İnsan iPS hücreleri dondurularak ve kurtarma Tam nakavt Serum Yedek Besleyici-Alerjik Orta
July 15th, 2010
Bu protokol nakavt SR kriyoprezervasyon orta insan iPS hücreleri dondurularak ve bu hücrelerin tam nakavt SR Besleyici Ücretsiz (KSR-FF), orta ya da besleyici tabanlı nakavt SR orta kurtarmak için ayrıntılı prosedürü anlatılmaktadır.
Bu prosedürün genel amacı, besleyici bazlı veya besleyicisiz kültür koşullarında IPS hücrelerini kriyoprezervasyon yapmak ve geri kazanmaktır. Bu, önce IPC'lerinizi normalde yaptığınız gibi paketlemeye başlayarak gerçekleştirilir. İşlemin ikinci adımı, hücrelerin serum serbest dondurma ortamına aktarılmasıdır.
Prosedürün üçüncü adımı, normalde yaptığınız gibi kriyoprezervasyon yapmaktır. İşlemin son adımı, hücreleri çözmek ve bakıma başlamaktır. Sonuç olarak, sağlıklı morfoloji ve çözülme sonrası iyileşme yoluyla IPS hücrelerinin serum serbest dondurma ortamında başarılı bir şekilde dondurulduğunu ve çözüldüğünü gösteren sonuçlar elde edilebilir.
Merhaba, ben Life Technologies'deki GCO sitesinden Kate Wagner. Bu protokolün görsel olarak gösterilmesi çok önemlidir çünkü IPC'ler donmaya ve T inceliğine karşı çok hassas olabilir. Bu protokolü kolaylaştıran şey, nakavt serum değişiminin tüm iş akışınız boyunca kullanılabilmesidir.
Bugün KSR ürün ailesi, embriyonik kök hücrelerinizin ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerinizin besleyici bazlı, yemsiz ve kseno içermeyen kültürü için tam bir ortam ve reaktif listesi içerir. KSR, türev büyümesi, kriyo-koruma, genişleme ve farklılaşmanın ilk ilk adımları için kullanılabilir. Aşağıdaki video, Peter içermeyen bir makinede KSR kullanarak kendinizi çözdürmeyi ve dondurmayı gösterecektir.
Bu prosedüre başlamak için. İlk olarak, 60 milimetrelik bir çanak olan kültür kabından harcanan ortamı bir su banyosunda 37 santigrat dereceye kadar uygun miktarda tam besleyici serbest ortamda ısıtın. Bu durumda, insan kaynaklı pluripotent kök hücreleri DPBS ile iki kez durulayın.
Sonra yemeğe bir mililitre dispa ekleyin. Çanağı 37 santigrat derecede üç dakika inkübe edin. Bundan sonra, dispa çözeltisini aspire edin ve hücreleri DPBS ile nazikçe yıkayın.
Daha sonra, çanağı kaplamak için tam besleyici serbest ortam ekleyin ve hücre transfer hücrelerini steril 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne nazikçe kazımak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Çanağı tam serbest ortam beslemesi ile durulayın, ayrılmamış hücreleri nazikçe püskürtün. Durulama solüsyonunu, hücreleri içeren aynı 15 mililitrelik tüpe aktarın.
Çanağı orta ile ikinci kez durulayın ve bu durulama solüsyonunu oda sıcaklığında üç dakika boyunca 1000 RPM'de santrifüjleme yoluyla hücre pelet hücreleri ile çekin. Santrifüjlemeden sonra, hücre peletini bozmadan süpernatanı dikkatlice aspire edin ve atın. Hücre peletini tüpün altından tamamen çıkarmak için tüpü hafifçe vurun.
Daha sonra, beş mililitrelik serolojik pipet kullanarak bir mililitre dondurma ortamı A ekleyin ve hücreleri hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. Topakların düzgün bir şekilde askıya alınmasını takiben, karıştırmak için hücre süspansiyonunu hafifçe döndürürken, tüpe damla damla bir şekilde bir mililitre donma ortamı B ekleyin. Bir izopropanol odasında gece boyunca eksi 80 santigrat derecede her bir kriyo aşağılık dondurma hücresine bir mililitre hücre süspansiyonu tahsis edin.
