Name: Büyük Ölçekli Zebra balığı Tabanlı In vivo Küçük Molekül Ekran (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Öğrenin, Danio rerio embriyoları kullanarak büyük ölçekli küçük molekül tarama yöntemini. Bu teknik, gelişimsel biyoloji ve ilaç keşfi araştırmalarında yeni biyoaktif bileşiklerin hızlı tanımlanmasını sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1) Zebra balığı Yumurta Toplama <ol><li> Kimyasal ekran gün önce öğleden sonra, 10 ila 20 Zebra balığı üreme tankları kurdu. Her bir tank su ile yetiştiricilik sistemi doldurun. Bir balık ağı kullanarak, her bir yetiştirme tankında iç konteyner bir yetişkin erkek ve 01:59 yetişkin kadın aktarın. Bir bölücü ile erkek ve dişi balık birbirinden ayırın. Kafesleri Etiket ve üzerlerine bir kapak koydu. </li><li> Ekranın sabah, üreme tankları bölücüler kaldırmak ve çiftleşmek için zebrafish izin. Önceki 1 saat boyunca, döllenmiş yumurta her iç konteyner alt kısmında ızgara üzerinden düşmesine izin vermeyin. </li><li> 1 saat sonra, kalıcı depolama tankları yetişkin zebrafish geri dönüş iç kabı çıkarın ve bir plastik çay süzgeci ile her bir yetiştirme tankında su süzme yumurta toplamak. </li><li> Petri kabı üzerinden süzgeci ters çevirin ve E3 orta içeren bir yıkama şişesi kullanarak Petri kabı içine yumurtaları temizlemek için yavaşça süzgeç durulayın. </li><li> Opak görünür tüm döllenmemiş yumurta, tek bir plastik pipet kullanarak çıkarılmalıdır. Her çiftleşme çapraz yaklaşık 200 embriyolar verim gerekir. </li></ol> 2) 96-kuyu Tabaklar Embriyolar Arraying <ol><li> 5, 96 plaka bir cam Pasteur pipeti kullanarak her bir kuyunun içine E3 ortamda embriyolar hakkında aktarın. </li><li> Embriyo ponksiyon bakım alarak, pipet embriyolar 96-plaka üzerine dizilmiş, bir 12-kanal (300 mcL 30) kullanarak kuyuların mümkün olabildiğince kadar E3 orta kaldırmak. 12-kanallı pipet kullanarak, böylece embriyolar kadar kuruması için izin vermemek için de mümkün olduğunca çabuk, her 0.5μg/ml kanamisin içeren E3 orta 250 mcL sunmak. </li><li> 96-kuyucuğu bileşikler eklenecek zaman istenilen aşamaya ulaşmak kadar 28.5 ° C inkübatör içine koyun. </li></ol> 3) Küçük Molekül Kütüphanesi Devri Bileşik transferi robotik transfer yöntemleri ile otomatik olabileceği gibi, biz manuel aktarma yöntemini anlatacağız. <ol><li> Küçük molekül kütüphaneleri, tipik olarak 10 mM stok olarak DMSO saklanan her bileşik ile, 96-well formatında temin edilmektedir. Bileşikler eklenecek embriyolar aşamaya ulaşmak yaklaşık 60 dakika önce, küçük moleküller aynı hacimde (kaynak plaka) içeren 96-kuyucuğu İstediğiniz bir numarayı Çözülme. Kaynak plakaların seri veya diğer kimlik numarası dikkate alınız. Plakalar üzerinde yoğunlaşma en aza indirmek için, buz eritme Drierite (WA HAMMOND DRIERITE CO, Xenia, OH) içeren bir kuruma odasında oluşabilir. </li><li> Kısaca çok plaka adaptörü ile donatılmış bir masa üstü santrifüj plakaları dönerler. </li><li> Kaynak plaka alüminyum sızdırmazlık bantı çıkarın. 12-kanallı pipet kullanarak, kaynak plaka bileşiklerin konsantrasyonu 0.5 mM (örneğin, 250 nL alikotları 10mM stok ile başlayan, her bir kuyunun 4.75 mcL DMSO eklemek) seyreltin. </li><li> 96-plaka embriyoların (alıcı plaka) istenilen aşamaya ulaşmak, alıcı plakalar içeren kaynak plakaları bileşiklerin 2.5μL (0.5mm) aktarmak için bir 12-kanal (2-20 mcL) pipet kullanın embriyoların. </li><li> Alıcı embriyo plakalar üzerinde kaynak plakalarının kimlik numarasını kaydedin. Kapak kapakları ile embriyoların ve bileşikleri içeren alıcı plakaları, yavaşça yavaşça dönen plakalar karışımı, ve 28.5 ° C inkübatör koyun. </li><li> Uzun süreli saklama için -80 ° C derin dondurucuda alüminyum sızdırmazlık bantı ve yer ile kullanılmayan küçük moleküller (0.5 mM) içeren her kaynak plaka Kapak. </li></ol> 4) Küçük Moleküllerin Etkileri fenotipleri Görsel Muayene Tarama <ol><li> Ekranın gerçekleştirmeden önce, ne bir &quot;hit&quot; teşkil edeceğini için belirli bir kriter formüle. </li><li> Gelişimi istenilen zamanlarda, inkübatör bileşik tedavi edilen embriyolar içeren 96-kuyucuğu çıkarın ve bir stereomikroskop altında her iyi incelemek. Dolaşım desen değişiklikleri gibi ince değişiklikler, daha iyi bir görünüm için, ters faz-kontrast mikroskop kullanılabilir. Floresan mikroskobu, bir doku spesifik organizatörü altında GFP veya DsRed proteinleri ifade pertürbasyon incelemek için kullanılabilir. </li><li> 5 embriyo en az 3 öngörülen &quot;hit&quot; fenotip sergileyen herhangi bir kuyu için 96-kuyucuğu hızla tarayın. Kimlik, plaka ve her potansiyel hit iyi bir konuma kaydedin. </li><li> Çeşitli dozlarda (1 UM, 5 UM, 10 mcM ve 50 mcM) bileşik etkileri yeniden test potansiyel bir hit teyit. Her doz için 48 plaka formatında E3 medya 0.5 ml, 10 embriyolar test edilmektedir. Test için bileşik Ayrıca zamanlama orijinal tarama aynı olmalıdır. Hit ortaya çıkardı fenotip compoun, yeniden test yeniden teyitd </li><li> Küçük moleküllerin kimyasal kütüphane veritabanı isabet bileşik belirleyin. </li></ol>

