Name: Non-ventriküler Plazmid Enjeksiyon ve Elektroporasyon Postnatal Rat Beyin Gen Teslimat (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-17T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Öğrenin, postnatal sıçan beynine plazmid enjeksiyonu ve elektroporasyon ile hedefli gen teslimatı yapmayı. Bu yöntem, nörobilim araştırmalarında hızlı ve etkili gen aktarımı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ekaterina Karelina için film müziği, video kayıt, CAG-EGFP plazmid hazırlanması için 3D animasyon ve Dr. Peter Blaesse Ivan Molotkov yardım için teşekkür ederim. Finlandiya Uluslararası Hareketlilik, Finlandiya Kültür Vakfı ve Finlandiya Akademisi Merkezi hibe destek verdi.

1. Giriş Transgenik hayvanlar oluşturulması, genlerin fonksiyonlarının incelenmesi, canlı hayvanlar 1 ve unraveling hastalığın mekanizması 2,3 yanı sıra hücrelerin 4 özellikleri işlemek için güçlü bir yöntem. Ancak, prosedür, bu nedenle bu tür viral enjeksiyon 5, elektroporasyonu 6 ve utero elektroporasyon 7,8 neonatal ventriküler enjeksiyonu gibi alternatif gen teslimat yöntemleri kullanmak dair teminat, son derece zaman alıcı ve pahalı oldukça zahmetli. ;, Örneğin kortikal ilgi alanında yerel bir ifade deseni oluşturmak olanağı göçmen olmayan hücre tiplerinin yerinde transfeksiyon non-viral genetik yapıları kullanımı: doğum sonrası ventriküler olmayan enjeksiyon ve elektroporasyon yöntemi özel bir takım avantajları vardır astrositler. Bu video, CMV artırıcı (pCAG-EGFP) 9 tavuk beta aktin organizatörü altında gelişmiş yeşil flüoresan protein plazmid bir kodlama kullanılarak yenidoğan sıçan beyin, doğum sonrası gen teslim ayrıntılı bir prosedür ortaya koymaktadır. Biz ince cam pipetler stereotaktik bir cihaz üzerinde imalat ve montajı mikroenjektör plazmid içeren enjeksiyon solüsyonu hazırlanması göstermektedir. Sonra biz, enjeksiyon prosedür hakkında ve forseps elektrotlar ve in vivo porator kullanarak elektroporasyon hakkında, ameliyat gerçekleştirme hakkında izofluran ile sıçan yavrular bayıltmadan hakkında konuşmak . Son olarak, beklenen sonuçları, bakış açıları ve bu deneyler sırasında ortaya çıkabilecek zorlukları kısaca tartışacağız. 2. Elektroporasyon için Plazmid Hazırlık <ol><li> Biz genellikle 10 ul 200 ul ince duvar tüp plazmid enjeksiyon çözüm hazırlar. Bu çözüm çeşitli deneyler için yeterli olacaktır. </li><li> Biz 1 ul 10X PBS (Malzeme ve ekipman) ve% 0,1 'Hızlı Yeşil su solüsyonu (Malzeme ve ekipman) 1 ul ul plazmid çözüm 8 (Malzeme ve ekipman) karıştırın. </li><li> Plazmid enjeksiyon çözüm nihai konsantrasyonu mg / ml 1 ile 3 arasında olmalıdır. DNA konsantrasyonu yüksek cam kapiller ince ucu ile enjeksiyon için çok viskoz ise plazmid DNA düşük konsantrasyonlarda, transfeksiyon verimliliği azaltacaktır. </li></ol> 3. Cam İğne Hazırlık <ol><li> Cam pipet hazırlanması için, biz, maksimum parametreleri çekerek ısıtma ve filament ile kılcal borosilikat cam (Malzeme ve ekipman) ve dik bir elektrot cam çektirmesi (Malzeme ve ekipman) kullanın. </li><li> Daha sonra ucu çapı 10-20 mikron ulaşmak için bir kağıt parçası kullanarak pipet ucu bölünürler. </li><li> Biz mikroskop amacı altında ucu çapı ve şekli kontrol edin. </li></ol> 4. Mikroenjektör Montaj <ol><li> Kılcal ince bir polimer (Malzeme ve ekipman) (Malzeme ve ekipman), mineral yağı ile (Malzeme ve ekipman) yaklaşık 1 / 3 dolgu hacminin 10 ul Hamilton şırınga kullanma. Hava kabarcıkları kaçının! </li><li> Sonra biz, mineral yağ ile cam pipet doldurmak ve Hamilton şırıngaya pipet yerleştirin. Hava kabarcıkları kaçının! </li><li> Cam pipet ile şırınga sonra (bkz. Malzeme ve ekipman) bir denetleyici bağlı mikroenjektör sabittir. </li><li> Stereotaktik aleti (Malzeme ve ekipman) sabit mikroenjeksiyon kurulum bize plazmid enjeksiyon solüsyonu ile güvenle cam pipet ucu tüpe imkanı bulursunuz. </li><li> Ucu çözüm yüzeye değdiğinde, 1 ile daha fazla ya da 2 mm daldırma ve mikro enjektör denetleyicisi kullanarak enjeksiyon karışımı yaklaşık 1 ul pipet doldurun. </li></ol> 5. Bayıltmadan hayvan Tüm işlemler burada sunulan hayvan deneyleri için Helsinki düzenlemelerin Üniversitesi göre yapıldı. <ol><li> Her