tekniği kullanarak bir doku kültürü kaputun içindeki tahlil gerçekleştirin. 1. Gün: Plaka ve Hücreler Hazırlık <ol><li> ELISPOT plaka çıkarın ve kaputu açın. </li><li> Varsa, aksi takdirde tek iyi pipetleme, kabul edilebilir, çok kanallı pipet kullanarak 1X PBS 150 mcL plaka, 3 kere yıkayın. </li><li> Rezervuarların bir paket çıkarın ve kaputu açın. </li><li> 2 mcg / ml yakalama antikor, anti-insan interferon-γ, 1X PBS 11 mL. Iyi Vortex. Bir rezervuar antikor karışımı aktarın. </li><li> Her biri de çok kanallı kullanarak 100 mcL kaplama çözüm yerleştirin. </li><li> Parafilm plaka sarın. </li><li> Bir gece buzdolabında tabak koyun. Plakalar hafta için iyi. Başparmak kuralı kuyuları sıvı sol hala varsa, plaka kullanılabilir olması. </li></ol> Hücre Hazırlık Sonra 37 PBMC'ler taze hücrelerin sayısı ve geceleme inkübe ° C,% 5 CO 2 ile. Hücre için hücre çözülme gerekli olan, sıvı nitrojen içinde saklanır. Protokol aşağıdaki gibi: <ol><li> 37 neredeyse tamamen çözülmüş kadar ° C su banyosunda hücrelerin cryovial çözülme. </li><li> Hemen R10 medya 5 ml tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> 225 x g. az 5 dakika Spin </li><li> R10 medya 5 ml yeniden süspanse edin ve tripan mavi kullanarak canlı hücreleri saymak. </li><li> R10 medya 2 x 10 6 hücre / mL konsantrasyon getir. </li><li> ° C ile% 5 CO 2 37 geceleme dinlendirin. </li></ol> 2. Gün: Plaka Oluşturmaya <ol><li> Örnek kimlik numarası, iyi şartlar, tarih ve etiket plakası kapak. </li><li> Dökümü ve blot yöntemi kullanarak, steril 1x PBS 150 mcL plaka 6 kez yıkayın. Damping ise plaka sıçrama için dikkatli olun. Bu mor plaka kuyu açmak için neden olabilir. </li><li> Her bir kuyunun R20 100 mcL ekleyin. </li><li> 37 ° C'de 1 saat süreyle plaka inkübe edin. </li><li> Plaka kuluçka iken, gece dinlenmiş olan hücreleri saymak. </li><li> 1500 rpm'de 5 dakika boyunca hücre süspansiyonu dönerler. Süpernatantı Durusu ve R10 medya 1mL başına 1x10 6 hücre nihai bir konsantrasyon böylece pelet tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> 1 saat inkübasyondan sonra, R20 dökümü ve blot yöntemi kullanarak. Damping ise plaka sıçrama için dikkatli olun. </li><li> Her bir kuyunun 100 mcL (10 5 hücreleri) hücre çözüm ekleyin. Nüsha halinde ilgili kuyulara uygun peptidler ve / veya antijenleri ekleyin. Yeni bir pipet ucu peptid çalışma çözeltisinin içine gitmek her zaman kullanın. Normal peptid konsantrasyonu 10-40 mg / ml. Peptidler değişir bu yana, her araştırmacı, optimum sonuçlar elde etmek için peptidler titre. </li><li> Negatif kontrol kuyularda, sadece hücreleri (peptidler) </li><li> Pozitif kontrol kuyularda, fitohemaglütininle (10 mg / ml; Sigma PHA) ekleyin. </li><li> Gece 37 ° ° C'de% 5 CO 2 (~ 18 saat). </li></ol> 3. Gün: Plaka Geliştirilmesi <ol><li> Dökümü ve blot yöntemi kullanarak 150 mcL 1xPBS plaka 6 kez yıkayın. </li><li> Plaka kanallı pipet kullanarak her bir kuyunun 100 mcL PBS ekleyin. </li><li> 15 dakika boyunca buzdolabında plaka koyun. </li><li> Buzdolabı plakasını alın ve doku kültürü kaputu yerleştirin. </li><li> Biotin antikor çözüm hazırlayın <ul><li> 11mL PBS 0.5 mikrogram / mL biotin antikor (MAB 7-B6-1) ekleyin. </li><li> Vortex iyice karıştırın çözüm. </li><li> Eğer çok kanallı bir çözüm eklemek için planlama, bir rezervuar içine dökün. </li></ul></li><li> Çöp sepeti içine Flicking PBS atın. Damping ise plaka sıçrama için dikkatli olun. </li><li> 100 mcL çözüm her bir kuyunun içine yerleştirin. </li><li> Bir saat boyunca oda sıcaklığında doku kültürü kaputu plaka inkübe edin. </li><li> Dökümü ve blot yöntemi kullanarak 150μL 1xPBS plaka 6 kez yıkayın. Streptavidin antikor hazırlanmış kadar 6. yıkama, PBS plaka üzerinde bırakın. </li><li> Streptavidin antikor hazırlayın. <ul><li> 11mL PBS (1:2000 dilüsyon) 5.5 μ l Streptavidin antikor (Streptavidin ALP) ekleyin. </li><li> Vortex iyice karıştırın çözüm. </li><li> Eğer çok kanallı bir çözüm eklemek için planlama, bir rezervuar içine dökün. </li></ul></li><li> PBS kuyulardan kalan atın ve plaka kurulayın. </li><li> Streptavidin çözüm her bir kuyunun 100 mcL ekleyin. </li><li> 1 saat oda sıcaklığında doku kültürü kaputu plaka inkübe edin. </li><li> Plakalar PBS dökümü ve blot yöntemi ile 6 kez yıkayın. Renk çözüm yaptık kadar 6. yıkama, plaka PBS bırakın. </li><li> Karanlıkta çalışın. Alkalen fosfataz substrat çözeltisi (Alkalin Fosfataz Yüzey Kit IV BCIP / NBT) hazırlayın: <ul><li> Substrat reaktif 1-11 ml Tris tamponu, iyi vorteks 4 damla ekleyin. Tris tamponu, iyi vorteks substrat reaktif 2 4 damla ekleyin. Tris tamponu, iyi vorteks substrat reaktif 3 4 damla ekleyin. </li></ul></li><li> Kalan PBS atın ve plaka kurulayın. </li><li> Plaka çok kanallı kullanarak her bir kuyu için renk çözüm 100 mcL ekleyin. </li><li> 5 ila 10 dakika renk geliştirdikten sonra ışığı açın. </li><li> Mor lekeler açmak için başlar ve oldukça koyu renk reaktifleri kadar plaka kalmasına izin verin. Bu yerden 5 ila 20 dakika sürer. Bunu yaparken yüksek arka plan neden olabilir, çünkü çok uzun substrat çözeltisi bırakmayacak şekilde dikkatli olun. </li><li> ELISPOT plaka 3 kez musluk suyu ile yıkayın. </li><li> Yaklaşık bir saat veya gece boyunca kurumaya bırakın. </li><li> Elle veya ELISPOT plaka okuyucu ile plaka okuyun. </li><li> Işığa maruz plaka uzak bir kutu içinde saklayın. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar: ELISPOT mikrobiyal antijenlere karşı bağışıklık tepkileri ölçmek için tasarlanmıştır. Her nokta, tek bir yanıt veren hücre ilgi sitokin ifade gösterir. Noktalar elle veya bir ELISPOT plaka okuyucu kullanarak sayılabilir. ELISPOT doğru yapılmış olduğunu Değerlendirme arka plan ilgi sitokin üretimi için negatif kontrol soruşturma ile başlamalıdır. Küçük bir arka plan (mor renkli) olabilir, ancak negatif kontrol kuyularında bir noktalar görmeyi bekliyorum. Tipik olarak, bir de başına beş noktalar ortalamasından daha az olmalıdır. Pozitif kontrol kuyuları tepki doğru olduğunu onaylayın ve hücrelerin antijenik stimülasyon duyarlı olduğunu. Pozitif kontrol kuyularında noktalar k (fiekil 1) bir izdiham nedeniyle derin bir mor arka planı görmek için beklenebilir. Hiçbir beyaz arka plan az olmamalıdır. Pozitif kontrol ve negatif kontrol örnekleri uygun değilse, bir sonra ilgi antijen içeren kuyu güvenebilirsiniz. "Optimal" sonucu yüksek arka plan (kuyu mor), hiçbir noktalar ya da çok az sayıda lekeler, boş merkezi, yetersiz tanımlanmış noktalar veya confluent lekeler yansıması olacaktır. Sorun giderme ipuçları listesi (Tablo 1). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/2221/2221fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 ELISPOT plaka bir temsilcisi. Her plaka pozitif kontrol, negatif kontrol ve en az iki kuyularda yapılan faiz peptid içermelidir. Koyu mor bir renk, konfluent hücreleri ve neredeyse hiç beyaz bir arka plan var gördüğünüz gibi C9, C10, D9 ve D10, pozitif kontrol kuyuları vardır. Negatif kontrol kuyuları, G11, G12, H11 ve H12. Bu kuyular mor bir arka plan ve beklendiği gibi herhangi bir noktalar var. Noktalar G7, G8, H7 ve H8, mikrobiyal peptidler hücresel yanıtları göstermek mor lekeler ilgi sitokin ifade eden bir tek duyarlı hücre temsil eder. Tablo 1 <table border="1"><tbody><tr><td> Gözlem </td><td> Olası Sorun </td><td> Olası Çözüm </td></tr><tr><td> Yüksek arka plan </td><td> 1. Membran Her iki taraf da doğru yıkanmış değil 2. Çok sayıda hücre salgılayan sitokin 3. Plaka düzgün kurutulmuş yanlış 4. Aşırı gelişmiş plaka </td><td> 1. Renk gelişimi öncesi ve sonrası, distile su ile zarının her iki taraf yıkayın. Reaktifler zarından plaka taban içine sızabilir ve yıkanıp değilse bu yüksek arka plan neden olabilir. 2. De her bir hücre sayısını azaltın, bu optimizasyon gerekecektir 3. Okumadan önce plaka uzun Kuru 4. Gelişmekte olan zamanı azaltın </td></tr><tr><td> Çok az lekeler / Spotlar yok </td><td> 1. Salgılayan sitokin / ilgi protein, yeterli hücre 2. Doğru hücreler uyarılır olun 3. L inkübe hücreleryeterli ong veya uyarıcı cevap vermek için zaman alabilir 4. Yetersiz renk gelişimi 5. Yeterince birincil ya da ikincil antikoru </td><td> 1. Hücre sayısını artırın. Bu optimizasyon gerekecektir 2. Ayrıca olumlu bir stimülasyon kontrol sitokin / ilgi protein ifadesi neden olacak bildiğiniz bir uyarıcı - 3. Hücre inkübasyon süresi artırın veya dolaylı yöntemi (uyarıcı tedavi ile ön hücreleri) kullanabilirsiniz 4. Havai bir mikroskop ile renk gelişimini izlemek ve gelişmekte olan reaktiflerin doğru saklanır ve aktivite kayıp değil sağlamak 5. Birincil ve / veya sekonder antikor konsantrasyonu artırılması gerekmektedir. Bu optimizasyon gerektirir. </td></tr><tr><td> Boş Alanları </td><td> 1. Membran önceden tedavi edilmezse 2. Membran bazı aşamada kuruduktan 3. Hücreler dengesiz dağıtılmış </td><td> 1. Emin olun zarı yeterince% 70 etanol (membranlar bu tedarikçi ile kontrol gerekmez) ile ön işlem. Daha sonra PBS 3X ile iyice yıkayın 2. Membran kuru değildir olun 3. Kuyulara pipetleme önce iyi bir homolog hücre süspansiyonu hücreler yavaşça karıştırınız olun </td></tr><tr><td> Boş Merkezi </td><td> 1. Yıkama hasar </td><td> 1. Otomatik yıkama (ya da pipetleme) Akış hızı çok yüksek olabilir. Daha yumuşak bir yıkama prosedürü ihtiyacınız var </td></tr><tr><td> Yanlış Pozitif </td><td> 1. Sekonder antikor agrega 2. Hücreler hala membran 3. Hücre kültürü kirlenmesine </td><td> 1. Filtre ikincil antikor 2. Tüm hücreleri sekonder antikoru inkübasyon önce PBS Tween 20 ile membran yıkanır olun. Membran sol hücreler düzensiz şekilli noktalar verecektir 3. Reaktifler steril ve mümkün olduğunca temiz tutun. Hücre kültürü tekniği steril olduğundan emin olun. Bir medya negatif kontrol çalıştırarak yanlış pozitif olup olmadığını kontrol edin. Plaka hareket için, <a href="http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&amp;rid=11457#7">yetersiz tanımlanmış noktalar</a> </td></tr><tr><td> Konfluent Spotlar </td><td> 1. Zavallı kaplama, çok fazla antikor 2. Uzun süreli hücre kültürü 3. Hücreleri üzerinde uyarılmış </td><td> 1. Primer antikor konsantrasyonunu azaltacak 2. Hücrelerin ne kadar uzun süre inkübe edilir, daha fazla sitokin / protein salgılanır. Bu birleştirme ve ayırt edilemez hale başlayacak büyük noktalar neden olacaktır. 