<ol><li>Bayliss, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+modulation+of+receptor+signaling+inhibits+regenerative+angiogenesis+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Chemical modulation of receptor signaling inhibits regenerative angiogenesis in adult zebrafish.</a> Nature chemical biology. 2, 265-273 (2006).</li>
<li>Burns, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+assay+for+small+molecules+that+modulate+zebrafish+embryonic+heart+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate.</a> Nature chemical biology. 1, 263-264 (2005).</li>
<li>Hao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+structure-activity+relationship+study+of+dorsomorphin+analogues+identifies+selective+VEGF+and+BMP+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">In vivo structure-activity relationship study of dorsomorphin analogues identifies selective VEGF and BMP inhibitors.</a> ACS chemical biology. 5, 245-253 (2010).</li>
<li>Hong, C. C., Peterson, Q. P., Hong, J. Y., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artery%2Fvein+specification+is+governed+by+opposing+phosphatidylinositol-3+kinase+and+MAP+kinase%2FERK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Artery/vein specification is governed by opposing phosphatidylinositol-3 kinase and MAP kinase/ERK signaling.</a> Curr Biol. 16, 1366-1372 (2006).</li>
<li>Milan, D. J., Peterson, T. A., Ruskin, J. N., Peterson, R. T., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs+that+induce+repolarization+abnormalities+cause+bradycardia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish.</a> Circulation. 107, 1355-1358 (2003).</li>
<li>Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+developmental+screens+reveal+the+logic+and+timing+of+vertebrate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 12965-12969 (2000).</li>
<li>Yu, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsomorphin+inhibits+BMP+signals+required+for+embryogenesis+and+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism.</a> Nature chemical biology. 4, 33-41 (2008).</li>
<li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews%22%5BJournal%5D)">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nature reviews. 4, 35-44 (2005).</li>
<li>Stern, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+that+delay+S+phase+suppress+a+zebrafish+bmyb+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Small molecules that delay S phase suppress a zebrafish bmyb mutant.</a> Nature chemical biology. 1, 366-370 (2005).</li>
<li>Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+suppression+of+a+genetic+mutation+in+a+zebrafish+model+of+aortic+coarctation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation.</a> Nature biotechnology. 22, 595-599 (2004).</li>
</ol>