deneme için izofluran yaklaşık 2 ml (Malzeme ve ekipman) ile gaz sızdırmaz bir şırınga (Malzeme ve ekipman) doldurun. </li><li> Şırınga, hava akımının kaynağına bağlı anestezi birimi (Malzeme ve ekipman) sabit değil, hayvan kutusu ve maske stereotaktik kurulum sabit. </li><li> Anestezi ünitesi, hava akımı yaklaşık 250 ml / dk ve izofluran düzeyi% 4'e ayarlayın. </li><li> Biz, 2-5 dakika süreyle hayvan kutuya yavru sıçan yerleştirin. </li><li> Yavru durur taşırken, stereotaktik kurulum bağlı ısıtma yastığı (Malzeme ve ekipman) üzerine yerleştirin. </li><li> Kullanıcı yavru kafa rostral parçası bayıltmadan maske içine yerleştirin. </li><li> Için 5 ila 10 dakika sürerderin anestezi girmek için yavru. </li><li> Anestezi derinliği bir kuyruk tutam kontrol edin ve yaklaşık% 2,0-1,5 izofluran girişi azaltmak. </li></ol> 6. Cerrahi, Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon <ol><li> % 70 etanol ile yavru kafasına cilt davranın. </li><li> (Malzeme ve ekipman), küçük makas (Malzeme ve ekipman) ve ince forseps kullanarak, alnında yavru bir ense cilt kesti. </li><li> Yanlara doğru bükün ve deri parçaları, hafif baş ve cilt fiksasyon için kafatasının işitsel orifisleri kulak bar çekin. </li><li> Binoküler bir mikroskop kullanarak, kafatası bregma noktayı bulmak. </li><li> Stereotaktik koordinatları kullanarak ilgi bölge tanımlayın. </li><li> Bu bölgenin üstüne enjeksiyon pipet yerleştirin ve kafatası yüzeye enjeksiyon solüsyonu 25-50 nl bırakarak işaretlemek. </li><li> Delinmiş alanda sıvı görünene kadar nazik ve dikkatli bir kafatası, mikroskop altında, yüksek hızlı bir cerrahi matkap (Malzeme ve ekipman) ile işaretlenmiş bir noktada delin. </li><li> Daha iyi iletkenlik elde etmek için geçerli iletken jel ile kafatası tarafta bir electropotation forseps elektrotlar (Malzeme ve ekipman) (Malzeme ve ekipman) sabitleyin. </li><li> Küçük tampon kullanarak deliğe damla sıvı (Malzeme ve ekipman) çıkarın ve enjeksiyon yeri koordinatlarına göre delik cam iğne batırın. </li><li> 25 ile 100 nl 5 ila 20 nl / sn hızda enjeksiyon solüsyonu infüze. </li><li> Pipet hızla kaldırmak ve hemen electroporate. Elektroporasyon 1 Hz frekansta 99 V 50 ms ve genlik süresi beş dikdörtgen darbeler uygulayarak yapılır. </li><li> Elektrotlar ve kulak çubukları çıkartın. </li><li> Dilsiz (Malzeme ve ekipman) ve keskin bir forseps ve cerrahi konuları (Malzeme ve ekipman) bir kombinasyonu kullanılarak kesilmiş deri diker. </li><li> Anestezi sonrası kurtarma yardım etmek için 15-30 dakika sıcak odasına yavru yerleştirin. </li><li> Sonra yavru anne kafesine geri koymak. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar Başarılı bir şekilde transfekte hücreler transgen ifadesi elektroporasyon yaklaşık 10 saat sonra görünür ve birkaç hafta boyunca sabit kalacaktır. Biz yukarıda anlatıldığı gibi derin kortikal katmanları veya postnatal günde 2 (P2) Wistar sıçan yavrular striatum bölge içine ya da plazmid microinjected ve in vivo elektroporasyon yapılan. Beyin dilimleri (kalınlığı 400 mikron) 2 ila 6 gün sonra kesilir (P4-P8) (HEPES Earle Dengeli Tuz Çözeltisi tamponlu) dilimleme soğuk ortamda 10 vibrotome kullanarak. Görüntü elde etme, oda sıcaklığında dilimleme orta Zeiss Axioplan 2 LSM5 Pascal konfokal mikroskop (Zeiss, Almanya) kullanılarak gerçekleştirildi. Derin kortikal katmanları ve striatumda enjeksiyon siteleri EGFP ifade çapı (Şekil 1A, B) yaklaşık 200-300 mikron kompakt bir bölgede bulunan birçok transfekte hücreleri içeriyordu. Transfekte hücreler içinde, EGFP ifade düzeyi, farklı şekillerde (Şekil 1D) ve akson demetleri (Şekil 1E) dikenler ile dendritler de dahil olmak üzere ince hücresel süreçler (Şekil 1C) görüntüleme izin için yeterince yüksek. EGFP elektroporasyon sonra hücre canlılığı yanı sıra sağlam bir istikrar aksonların distal parçaları gibi kortikal terminalleri (Şekil 1F) (1.5-2 mm hücre gövdeleri) izleme izin verdi. <img src="/files/ftp_upload/2244/2244fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 (A) başarıyla striatum bölgede plazmid enjeksiyon yeri tasvir P4 sıçan beyin hücreleri transfekte. (B) P5 sıçan beyin derin kortikal tabakalar halinde transfekte hücreleri (kortikal yüzey altında yaklaşık 1000 mm). (C) P8 sıçan beyin striatum bölgede transfekte hücresi. (D) P8 sıçan beyin striatum bölgede transfekte hücre Dendritik süreçler; oklar dendritik dikenler ve filopodia farklı türlerini belirtir. (E) teminat yolağı içinde transfekte hücrelerinin Aksonlar. (F) P8 sıçan korteks (ok ucu) pial yüzey sonlandırma Aksonlar. Ölçek çubukları, A, B, E ve F 100 mikron, 10 mikron, C ve D