3. Hücre kültürü adım inkübasyon süresi azaltın. Aşırı stimülasyon sitokin / hücre tarafından salgılanan protein bir sürü neden olacaktır. Bu birleştirme ve ayırt edilemez hale başlayacak noktalar üretecektir. Kısa bir zaman miktarı için, kültür ortamı veya kültür uyarıcı miktarını azaltın </td></tr><tr><td> Yeteri kadar Tanımlı Spotlar </td><td> 1. Membran önişlemden (membran gerektiriyorsa, tedarikçi ile kontrol) 2. Hücre inkübasyon sırasında Plaka hareketi </td><td> 1. Membran, etanol ya da bu bulanık, kötü tanımlı noktalar yol açabilir önceden tedavi edilmelidir. Okuyucu bu ayırt etmek zor olacak 2. Taşındı hücrelerin birden fazla spot yaratacaktır plaka hücre inkübasyon sırasında taşımak için izin vermeyin. İnkübasyon sırasında açılmayacaktır adanmış bir inkübatör kullanmak. Plak hücreler ekledikten sonra dokunmayın </td></tr><tr><td> Pozitif Kontrol kuyuları düşük. </td><td> 1. Azgelişmişlik - oda sıcaklığına getirilmelidir henüz Streptavidin-ALP ve / veya BCIP / NBT çözümleri kullanarak bir sonucu olabilir </td><td> 1. Reaktifler kuyulardan eklemeden önce oda sıcaklığına getirin </td></tr><tr><td> Yoğunluk lekelerin zor onları ölçmek için yapar </td><td> 1. Çok sayıda hücre kuyulara ilave edildi </td><td> 1. Ayrı lekelerin oluşumuna neden olacaktır hücre optimal sayısını belirlemek için hücre dilüsyonları (yani, 1 de ortalama x 10 6, 5 x 10 5, 1 x 10 5, 5 x 10 4, 1 x 10 4 hücreleri) </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Dosanjh, D. P., Hinks, T. S., Innes, J. A., Deeks, J. J., Pasvol, G., Hackforth, S., Varia, H., Millington, K. A., Gunatheesan, R., Guyot-Revol, V., Lalvani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+diagnostic+evaluation+of+suspected+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Improved diagnostic evaluation of suspected tuberculosis.</a> Ann Intern Med. 148, 325-336 (2008).</li>
<li>Sung, H. K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+abdominal+tuberculosis+by+T-cell+based+assays+on+peripheral+blood+and+peritoneal+fluid+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of abdominal tuberculosis by T-cell based assays on peripheral blood and peritoneal fluid mononuclear cells.</a> Journal of Infection. 59, 409-415 (2009).</li>
<li>Kim, S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+Central+Nervous+System+Tuberculosis+by+T-Cell-Based+Assays+on+Peripheral+Blood+and+Cerebrospinal+Fluid+Mononuclear+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Vaccine+Immunology%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of Central Nervous System Tuberculosis by T-Cell-Based Assays on Peripheral Blood and Cerebrospinal Fluid Mononuclear Cells.</a> Clinical and Vaccine Immunology. , 1356-1362 (2008).</li>
<li>Drake, W. P., Dhason, M. S., Nadaf, M., Shepherd, B. E., Vadivelu, S., Hajizadeh, R., Newman, L. S., Kalams, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+recognition+of+Mycobacterium+tuberculosis+ESAT-6+and+KatG+peptides+in+systemic+sarcoidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Cellular recognition of Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 and KatG peptides in systemic sarcoidosis.</a> Infect Immun. 75, 527-530 (2007).</li>
<li>Allen, S. S., Evans, W., Carlisle, J., Hajizadeh, R., Nadaf, M., Shepherd, B. E., Pride, D. T., Johnson, J. E., Drake, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+dismutase+A+antigens+derived+from+molecular+analysis+of+sarcoidosis+granulomas+elicit+systemic+Th-1+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Res%22%5BJournal%5D)">Superoxide dismutase A antigens derived from molecular analysis of sarcoidosis granulomas elicit systemic Th-1 immune responses.</a> Respir Res. 25, 36-36 (2008).</li>
<li>Mutsvangwa, J., Millington, K. A., Chaka, K., Mavhudzi, T., Cheung, Y. B., Mason, P. R., Butterworth, A. E., Corbett, E. L., Lalvani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+recent+Mycobacterium+tuberculosis+transmission+in+the+setting+of+high+HIV+and+TB+burden%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Identifying recent Mycobacterium tuberculosis transmission in the setting of high HIV and TB burden.</a> Thorax. 65, 315-320 (2010).</li>
<li>Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+IFN-gamma+Elispot+assay+in+HIV+vaccine+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research.</a> Nat Protoc. 4, 461-469 (2009).</li>
<li>Chaudhary, N., Staab, J. F., Marr, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healthy+human+T-Cell+Responses+to+Aspergillus+fumigatus+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Healthy human T-Cell Responses to Aspergillus fumigatus antigens.</a> PLoS One. 5, e9036-e9036 (2010).</li>
<li>Manigold, T., Mori, A., Graumann, R., Llop, E., Simon, V., Ferr, S. M., Valdivieso, F., Castillo, C., Hjelle, B., Vial, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+differentiated%2C+resting+gn-specific+memory+CD8%2B+T+cells+persist+years+after+infection+by+andes+hantavirus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Highly differentiated, resting gn-specific memory CD8+ T cells persist years after infection by andes hantavirus.</a> PLoS Pathog. 6, e1000779-e1000779 (2010).</li>
<li>Ndongala, M. L., Kamya, P., Boulet, S., Peretz, Y., Rouleau, D., Tremblay, C., Leblanc, R., Côté, P., Baril, J. G., Thomas, R., Vézina, S., Boulassel, M. R., Routy, J. P., Sékaly, R. P., Bernard, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+function+of+HIV-specific+T-cell+responses+with+increasing+time+from+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Viral+Immunol%22%5BJournal%5D)">Changes in function of HIV-specific T-cell responses with increasing time from infection.</a> Viral Immunol. 2, 159-168 (2010).</li>
</ol>