Ertesi gün, hücre şişelerini uzun süreli depolama için sıvı bir nitrojen tankına aktarın. Donmuş hücre şişesini, şişede sadece küçük bir donmuş parça kalana kadar yaklaşık üç ila dört dakika boyunca 37 santigrat derece su banyosuna yerleştirerek hızla çözün. Şişeyi su banyosundan çıkardıktan sonra, dekontamine etmek için% 70 izopropanol ile püskürtün, ardından şişenin tüm içeriğini aseptik olarak 15 mililitrelik bir konik tüpe aktarmak için beş mililitrelik bir pipet kullanın.
Bir sonraki adım, prosedürün en zor yönü olabilir. Besleyici serbest ortam, hücrelere yavaş ve dikkatli bir şekilde eklenmelidir. Ozmotik şoku azaltmak için: 15 mililitrelik konik tüpteki hücrelere damla damla dört mililitre tam besleyici serbest ortamı yavaşça ekleyin.
Ortamı eklerken, hücreleri karıştırmak için tüpü yavaşça ileri geri hareket ettirin. Bu, hücrelere ozmotik şoku azaltacaktır. Komple besleyici serbest ortam, besleyicilerle kullanım için metamfetamin şartlandırılmış ortam veya nakavt serum değiştirme ortamı içeren nakavt serum replasmanı ile değiştirilebilir, medya hazırlama talimatları için protokol metnine bakın.
Dört mililitre ortamın tümü eklendikten sonra, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 1000 RPM'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, hücre peletini bozmadan aklı başında dikkatlice aspire edin ve atın. Hücre peletini dört mililitre tam besleyici içermeyen ortamda nazikçe yeniden süspanse edin.
Beş mililitrelik bir pipet kullanarak, hücre süspansiyonunu 60 milimetre kültür kabı kaplı bir jelt kamyonuna damla damla yavaşça ekleyin. Kültür kabını, havada% dört ila 6 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir atmosfere sahip 36 ila 38 santigrat derece inkübatöre yerleştirin. Hücreleri eşit şekilde dağıtmak için tabağı kuzeyden güneye, doğudan batıya dikkatlice döndürün.
Çözülmeden 24 saat sonra. Tabaktaki ortamı taze ortamla değiştirin. Hücreler yaklaşık% 70 ila 80 birleşene kadar harcanan ortamı günlük olarak değiştirin.
Bu kontrast görüntü, tam serum replasmanı, besleyici içermeyen ortam kullanılarak jelt TRX kaplı kültür kaplarında büyütülen insan kaynaklı pluripotent kök hücreleri göstermektedir. IPC'ler, büyük çekirdekler ve yetersiz sitoplazma ile karakterize edilen insan embriyonik kök hücrelerine benzer morfoloji sergiler. Çözülme ve nakavt sonrası hücrelerin serum replasmanına bir örnek.
Jelt TrackX üzerindeki besleyici içermeyen ortam burada gösterilmiştir. Bu prosedürü uygularken, tüm hücre kolonilerinizi aynı boyutta tutmayı unutmamak önemlidir. Kriyo koruma yaparken, bu hücre iyileşmesini iyileştirir.
İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.
Genel Bakış
Bu protokol, KnockOut SR kriyoprezervasyon ortamı kullanarak insan kaynaklı pluripotent gövde (iPS) hücrelerinin kriyoprezervasyon prosedürünü ve bunların tamamı KnockOut SR Besleyici Olmayan (KSR-FF) ortamında veya besleyici temelli KnockOut SR ortamında kurtarılmasını ana hatlarıyla belirtir. Yöntem, dondurma ve çözme sırasında iPS hücrelerinin hassasiyeti nedeniyle görsel gösterimin önemini vurgular.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Biyolojisi
- Kök Hücre Araştırması
- Kriyoprezervasyon Teknikleri
Arka Plan
- İnsan iPS hücreleri dondurma ve çözme işlemlerine duyarlıdır.