Zebrafish bazlı kimyasal ekran planlama yaparken özellikle dikkat sağlamlık fenotip ve arka plan gibi fenotip oranı dikkate alınarak ödenmelidir. Bu kimyasal bastırıcılar kaynaklı bir fenotip ekranlar için özellikle önemlidir. Örneğin, bir transgen ısı-şok indüksiyon kaynaklanan bir fenotip, fenotipe neden olan durum tekrarlanabilir kabul edilemeyecek kadar yüksek yalancı pozitiflik oranları önlemek için tam ekran başlamadan önce eşlenmiş olmalıdır. Dikkatli bir planlama ile, mütevazı bir sermaye yatırımı gerektirir zeb...

<ol><li> En az 20 çift istenilen genotip yetişkin zebrafish. </li><li> Balık ağları, Hayvancılık tankları, çıkarılabilir iç konteyner ve bölücüler (Aquatic Habitat). </li><li> Petri kapları (10 cm). </li><li> Plastik çay süzgeci. </li><li> Şişe containg embriyo su yıkayın. </li><li> Tek kullanımlık polietilen transferi pipetler. </li><li> Polistiren 96-iyi yuvarlak alt test plakaları (Corning Costar Lowell, MA). </li><li> Cam Pasteur pipeti (Fisher Scientific). </li><li> Manuel pipet pompası, 10 ml (Bel-Sanat Ürünleri, Pequannock, NJ). </li><li> E3 embriyo orta:% 0.003 PTU (phenylthio-karbamit, Sigma, St Louis, MO) içeren 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl 2, 0.33 mM MgSO 4,. PTU 1 L E3 embriyo medya 0.3 g PTU eriterek 10x bir çözüm olarak hazırlanabilir. PTU içeren Çözümleri alüminyum folyo ile kaplayarak ışıktan korunmalıdır. </li><li> 12-kanallı pipetler, 2-20 mcL (Eppendorf). </li><li> 12-kanallı pipetler, 3-300 mcL (Eppendorf). </li><li> Tek kullanımlık polistiren pipet havzası, 50 ml (Fisher Scientific). </li><li> DMSO 10 mM stok az 96 wll formatında dizilmiş yapısal olarak farklı bileşiklerin küçük molekül kütüphanesi. Her ana plaka 96-iyi polipropilen depolama levhalar (Corning) aliquoted ve -80 ° C kullanana kadar saklanır. </li><li> Alüminyum (Nunc, Rochester, NY) 96-kuyucuğu için bant mühürleme. </li><li> DMSO (Sigma, St Louis, MO). </li><li> Temel inkübatör, 28.5 ° C (Fisher Scientific). </li><li> Iletilen ışık tabanı (Leica Microsystems, Bannockburn, IL) ile stereomikroskopta. </li></ol>

büyük Ölçekli zebra balığı tabanlı in vivo küçük molekül ekran

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

, Küçük embriyo boyutu, hızlı bir gelişme, şeffaflık, doğurganlık ve memeliler için çok sayıda moleküler, morfolojik ve fizyolojik benzerlikleri göz önüne alındığında, zebrafish güçlü olarak ortaya çıkmıştır<em&gt; In vivo</em&gt; Fenotip tabanlı ilaç ekranları kimyasal ve genetik analiz platformu. Burada, küçük moleküller zebrafish embriyoları kullanılarak büyük ölçekli tarama için basit, pratik bir yöntem gösteriyor.

