Name: İnsan iPS hücreleri dondurularak ve kurtarma Tam nakavt Serum Yedek Besleyici-Alerjik Orta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Öğrenin insan iPS hücrelerinin serum içermeyen dondurma ortamı kullanılarak kriyoprezervasyonu ve besleyici içeren veya içermeyen koşullarda kurtarma yöntemini. Bu protokol hücre canlılığını korur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Not: steril kültür koşullarını korumak için, bu protokol tüm prosedürlerin steril laboratuar uygulamaları kullanılarak gerçekleştirilen ve laminer akış kaputu altında yürütülmelidir. Başlamadan önce, herhangi bir ortam, 37 dengelenmiş olduğundan emin ° C ve uygun gazladı. Geltrex kaplı Kültür Yemekleri hazırlanması Not: CELLstart kaplı kültür kaplarına kullanmak için eke bakınız. <ol><li> Çözülme Geltrex yavaş yavaş 2-8 (1 mL) ° C tüp ve Knockout D-MEM/F-12 99 ml 1:100 onu sulandırmak. Çözüm hafifçe karıştırın. Not: Bazı iPS hücre hatları, optimum büyüme için farklı bir Geltrex seyreltme gerekebilir. Alternatif dilüsyonları için eke bakınız. </li><li> Her kültürün çanak tüm yüzeyi Geltrex çözüm (35 mm yemek için 1 ml, 60 mm yemek için 1.5 ml) ile kaplayın. </li><li> Kurumasını önlemek ve 37 yemekleri az 1 saat inkübe Parafilm ° C ile her tabak sızıntısını önleyiniz Not: Bu noktada, 1 aya kadar 4 ° C&#39;de Geltrex kaplı kültür kaplarına saklayabilir. Geltrex kurumasını önlemek için her tabak Parafilm Seal. </li><li> Kullanmadan önce, bir laminer akış kaputu Geltrex kaplı yemekler aktarmak ve onları oda sıcaklığında (yaklaşık 1 saat) gelmesini sağlar. </li></ol> Komple nakavt SR Besleyici Ücretsiz Orta hazırlanması <ol><li> 10 mcg / ml Temel FGF çözüm, 1 ml hazırlamak için, aseptik aşağıda listelenen bileşenleri karıştırın. -20 ° C&#39;de kısım çözüm ve mağaza, 6 aya kadar. <table border="0"><tbody><tr><td> Temel FGF </td><td> 10 mikrogram </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 990μL </td></tr><tr><td> 10% BSA </td><td> 10 mcL </td></tr></tbody></table> Not: BSA aynı konsantrasyonda HSA veya Knockout SR ile ikame edilebilir. </li><li> 50 ml 2 mg / ml Dispase çözüm hazırlamak için, aseptik aşağıda listelenen bileşenleri karıştırın. Filtre 4 çözüm ve mağaza ° C 2 haftaya kadar sterilize. <table border="0"><tbody><tr><td> Dispase </td><td> 100 mg </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 50 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Besleyici-Free (KSR-FF) Tam nakavt SR 100 mL hazırlamak için aseptik aşağıdaki tabloda listelenen bileşenleri birleştirmek. <table border="1"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Stok Konsantrasyon </td><td> Final Konsantrasyon </td><td> Hacim </td></tr><tr><td> Nakavt DMEM/F12 (Kat. No. 12.660-012) </td><td> - </td><td> 1X </td><td> 76.8 ml </td></tr><tr><td> GlutaMAX-I (Kat. No: 35.050-061) </td><td> 200 mm </td><td> 2 mM </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Nakavt SR (Kat. no: 10.828-028) </td><td> - </td><td> % 20 </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> Nakavt SR-GFC (Kat. no. A10580-01) </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> bFGF (Kat. No. PHG0024). </td><td> 10 mcg / mL </td><td> 20 ng / ml </td><td> 200 mcL </td></tr></tbody></table> Bir haftaya kadar 2-8 ° C&#39;de KSR-FF orta saklayabilir. </li><li> Sıcaklık ve gazlar için tam orta pre-değişikti hemen önce, aseptik 0.1 mM son konsantrasyon için gerekli 2 merkaptoetanol hacmi (55 mM stok konsantrasyonu) ekleyin. Örneğin, 100 ml KSR-F hazırlamak içinF orta, 2-mercaptoethanol (1:550 