Name: İnsan IPS Hücreler Komple nakavt Serum Yedek Besleyici-Alerjik Orta kullanarak Besleyici Adaptasyon, Kültür ve Pasajlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Öğrenin insan iPS hücrelerini besleyici-alejik ortamda KnockOut Serum Replacement kullanarak adapte etme ve kültürleme yöntemini. Bu teknik kök hücre biyolojisinde tutarlılık ve verimlilik sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Not: steril kültür koşullarını korumak için, bu protokol tüm prosedürlerin steril laboratuar uygulamaları kullanılarak gerçekleştirilen ve laminer akış kaputu altında yürütülmelidir. Başlamadan önce, herhangi bir ortam, 37 dengelenmiş olduğundan emin ° C ve uygun gazladı. Geltrex kaplı Kültür Yemekleri hazırlanması Not: CELLstart kaplı kültür kaplarına kullanımı için Ek <ol><li> Çözülme Geltrex yavaş yavaş 2-8 (1 mL) ° C tüp ve Knockout D-MEM/F-12 99 ml 1:100 onu sulandırmak. Çözüm hafifçe karıştırın. Not: Bazı iPS hücre hatları, optimum büyüme için farklı bir Geltrex seyreltme gerekebilir. Alternatif dilüsyonları için eke bakınız. </li><li> Her kültürün çanak tüm yüzeyi Geltrex çözüm (35 mm yemek için 1 ml, 60 mm yemek için 1.5 ml) ile kaplayın. </li><li> Kurumasını önlemek ve 37 yemekleri az 1 saat inkübe Parafilm ° C ile her tabak sızıntısını önleyiniz Not: Bu noktada, 1 aya kadar 4 ° C'de Geltrex kaplı kültür kaplarına saklayabilir. Geltrex kurumasını önlemek için her tabak Parafilm Seal. </li><li> Kullanmadan önce, bir laminer akış kaputu Geltrex kaplı yemekler aktarmak ve onları oda sıcaklığında (yaklaşık 1 saat) gelmesini sağlar. </li></ol> Komple nakavt SR Besleyici Ücretsiz Orta hazırlanması <ol><li> 10 mcg / ml Temel FGF çözüm, 1 ml hazırlamak için, aseptik aşağıda listelenen bileşenleri karıştırın. -20 ° C'de kısım çözüm ve mağaza, 6 aya kadar. <table border="0"><tbody><tr><td> Temel FGF </td><td> 10 mikrogram </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 990 mcL </td></tr><tr><td> 10% BSA </td><td> 10 mcL </td></tr></tbody></table> Not: BSA aynı konsantrasyonda HSA veya Knockout SR ile ikame edilebilir. </li><li> 50 ml 2 mg / ml Dispase çözüm hazırlamak için, aseptik aşağıda listelenen bileşenleri karıştırın. Filtre 4 çözüm ve mağaza ° C 2 haftaya kadar sterilize. <table border="0"><tbody><tr><td> Dispase </td><td> 100 mg </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 50 ml </td></tr></tbody></table></li><li> 100 ml tam nakavt SR Besleyici-Free (KSR-FF) orta aseptik aşağıdaki tabloda listelenen bileşenleri bir araya hazırlamak için. <table border="1"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Stok Konsantrasyon </td><td> Final Konsantrasyon </td><td> Hacim </td></tr><tr><td> Nakavt DMEM/F12 (Kat. No. 12.660-012) </td><td> - </td><td> 1X </td><td> 76.8 ml </td></tr><tr><td> GlutaMAX-I (Kat. No: 35.050-061) </td><td> 200 mm </td><td> 2 mM </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Nakavt SR (Kat. no: 10.828-028) </td><td> - </td><td> % 20 </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> Nakavt SR-GFC (Kat. no. A10580-01) </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> bFGF (Kat.. PHG0024) </td><td> 10 mcg / mL </td><td> 20 ng / ml </td><td> 200 mcL </td></tr></tbody></table> Bir haftaya kadar 2-8 ° C'de KSR-FF orta saklayabilir. </li><li> Sıcaklık ve gazlar için tam orta pre-değişikti hemen önce, aseptik 0.1 mM son