Hücre Orta Wolbachia bakımı

Benim adım Courtney Ston. Dr. Jason Rascon'un laboratuvarında, Johns Hopkins Bloomberg Halk Sağlığı Okulu'nda çalışıyorum. Bugün, kültürlenmiş böcek hücrelerinden bakteriyel saflaştırma işlemi gerçekleştireceğiz.

Aslında oldukça basit bir prosedürdür. İlk olarak hücrelerimizi hasat ederek başlarız ve ardından cam boncuk lizisi kullanarak ökaryotik konak hücre membranlarını fiziksel olarak parçalarız. Sonrasında, bakterileri konak hücre kalıntılarından ayırmak için diferansiyel santrifüjleme uygularız.

Ardından, konak hücre partiküllerini daha fazla uzaklaştırmak için bir dizi filtrasyon adımı uygularız, böylece sonunda elimizde sadece saflaştırılmış bakteriyel pelet kalır. Bu aslında temel gereksinimlerden biridir. Bu bir hücre kültürü kabinidir ve hücre kültürü kontamine olmaya çok yatkın olduğu için her şeyi steril tutmak amacıyla kullanılır.

Ayrıca hücre kültürü ortamına, hücrelerin kendilerine ve bunları yetiştirmek için plastik flasklara ihtiyacımız var. Ayrıca üç milimetrelik blast boncuklarına, 50 ml'lik konik tüplere ve bakterilerimizi çöktürmek için yaklaşık 18,000 G gibi yüksek hızda santrifüj yapabilen, aynı zamanda konak hücrelerimizi çöktürmek için yaklaşık 3000 G veya 2,500 G hızda çalışabilen bir santrifüje ihtiyacımız var. Bu nedenle, ilk olarak kültürlenmiş hücrelerimizle başlayacağız.

Yetiştiriliyorlar, değil mi? Bunlar T 75 flasklar. İçlerinde 15 ml kültür medyumu ve bizim hücrelerimiz var.

İlk olarak, hücre tabakasını bozarak hücreleri 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne toplayarak başlayacağız. Hücre tabakasını aşağı ve yukarı doğru sıyırarak tüm hücrelerin besiyerine geçmesini sağlamanız yeterlidir. Hücreler besiyerine geçtiğinde, onları pipetle 50 ml'lik konik tüpe aktaracağız.

Şimdi iki hücre süspansiyonuna 3 mm'lik cam boncuklar ekleyeceğiz. Bunlar önceden otoklavlanmıştır ve aslında yeniden kullanılabilirler. Yeniden kullanılmadan önce yıkanabilir, çamaşır suyunda bekletilebilir ve ardından otoklavlanabilirler.

Cam B kavanozunun ağzının santrifüj tüpünün ağzına değmediğinden emin olarak dökün. Her bir santrifüj tüpüne yaklaşık 5 ml hacim çizgisine kadar cam boncuk yerleştiriyoruz. Bir sonraki adımda, bakterileri süspansiyona salmak için eary hücrelerini fiziksel olarak parçalamak istiyoruz.

Bu nedenle, bir vorteks kullanıyoruz, cihazı en yüksek hız ayarına getiriyoruz ve ardından beş dakika boyunca vorteksliyoruz. Şimdi hücreleri üç milimetrelik cam boncuklarla beş dakika boyunca vorteksliyoruz ve ardından süpernatantı temiz bir pipetle temiz ve steril bir 50 mL santrifüj tüpüne pipetle aktarıyoruz. Yeni oluşturduğumuz süspansiyonu döküyoruz; bu süspansiyon, serbest kalan bakterileri ve çözeltiyi olduğu kadar tüm hücre kalıntılarını da içermektedir.

Sıradaki adımda, kaba materyalleri çöktürmek ve bakterileri süspansiyon halinde bırakmak için düşük hızlı bir santrifüjleme işlemi gerçekleştireceğiz. Santrifüj cihazını 2.500 ×g hızında 10 dakika boyunca kullanacağız. Ayrıca, pelletin tabitte toplanmasına yardımcı olmak için santrifüj işlemini 4 °C'de gerçekleştireceğiz.