ELISPOT testi insanlarda bağışıklık yanıtlarını izlemek için en önemli ve en yaygın olarak kullanılan testlerin biri olarak ortaya çıktı ve diğer türlerin bir çeşitlilik vardır. ELISPOT testi ile, bağışıklık hücre frekansları hücre popülasyonlarının genişleme veya manipülasyon olmadan tek hücre düzeyinde ölçülebilir. ELISPOT testinin yaygın enfeksiyon, kanser, alerji ve otoimmün hastalıklar da dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda antijen spesifik bağışıklık yanıtlarını araştırmak için uygulanmıştır. Bu testin uygulam...

A. Medya hazırlanması <img src="/files/ftp_upload/2221/2221materialsA.jpg" alt="Malzeme A"> Tris Buffer B. Hazırlık <ol><li> GKD 2 O 800 ml, 1 L beher ekleyin . </li><li> Tris 12 gram ölçün ve beher ekleyin. </li><li> Behere: magnezyum klorür hekzahidrat 0.12 gram (6H 2 O MgCl 2) ekleyin. </li><li> Otomatik karıştırma plaka üzerinde manyetik karıştırma çubuğu ile karıştırın. </li><li> Bir kez 9,5 pH, çözünmüş. </li><li> 1000ml için o kadar getirerek, GKD 2 O 200 ml beher ekleyin. </li><li> 0.22 mikron filtre ile çözüm Filtresi. </li></ol> ELISPOT analiz için gerekli olan C Malzemeler: <img src="/files/ftp_upload/2221/2221materialsb.jpg" alt="Malzeme Yatak">