konsantrasyon için gerekli 2 merkaptoetanol hacmi (55 mM stok konsantrasyonu) ekleyin. Örneğin, 100 ml KSR-FF orta hazırlamak için 182 mcL 2-mercaptoethanol (1:550 dilüsyon) Alternatif olarak 55 mM, 2-mercaptoethanol 1X tamamlanan orta ve 2-8 ° C'de saklanan olabilir bir hafta kadar. </li></ol> KSR-FF Orta iPSCs uyarlanması <ol><li> Başlamadan önce, kaput Geltrex kaplı yemekleri oda sıcaklığında ön dengelenmesi. </li><li> Kültür MEF besleyici hücreler iPSCs% 70-80 konfluent kadar. MEF tabanlı kültür protokoller için Gibco Fare Embriyonik Fibroblast el kitabı bakın. </li> 37 ° C su banyosunda Dispase Öncesi sıcak gerekli hacim. Gerekli miktarlar hakkında ayrıntılı bilgi için aşağıdaki Tablo 1'e bakınız. <li> 37 ° C su banyosunda for15 dakika KSR-FF gerekli hacmi Pre-dengelenmesi. Gerekli miktarlar hakkında ayrıntılı bilgi için aşağıdaki Tablo 1'e bakınız. </li><li> Kültür yemekleri orta aspire ve uygun miktarda bir Dispase çözüm ekleyin. Bulaşıkları 3-5 dakika 37 ° C'de inkübe edin. </li><li> Her kültürün gemi Dispase çözüm aspire ve D-PBS (2 ila 3 kat) MEF besleyici hücrelerin nazikçe yıkayın. </li><li> Her kültür gemi için uygun bir miktar tam nakavt SR orta ekleyin. Kapalı hücreleri kültür gemi yüzeyine hafifçe kazımak için bir hücre kazıyıcı ya da 5 ml pipet kullanın. Not: sabit iPS uyum hücre hatları için alternatif uyum protokoller için eke bakınız, </li><li> Her kültürün çanak hücre süspansiyonu ayrı 15 ml konik tüpler içine toplayın. Her bir kültür damarı tam nakavt SR orta uygun bir miktarı ile temizleyin, durulayın ve D-PBS hücre süspansiyonu içeren 15 ml konik tüpler içine orta durulama ekleyin. Tek hücre içine hücre kümeleri kırmak için değil dikkatli olun </li><li> 15 ml konik tüpler iPSCs pelet 5 dakika boyunca 200 xg'de santrifüjleyin. </li><li> IPSC pelet süpernatant aspire. KSR-FF orta split oranı (Tablo 1) göre uygun bir miktarda pelletini tekrar. Küçük öbekler yüzeye iyi binmemelidir, çünkü küçük bir boyutu, hücre kümeleri kırmak değil. Not: Biz ilk 3 pasajlar iPSCs iPSC MEF Kültür Orta KSR-FF orta direkt geçişli olmuştur sonra 1:2 bölünmüş bir oranı öneririz. Normalde, 01:03 ve 01:05 arasında bir bölünme oranı uygun olan, ancak 01:02 az Pasajlanması besleyici ücretsiz bir kültürün içine adapte gerekli hücrelerinin yüksek yoğunluklu sağlar. </li><li> Geltrex kaplı yemekleri iPSCs kaplama, önce ön kaplı çanak artık Geltrex çözümü aspirat ve yavaş yavaş her kültür çanak için uygun bir miktarda hücre süspansiyonu ekleyin. Not: kaplama önce yemekleri durulama yok. </li><li> Çanağı yüzeyi boyunca hücreler dağıtmak için birkaç kez ileri geri ve yan kültür çanak hareket ettirin. Hafifçe nemlendirilmiş bir atmosfer hava 4 ila% 6 CO 2 ile 37 ° C inkübatör kültür tabağına yerleştirin. KSR-FF ile harcanan orta her gün değiştirin. </li></ol> KSR-FF kullanarak Pasajlanması insan iPS hücreleri <ol start="13"><li> Mikroskop altında hücrelerin% 70-80 konfluent ve pasajlandı olmaya hazır olduğunu doğrulamak için tam KSR-FF büyüyen insan iPSCs uyun. Şekil 1 bakın. Not: koloniler çok yoğun veya çok büyük hale gelirse, artan farklılaşması oluşur. </li><li> Kes ve kültür Pasajlanması önce herhangi bir farklılaşmış iPSC koloniler kaldırmak. </li><li> 37 ° C su banyosunda Dispase Öncesi sıcak gerekli hacim. Gerekli miktarlar hakkında ayrıntılı bilgi için aşağıdaki Tablo 1'e bakınız. </li><li> 37 ° C su