Büyük Ölçekli Zebra balığı Tabanlı In vivo Küçük Molekül Ekran

Aşağıdaki deneyin genel amacı, embriyonik gelişim ve fizyolojinin temel yönlerini spesifik olarak modüle eden küçük molekülleri keşfetmektir. Bu, ikinci adım olarak plakaları tararken 96'ya çok sayıda döllenmiş yumurta yerleştirilerek elde edilir. Küçük moleküllerden oluşan bir kütüphanenin alikotları, 96'daki embriyoların yanındaki 96 kuyucuk plakasına eklenir.

Kuyu plakaları, küçük moleküller tarafından ortaya çıkan fenotipler için incelenir. Hangi küçük moleküllerin özellikle süper balık gelişimini veya fizyolojisini etkilediğini gösteren sonuçlar elde edilir. Merhaba, benim adım Charles Hong, Vanderbilt Üniversitesi Tıp Fakültesi'nden.

Laboratuvarımızda, difish embriyoları kullanarak yüksek verimli kimyasal taramalar yapıyoruz. Bu, yeni biyoaktif bileşikleri keşfetmek için geniş çapta uyarlanabilen nispeten kolay bir tekniktir. Kimyasal tarama gününden önceki öğleden sonra, 10 ila 20 zebra balığı yetiştirme tankı kurun.

Her tanka bir bölücü yerleştirin ve her tankı, bir yetişkin erkek ve bir ila iki yetişkin dişi iç kaba bir balık ağı transferi kullanarak su ürünleri yetiştiriciliği sisteminden gelen suyla doldurun. Her üreme tankında, tankları etiketleyin ve ekranın sabahı üzerlerine bir kapak koyun. Bölücüleri üreme tanklarından çıkarın ve zebra balıklarının çiftleşmesine izin verin.

Önümüzdeki bir saat boyunca. Döllenmiş yumurtaların her bir iç kabın altındaki ızgaradan düşmesine izin verin. Bir saat sonra yetişkin seber balıklarını kalıcı depolama tanklarına geri koyun.

İç kabı çıkarın ve her bir üreme tankındaki suyu plastik bir çay süzgecinden geçirerek yumurtaları toplayın. Süzgeci bir Petri kabının üzerinde ters çevirin ve yumurtaları Petri kabına atmak için süzgeci nazikçe durulayın. E üç besiyeri içeren bir yıkama şişesi kullanılarak, opak görünen tüm döllenmemiş yumurtalar çıkarılmalıdır.

Tek kullanımlık bir plastik pipet kullanarak, her eşleşen çaprazlama yaklaşık 200 embriyo vermelidir. Daha sonra, bir cam macun pipeti kullanarak 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna E üç besiyerinde yaklaşık beş embriyo aktarın. Embriyolar 96 oyuklu bir plakaya dizildikten sonra.

12 kanallı bir pipet kullanarak E three ortamının mümkün olduğunca çoğunu kuyucuklardan çıkarın. Embriyoları delmemeye özen göstererek. 12 kanallı pipeti kullanarak 250 mikrolitre E 3 verin.

Mililitrede 0.5 Mikrogram içeren ortam, embriyoların kurumasına izin vermemek için her birine mümkün olduğunca çabuk misin yapabilir. 96 kuyulu plakayı, bileşiklerin ekleneceği istenen aşamaya ulaşana kadar 28.5 santigrat derecelik bir inkübatöre koyun. Bu protokolde, erken embriyonik modellemeyi bozan ve embriyoları üç saat boyunca veya 1000 hücre aşamasına ulaşılana kadar, küçük molekül kütüphanelerinin tipik olarak sağlandığı embriyoların %90'ından daha fazlası tarafından kuluçkaya yatıracak bileşikler arıyoruz.

Her bir bileşiğin DMSO'da 10 milimolar bir stok olarak depolandığı 96 oyuklu bir kaynak plakasında, embriyolar istenen aşamaya ulaşmadan yaklaşık 60 dakika önce, küçük moleküllerin alikotlarını içeren uygun sayıda 96 oyuklu plaka çözülür. Plakalardaki yoğuşmayı en aza indirmek için kaynak plakalarının seri veya diğer kimlik numaralarına dikkat edin. T kurutucu içeren bir kurutma odasına düşer. Sağ.