enzim-linked immünospot testi (elispot): th-1 mikrobiyal antijenlere karşı hücresel immün cevaplar kantitasyonu

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Adaptif bağışıklık hücre içi patojenlerin temizlenmesi için önemli bir bileşenidir. İnsanlarda bu tepkileri algılamak ve ölçmek için yeteneği önemli bir tanı aracıdır. Enzyme-linked immünospot assay (ELISPOT), transplantasyon ile HIV enfeksiyonu olanlar gibi bağışıklık sistemi baskılanmış popülasyonları ve steroid kullanımı da dahil olmak üzere, mikrobiyal antijenlere karşı hücresel immün yanıtları belirlemeye kabiliyetini popülerlik kazanıyor. Bu test spesifik mikrobiyal antijenlere karşı bağışıklık yanıtları yanı sıra, bu yanıtları karakter Th1 veya Th2 ayırt ölçmek için kapasitesine sahiptir. ELISPOT inflamasyon site ile sınırlı değildir. Bu onun yeteneği yanı sıra periferik kan, bronkoalveoler lavaj, beyin omurilik sıvısı ve assit olarak aktif katılımı siteleri içinde bağışıklık yanıtlarını değerlendirmek için çok yönlüdür. Tek veya birden fazla antijene karşı bağışıklık yanıtlarını tespiti mümkündür yanı sıra mikrobiyal proteinler içinde belirli epitoplar. Bu testte, zamanla bağışıklık yanıtlarını tespiti yanı sıra konak T hücreleri tarafından tanınır antijenleri ayrımlar kolaylaştırır. Çift renkli ELISPOT testleri aynı anda iki sitokinlerin ifade tespiti için kullanılabilir. Bu teknik için yeni uygulamalar ekstrapulmoner tüberküloz tanısı yanı sıra otoimmün hastalıklar bulaşıcı antijenlerin katkısının araştırılması.