banyosunda for15 dakika KSR-FF gerekli hacmi Pre-dengelenmesi. Gerekli miktarlar hakkında ayrıntılı bilgi için aşağıdaki Tablo 1'e bakınız. </li><li> Bir pipet kullanarak kültür damarı harcanan orta aspire ve hücrelerin D-PBS ile iki kez yıkayın. </li><li> Yavaşça kültür damarı (örneğin, 60 mm kültür çanak başına Dispase çözüm 1 ml) önceden ısıtılmış Dispase çözüm ekleyin. Tüm hücre yüzeyinde kat Swirl kültür damarı. </li><li> Kültür damarı 3 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. </li><li> Inkübatör geminin çıkarın, Dispase çözüm aspirat ve D-PBS ile hücrelerin nazikçe yıkayın. </li><li> Hücrelerin, hücre kazıyıcı kullanarak kültürü çanak yüzeyinden hafifçe kazıyın ve 15 mL steril bir santrifüj tüpüne hücreleri aktarmak. </li><li> Nazikçe müstakil olmayan herhangi bir hücre "püskürtme", KSR-FF ile iki kez kültür çanak durulayın Havuz, 15 mL tüp hücreleri orta durulayın. </li><li> Tüp, oda sıcaklığında pelet hücreleri 5 dakika boyunca 200 xg'de santrifüjleyin . </li><li> Dikkatle hücre pelletini bozmadan süpernatantı aspirat ve atın. </li><li> Yavaşça tüp tüp alttan tamamen hücre pelletini çıkarmak için hafifçe vurun. </li><li> 5ml serolojik bir pipet kullanarak ön dengelenmiş KSR-FF hücreler yavaşça tekrar süspansiyon haline getirin. Çiğnemek değil. Not: hafifçe zarar vermemek için kuvvet kullanmadan hücreleri tekrar süspansiyon adım kritik. </li><li> Istenen bölünmüş oranında taze bir 60 mm Geltrex kaplı çanak hücreleri transferi ve yüzeyi boyunca hücreler dağıtmak için birkaç kez ileri geri ve yan kültür çanak taşımak. </li><li> Nemlendirilmiş bir atmosferi ile 37 ° C inkübatör kültür tabağına yerleştirin% 4 ila 6 hava CO 2. </li><li> Ertesi gün hafifçe hücre enkaz kaldırmak için harcanan orta KSR-FF ile değiştirin. Bundan sonra günlük harcanan orta değiştirin. IPS hücreleri günlük olarak (yaklaşık olarak her 4-5 gün) geçişi dikkate alınmalıdır. Pasajlanması hücrelerin% 70-80 izdiham ulaştığınızda tavsiye edilir. IPS hücre dondurulması ve eritme için, "Komple nakavt Serum Yedek Besleyici-Alerjik Orta kullanarak dondurularak ve İnsan iPS Hücreler kurtarma" başlıklı protokol bakın. </li></ol> Beklenen Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2236/2236fig1.jpg" alt="Mikroskop altında hücre kültürü; hücre büyümesinin incelenmesi; mikroskopi görüntüleme; biyolojik araştırma." data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Aşağıdaki faz kontrast görüntü tam nakavt Serum Yedek Besleyici Ücretsiz orta kullanarak Geltrex kaplı kültür kaplarına yetişen iPSCs gösterir. IPSCs, büyük bir çekirdek ve kıt sitoplazma ile karakterize hESC, morfolojisi benzer sergiler. (40x büyütme) <table border="1"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> 35mm Bulaşık </td><td> 60mm Bulaşık </td><td> 100mm Bulaşık </td></tr><tr valign="top"><td> Komple nakavt SR orta </td><td> 2 mL </td><td> 4 mL </td><td> 10 ml </td></tr><tr valign="top"><td> Geltrex Çözüm </td><td> 1 ml </td><td> 1,5 mL </td><td> 4-5 ml </td></tr><tr valign="top"><td> Dispase </td><td> 0,5 mL </td><td> 1 ml </td><td> 3-4 ml </td></tr><tr valign="top"><td> Durulama için D-PBS </td><td> 2 mL </td><td> 4 mL </td><td> 10 ml </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Önerilen Hacimleri <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2236/2236appendix.pdf">Ek görmek için buraya tıklayınız</a> .