dilüsyon) Alternatif olarak 55 mM 182 mcL eklemek, 2-merkaptoetanol 1X tamamlanan orta eklenir ve bir haftaya kadar 2-8 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol> Donma / Kriyoprezervasyon Orta hazırlanması Kriyoprezervasyon orta iki ortam oluşur; Donma Orta ve Donma Orta B. farklı zamanlarda hücreleri eklenir ve kalır ayrılmalıdır. Her Kriyoprezervasyon Orta toplam hacminin% 50 ihtiyaç vardır. Donmuş gibi her flakon için gerekli Kriyoprezervasyon Orta toplam hacim 1 ml. HESC% 90 konfluent 60mm çanak hESC banka 2 şişeleri kriyoprezervasyon medya için kullanılabilir. Tutarı düşmek sağlamak için ekstra 2-5ml her Donma Orta yeterli hacmi hazırlayın. <table border="1"><tbody><tr><td> Donma Orta A (son hacmi% 50): </td><td> 50% DMEM/F12 </td><td> 50% KSR </td></tr><tr><td> Donma Orta B (son hacmi% 50): </td><td> 80% DMEM/F12 </td><td> % 20 DMSO </td></tr></tbody></table> Örnek: 20 şişeleri hücre dondurma iseniz, Kriyoprezervasyon Orta 20ml gerekecektir. 24mL Kriyoprezervasyon Orta toplam tutarı düşmek için 4ml ekleyin. Donma Orta 12ml gerekecektir anlamına gelir (24mL% 50) ve Donma Orta B (24mL% 50), 12ml. <table border="1"><tbody><tr><td> Donma Orta A (12 ml): </td><td> 6 ml DMEM/F12 </td><td> 6 ml KSR </td></tr><tr><td> Donma Orta B (12 ml): </td><td> 9.6 mL DMEM/F12 </td><td> 2.4 mL DMSO </td></tr></tbody></table> Kriyoprezervasyon Orta nihai bileşimi% 65 DMEM/F12,% 25 KSR, ve% 10 DMSO. Dondurularak iPSCs <ol><li> 37 ° C su banyosunda Dispase Öncesi sıcak gerekli hacim. Gerekli miktarlar hakkında ayrıntılı bilgi için aşağıdaki Tablo 1&#39;e bakınız. </li><li> 37 ° C su banyosunda for15 dakika KSR-FF gerekli hacmi Pre-dengelenmesi. Tablo 1below gerekli miktarlar hakkında ayrıntılı bilgi için bakınız. </li><li> Bir pipet kullanarak kültür damarı harcanan orta aspire ve hücrelerin D-PBS ile iki kez yıkayın. </li><li> Yavaşça kültür damarı (örneğin, 60 mm kültür çanak başına Dispase çözüm 1 ml) önceden ısıtılmış Dispase çözüm ekleyin. Tüm hücre yüzeyinde kat Swirl kültür damarı. </li><li> Kültür damarı 3 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Inkübatör geminin çıkarın, Dispase çözüm aspirat ve D-PBS ile hücrelerin nazikçe yıkayın. </li><li> Hücrelerin, hücre kazıyıcı kullanarak kültürü çanak yüzeyinden hafifçe kazıyın ve 15 mL steril bir santrifüj tüpüne hücreleri aktarmak. </li><li> Nazikçe müstakil olmayan herhangi bir hücre &quot;püskürtme&quot;, KSR-FF ile iki kez kültür çanak durulayın Havuz, 15 mL tüp hücreleri orta durulayın. </li><li> Tüp, oda sıcaklığında pelet hücreleri 5 dakika boyunca 200 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Dikkatle hücre pelletini bozmadan süpernatantı aspirat ve atın. </li><li> Cryovials yeterli miktarda hazırlayın. Hücreleri DMSO ile temas edildikten sonra, onlar aliquoted ve 2-3 dakika içinde dondurulmuş olmalıdır. </li><li> Yavaşça tam [tüp alttan hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme 5 ml serolojik pipet kullanarak] hücre pelletini yerinden ve Donma Orta A. hücreleri yeniden askıya tüp fiske. Hafifçe karıştırın hücre süspansiyonu dönen kümeleri tek tip süspansiyon ardından, bir damla akıllıca bir şekilde, eşit miktarda Donma Orta B ekleyin. Not: Bu noktada, hücrelerin DMSO ile temas ve çalışma verimli bir şekilde yapılmalıdır. Hücreleri DMSO ile temas edildikten sonra, onlar aliquoted ve 2-3 dakika içinde dondurulmuş olmalıdır. </li><li> Her cryovial hücre süspansiyonu kısım 1 ml. </li><li> Hızla [hızla dondurma] Mr Frosty şişeleri yer ve -80 ° C gecede transfer. </li><li> ° C - -80 geceleme depolama sonra, uzun süreli depolama için bir sıvı nitrojen tankı hücreleri aktarmak. </li></ol> iPSC flakon çözülme ve hücre kurtarma Not: KSR-FF KSR-MEF-klimalı içeren orta veya besleyiciler ile kullanmak için KSR orta ile değiştirilebilir. Medya hazırlanması için talimatlar için eke bakınız. KSR-FF orta Pre-sıcak 10 ml, 50 ml tüp içinde. <ol><li> Geltrex kaplı yemekler sadece kaplama önce oda sıcaklığına uygun miktar dengelenmesi ve yemeklerinden herhangi bir sıvı aspirer hücreleri. </li><li> HESC Sıvı Azot Depolama Tankı (veya iPSC) flakon dikkatlice çıkarın. </li><li> Sadece küçük bir dondurulmuş yığın flakon kalana kadar hızla 37 ° C su banyosunda hücreler dondurulmuş flakon Çözülme. </li><li> % 70 ile dekontamine ve steril doku kültürü kaputu transfer izopropanol flakon Sprey. </li><li> Aseptik olarak 5 ml pipet kullanarak 15 ml konik bir tüp içine flakon tüm içeriğini aktarmak. </li><li> KSR-FF 1 ml Flakon durulayın ve 15 ml santrifüj tüpüne ekleyin. </li><li> Yavaşça, KSR-FF 4 mL, 15 mL konik tüp hücrelerin damla-bilge ekleyin. Orta eklerken, hücreler hafifçe karıştırın tüp ileri ve geri hareket ettirin. (Bu hücrelerin ozmotik şok azaltır). </li><li> 15 ml tüp, oda sıcaklığında 2 dakika 1000rpm (200 x g) hücre süspansiyonu ile santrifüjleyin . </li><li> Dikkatlice aspire ve hücre pelletini bozmadan süpernatantı atın. </li><li> Önceden ısıtılmış KSR-FF hücre pelet (örneğin 4mL/60 mm çanak) 5 ml pipet kullanarak hücrelerin hücre pelletini tamamen dağınık olduğu kadar yavaşça yukarı aşağı pipet ve yeniden askıya aldı. Canlılığı% 70&#39;den az ise% 70 daha fazla bir canlılığı bekleniyor, ancak, bu hücreler için izdiham ulaşmak için daha uzun sürebilir. </li><li> Aynı pipet kullanarak, hücre süspansiyonu oda sıcaklığında ön dengelenmiş Geltrex kaplı kültürü çanak açılır akıllıca aktarın. </li><li> Havada% 4 ila 6 CO 2 nemlendirilmiş bir atmosfer ile 37 ° C inkübatör kültür çanak yerleştirin. Kuzey güney, doğu batı desen hücreler eşit olarak dağıtmak için dikkatlice girdap gemi. </li><li> Yavaşça kültür tabak sıvı değiştirmek için 24 saat sonrası çözülme ve hücre enkaz kaldırmak için ve bundan sonra çanak konfluent yaklaşık% 70-80 kadar taze besin sağlamak için günlük. IPS hücreleri devam eden kültür ve Pasajlanması için, &quot;İnsan iPS Hücreler Komple nakavt Serum Yedek kullanarak Besleyici Ücretsiz Kültür ve Pasajlanması Besleyici-Alerjik Orta&quot; başlıklı protokol bakın </li></ol> Beklenen Sonuçlar Hücreleri önce kriyoprezervasyon konfluent kabaca% 70-80 olmalıdır. Kıvrık ve koloni kenarları boyunca koloniler katlayarak sindirim sonuçları Dispase. Sonra hasat hücrelerin dondurulması medyada küçük kümeleri olarak dondurulur. Flakon çözülmüş sonra, hücreler kurtarmak ve küçük kümeleri olarak önceden kaplı çanak eklemek. Bunlar hızla konfluent 5-6 gün içinde bir çanak lider büyür. Tablo 1 - Önerilen Hacimleri <table border="1"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> 35mm Bulaşık </td><td> 60mm Bulaşık </td><td> 100mm Bulaşık </td></tr><tr><td> Komple nakavt SR orta </td><td> 2 mL </td><td> 4 mL </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Geltrex Çözüm </td><td> 1 ml </td><td> 1,5 mL </td><td> 4-5 ml </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> 0,5 mL </td><td> 1 ml </td><td> 3-4 ml </td></tr><tr><td> Durulama için D-PBS </td><td> 2 mL </td><td> 4 mL </td><td> 10 ml </td></tr></tbody></table> Lütfen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2237/2237_appendix.pdf">ek görmek için tıklayınız</a> .

