İnsan IPS Hücreler Komple nakavt Serum Yedek Besleyici-Alerjik Orta kullanarak Besleyici Adaptasyon, Kültür ve Pasajlanması

Bu prosedürün genel amacı, insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerini, complete knockout serum replacement içeren feeder-free besiyeri kullanarak feeder-free kültüre adapte etmek ve sürdürmektir. Bu işlem, öncelikle gelt, TRX kaplı veya cell start kaplı plakalar hazırlanarak gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, iPS hücrelerinin disk alanı kullanılarak MEF'lerden feeder-free besiyerine pasajlanmasıdır.

Prosedürün son adımı, iPS hücrelerinizi sürekli olarak besleyici hücreden bağımsız (feeder-free) şekilde sürdürmektir. Nihayetinde, pluripotent belirteçlerle yapılan immün boyama aracılığıyla, metil kültürlerinde görülen hücre büyümesine ve kök hücre özelliklerine benzer sonuçlar elde edilebilir. Merhaba, ben Life Technologies'teki GIB merkezinden Kate Wagner.

Bu tekniğin mevcut tekniklere göre temel avantajı, tüm iş akışınız boyunca knockout serum replasmanı kullandığınızda zaman tasarrufu sağlayabilmeniz ve hücre kültürünüzdeki tutarlılığı artırabilmenizdir. Günümüzde knockout ürün ailesi; insan embriyonik kök hücreleri, fare embriyonik kök hücreleri ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler için besleyici hücre bazlı, besleyici hücreden bağımsız ve kseno-serbest koşullara yönelik kapsamlı bir besiyeri ve reaktif listesi içermektedir. KSR; türetme gelişimi, ekspansiyon, kriyoprezervasyon ve diferansiyasyonun başlangıç aşamalarında kullanılabilir.

Aşağıdaki video, feeder-free (besleyici hücre içermeyen) koşullarda KSR kullanarak hücrelerinizi adapte etme ve pasajlama işlemlerini gösterecektir. Feeder-free koşullarda insan kaynaklı uyarılmış pluripotent kök hücrelerin adaptasyonu ve pasajlanması için Gel TRX kaplı kültür kapları gereklidir; bu kapların hazırlanmasından bir gün önce, bir tüp Gel TRX'i gece boyunca buzdolabında bırakarak yavaşça çözdürün. Ertesi gün, 1 ml Gel TRX'i 99 ml bazal medyum içeren bir şişeye aktararak çözünmüş Gel TRX tüpünü bazal medyumda 1/100 oranında seyreltin. Çözeltiyi nazikçe karıştırın.

Bazal besiyeri olarak knockout D-M-E-M-F 12 kullanılmasını öneririz, ancak diğer seçenekler için lütfen protokol metnine bakınız. Her bir kültür kabının tüm yüzeyini gel Rex çözeltisi ile kaplayın. Her 60 milimetrelik kap için 1,5 mililitre gel trek çözeltisi ekleyin.

Plakları 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Fazla plaklar parafilm ile sarılabilir ve buzdolabında dört haftaya kadar saklanabilir. Fazla seyreltilmiş gelt TRX paylaştırılabilir ve -20 ile -80 °C arasında saklanabilir, ancak kullanmadan önce tekrarlanan dondurma-çözme döngülerinden kaçınılmalıdır.

Gel TRX kaplı kapları bir laminer akış kabinine aktarın ve oda sıcaklığına ulaşana kadar bekleyin. Ayrıca, gerekli diğer tüm reaktifleri hazırlayın ve tüm besiyerlerinin 37 °C'ye ulaştığından ve uygun şekilde gazlandığından emin olun. İnsan IPC'lerini besleyici hücre içermeyen besiyerine adapte etmek için öncelikle kültürleyin.

iPSC'ler, %70 ila %80 konfluen olana kadar meth feeder hücreleri üzerinde tutulur. Her 60 milimetrelik kültür kabındaki besiyerini aspire edin ve bir mililitre olan uygun miktarda dispa çözeltisi ekleyin. Bu durumda, kapları 37 °C'de üç ila beş dakika boyunca inkübe edin.

Her bir kültür kabındaki dispa solüsyonunu aspire edin ve meth besleyici hücreleri DPBS ile iki ila üç kez nazikçe yıkayın. Ardından, her bir kültür kabına uygun miktarda komple serum ikame ortamı ekleyin. Bir hücre kazıyıcı kullanarak, hücreleri kabın yüzeyinden nazikçe kazıyın.

Her bir kaptaki hücre süspansiyonunu ayrı 15 mililitrelik konik tüplere toplayın. Her bir kültür kabını uygun miktarda tamamlayıcı serum takviyeli besiyeri ile durulayın ve durulama besiyerini hücre süspansiyonunun bulunduğu 15 mililitrelik konik tüplere ekleyin. Hücreleri çöktürmek için 15 mililitrelik konik tüpleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 200 G'de santrifüjleyin.