<ol><li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li>
<li>Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).</li>
<li>Dimos, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li>
<li>Aasen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnli%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).</li>
</ol>

Bu makalenin yazarları, bu yazıda kullanılan reaktifler ve aletleri üreten Life Teknolojileri tarafından istihdam edilmektedir.

<table><tbody><tr><td>Knockout DMEM/F12</td><td></td><td>Kat. no. 12660-012</td><td>Not: alternatif DMEM ürünlerinin kullanımı için ekle bakınız</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I</td><td></td><td>Kat. No. 35050-061</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td></td><td>KnockOut SR, Kat. no. 10828-028</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement Büyüme Faktörü Kokteyli</td><td></td><td>KnockOut SR-GFC, Kat. no. A10580-01</td><td></td></tr><tr><td>FGF-basic, insan rekombinant proteini, 10 &amp;mu;g</td><td></td><td>bFGF, Kat. no. PHG0024</td><td>Not: alternatif bFGF paket boyutları için ekle bakınız.</td></tr><tr><td>2-Merkapto&amp;#8211;etanol</td><td></td><td>Kat. no. 21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td></td><td>Kat. no. 17105-041</td><td>Not: alternatif pasajlama yöntemleri için ekle bakınız.</td></tr><tr><td>Geltrex hESC-Onaylı İndirgenmiş Büyüme Faktörü Bazal Matrisi, 1 mL</td><td></td><td>Kat. no. A10480-01</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum ve magnezyum içermeyen Dulbecco&amp;rsquo;s Fosfat Tamponlu Salin (D-PBS)</td><td></td><td>Kat. no. 14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Steril Doku Kültürü Kabini</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C'ye ayarlanmış inkübatör</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipet Yardımcısı (Pipette-Aid)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C'ye ayarlanmış su banyosu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steril serolojik pipetler (5 mL, 10 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL santrifüj tüpleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm doku kültürü işlemli kaplar</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan ips hücreler komple nakavt serum yedek besleyici-alerjik orta kullanarak besleyici adaptasyon, kültür ve pasajlanması

Feeder-Free Adaptation, Culture and Passaging of Human IPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

2006 yılında, insan ve fare fibroblastlar dikkat çekici embriyonik kök hücrelere benzer nitelikleri ile 1-3 iPS hücreleri üretmek yeniden olabilir keşif pluripotent hücrelerin hücre tedavisi, ilaç keşfi ve temel araştırmalar için değerli bir yeni kaynak yaratmıştır . Gibco medya ve reaktifler yıllardır pluripotent kök hücre araştırmaları ön planda olmuştur. DMEM Nakavt Nakavt Serum Değiştirme ile desteklenmiş, embriyonik kök hücre büyümesi ve şimdi iPS hücre kültürü 3-9 için tercih edilen medya . Bu altın standart medya sistemi artık Nakavt SR Büyüme Faktörü Kokteyli ilavesi ile besleyici ücretsiz kültür kullanılabilir. Geleneksel insan ES ve iPS hücre kültürü yöntemleri, fare veya insan fibroblast besleyici katmanları veya besleyici klimalı ortamı gerektirir. Bu kültür yöntemleri ölçekli, emek-yoğun, sert ve tanımlanmamış durumlar nedeniyle farklılaşmamış kalça hücreleri korumak için zordur. Invitrogen Nakavt SR hala korurken, besleyici-ücretsiz geçiş kalça hücre kültürlerinde kolaylıkla izin Nakavt SR Büyüme Faktörü Kokteyl geliştirdi.