Ardından numuneyi buraya yerleştiriyoruz, dengeli olduğundan emin oluyoruz, kapağı kapatıyoruz ve 10 dakika boyunca santrifüj ediyoruz. Şu anda, konak hücre kalıntılarının yanı sıra saflaştırılmış bakterileri de içeren süpernatantımızı santrifüj etmiş bulunmaktayım. İşlemi 2,500 G'de 10 dakika boyunca gerçekleştirdim.

Gördüğünüz gibi, tüpümün dibinde teori hücre kalıntılarından oluşan bir pelet var. Yeni serbest kalan bakterilerim, santrifügasyon onları da çöktürecek kadar yüksek olmadığı için hâlâ süpernatantta bulunuyor. Bu nedenle yapacağım bir sonraki işlem, süpernatantı alıp beş mikronluk bir filtreden geçirmek olacaktır.

Bu, beş mikronluk bir filtredir ve aslında her türlü şırıngaya uygundur. Ben 30 ml'lik bir şırınga kullanacağım; pistonu yukarı çekin ve ardından, özellikle alt kısmındaki bölüm olmak üzere, steril kalması gereken filtreye dokunmadan şırıngayı filtreye çevirerek takın; daha sonra süpernatantın tüpümüze geçmesi için pistonu yavaşça aşağı bastırın.

Filtreyi kırıp işlevsiz hale getirebileceğiniz için çok fazla bastırmamak gerekir. Çok fazla basınç uygulamanız gereken bir noktaya gelindiyse, filtrenin çok fazla hücre kalıntısıyla tıkandığı anlamına gelir ve bu durumda filtreyi çıkarıp değiştirmeniz gerekir. Bu aşamada, hacmimize bağlı olarak, çok saf bir bakteri kültürü elde etmeye yönelik ek bir yöntem olarak, yüksek hızlı santrifüj tüpüne filtre sterilizasyonundan geçirilmiş 250 millimolar sükroz solüsyonu ekleriz.

Şişeyi yaklaşık olarak en az %80 oranında doldurun. Genellikle boyun kısmına kadar doldururuz. Bu tüplerin, yüksek hızlı santrifüjümüzün içinde içe doğru çökmemeleri için bu düzeyde dolu olmaları gerekir.

Tamam, şimdi süpernatantı döndüreceğiz ve saflaştırılmış bakterilerimizi bu yüksek hızlı santrifüjle 18,000 ×g'de çöktüreceğiz. Tüplerimizi elbette dengeli bir şekilde yerleştirdiğimizden emin oluyoruz ve ardından kapağı kapatıyoruz. Süreyi 10 dakika olarak ayarlayacağız.

Bunu, sıcaklığın burada ayarlandığı şekilde, 10 °C veya daha düşük bir sıcaklıkta gerçekleştirmeyi tercih ediyoruz. Santrifüjdeki bu spesifik rotor için açısal hızımız ise dakikada 12,5 devirdir. Bir dönüştürme tablomuz olduğu için, yaklaşık 18.670 ×g hızında dönecektir. Böylece, saflaştırılmış bakterilerimizi çöktürmek için yüksek hızlı santrifüj işlemini gerçekleştirmiş olduk.

Şimdi gördüğünüz üzere, yüksek hızlı santrifüj tüpümüzün dibinde güzel bir bakteri peleti oluştu. Şimdi yapacağımız işlem, tüm süpernatantı bir sıvı atık konteynerine aktarmaktır. Bu aşamada yapmamız gereken, bakterilerimizi yeniden süspanse etmektir.

Örneği, %10 ısıdan arındırılmış fetal bovine serum ile desteklenmiş Schneider böcek besiyeri olan kültür ortamımızın iki mililitresi içinde yeniden süspanse edeceğim. Tüm bakteriler tekrar çözeltiye geçene kadar, pipetle aşağı yukarı çekerek peleti yeniden süspanse edeceğim. Bakterilerimiz tekrar süspansiyona girdiğine göre, olası diğer konak hücre kalıntılarını temizlemek için bir saflaştırma adımı daha gerçekleştireceğiz.