<ol><li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li>
<li>Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).</li>
<li>Dimos, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li>
<li>Aasen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnli%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).</li>
</ol>

Bu makalenin yazarları, bu yazıda kullanılan reaktifler ve aletleri üreten Life Teknolojileri tarafından istihdam edilmektedir.

<table><tbody><tr><td>Knockout DMEM/F12</td><td></td><td>12660-012</td><td>Not: alternatif DMEM ürünleri GlutaMAX-I (Kat. No. 35050-061) kullanımı için ekle bakınız</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td></td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail</td><td></td><td>A10580-01</td><td></td></tr><tr><td>FGF-basic, insan rekombinant proteini, 10 &amp;mu;g</td><td></td><td>PHG0024</td><td>Not: alternatif bFGF paket boyutları için ekle bakınız.</td></tr><tr><td>2-Merkapto&amp;#8211;etanol</td><td></td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td></td><td>17105-041</td><td>Not: alternatif pasajlama yöntemleri için ekle bakınız</td></tr><tr><td>Geltrex hESC-Kalifiye İndirgenmiş Büyüme Faktörü Bazal Matrisi, 1 mL</td><td></td><td>A10480-01</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum ve magnezyum içermeyen Dulbecco&amp;rsquo;s Fosfat Tamponlu Salin (D-PBS)</td><td></td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, 500mL</td><td>JT Baker</td><td>JT9224-1</td><td></td></tr><tr><td>Steril Doku Kültürü Kabini</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C'ye ayarlanmış İnkübatör</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipet Yardımcısı (Pipette-Aid)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C'ye ayarlanmış Su Banyosu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steril serolojik pipetler (5 mL, 10 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL santrifüj tüpleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm Doku Kültürü işlem görmüş kaplar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sıvı azot depolama tankı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>İzopropanol dondurma kapları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Kriyotüpler</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan ips hücreleri dondurularak ve kurtarma tam nakavt serum yedek besleyici-alerjik orta

Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

2006 yılında, insan ve fare fibroblastlar dikkat çekici embriyonik kök hücrelere benzer nitelikleri ile 1-3 iPS hücreleri üretmek yeniden olabilir keşif pluripotent hücrelerin hücre tedavisi, ilaç keşfi ve temel araştırmalar için değerli bir yeni kaynak yaratmıştır . Gibco medya ve reaktifler yıllardır pluripotent kök hücre araştırmaları ön planda olmuştur. DMEM Nakavt Nakavt Serum Değiştirme ile desteklenmiş, embriyonik kök hücre büyümesi ve şimdi iPS hücre kültürü 3-9 için tercih edilen medya . Bu altın standart medya sistemi artık Nakavt SR Büyüme Faktörü Kokteyli ilavesi ile besleyici ücretsiz kültür kullanılabilir. Geleneksel insan ES ve iPS hücre kültürü yöntemleri, fare veya insan fibroblast besleyici katmanları veya besleyici klimalı ortamı gerektirir. Bu kültür yöntemleri ölçekli, emek-yoğun, sert ve tanımlanmamış durumlar nedeniyle farklılaşmamış kalça hücreleri korumak için zordur. Invitrogen Nakavt SR hala korurken, kalça ve embriyonik kök hücre kültürlerinde kolaylıkla geçiş için besleyici ücretsiz izin Nakavt SR Büyüme Faktörü Kokteyl geliştirdi.

Bu protokol nakavt SR kriyoprezervasyon orta insan iPS hücreleri dondurularak ve bu hücrelerin tam nakavt SR Besleyici Ücretsiz (KSR-FF), orta ya da besleyici tabanlı nakavt SR orta kurtarmak için ayrıntılı prosedürü anlatılmaktadır.

İnsan iPS hücreleri dondurularak ve kurtarma Tam nakavt Serum Yedek Besleyici-Alerjik Orta

2006 yılında insan ve fare fibroblastlarının, embriyonik kök hücrelere dikkat çekici derecede benzer özelliklere sahip iPS hücreleri 1-3 üretmek üzere yeniden programlanabileceğinin keşfi...