Aşağıdaki protokolü tam nakavt Serum Yedek Besleyici Ücretsiz orta (KSR-FF) kullanarak besleyici ücretsiz kültür, insan kaynaklı Pluripotent Kök (IPS) Hücreler uyarlanması için talimat sağlar. Bir kez, adapte sürekli bakım için talimatlar ayrıca verilmiştir.

İnsan IPS Hücreler Komple nakavt Serum Yedek Besleyici-Alerjik Orta kullanarak Besleyici Adaptasyon, Kültür ve Pasajlanması

2006 yılında, insan ve fare fibroblastlarının, embriyonik kök hücrelerle dikkat çekici derecede benzer özelliklere sahip iPS hücreleri 1-3 üretmek üzere yeniden programlanabileceğinin keşfi...

Bu prosedürün genel amacı, insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerini, complete knockout serum replacement içeren feeder-free besiyeri kullanarak feeder-free kültüre adapte etmek ve sürdürmektir. Bu işlem, öncelikle gelt, TRX kaplı veya cell start kaplı plakalar hazırlanarak gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, iPS hücrelerinin disk alanı kullanılarak MEF'lerden feeder-free besiyerine pasajlanmasıdır.Prosedürün son adımı, iPS hücrelerinizi sürekli olarak besleyici hücreden bağımsız (feeder-free) şekilde sürdürmektir. Nihayetinde, pluripotent belirteçlerle yapılan immün boyama aracılığıyla, metil kültürlerinde görülen hücre büyümesine ve kök hücre özelliklerine benzer sonuçlar elde edilebilir. Merhaba, ben Life Technologies'teki GIB merkezinden Kate Wagner.Bu tekniğin mevcut tekniklere göre temel avantajı, tüm iş akışınız boyunca knockout serum replasmanı kullandığınızda zaman tasarrufu sağlayabilmeniz ve hücre kültürünüzdeki tutarlılığı artırabilmenizdir. Günümüzde knockout ürün ailesi; insan embriyonik kök hücreleri, fare embriyonik kök hücreleri ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler için besleyici hücre bazlı, besleyici hücreden bağımsız ve kseno-serbest koşullara yönelik kapsamlı bir besiyeri ve reaktif listesi içermektedir. KSR; türetme gelişimi, ekspansiyon, kriyoprezervasyon ve diferansiyasyonun başlangıç aşamalarında kullanılabilir.Aşağıdaki video, feeder-free (besleyici hücre içermeyen) koşullarda KSR kullanarak hücrelerinizi adapte etme ve pasajlama işlemlerini gösterecektir. Feeder-free koşullarda insan kaynaklı uyarılmış pluripotent kök hücrelerin adaptasyonu ve pasajlanması için Gel TRX kaplı kültür kapları gereklidir; bu kapların hazırlanmasından bir gün önce, bir tüp Gel TRX'i gece boyunca buzdolabında bırakarak yavaşça çözdürün. Ertesi gün, 1 ml Gel TRX'i 99 ml bazal medyum içeren bir şişeye aktararak çözünmüş Gel TRX tüpünü bazal medyumda 1/100 oranında seyreltin. Çözeltiyi nazikçe karıştırın.Bazal besiyeri olarak knockout D-M-E-M-F 12 kullanılmasını öneririz, ancak diğer seçenekler için lütfen protokol metnine bakınız. Her bir kültür kabının tüm yüzeyini gel Rex çözeltisi ile kaplayın. Her 60 milimetrelik kap için 1,5 mililitre gel trek çözeltisi ekleyin.Plakları 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Fazla plaklar parafilm ile sarılabilir ve buzdolabında dört haftaya kadar saklanabilir. Fazla seyreltilmiş gelt TRX paylaştırılabilir ve -20 ile -80 °C arasında saklanabilir, ancak kullanmadan önce tekrarlanan dondurma-çözme döngülerinden kaçınılmalıdır.Gel TRX kaplı kapları bir laminer akış kabinine aktarın ve oda sıcaklığına ulaşana kadar bekleyin. Ayrıca, gerekli diğer tüm reaktifleri hazırlayın ve tüm besiyerlerinin 37 °C'ye ulaştığından ve uygun şekilde gazlandığından emin olun. İnsan IPC'lerini besleyici hücre içermeyen besiyerine adapte etmek için öncelikle kültürleyin.iPSC'ler, %70 ila %80 konfluen olana kadar meth feeder hücreleri üzerinde tutulur. Her 60 milimetrelik kültür kabındaki besiyerini aspire edin ve bir mililitre olan uygun miktarda dispa çözeltisi ekleyin. Bu durumda, kapları 37 °C'de üç ila beş dakika boyunca inkübe edin.Her bir kültür kabındaki dispa solüsyonunu aspire edin ve meth besleyici hücreleri DPBS ile iki ila üç kez nazikçe yıkayın. Ardından, her bir kültür kabına uygun miktarda komple serum ikame ortamı ekleyin. Bir hücre kazıyıcı kullanarak, hücreleri kabın yüzeyinden nazikçe kazıyın.Her bir kaptaki hücre süspansiyonunu ayrı 15 mililitrelik konik tüplere toplayın. Her bir kültür kabını uygun miktarda tamamlayıcı serum takviyeli besiyeri ile durulayın ve