Zebra balığı güçlü olarak ortaya çıkmıştır<em&gt; In vivo</em&gt; Fenotip tabanlı ilaç ekranları kimyasal ve genetik analiz platformu. Burada, küçük moleküller zebrafish embriyoları kullanılarak büyük ölçekli tarama için basit, pratik bir yöntem gösteriyor.

Büyük Ölçekli Zebra balığı Tabanlı In vivo Küçük Molekül Ekran

Küçük embriyo boyutları, hızlı gelişimleri, şeffaflıkları, yüksek doğurganlıkları ve ... ile olan çok sayıdaki moleküler, morfolojik ve fizyolojik benzerlikleri göz önüne alındığında...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, embriyonik gelişim ve fizyolojinin temel yönlerini spesifik olarak modüle eden küçük molekülleri keşfetmektir. Bu, ilk adımda çok sayıda döllenmiş yumurtanın 96 kuyucuklu plakalara yerleştirilmesi ve ikinci adımda tarama yapılmasıyla gerçekleştirilir. Küçük molekül kütüphanesinden alınan alikotlar, 96 kuyucuklu plakalardaki embriyolara eklenir.Küçük moleküller tarafından ortaya çıkarılan fenotipler için kuyucuk plakaları incelenir. Hangi küçük moleküllerin süper balık gelişimini veya fizyolojisini spesifik olarak etkilediğini gösteren sonuçlar elde edilir. Merhaba, ben Vanderbilt Üniversitesi Tıp Fakültesi'nden Charles Hong.Laboratuvarımızda, danio rerio embriyolarını kullanarak yüksek kapasiteli kimyasal taramalar yapıyoruz. Bu, yeni biyoaktif bileşiklerin keşfi için yaygın olarak uyarlanabilen nispeten kolay bir tekniktir. Kimyasal tarama gününden önceki gün öğleden sonra, 10 ila 20 adet zebra balığı üretim tankı hazırlayın.Her tankın içine bir bölücü yerleştirin ve her tankı, bir yetişkin erkek ile bir veya iki yetişkin dişiyi iç kaba aktarmak için bir balık kepçesi kullanarak akuakültür sisteminden gelen suyla doldurun. Her üretim tankında, tankla

large-scale-zebrafish-based-in-vivo-small-molecule-screen

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz zebrafish transgenik embriyolar multiwell plakaları otomatik olarak görüntüleme ve analiz için bir sistem geliştirme raporu. Fibroblast Büyüme Faktörü muhabiri gen ekspresyonu üzerine küçük bir molekül, BCI, doza bağımlı etkileri ölçmek ve yüksek verimli zebrafish kimyasal ekranlar kurulması için teknoloji yeteneğini göstermektedir.

Zebrafish kimyasal ekranlar için otomatik görüntüleme ve analiz geliştirilmesi.

Bu makalede, zebra balığı embriyoları kimyasal toksisite taraması için kullanılmıştır. Kimyasal toksisite, fenotip okumaları ile ilişkilidir. Numune protokolü, kimyasal toksisite taramasının gerçekleştirilmesine yönelik metodolojik bir yaklaşımı göstermektedir.

Embriyo Bazlı Kimyasal Toksisite Ekranı: Zebra Balığı Embriyolarının Geliştirilmesi Üzerindeki Etkilerin Değerlendirilmesi

Zebra balığı embriyolarının dokuya özel floresans yarı otomatik görüntüleme için bir protokol aşağıda tarif edilmiştir.

Zebra balığı Embriyolar Doku spesifik Floresans yarı otomatik Görüntüleme

Bu video makalede, başarılı bir bütün omurgalı hayvan organizmayı kullanarak bileşik test ve ilaç keşfi için yeni bir güçlü bir araç sağlayan Zebra balığı embriyolarının büyük sayıda bulaştırmak ve analiz etmek için kurulmuştur yüksek kapasiteli boru hattı açıklanır.