Bu işlem için 2.7 micron filtre kullanacağız. Tercih ettiğim yöntem, tutucu olarak beş micron filtremizin plastik gövdesini kullanmaktır. Böylece solüsyonumuzu çekebilir, şırıngayı 2.7 micron filtreye vidalayabilir ve ardından uzun süreli saklama tüpüne filtreleme yapabiliriz.

Diğer filtrede olduğu gibi, pistonu nazikçe bastırın. Böylece saflaştırılmış bakteri çözeltisini elde etmiş olduk. Şimdi size göstereceğim bir sonraki aşama, canlılık analizinin nasıl yapılacağıdır.

Molecular Probes tarafından üretilen backlight canlı-ölü bakteri canlılık kitini kullanıyoruz. Bu kit iki boya içerir: propidyum iyodür ve cyto nine. Propidyum iyodür kırmızı floresan yayar ve yalnızca bakteri membranı tamamen sağlam olmayan bakterileri boyar; cyto nine ise tüm bakterileri boyar.

Bu bakterilere floresan optiklerle donatılmış bir mikroskop altında baktığınızda, tüm bakteriler yeşil floresan verecek ve bunlardan ölü olan bir alt grup ise kırmızı floresan verecektir. Saflaştırılmış örneğimizden küçük bir alikot alıyoruz ve bu durumda, sadece bir lam hazırlamaya yetecek kadar, yani sadece 10 µL alacağım. Bunu diğer iki tüpe dağıtacağım.

Ardından, bakteriyel süspansiyonumuza propidium iodide ve cyto nine karışımından sadece bir microliter ekleyerek diğer iki boyamızı da ilave edeceğim. Sonrasında, bunu 15 dakika boyunca karanlıkta inkübe edebilirsiniz. Ancak, örneği hemen hazırlayıp inceleyebileceğinizi ve sonuçlarınızı hemen görebileceğinizi tespit ettik.

Tamam, şimdi canlı-ölü arka plan boyamasıyla boyanmış bakteri örneğimi içeren lamı mikroskop altında inceleyeceğim. Boyayı lamın üzerine damlatıp lameli kapatıyorum ve ardından görüntülemeye geçiyorum. Bakterilerimin canlılığını değerlendirebilmek için kırmızı-yeşil karışık filtremizi kullanacağım.

Deklanşörü açtığımda, bakterilerimi aşağı yukarı küçük noktalar şeklinde görüyorum. Ancak burada bakterilerin yaklaşık %90 ila %95'inin yeşil, sadece yaklaşık %5'inin ise kırmızı olduğunu görüyorum. Bu durumda, çok yüksek bir canlılık oranımız var, değil mi?

Böylece, kültüre edilmiş böcek hücrelerinden canlı Akia saflaştırma sürecini birlikte inceledik. Bu protokol, saflaştırılmış bakterileri izole etmek için ökaryotik konak hücrelerin fiziksel olarak parçalanmasını ve ardından diferansiyel santrifüjleme işlemini, ayrıca saflaştırılmış bakterilerinizin kalitesini sağlamak ve tüm konak hücre bileşenlerinden tamamen arındırmak için bir dizi filtrasyon adımını içeriyordu. Ardından, bakterilerinizin canlılığını değerlendirmek için iki boyanın kullanıldığı canlı-ölü boyama analizini gerçekleştirdik.

Artık saflaştırılmış bakterilerinizi, belirli bir sistemdeki enfeksiyon oranını artırmak için diğer kültürlenmiş hücre sistemlerini enfekte etmek de dahil olmak üzere çeşitli uygulamalarda kullanabilirsiniz. Ayrıca, canlı saflaştırılmış bakterilerinizi kullanarak metabolik çalışmalar veya diğer pek çok farklı çalışma da gerçekleştirebilirsiniz.