Adaptif bağışıklık idiyopatik hastalıklar mikrobik hedeflerin belirlenmesi, enzim bağlı immünospot testinin kullanımı yapılabilir.

Enzim-linked immünospot Testi (ELISPOT): Th-1 Mikrobiyal antijenlere karşı hücresel immün cevaplar Kantitasyonu

Adaptif bağışıklık, hücre içi patojenlerin temizlenmesinde önemli bir bileşendir. İnsanlarda bu yanıtları saptama ve miktarlaştırma yeteneği, bir ...

Bu prosedürün genel amacı, ilgi duyulan antijenlere karşı gelişen T hücresi yanıtlarını tespit etmektir. Bu işlem, öncelikle yakalama antikorları ile kodlama yapılarak gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, hücrelerin ve ilgi duyulan antijenlerin eklenmesi ve ardından gece boyunca inkübe edilmesidir.Prosedürün üçüncü adımı deteksiyon antikorlarının eklenmesidir. Prosedürün son adımı, plakların substrat reaktifleri ile geliştirilmesi ve lekelerin analiz edilmesidir. Nihayetinde, leke oluşturan birimlerin analizi yoluyla ilgilenilen sitokinlerin seçildiği sonuçlar elde edilebilir.Merhaba, ben Dr. Ki Richter; Vanderbilt Üniversitesi Bulaşıcı Hastalıklar bölümünde, Dr. Wonder Drake'in laboratuvarında araştırma eğitmeni olarak görev yapıyorum. Bugün, enzimle bağlantılı immünospot testi olarak da bilinen ELISpot tekniğini gösteriyoruz. Dr. Isfahan Chambers ve Tiffany Cone, tekniği bugün sizlere uygulamalı olarak gösterecekler.Hücre kültürü standartlarını korumak için, manipülasyonları steril koşullar altında çeker ocak içinde gerçekleştirin, bir ally spot plakası açın ve PBS ile üç kez yıkayın. PBS içinde yakalama antikorundan oluşan bir kaplama çözeltisi hazırlayın. Kolaylık sağlamak için vorteksleyerek iyice karıştırın.Antikor çözeltisini çok kanallı pipet için bir rezervuara aktarın ve her bir kuyucuğa 100 µL kaplama çözeltisi ekleyin. Plakayı parafilm ile kapatın ve gece boyunca buzdolabında bekletin. Antikorla kaplanmış bu plakalar haftalarca saklanabilir.Genel kural, kuyucuklarda hala sıvı kaldığı sürece bir plakanın kullanılabileceğini belirtir. Hücreleri bu analiz için hazırlamak amacıyla, yeni izole edilmiş periferik kan mononükleer hücrelerini canlılık analizi için tripan mavisi ile boyayın ve sayın. PBMC'leri 10 medya içerisinde mililitre başına 2 milyon hücre olacak şekilde plakaya ekin ve 37 °C'de, %5 karbondioksit ile gece boyunca inkübe edin. Deneyi takip edebilmek için, Ali spot plaka kapağını numune tanımlama numarası, kuyucuk koşulları ve tarihle etiketleyin.Plakayı boşaltma ve kurutma yöntemini kullanarak steril PBS ile altı kez yıkayın. Boşaltma işlemi sırasında plağı sıçratmamaya dikkat edin, çünkü bu durum plaka kuyucuklarının mora dönmesine neden olabilir. Her kuyucuğa 20 µL besiyeri ekleyin ve plağı 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.Plaka inkübe olurken, gece boyunca dinlendirilen hücreleri sayın. PBMC'leri santrifüj ile hasat edin. Süpernatantı dökün ve pelletini 10 medya içerisinde mililitre başına 1 milyon hücre konsantrasyonunda yeniden süspanse edin.Ally spot plakalarının bir saatlik inkübasyonundan sonra, R 20 besiyerini dökme ve kurulama yöntemiyle uzaklaştırın. Dökme işlemi sırasında plağa sıçratmamaya dikkat edin. Her birine 100 µL hücre süspansiyonu ekleyin.Peptitlerin ve antijenlerin ilgili test kuyucuklarına eklenmesiyle deneysel tasarıma devam edilecektir. Her zaman peptit içermeyen hücrelerden oluşan bir negatif kontrol ve ayrıca fitohemaglutinin eklenmiş pozitif kontrol kuyucukları ekleyin. Plakayı 37 °C'de, %5 karbon dioksit içeren ortamda gece boyunca inkübe edin.Plakayı, dökme ve kurulama yöntemiyle 150 µL 1x PBS ile altı kez yıkayın. Plakanın her kuyucuğuna 100 µL PBS ekleyin ve plakayı 15 dakika boyunca buzdolabında veya oda sıcaklığında bekletin. Bu sırada, PBS içinde biotinli antikor çözeltisini hazırlayın.ALI spot plakasını buzdolabından çıkarın ve PBS'yi çöp kutusuna silkeleyerek boşaltın. Her kuyucuğa biotinli antikor çözeltisinden bir alikot eklerken plağı sıçratmamaya dikkat edin ve plağı doku kültürü davlumbazında oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Plağı PBS ile altı kez yıkayın ve son yıkamada boşaltma ve kurutma (dump and blot) yöntemini kullanın.PBS'yi şimdi plaka üzerinde bırakın. Çözeltiyi karıştırmak için vortekslediğinizden emin olarak, PBS içinde STREPTAVIDIN antikor çözeltisini hazırlayın. Kuyucuklardaki son PBS yıkamasını boşaltın ve ALI spot plakasını yerleştirin.Her bir kuyucuğa streptavidin antikor çözeltisi ekleyin ve plakayı doku kültürü davlumbazında, oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Fazla streptavidin antikoru uzaklaştırmak için plakayı altı kez PBS ile yıkayın; son yıkamada dökme ve kurutma yöntemini kullanın ve plakada PBS bırakın. B-C-I-P-M-B-T alkalin fosfataz substrat çözeltisinin ışığa duyarlılığı göz önünde bulundurulmalıdır.Alkali fosfataz substrat kiti talimatlarında üreticiler tarafından açıklandığı şekilde stok çözeltiyi hazırlarken karanlıkta çalışın; kuyucuklarda kalan PBS'yi boşaltın ve ly spot plakasını kurulayın. Her kuyucuğa substrat çözeltisi ekleyin ve ışığı açın. Beş ila 10 dakikalık renk gelişimi sonrası, lekeler morarmaya başlayıp iyice koyulaşana kadar reaktiflerin plakada kalmasını sağlayın.Bu işlem 20 dakikaya kadar sürer. Ali spot plakasını musluk suyuyla üç kez yıkayın ve havada kurumaya bırakın. Her plaka; bir pozitif kontrol, bir negatif kontrol ve ilgilenilen peptidin en az çift örneğini (duplicate) içerir.Pozitif kontrol kuyucukları, konfluent bir hücre tabakasını yansıtan koyu mor bir renge sahiptir ve neredeyse hiç beyaz arka plan görülmez. Negatif kontrol kuyucuklarında, beklendiği üzere mor arka plan ve leke bulunmamaktadır. Test örneği kuyucukları ise buradaki mikrobiyal peptitlere karşı verilen hücresel yanıtları göstermektedir.LA spot tekniği uygulandığında, mor lekeler ilgili sitokini eksprese eden tek bir yanıt veren hücreyi temsil eder. Lütfen pipet uçlarıyla membranı delmemeye veya plakanızın kurumasına izin vermemeye dikkat edin; çünkü bu durum yüksek arka plan gürültüsüne yol açacaktır.