Plakaları, çok kuyulu bir plaka adaptörü ile donatılmış bir masa üstü santrifüjde kısaca döndürün. 12 kanallı bir pipet kullanarak alüminyum tavan bandını kaynak plakasından çıkarın, kaynak plakasındaki bileşikleri DMSO ile istenen konsantrasyona seyreltin. Bu protokolde, 0.5 milimolar stok plakasını seyreltmek için 0.5 milimolar nihai konsantrasyon kullanıyoruz ve 4.75 mikrolitre DMSO ekliyoruz.

96 oyuklu plakadaki embriyolar istenen aşamaya ulaştığında, kaynak plakalardan 2.5 mikrolitre bileşiği embriyoları içeren alıcı plakalara aktarmak için 12 kanallı bir pipet kullanın. Şimdi embriyoları ve bileşikleri içeren plakaları kapaklarla kapatın ve embriyo plakalarının üzerine kaynak plakaların kimlik numarasını kaydedin. Plakaları hafifçe döndürerek karıştırın ve 28,5 derecelik bir inkübatöre yerleştirin.

Kullanılmayan küçük molekülleri içeren her bir kaynak plakasını alüminyum tavan, bant ile örtün ve uzun süreli saklama için eksi 80 santigrat derece dondurucuya koyun. Görsel ekranı gerçekleştirmeden önce, belirli bir isabet kriteri formüle edin. Örneğin, dört beyin gelişiminin küçük moleküllü inhibitörleri için bir ekranda, bir isabet, ön beynin kaybını sağlayan bir bileşik olabilir.

Gözlerin yokluğu, ön beyin kaybının kolay bir görsel göstergesidir ve gelişimde istenen zamanlarda test etmek için floresan gerektirmez. Bileşik muamele edilmiş embriyoları içeren 96 kuyulu plakayı inkübatörden çıkarın ve dört beyin gelişiminin küçük molekül inhibitörlerini tararken her bir kuyucuğu stereo mikroskop altında inceleyin, dört beyin gelişimsel inhibisyonunun bir belirteci olarak göz kaybı için 28 saat sonra plakaları inceleyin. Beş embriyodan en az üçünün öngörülen yüksek fenotipi sergilediği herhangi bir kuyu için plakanın kimliğini ve kuyu konumunu kaydedin 96 oyuklu plakayı inkübatöre geri yerleştirin.

48 saat sonra göz ve ön beyin kaybını tekrar onaylayın. Embriyoların ön beyni olmasa da, en az dört gün hayatta kalacaklar. Bileşiğin etkilerini her doz için birkaç dozda yeniden test ederek potansiyel bir isabeti yeniden doğrulayın, 10 embriyo 48 oyuklu plaka formatında 0.5 mililitre E üç ortamında test edilir.

Yeniden test için bileşik baskının zamanlaması, orijinal taramanınkiyle aynı olmalıdır. Ortaya çıkan fenotip, bileşiğin yeniden test edilmesine bağlı bir şekilde doza bağlı bir şekilde yeniden üretildiğinde bir HIIT doğrulanır. Son olarak, hi bileşiğini kimyasal kütüphanedeki küçük moleküllerin veri tabanından tanımlayın.

Zebra balığı bazlı görsel kimyasal ekranı kullanarak, vücut ekseni üzerindeki etkisine dayanan küçük moleküllü bir kirpi sinyal inhibitörü keşfettik. Bu görüntü, kuyruğun belirgin ventral eğriliğini gösteren kirpi inhibitörüne maruz kalan embriyoları göstermektedir. 24 saatte, 48 saatte incelenen aynı embriyolar hala ventral kavisli fenotipi göstermektedir.

Bu görüntü, kirpi yolu mutant embriyosu ile karşılaştırıldığında bileşikle tedavi edilen embriyoyu göstermektedir. Bu tekniğe hakim olduktan sonra, bir kişi sadece birkaç saat içinde haftada yaklaşık 400 bileşiği tarayabilir. Bu teknik aynı zamanda kimyasal biyologların hücre gelişimi, hücre sinyal yolları ve embriyonik gelişim gibi şeyleri incelemelerinin yolunu açmıştır.

Karakterize edilmemiş küçük moleküllerle çalışırken, bu karakterize edilmemiş moleküller potansiyel olarak tehlikeli olabileceğinden, uygun güvenlik kullanımı laboratuvar önlüklerine ve eldivenlerine sahip olmak önemlidir.