İnsan iPS hücreleri dondurularak ve kurtarma Tam nakavt Serum Yedek Besleyici-Alerjik Orta

Bu prosedürün genel amacı, IPS hücrelerini besleyici hücre içeren veya besleyici hücre içermeyen kültür koşullarında kriyoprezerve etmek ve geri kazanmaktır. Bu işlem, öncelikle IPC'lerinizi normalde yaptığınız şekilde paketlemeye başlayarak gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, hücrelerin serumsuz dondurma besiyerine aktarılmasıdır.

Prosedürün üçüncü adımı, hücreleri normalde yaptığınız şekilde kriyoprezerve etmektir. Prosedürün son adımı ise hücreleri çözmek ve bakım işlemlerine başlamaktır. Nihayetinde, sağlıklı morfoloji ve çözüm sonrası geri kazanım aracılığıyla, serumsuz dondurma ortamında iPS hücrelerinin başarılı bir şekilde dondurulduğunu ve çözüldüğünü gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Merhaba, ben Life Technologies bünyesindeki GCO sahasından Kate Wagner. Bu protokolün görsel gösterimi kritik öneme sahiptir çünkü iPSC'ler dondurma işlemine ve T fine'a karşı oldukça hassas olabilirler. Bu protokolü kolaylaştıran unsur, tüm iş akışınız boyunca knockout serum replasmanının kullanılabilmesidir.

Günümüzde KSR ürün ailesi, embriyonik kök hücrelerinizin ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerinizin feeder bazlı, feeder içermeyen ve xeno-free kültürü için medya ve reaktiflerin eksiksiz bir listesini sunmaktadır. KSR; derivasyon, büyüme, kriyoprezervasyon, ekspansiyon ve diferansiyasyonun ilk başlangıç adımları için kullanılabilir. Aşağıdaki video, feeder içermeyen bir ortamda KSR kullanarak hücrelerin çözdürme ve dondurma işlemlerini size gösterecektir.

Bu prosedüre başlamak için, öncelikle uygun miktarda komple besleyici hücre içermeyen ortamı bir su banyosunda 37 °C'ye ısıtın; 60 mm'lik bir kap olan kültür kabındaki kullanılmış ortamı aspire edin. Bu durumda, insan indüklenmiş pluripotent kök hücrelerini iki kez DPBS ile durulayın.

Ardından kaba bir mililitre dispa ekleyin. Kabı 37 °C'de üç dakika inkübe edin. Bundan sonra, dispa solüsyonunu aspire edin ve hücreleri DPBS ile nazikçe yıkayın.

Ardından, kabı kaplayacak kadar komple besleyici hücresiz ortam ekleyin ve hücreleri hafifçe kazımak için bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri steril bir 15 milliliter santrifüj tüpüne aktarın. Kabı komple besleyici hücresiz ortam ile durulayın ve ayrılmamış hücreleri nazikçe püskürterek temizleyin. Durulama solüsyonunu hücrelerin bulunduğu aynı 15 milliliter tüpe aktarın.

Kabı orta ile ikinci kez durulayın ve hücreleri içeren bu durulama solüsyonunu çekerek oda sıcaklığında 1000 RPM'de üç dakika santrifüjle çöktürün. Santrifüjden sonra, hücre peletini bozmadan süpernatanı dikkatlice aspire edin ve atın. Hücre peletini tüpün dibinden tamamen ayırmak için tüpe hafifçe vurun.

Ardından, beş mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak bir mililitre dondurma besiyeri A ekleyin ve hücreleri nazikçe pipetleyerek yeniden süspande edin. Topaklanmalar homojen bir süspansiyon haline geldikten sonra, hücre süspansiyonunu karıştırmak için nazikçe çevirerek tüpe damla damla bir mililitre dondurma besiyeri B ekleyin. Hücre süspansiyonunu her bir kriyotüpe bir mililitre olacak şekilde paylaştırın ve hücreleri bir izopropanol haznesinde gece boyunca -80 °C'de dondurun.

Ertesi gün, hücre tüplerini uzun süreli saklama için bir sıvı azot tankına aktarın. Dondurulmuş hücre tüpünü, tüpün içinde sadece küçük bir donmuş parça kalana kadar yaklaşık üç ila dört dakika boyunca 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirerek hızla çözdürün. Tüpü su banyosundan çıkardıktan sonra dekontamine etmek için %70 izopropanol püskürtün, ardından tüpün tüm içeriğini aseptik bir şekilde 15 mL'lik konik bir tüpe aktarmak için beş mililitrelik bir pipet kullanın.

Bir sonraki adım, prosedürün en zor kısmı olabilir. Besleyici hücre içermeyen ortam, hücrelere yavaşça ve dikkatlice eklenmelidir. Ozmotik şoku azaltmak için, 15 mL'lik konik tüpteki hücrelere dört mL tamamlanmış besleyici hücre içermeyen ortamı damla damla ve yavaşça ekleyin.

Besiyeri eklerken, hücreleri karıştırmak için tüpü yavaşça ileri geri hareket ettirin. Bu işlem hücrelerin maruz kaldığı ozmotik şoku azaltacaktır. Besleyici hücre içermeyen tam besiyeri, meth kondisyonlu besiyeri içeren knockout serum replasmanı ile veya besleyici hücrelerle kullanım için knockout serum replasman besiyeri ile değiştirilebilir; besiyeri hazırlama talimatları için protokol metnine bakınız.

Besiyerinin dört mililitresinin tamamı eklendikten sonra, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 1000 RPM'de santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, hücre peletini rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice aspire ederek uzaklaştırın. Hücre peletini dört mililitre komple feeder-free besiyeri içerisinde nazikçe resüspande edin.

Beş mililitrelik bir pipet kullanarak, hücre süspansiyonunu gelt trucks kaplı 60 milimetrelik bir kültür kabına damla damla nazikçe ekleyin. Kültür kabını, havada %4 ila %6 karbondioksit içeren nemlendirilmiş atmosfere sahip 36 ila 38 derece Celsius sıcaklıktaki bir inkübatöre yerleştirin. Hücrelerin eşit şekilde dağılması için kabı kuzey-güney ve doğu-batı yönlerinde dikkatlice dairesel hareketlerle sallayın.

Çözme işleminden 24 saat sonra, kaptaki ortamı taze ortamla değiştirin. Hücreler yaklaşık %70 ila %80 konfluens düzeyine ulaşana kadar, tükenmiş ortamı her gün değiştirmeye devam edin.

Bu kontrast görüntü, komple serum ikamesi içeren, feeder-free (besleyici hücre içermeyen) besiyeri kullanılarak gelTRX kaplı kültür kaplarında büyütülen insan indüklenmiş pluripotent kök hücrelerini göstermektedir. iPSC'ler, büyük çekirdekler ve az sitoplazma ile karakterize edilen, insan embriyonik kök hücrelerine benzer bir morfoloji sergilemektedir. Çözdürme sonrası ve serum ikamesi sonrası hücrelere bir örnek.

Gelt TrackX üzerindeki besleyici hücresiz ortam burada gösterilmiştir. Bu prosedür takip edilirken, tüm hücre kolonilerinin aynı boyutta tutulmasının önemli olduğu unutulmamalıdır. Kriyoprezervasyon sırasında bu durum hücre geri kazanımını artırır.

İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.