durulama besiyerini hücre süspansiyonunun bulunduğu 15 mililitrelik konik tüplere ekleyin. Hücreleri çöktürmek için 15 mililitrelik konik tüpleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 200 G'de santrifüjleyin.Santrifüjlemeden sonra, hücre peletini bozmadan süpernatantı dikkatlice aspire edin ve atın. Hücre peletini tüp tabanından tamamen ayırmak için tüpü hafifçe vurun. İstenen ayırma oranına göre uygun miktarda komple serum ikamesi, feeder-free medyum ekleyin.Ve pellet'i nazikçe resüspande edin. Hücre kümelerini daha küçük boyutlara ayırmayın çünkü küçük kümeler yüzeye iyi tutunmaz. Önceden hazırlanmış gel Rex kaplı kültür kaplarındaki tüm kalıntı jel TRE solüsyonunu aspire edin ve her bir kültür kabına uygun miktarda hücre süspansiyonunu yavaşça ekleyin.Hücrelerin kap yüzeyine dağılmasını sağlamak için kültür kabını birkaç kez ileri geri ve yanlara doğru hareket ettirin. Kültür kaplarını, hava içinde %4 ila %6 CO2 içeren nemlendirilmiş atmosfere sahip 37 degree Celsius sıcaklığındaki bir inkübatöre nazikçe yerleştirin. Hücreler yaklaşık %70 ila %80 konfluens düzeyine ulaşana kadar, bundan sonra her gün kullanılmış besiyerini yenileyin.Tam serum ikamesi içeren, feeder-free (besleyici hücre içermeyen) ortamda büyütülen insan kaynaklı pluripotent kök hücreler %70 ila %80 konfluense ulaştıklarında, alt kültüre alınmaya hazır hale gelirler. Eğer herhangi bir diferansiye hücre varsa, pasajlama öncesinde bunları uzaklaştırın. 60 mm'lik kültür kabındaki kullanılmış ortamı bir pipet yardımıyla aspire edin ve hücreleri iki kez durulayın.DPBS ile birlikte, önceden ısıtılmış disk bazlı solüsyondan bir mililitreyi kültür kabına yavaşça ekleyin. Tüm hücre yüzeyini kaplamak için kültür kabını dairesel hareketlerle sallayın. Kültürü 37 °C'de üç ila beş dakika boyunca inkübe edin.Ardından, dis uzayı solüsyonunu aspire edin ve hücreleri DPBS ile nazikçe iki kez yıkayın; ardından komple serum yerine koyma solüsyonu ve besleyici hücresiz besiyeri ekleyip hücreleri kültür kabının yüzeyinden nazikçe kazıyın. Bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri steril 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Kültür kabını komple serum yerine koyma solüsyonu ile iki kez durulayın.Ayrılmamış hücreleri nazikçe püskürterek temizlemek için besleyici hücre içermeyen besiyeri kullanın. Her iki durulama işleminden gelen besiyerini, hücrelerin bulunduğu 15 mililitrelik tüpe çekin. Hücre peletini bozmadan çöktürmek için tüpü oda sıcaklığında 200 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve atın. Hücre peletini tüp tabanından tamamen ayırmak için tüpe hafifçe vurun. Hücreleri komple serum replasmanında nazikçe resüspanse edin.Beş mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak besleyici hücre içermeyen (feeder-free) ortam ekleyin. Titrasyon yapmayın. Hücreleri istenen bölme oranında taze bir 60 milimetrelik Geltrex kaplı kaba aktarın.Hücrelerin yüzeye yayılması için kültür kabını birkaç kez ileri geri ve yanlara doğru hareket ettirin. Kültür kabını, ertesi güne kadar hava içerisinde %4 ila 6 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir atmosfere sahip 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Tüketilmiş besiyerini nazikçe tam serum yenileme besiyeri ile değiştirin.Hücre kalıntılarını uzaklaştırmak için besiyersiz ortam uygulayın. Bundan sonraki süreçte tüketilen besiyerini her gün yenileyin. Bu faz kontrast görüntüsü, tamamlayıcı serum ikamesi içeren besiyersiz ortam kullanılarak gelt TRX kaplı kültür kaplarında büyütülen insan indüklenmiş pluripotent kök hücrelerini göstermektedir.iPSC'lerin, büyük çekirdekler ve az sitoplazma ile karakterize olan insan embriyonik kök hücrelerine benzer bir sergileme morfolojisine sahiptir; immün boyama, nakavt serum replasman ortamı ve büyüme faktörü kokteyli ile kültüre edilen iPSC'lerin, pluripotent belirteçler olan OCT four ve SSEA four'u eksprese ettiğini göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, iPSC'lerinizi nakavt serum replasman ve feeder-free (besleyici hücre içermeyen) koşullarında nasıl adapte edeceğiniz ve sürdüreceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. İşte hepsi bu kadar.İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