Santrifüjlemeden sonra, hücre peletini bozmadan süpernatantı dikkatlice aspire edin ve atın. Hücre peletini tüp tabanından tamamen ayırmak için tüpü hafifçe vurun. İstenen ayırma oranına göre uygun miktarda komple serum ikamesi, feeder-free medyum ekleyin.

Ve pellet'i nazikçe resüspande edin. Hücre kümelerini daha küçük boyutlara ayırmayın çünkü küçük kümeler yüzeye iyi tutunmaz. Önceden hazırlanmış gel Rex kaplı kültür kaplarındaki tüm kalıntı jel TRE solüsyonunu aspire edin ve her bir kültür kabına uygun miktarda hücre süspansiyonunu yavaşça ekleyin.

Hücrelerin kap yüzeyine dağılmasını sağlamak için kültür kabını birkaç kez ileri geri ve yanlara doğru hareket ettirin. Kültür kaplarını, hava içinde %4 ila %6 CO2 içeren nemlendirilmiş atmosfere sahip 37 degree Celsius sıcaklığındaki bir inkübatöre nazikçe yerleştirin. Hücreler yaklaşık %70 ila %80 konfluens düzeyine ulaşana kadar, bundan sonra her gün kullanılmış besiyerini yenileyin.

Tam serum ikamesi içeren, feeder-free (besleyici hücre içermeyen) ortamda büyütülen insan kaynaklı pluripotent kök hücreler %70 ila %80 konfluense ulaştıklarında, alt kültüre alınmaya hazır hale gelirler. Eğer herhangi bir diferansiye hücre varsa, pasajlama öncesinde bunları uzaklaştırın. 60 mm'lik kültür kabındaki kullanılmış ortamı bir pipet yardımıyla aspire edin ve hücreleri iki kez durulayın.

DPBS ile birlikte, önceden ısıtılmış disk bazlı solüsyondan bir mililitreyi kültür kabına yavaşça ekleyin. Tüm hücre yüzeyini kaplamak için kültür kabını dairesel hareketlerle sallayın. Kültürü 37 °C'de üç ila beş dakika boyunca inkübe edin.

Ardından, dis uzayı solüsyonunu aspire edin ve hücreleri DPBS ile nazikçe iki kez yıkayın; ardından komple serum yerine koyma solüsyonu ve besleyici hücresiz besiyeri ekleyip hücreleri kültür kabının yüzeyinden nazikçe kazıyın. Bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri steril 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Kültür kabını komple serum yerine koyma solüsyonu ile iki kez durulayın.

Ayrılmamış hücreleri nazikçe püskürterek temizlemek için besleyici hücre içermeyen besiyeri kullanın. Her iki durulama işleminden gelen besiyerini, hücrelerin bulunduğu 15 mililitrelik tüpe çekin. Hücre peletini bozmadan çöktürmek için tüpü oda sıcaklığında 200 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve atın. Hücre peletini tüp tabanından tamamen ayırmak için tüpe hafifçe vurun. Hücreleri komple serum replasmanında nazikçe resüspanse edin.

Beş mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak besleyici hücre içermeyen (feeder-free) ortam ekleyin. Titrasyon yapmayın. Hücreleri istenen bölme oranında taze bir 60 milimetrelik Geltrex kaplı kaba aktarın.

Hücrelerin yüzeye yayılması için kültür kabını birkaç kez ileri geri ve yanlara doğru hareket ettirin. Kültür kabını, ertesi güne kadar hava içerisinde %4 ila 6 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir atmosfere sahip 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Tüketilmiş besiyerini nazikçe tam serum yenileme besiyeri ile değiştirin.

Hücre kalıntılarını uzaklaştırmak için besiyersiz ortam uygulayın. Bundan sonraki süreçte tüketilen besiyerini her gün yenileyin. Bu faz kontrast görüntüsü, tamamlayıcı serum ikamesi içeren besiyersiz ortam kullanılarak gelt TRX kaplı kültür kaplarında büyütülen insan indüklenmiş pluripotent kök hücrelerini göstermektedir.

iPSC'lerin, büyük çekirdekler ve az sitoplazma ile karakterize olan insan embriyonik kök hücrelerine benzer bir sergileme morfolojisine sahiptir; immün boyama, nakavt serum replasman ortamı ve büyüme faktörü kokteyli ile kültüre edilen iPSC'lerin, pluripotent belirteçler olan OCT four ve SSEA four'u eksprese ettiğini göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, iPSC'lerinizi nakavt serum replasman ve feeder-free (besleyici hücre içermeyen) koşullarında nasıl adapte edeceğiniz ve sürdüreceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. İşte hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.