enzyme-linked-immunospot-assay-elispot-quantification-th-1-cellular

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

İnsan papillomaviri gibi lokalize enfeksiyonlara neden olan patojenlerin T-hücresi epitoplarının karakterizasyonu, dolaşımdaki T hücresi sayısının sınırlı olması nedeniyle zorludur. Nadir T hücrelerinin, çok az sayıdaki hücreden başlanarak izole edildiği ve karakterize edildiği bir yöntem açıklanmıştır.

Human Papillomavirüs Roman T hücre epitopları Karakterizasyonu için interferon-γ Enzim bağlı immünospot Assay Kullanımı

Bu video, antikor salgılayan B hücrelerinin, ASC'lerin işlevini değerlendirmek için ELISpot testinin kullanımını göstermektedir. ASC'ler tarafından salgılanan antikorlar, enzim konjuge IgG veya IgM antikorları tarafından tespit edilen zara bağlı poliklonal antikor fragmanları ile etkileşime girer. Her bir oyukta üretilen renkli nokta, B hücrelerinin salgı aktivitesi ile ilişkili olan spesifik antikorun izotipinin varlığını gösterir.

Antikor Salgılayan B Hücrelerinin ELISpot Testi Kullanılarak Fonksiyonel Değerlendirmesi

Bu tür tek hücre düzeyinde sitokin üretimi tespit etmek ve T hücre yanıtlarının hem nicel hem de nitel karakterizasyonu sağlanmıştır interferon gamma (IFN-γ) ELISpot, gibi fonksiyonel deneylerde sahip yeni kuşak varicella zoster karşı hücre aracılı bağışıklık tepkilerini ölçmek için kullanılabilir virüsü (VZV).