Bu prosedürün genel amacı, IPS hücrelerini besleyici hücre içeren veya besleyici hücre içermeyen kültür koşullarında kriyoprezerve etmek ve geri kazanmaktır. Bu işlem, öncelikle IPC'lerinizi normalde yaptığınız şekilde paketlemeye başlayarak gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, hücrelerin serumsuz dondurma besiyerine aktarılmasıdır.Prosedürün üçüncü adımı, hücreleri normalde yaptığınız şekilde kriyoprezerve etmektir. Prosedürün son adımı ise hücreleri çözmek ve bakım işlemlerine başlamaktır. Nihayetinde, sağlıklı morfoloji ve çözüm sonrası geri kazanım aracılığıyla, serumsuz dondurma ortamında iPS hücrelerinin başarılı bir şekilde dondurulduğunu ve çözüldüğünü gösteren sonuçlar elde edilebilir.Merhaba, ben Life Technologies bünyesindeki GCO sahasından Kate Wagner. Bu protokolün görsel gösterimi kritik öneme sahiptir çünkü iPSC'ler dondurma işlemine ve T fine'a karşı oldukça hassas olabilirler. Bu protokolü kolaylaştıran unsur, tüm iş akışınız boyunca knockout serum replasmanının kullanılabilmesidir.Günümüzde KSR ürün ailesi, embriyonik kök hücrelerinizin ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerinizin feeder bazlı, feeder içermeyen ve xeno-free kültürü için medya ve reaktiflerin eksiksiz bir listesini sunmaktadır. KSR; derivasyon, büyüme, kriyoprezervasyon, ekspansiyon ve diferansiyasyonun ilk başlangıç adımları için kullanılabilir. Aşağıdaki video, feeder içermeyen bir ortamda KSR kullanarak hücrelerin çözdürme ve dondurma işlemlerini size gösterecektir.Bu prosedüre başlamak için, öncelikle uygun miktarda komple besleyici hücre içermeyen ortamı bir su banyosunda 37 °C'ye ısıtın; 60 mm'lik bir kap olan kültür kabındaki kullanılmış ortamı aspire edin. Bu durumda, insan indüklenmiş pluripotent kök hücrelerini iki kez DPBS ile durulayın.Ardından kaba bir mililitre dispa ekleyin. Kabı 37 °C'de üç dakika inkübe edin. Bundan sonra, dispa solüsyonunu aspire edin ve hücreleri DPBS ile nazikçe yıkayın.Ardından, kabı kaplayacak kadar komple besleyici hücresiz ortam ekleyin ve hücreleri hafifçe kazımak için bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri steril bir 15 milliliter santrifüj tüpüne aktarın. Kabı komple besleyici hücresiz ortam ile durulayın ve ayrılmamış hücreleri nazikçe püskürterek temizleyin. Durulama solüsyonunu hücrelerin bulunduğu aynı 15 milliliter tüpe aktarın.Kabı orta ile ikinci kez durulayın ve hücreleri içeren bu durulama solüsyonunu çekerek oda sıcaklığında 1000 RPM'de üç dakika santrifüjle çöktürün. Santrifüjden sonra, hücre peletini bozmadan süpernatanı dikkatlice aspire edin ve atın. Hücre peletini tüpün dibinden tamamen ayırmak için tüpe hafifçe vurun.Ardından, beş mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak bir mililitre dondurma besiyeri A ekleyin ve hücreleri nazikçe pipetleyerek yeniden süspande edin. Topaklanmalar homojen bir süspansiyon haline geldikten sonra, hücre süspansiyonunu karıştırmak için nazikçe çevirerek tüpe damla damla bir mililitre dondurma besiyeri B ekleyin. Hücre süspansiyonunu her bir kriyotüpe bir mililitre olacak şekilde paylaştırın ve hücreleri bir izopropanol haznesinde gece boyunca -80 °C'de dondurun.Ertesi gün, hücre tüplerini uzun süreli saklama için bir sıvı azot tankına aktarın. Dondurulmuş hücre tüpünü, tüpün içinde sadece küçük bir donmuş parça kalana kadar yaklaşık üç ila dört dakika boyunca 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirerek hızla çözdürün. Tüpü su banyosundan çıkardıktan sonra dekontamine etmek için %70 izopropanol püskürtün, ardından tüpün tüm içeriğini aseptik bir şekilde 15 mL'lik konik bir tüpe aktarmak için beş mililitrelik bir pipet kullanın.Bir sonraki adım, prosedürün en zor kısmı olabilir. Besleyici hücre içermeyen ortam, hücrelere yavaşça ve dikkatlice eklenmelidir. Ozmotik şoku azaltmak için, 15 mL'lik konik tüpteki hücrelere dört mL tamamlanmış besleyici hücre içermeyen ortamı damla damla ve yavaşça ekleyin.Besiyeri eklerken, hücreleri karıştırmak için tüpü yavaşça ileri geri hareket ettirin. Bu işlem hücrelerin maruz kaldığı ozmotik şoku azaltacaktır. Besleyici hücre içermeyen tam besiyeri, meth kondisyonlu besiyeri içeren knockout serum replasmanı ile veya besleyici hücrelerle kullanım için knockout serum replasman besiyeri ile değiştirilebilir; besiyeri hazırlama talimatları için protokol metnine bakınız.Besiyerinin dört mililitresinin tamamı eklendikten sonra, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 1000 RPM'de santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, hücre peletini rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice aspire ederek uzaklaştırın. Hücre peletini dört mililitre komple feeder-free besiyeri içerisinde nazikçe resüspande edin.Beş mililitrelik bir pipet kullanarak, hücre süspansiyonunu gelt trucks kaplı 60 milimetrelik bir kültür kabına damla damla nazikçe ekleyin. Kültür kabını, havada %4 ila %6 karbondioksit içeren nemlendirilmiş atmosfere sahip 36 ila 38 derece Celsius sıcaklıktaki bir inkübatöre yerleştirin. Hücrelerin eşit şekilde dağılması için kabı kuzey-güney ve doğu-batı yönlerinde dikkatlice dairesel hareketlerle sallayın.Çözme işleminden 24 saat sonra, kaptaki ortamı taze ortamla değiştirin. Hücreler yaklaşık %70 ila %80 konfluens düzeyine ulaşana kadar, tükenmiş ortamı her gün değiştirmeye devam edin.Bu kontrast görüntü, komple serum ikamesi içeren, feeder-free (besleyici hücre içermeyen) besiyeri kullanılarak gelTRX kaplı kültür kaplarında büyütülen insan indüklenmiş pluripotent kök hücrelerini göstermektedir. iPSC'ler, büyük çekirdekler ve az sitoplazma ile karakterize edilen, insan embriyonik kök hücrelerine benzer bir morfoloji sergilemektedir. Çözdürme sonrası ve serum ikamesi sonrası hücrelere bir örnek.Gelt TrackX üzerindeki besleyici hücresiz ortam burada gösterilmiştir. Bu prosedür takip edilirken, tüm hücre kolonilerinin aynı boyutta tutulmasının önemli olduğu unutulmamalıdır. Kriyoprezervasyon sırasında bu durum hücre geri kazanımını artırır.İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