feeder-free-adaptation-culture-passaging-human-ips-cells-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol nakavt SR kriyoprezervasyon orta insan iPS hücreleri dondurularak ve bu hücrelerin tam nakavt SR Besleyici Ücretsiz (KSR-FF), orta ya da besleyici tabanlı nakavt SR orta kurtarmak için ayrıntılı prosedürü anlatılmaktadır.

İnsan iPS hücreleri dondurularak ve kurtarma Tam nakavt Serum Yedek Besleyici-Alerjik Orta

Fare embriyonik fibroblast (MEFS) kalitesi, CF-1 gibi farenin sağ suşu tarafından dikte edilir. Bu elde edilen Pluripotency destekleyici MEFS ve klimalı ortam (CM) işbirliği içinde kendini yenileyen ve pluripotency korumak için aktivin / Düğüm ve FGF yolları için gerekli aktivin A, Gremlin ve Tgfβ1 optimal konsantrasyonu içermelidir.

Kültürleme İnsan Embriyonik ve Bağlı Pluripotent Kök Hücrelerinin için uygundur Fare embriyonik fibroblast hücreleri hazırlanması

Geçiş kültürlere besleyici-özgür koşullarda devam eden çabalarına rağmen, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve türetme ve kültürü fare embriyonik besleyiciler (MEFS) ile işbirliği kültürler büyük oranda bağımlı kalır. Burada, biz hızla öncesi deneylere hESC kültürlerden besleyiciler kaldırmak için yeni bir metodoloji göstermektedir.

Yüksek Yoğunluklu İnsan Embriyonik Kök Hücre Kültürleri gelen Rapid Fibroblast Kaldırma

Insan pluripotent kök hücreleri (hPSC) türetilmiş nöral krest (NC) hücreler, insan gelişimi ve hastalık modelleme ve hücre replasman tedavileri için büyük bir potansiyele sahiptir. Burada, şu anda yaygın olarak kullanılan bir besleyici ücretsiz...