Göbek Kordon Kanı Transplantasyonu takiben, IFN-γ değerlendirin ELISpot Tahlili Varisella-Zoster Virüs spesifik hücre-aracılı bağışıklık geliştirilmesi

Uzun süreli kültürlenmiş interferon-γ enzime bağlı immünospot deneyi merkezi bellek tepkilerinin bir ölçüsü olarak kullanılır ve koruyucu, anti-mikobakteriyel aşı cevabı ile bağıntılı olduğu ortaya konmaktadır. Bu testte, periferal kan tek-çekirdekli hücreleri, mikobakteriyel antijenlerin ve interlökin-2, 14 gün için, etkinleştirme farklılaşma ve merkezi bellek T hücrelerinin genişlemesi ile stimüle edilir.

Sığırlarda Efektör ve hafıza T Hücre Yanıtları değerlendirilmesi için uzun vadeli kültürlü İnterferon-γ Enzim-linked immünospot Testi Uygulaması

İnsan periferik kanı, humoral immün yanıtın değerlendirilmesi için yaygın olarak kullanılır. Burada, insan B hücrelerini periferik kandan izole etme, insan B hücrelerini kültürde antikor (Ab) salgılayan B hücrelerine (ASC'ler) ayırma ve bir ELISpot testi ile toplam IgM ve IgG-ASC'leri numaralandırma yöntemleri açıklanmaktadır.

İzolasyon, Farklılaşma ve Niceleme İnsan Kanı B Hücreleri Antikor salgılayan: ELISPOT Hümoral Bağışıklık bir Fonksiyonel Göstergesi&#39;nin olarak

Qa-1 (HLA-E insan) klasik olmayan MHC kompleksi 1b molekülleri bir gruba ait. Bağışıklama Qa-1-bağlama epitopları ile doku özgü bağışıklık yönetmelik çoğaltmak ve birkaç otoimmün hastalıkları iyileştirmek için gösterilmiştir. Burada biz bir protein Qa-1 epitopları tanımlanması için çakışan bir peptid Kütüphane strateji tanımlarlar.

Qa-1 epitopları bir protein eşlemek için çakışan Peptide Kütüphane

Bu yazıda, biz T-bağımlı ve T-bağımsız immünglobulin (Ig) izotip yanıt ELISA kullanarak farelerde karakterize için bir protokol tanımlamak. Bu yöntem tek başına veya kullanılabilir akış ile birlikte sitometresi araştırmacılar T-bağımlı ve bağımsız T antijen bağışıklama takip farelerde B hücre-aracılı Ig izotip yanıtlarında farkları belirlemek için izin verir.

Timus bağlı ve timus bağımsız immünglobulin izotip yanıt Immunosorbent Assay enzim bağlı kullanarak farelerde karakterizasyonu

İnterferon-gamma ELISpot tahlil için eskiden şiling şimdi domuz PBMCs gelişimi bulaşıcı hastalıklar çalışmak için son derece alakalı bu modelde T hücreli yanıt karakterizasyonu sağlar. DNA aşıları intradermal teslimatla ilişkili T hücre yanıtları ölçmek için tahlil başvurdum.

En iyi duruma getirilmiş Interferon-gamma ELISpot tahlil ölçü birimi T hücre yanıtları sonrasi hipererjik eskiden şiling şimdi domuz modelinde

Burada, eski için bir iletişim kuralı mevcut antijen spesifik CD8 vivo nitel tespiti+ T hücreleri. Analiz tek hücre süspansiyonlar organları veya küçük miktarda kan ile mümkündür. Çok çeşitli çalışmalar sitotoksik T hücre yanıt (aşı ve kanser immünoterapi çalışmaları) analizini gerektirir.

Anti-vektör ve Anti transgene özel CD8 eşzamanlı miktar+ T hücreleri MHC ile ben Tetramer sonrasi hipererjik bir Viral vektör ile boyama

Protokol, nanoemülsiyon ofiyopogonin D adjuvanının etkili hücresel immün yanıtları destekleyip desteklemediğini değerlendirmek için ayrıntılı yöntemler sunar.

İn Vitro Nanoemülsiyon Aşısı Adjuvan Ophiopogonin D'nin Hücresel Aktivitesinin Değerlendirilmesi

Öğrenin ELISPOT yöntemiyle T hücre yanıtlarını mikrobiyal antijenlere karşı nasıl kantite edeceğinizi. Bu teknik idiyopatik hastalıklarda adaptif bağışıklık hedeflerini belirlemeye yardımcı olur.

Enzim-linked immünospot Testi (ELISPOT): Th-1 Mikrobiyal antijenlere karşı hücresel immün cevaplar Kantitasyonu

Daha fazla video keşfet