cryopreserving-recovering-human-ips-cells-using-complete-knockout

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Aşağıdaki protokolü tam nakavt Serum Yedek Besleyici Ücretsiz orta (KSR-FF) kullanarak besleyici ücretsiz kültür, insan kaynaklı Pluripotent Kök (IPS) Hücreler uyarlanması için talimat sağlar. Bir kez, adapte sürekli bakım için talimatlar ayrıca verilmiştir.

İnsan IPS Hücreler Komple nakavt Serum Yedek Besleyici-Alerjik Orta kullanarak Besleyici Adaptasyon, Kültür ve Pasajlanması

Burada bir episomuna göre yeniden programlama strateji ve histon deasetilaz inhibitörleri kullanılarak periferal kandan alınan insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi için bir protokol açıklar.

Epizomlar ve HDAC inhibitörleri kullanarak Blood Verimli iPS Hücre Üretimi

İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) pluripotent durumlarının korunmasını belirlemek için düzenli karakterizasyonu, bu hücrelerin diğer uygulamalar için kullanılmadan önce önemli bir adımdır. Burada, immünositokimya yoluyla kolay ve rutin karakterizasyonlarını sağlamak için özel olarak tasarlanmış insan iPSC'lerinin küçük ölçekli yayılımı için bir yöntem açıklıyoruz.

Rutin İmmünositokimyasal Karakterizasyonu için serum serbest şartlar İnsan iPSCs küçük ölçekli Yayılım

Burada, insandan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hiPSC) serum serbest embriyo gövdesi (SFEB) denilen üç boyutlu (3 boyutlu) bir sistem geliştirmek için bir protokol bildirdik. Bu 3 Boyutlu model, insan kortikal gelişimini modellemek için organotipik dilim kültürü gibi ve gelişmekte olan sinir devrelerinin fizyolojik sorgusu için kullanılabilir.

Fizyolojik Olarak İlgili Tahliller Kullanılarak 3-D Kök Hücre Kültürlerinin Sorgulanması İçin HiPSC Türevi Serum Serbest Embriyoid Cisim Geliştirilmesi

Pluripotent kök hücrelerden özel Retina hücrelerinin üretimini geliştirme retina hastalıkları için kök hücre tabanlı tedavisinin bir dönüm noktası olduğunu. Mevcut kağıt Retina organoids ve Retina pigmentli epitel verimli bir nesil için temel, çevirim ve klinik araştırma için basit bir yöntem açıklanır.