- KnockOut SR ürünleri, kök hücre kültürünün çeşitli aşamalarını kolaylaştırır.
- Doğru kriyoprezervasyon, hücre canlılığının korunması için kritik öneme sahiptir.
- Besleyici olmayan ve besleyici temelli kültür koşulları iPS hücreleri için kullanılabilir.
Çalışmanın Amacı
- iPS hücrelerini kriyoprezerve etmek için güvenilir bir protokol sağlamak.
- Çözme sonrası hücrelerin başarılı bir şekilde kurtarılmasını sağlamak.
- İş akışının tümünde KSR ürünlerinin kullanımını göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- iPS hücrelerinin kriyoprezervasyon için hazırlanması.
- Hücre korunması için serum içermeyen dondurma ortamının kullanılması.
- -80 derece Celsius'ta kriyoprezervasyon ve ardından sıvı nitrojen içinde depolanması.
- Hücrelerin tam besleyici olmayan ortamda çözülmesi ve yeniden askıya alınması.
Ana Sonuçlar
- Sağlıklı morfoloji ile iPS hücrelerinin başarılı bir şekilde dondurulması ve çözülmesi gösterilmiştir.
- Hücreler hem besleyici olmayan hem de besleyici temelli koşullarda canlılık ve büyümeyi sürdürmüştür.
- Hücre kurtarmalarının görsel değerlendirmesiyle protokolün etkinliği doğrulanmıştır.
- Hücre koloni boyutunun tek tip tutulması, kurtarma oranlarını artırmıştır.
Sonuçlar
- Protokol, iPS hücrelerini kriyoprezerve etmek için sistematik bir yaklaşım sunar.
- KnockOut SR ürünleri, işlem sırasında hücre sağlığını korumak için etkilidir.
- Görsel gösteriler, protokolün anlaşılması ve uygulanmasını artırır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Reliable cryopreservation and recovery of human iPS cells using feeder-free, defined media directly addresses scalability and standardization challenges in early discovery and translational research. This protocol enables consistent pluripotent cell banking, supporting robust assay development and downstream applications in drug discovery portfolios. Feeder-free workflows reduce biological variability, enhancing predictive confidence and portfolio triage at key inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables consistent banking of pluripotent cells for repeated hypothesis testing and pathway interrogation.
- Reduces biological variability by eliminating feeder layers, supporting functional target validation.
- Facilitates mechanistic de-risking by maintaining cell health and pluripotency post-thaw.
- Supports predictive confidence in early-stage screening and triage decisions.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, feeder-free system for preparing validated iPS cells for high-throughput assays.
- Improves reproducibility and scalability of cell-based assays by using defined media components.
- Enables reliable compound evaluation by ensuring healthy, undifferentiated cell recovery.
- Supports platform reuse and assay standardization across discovery teams.
Translational & Preclinical Research
- Maintains disease-relevant cell models for translational biomarker studies when using patient-derived iPS cells.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by supporting robust cell recovery and expansion.
- Reduces risk of batch-to-batch variability in preclinical model development.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing reliable cell sources.
Pipeline & Workflow Integration
This cryopreservation and recovery protocol fits from early discovery through preclinical research, enabling seamless transitions between banking, expansion, and assay deployment stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by providing healthy, pluripotent cells on demand.
- Screening: Delivers assay-ready iPS cells with reproducible morphology and viability for quantitative readouts.
- Analytics: Enables consistent measurement of cell health and recovery, supporting cross-condition comparisons.
- Translational Research: Maintains continuity for disease modeling and biomarker alignment when using patient-derived lines.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, feeder-free workflow for pluripotent cell management across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-based studies.
- Operational Value: Standardizes cryopreservation and recovery, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in pluripotent stem cell handling and feeder-free culture techniques.
- Needs access to defined media, cryopreservation equipment, and controlled thawing infrastructure.
- Demands cross-team standardization of cell colony size and handling procedures for optimal recovery.
- Adaptation may be needed for different iPS cell lines or disease models.
- Careful osmotic shock management is critical for maintaining cell viability post-thaw.