İnsan Pluripotent dan Sinir Crest Progenitör Hücreler besleyici ücretsiz Derivasyon Kök Hücre

Bu protokol, serumdan türetilmiş fare embriyonik kök hücrelerin içinde (Mesc) -conditioned ortamı (Mesc-CM) için bir yöntem sağlar (fetal inek serumu, FBS) - ve besleyici (fare embriyonik fibroblastlar, MEF'ler) bir hücrenin içermeyen koşullar -ücretsiz yaklaşım. Bu yaşlanma ve yaşlanma ile ilişkili hastalıkların tedavisi için uygun olabilir.

Serum- toplanması ve Besleyici serbest Fare Embriyonik Hücre içermeyen Yaklaşım Hücre klimalı Orta Kök

İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) pluripotent durumlarının korunmasını belirlemek için düzenli karakterizasyonu, bu hücrelerin diğer uygulamalar için kullanılmadan önce önemli bir adımdır. Burada, immünositokimya yoluyla kolay ve rutin karakterizasyonlarını sağlamak için özel olarak tasarlanmış insan iPSC'lerinin küçük ölçekli yayılımı için bir yöntem açıklıyoruz.

Rutin İmmünositokimyasal Karakterizasyonu için serum serbest şartlar İnsan iPSCs küçük ölçekli Yayılım

Pluripotent kök hücrelerden özel Retina hücrelerinin üretimini geliştirme retina hastalıkları için kök hücre tabanlı tedavisinin bir dönüm noktası olduğunu. Mevcut kağıt Retina organoids ve Retina pigmentli epitel verimli bir nesil için temel, çevirim ve klinik araştırma için basit bir yöntem açıklanır.

Tanımlanmış Xeno-alerjik ve besleyici-Alerjik kültür koşulları üretimi insan IPSC kaynaklı Retina hücre modelleri için

Gelecekteki hastalığı modelleme uygulamaları olan kimyasal olarak tanımlanan koşullarda, burada İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre farklılaşma içine her somite türev (myotome, sclerotome, dermatome ve syndetome) için bir iletişim kuralı mevcut ve Ortopedik cerrahi hücre tabanlı terapiler.

Somite türevleri indüklenen insan nesil Vitro Pluripotent kök hücreler

Besleyici hücrelerde kültürlenen insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC'ler) ve insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (hiPSC'ler) enzimatik veya mekanik geçişiyle ilişkili sınırlamalardan kaçınmak için, EDTA aracılı yapışma bozukluğu kullanılarak insan sünnet derisi fibroblastlarının besleyici hücre tabakasında tutulan hESC veya hiPSC kolonilerinin toplanması için hızlı, etkili, uygun maliyetli, yüksek verimli bir yöntem oluşturduk.

İnsan pluripotent kök hücrelerinin besleyici hücreler üzerinde etilendiamintetraasetik asit aracılı yapışma ile hızlı, uygun maliyetli, enzimsiz geçişi

Burada, insan iPSC'den türetilmiş kimerik antijen reseptörü (CAR) eksprese eden doğal öldürücü hücreleri çeşitli malignitelere karşı daha iyi öldürme ile ayırt etmek ve genişletmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu protokol, doğal öldürücü (NK) optimize edilmiş iPSC'den türetilmiş CAR-NK hücrelerinin farklılaşmasını ve genişlemesini ve çeşitli tümör hücre hatlarına karşı antitümör aktivitesinin ölçümünü gösterir.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kimerik Antijen Reseptörü İfade Eden Doğal Öldürücü Hücrelerdeki Gelişmeler

Öğrenin insan iPS hücrelerini besleyici-alejik ortamda KnockOut Serum Replacement kullanarak adapte etme ve kültürleme yöntemini. Bu teknik kök hücre biyolojisinde tutarlılık ve verimlilik sağlar.

İnsan IPS Hücreler Komple nakavt Serum Yedek Besleyici-Alerjik Orta kullanarak Besleyici Adaptasyon, Kültür ve Pasajlanması

Daha fazla video keşfet