Kuruluş ve Eğitim için bir Yüksek Verimli Kur Optimizasyonu<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Ve<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Enfeksiyon İlaç Keşif için bir model olarak

Zebra balığı omurgalı gelişimsel süreçleri ve model insan hastalığı araştırmak için mükemmel bir deneysel organizmadır. Burada, bir ile zebra balığı embriyolarının bir manuel yüksek verimli kimyasal ekran gerçekleştirmek için nasıl bir protokol tarif Okuması in situ hibridizasyon (VVISH) içinde tüm montaj.

Zebra balığı Embriyolar kullanılarak Yüksek verim Yaklaşıyor A Manuel Küçük Molekül Ekran

Zebra balığı, genetik ve gelişimsel çalışmalar için mükemmel bir model sistemdir. Boncuk implantasyonu, lokal hücresel ortamlarda değişiklikler yaparak gelişimsel mekanizmaları sorgulamak için kullanılabilecek değerli bir doku manipülasyon tekniğidir. Bu protokol, zebra balığı embriyosunda mikroboncuk implantasyonunun nasıl gerçekleştirileceğini açıklar.

Zebra balığı Embriyo microbead İmplantasyonu

Zebra balığı embriyoları kimyasal bileşiklerin toksisitesini değerlendirmek için kullanılır. Onlar harici geliştirmek ve kimyasallara duyarlı, ince phenotik değişikliklerin tespitine izin. Deney sadece doğrudan embriyo içeren plaka eklenir bileşik küçük bir miktar gerektirir, test sistemi verimli ve maliyet-etkin hale.

Zebrabalığı Embriyoları Kullanılarak Kimyasal Bileşiklerin Toksisitesinin Hızlı Değerlendirilmesi

Zebrabalığı ksenogreft modelleri, in vivo mikroortamda yüksek üretimli ilaç taraması ve insan kanser hücrelerinin floresan görüntülemesini sağlar. Zebra balığında hasta kaynaklı lösemi örnekleri üzerinde otomatik floresan mikroskop donanımlı görüntüleme ünitesi kullanılarak büyük ölçekli, otomatik ilaç taraması için bir iş akışı geliştirdik.

Zebrabalığında Primer Hasta Kaynaklı Tümör Xenograftların İlaç Taraması

Bu protokol, zebra balığı larvalarında döllenmeden 3-7 gün sonra bir ilaç tarama prosedürünü ve ardından morfolojik değerlendirmeyi tanımlar.

Erken Evre Zebra Balığı Larvalarında Küçük Molekül Taraması ve Toksisite Testi

RASopatiler, RAS-MAPK yolağı hiperaktivasyonunun neden olduğu multisistemik genetik sendromlardır. Doğrulanmayı bekleyen potansiyel olarak patojenik varyantlar sürekli olarak ortaya çıkarken, zayıf klinik öncesi kanıtlar tedaviyi sınırlar. Burada, genç muhabir zebra balığında canlı FRET görüntüleme ile RASopati ile ilişkili ERK aktivasyon seviyelerini ve embriyogenez sırasındaki farmakolojik modülasyonunu test etmek ve çapraz doğrulamak için in vivo protokolümüzü açıklıyoruz.

Canlı FRET mikroskobu ve immünofloresan ile erken zebra balığı Noonan sendromu modellerinde ERK aktivite modülasyonunu değerlendirmek için etkili bir protokol

Öğrenin, Danio rerio embriyoları kullanarak büyük ölçekli küçük molekül tarama yöntemini. Bu teknik, gelişimsel biyoloji ve ilaç keşfi araştırmalarında yeni biyoaktif bileşiklerin hızlı tanımlanmasını sağlar.

Büyük Ölçekli Zebra balığı Tabanlı In vivo Küçük Molekül Ekran

Daha fazla video keşfet