Tanımlanmış Xeno-alerjik ve besleyici-Alerjik kültür koşulları üretimi insan IPSC kaynaklı Retina hücre modelleri için

Primordial germ hücreleri (PGCs) ortak öncüleri sperm ve yumurta vardır. İnsan embriyonik PGCs pluripotent epiblast hücreleri sitokinler etkileşimleri aracılığıyla belirtilir. Burada, biz insan hücreleri transcriptomally embryoid organları yüzeyden astarlanmalıdır pluripotency indüklenen pluripotent kök hücreler, PGCs benzeyen inducing bir 13 günlük iletişim kuralı tanımlamak.

Pluripotent kök hücre üretimi insan ilkel Germ hücreli benzeri hücre Embryoid organları yüzeyden astarlanmalıdır pluripotent adlı indüklenen

İndüklenen pluripotent kök hücrelerinden (IPSC-EPs) elde edilen endotel progenatörler, kardiyovasküler hastalık tedavilerinin devrimleştirilmesi ve daha sadık kardiyovasküler hastalık modellerinin oluşturulmasını sağlamak için potansiyele sahiptir. Burada, üç boyutlu (3D) kollajen mikroortamlarda IPSC-EPs kapsülleme ve bu hücrelerin vasculogenik potansiyelinin nicel Analizi açıklanmıştır.

Bir In vitro 3D model ve hesaplamalı boru hattı PSC-türetilen endotel progenitors Vazculogenik potansiyelini ölçmek için

Hücre yeniden programlama, pluripotent hücre durumunu düzenleyen ve koruyan anahtar genlerin tanıtılmasını gerektirir. Açıklanan protokol, insan dermal fibroblastlarından viral/entegre yöntemler olmadan ancak modifiye edilmeyen RNA'lar (NM-RNA) kullanarak hücresel savunma mekanizmalarını azaltan immün kaçırma faktörleri ile birlikte indüklenen pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) kolonilerinin oluşmasını sağlar.

Erişkin İnsan Dermal Fibroblastlarının Abdominal Deriden İzolasyon ve İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerin Indüklenen Alacalı Kök Hücrelerin Indükleyici Olmayan Yöntemle Üretilmesi

Bu çalışma, insan kök hücresinden türetilmiş retina pigment epitel hücrelerinin etkili bir şekilde dondurularak saklanması için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kaynaklı Retina Pigment Epitel Hücrelerinin Optimal Aşamada Dondurularak Saklanması

Sunulan yöntem, yüksek verimli bir lentiviral aracılı gen dağıtım sistemi kullanarak L2HGDH genini hedefleyen sgRNA'ları kararlı bir şekilde ifade eden insan embriyonik kök hücre (hESC) hattı H9'da CRISPR aracılı bir gen nakavtının oluşturulmasını açıklar.

Besleyicisiz Koşullar Altında Kültürlenen İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-Cas9 Aracılı Gen Delesyonuna

Burada, insan iPSC'den türetilmiş kimerik antijen reseptörü (CAR) eksprese eden doğal öldürücü hücreleri çeşitli malignitelere karşı daha iyi öldürme ile ayırt etmek ve genişletmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu protokol, doğal öldürücü (NK) optimize edilmiş iPSC'den türetilmiş CAR-NK hücrelerinin farklılaşmasını ve genişlemesini ve çeşitli tümör hücre hatlarına karşı antitümör aktivitesinin ölçümünü gösterir.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kimerik Antijen Reseptörü İfade Eden Doğal Öldürücü Hücrelerdeki Gelişmeler

Öğrenin insan iPS hücrelerinin serum içermeyen dondurma ortamı kullanılarak kriyoprezervasyonu ve besleyici içeren veya içermeyen koşullarda kurtarma yöntemini. Bu protokol hücre canlılığını korur.

İnsan iPS hücreleri dondurularak ve kurtarma Tam nakavt Serum Yedek Besleyici-Alerjik Orta

Daha fazla video keşfet