Enzim-linked immünospot Testi (ELISPOT): Th-1 Mikrobiyal antijenlere karşı hücresel immün cevaplar Kantitasyonu

Bu prosedürün genel amacı, ilgilenilen antijenlere karşı T hücresi yanıtlarını tespit etmektir. Bu, ilk olarak yakalama antikorları ile kodlanarak gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, ilgilenilen hücreleri ve antijenleri eklemek ve daha sonra gece boyunca inkübe etmektir.

Prosedürün üçüncü adımı, tespit antikorlarının eklenmesidir. Prosedürün son adımı, plakanın substrat reaktifleri ile geliştirilmesi ve noktaların analiz edilmesidir. Sonuç olarak, nokta oluşturan birimlerin analizi yoluyla ilgilenilen sitokinleri seçen sonuçlar elde edilebilir.

Merhaba, benim adım Dr.Ki Richter ve Vanderbilt Üniversitesi'ndeki Dr.Wonder Drake'in Laboratuvarı'nda Bulaşıcı Hastalıklar bölümünde araştırma eğitmeniyim. Bugün, enzime bağlı immüno-spot testi olarak da bilinen Ellie Spot tekniğini gösteriyoruz. Dr.Isfahan chambers ve Tiffany Cone bugün sizin için tekniği gösterecek.

Hücre kültürü standartlarını korumak için, başlıkta steril koşullar altında manipülasyonlar yapın, bir müttefik nokta plakası açın ve PBS ile üç kez yıkayın. PBS'de yakalama antikorunun bir kaplama solüsyonunu hazırlayın. Kolaylık sağlamak için girdap yaparak iyice karıştırın.

Antikor solüsyonunu çok kanallı, pipetleyici ve her birine 100 mikrolitre kaplama solüsyonu için bir rezervuara aktarın. Plakayı perfil ile iyice kapatın ve gece boyunca buzdolabına koyun. Bu antikor kaplı plakalar haftalarca iyidir.

Temel kural, kuyularda hala sıvı kalması durumunda bir plakanın kullanılabileceğini belirtir. Hücreleri bu tahlil için hazırlamak için, yeni izole edilmiş periferik kan mononükleer hücrelerini canlılık açısından trien mavisi ile boyayın ve sayın: Pbmc'yi 10 ortamımızda mililitrede 2 milyon hücrede plakalayın ve gece boyunca 37 santigrat derecede %5 karbondioksit ile inkübe edin. Deneyi takip etmek için, Ali spot plaka kapağını numune kimlik numarası, kuyu koşulları ve tarih ile etiketleyin.

Plakayı, boşaltma ve lekeleme yöntemini kullanarak steril PBS ile altı kez yıkayın. Boşaltma sırasında plakayı sıçratmamaya dikkat edin, çünkü bu, plakanın kuyularının mora dönmesine neden olabilir. Her bir oyuğa 20 ortamımızı ekleyin ve plakayı bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Plaka inkübe edilirken, gece boyunca dinlendirilen hücreleri sayın. Pbmc'yi santrifüjleme ile hasat edin. Süpernatanı boşaltın ve peleti 10 ortamımızda mililitre başına 1 milyon hücre konsantrasyonunda yeniden süspanse edin.

Müttefik spot plakasının bir saatlik inkübasyonundan sonra, boşaltma ve lekeleme yöntemini kullanarak R 20 ortamını çıkarın. Boşaltırken plakayı sıçratmamaya dikkat edin. Her birine 100 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin.

İlgili test kuyucuklarına peptitler ve antijenler eklenerek deneysel tasarımı takip edin. Her zaman peptit içermeyen hücrelerin negatif kontrolünü ve ayrıca fito hemaglutinin eklenmiş pozitif kontrol kuyularını dahil edin. Plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile inkübe edin.

Boşaltma ve lekeleme yöntemini kullanarak plakayı 150 mikrolitre bir XPBS ile altı kez yıkayın. Plakanın her bir oyuğuna 100 mikrolitre PBS ekleyin ve plakayı buzdolabında veya oda sıcaklığında 15 dakika bekletin. Bu arada, biyotin antikor çözeltisini PBS'de hazırlayın.

ALI spot plakasını buzdolabından çıkarın ve PBS'yi çöp sepetine atarak atın. Her bir oyuğa bir alikot biyotin antikor solüsyonu dökerken plakayı sıçratmamaya dikkat edin ve plakayı oda sıcaklığında oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Son yıkamada boşaltma ve lekeleme yöntemini kullanarak plakayı PBS ile altı kez yıkayın.

PBS'yi şimdi tabağın üzerinde bırakın. STREPTAVIDIN antikor çözeltisini PBS'de hazırlayın ve karıştırmak için çözeltiyi girdapladığınızdan emin olun. Son PBS yıkamasını kuyulardan atın ve ALI spot plakasını çizin.

Her bir oyuğa streptavidin antikor çözeltisi ekleyin ve plakayı doku kültürü davlumbazında oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Fazla trevain antikorunu çıkarmak için, son yıkamada boşaltma ve lekeleme yöntemini kullanarak plakayı PBS ile altı kez yıkayın, PBS'yi plakaya yönlendirin. B-C-I-P-M-B-T alkalin fosfataz substrat çözeltisinin ışık hassasiyeti göz önüne alındığında.

Sap çözeltisini hazırlarken karanlıkta çalışın, üreticiler tarafından alkalin fosfataz substrat kiti talimatlarında açıklandığı gibi, kalan PBS'yi kuyulardan atın ve ly spot plakasını kurulayın. Her kuyucuğa substrat çözeltisi ekleyin ve ışığı açın. Beş ila 10 dakikalık renk gelişiminden sonra, lekeler mora dönmeye başlayana ve oldukça koyu olana kadar reaktiflerin plaka üzerinde kalmasına izin verin.

Bu işlem 20 dakika kadar sürer. Ali spot plakasını musluk suyuyla üç kez yıkayın ve kurumaya bırakın. Her plaka, en az iki kopya halinde yürütülen bir pozitif kontrol, negatif kontrol ve ilgilenilen peptid içerir.

Pozitif kontrol kuyuları koyu mor renktedir, birleşik bir hücre katmanını yansıtır ve neredeyse hiç beyaz arka plan yoktur. Negatif kontrol kuyularının beklendiği gibi mor bir arka planı ve lekesi yoktur. Test numunesi kuyuları, burada mikrobiyal peptitlere hücresel tepkileri göstermektedir.

Mor lekeler, LA lekesi tekniğini uygularken ilgilenilen sitokin'i ifade eden tek bir duyarlı hücreyi temsil eder. Lütfen pipet uçlarınızla zarı delmemeye veya plakanızın kurumasına izin vermemeye dikkat edin, çünkü bu yüksek arka plana yol açacaktır.