<ol><li>Gerlai, R., Clayton, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+hippocampal+function+in+transgenic+mice%3A+an+ethological+perspective.+Trends+Neurosci%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Analyzing hippocampal function in transgenic mice: an ethological perspective. Trends Neurosci.</a> 22, 47-51 (1999).</li>
<li>McGowan, E., Eriksen, J., Hutton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+modeling+Alzheimer%27s+disease+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">A decade of modeling Alzheimer's disease in transgenic mice.</a> Trends Genet. 2, 281-289 (2006).</li>
<li>Cryan, J. F., Holmes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ascent+of+mouse%3A+advances+in+modeling+human+depression+and+anxiety%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The ascent of mouse: advances in modeling human depression and anxiety.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 4, 775-790 (2005).</li>
<li>Wells, T., Carter, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+neural+function+in+transgenic+rodents%3A+towards+a+comprehensive+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of neural function in transgenic rodents: towards a comprehensive strategy.</a> J. Neurosci. Methods. 108, 111-130 (2001).</li>
<li>Pilpel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((reproducible+transduction+of+select+forebrain+regions+by+targeted+recombinant+virus+injection+into+the+neonatal+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain.</a> J. Neurosci. Methods. 182, 55-63 (2009).</li>
<li>Boutin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PLoS One. 3, e1883-e1883 (2008).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101, 16-22 (2004).</li>
<li>De Simoni, A., Yu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures%3A+interface+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method.</a> Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).</li>
<li>Walantus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li>
<li>Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E16+rat+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li>
<li>Umeshima, H., Hirano, T., Kengaku, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-based+nuclear+movement+occurs+independently+of+centrosome+positioning+in+migrating+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Microtubule-based nuclear movement occurs independently of centrosome positioning in migrating neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 16182-16187 (2007).</li>
<li>Ashwell, K., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshwell%2C+K+%22Atlas+of+the+Developing+Rat+Nervous+System%22">Atlas of the Developing Rat Nervous System</a>. , 3rd edition, Academic Press. (2008).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , 6th edition, Academic Press. (2007).</li>
</ol>

Yaşayan kemirgen beyin içine gen teslimat yöntemleri ve doğum sonrası elektroporasyon 6 için, son zamanlarda, utero elektroporasyon 7,8,11,12 kurulan ve. Ancak, bu yöntemlerin çeşitli uygulamalar için sınırlayıcı olabilir plazmid DNA, intraventriküler enjeksiyon dayanmaktadır. Örneğin, bu yöntemleri, hipokampus, ne de kortikal astrositler gibi göçmen olmayan hücre tiplerinin transfeksiyon gibi belirli beyin bölgelerindeki hücrelerini hedef izin vermez. Non-ventriküler enjeksiyon elektropor...

<table><tbody><tr><td>2A-sa küt uçlu pens, 115mm</td><td>ekipman</td><td>XYtronic</td><td>XY-2A-SA</td><td>Cerrahi manipülasyonlarda kullanmadan önce dezenfeksiyon için %70 etanol ile işlem yapın</td></tr><tr><td>Paslanmaz çelik ısıtma pedli biyolojik sıcaklık kontrolörü</td><td>ekipman</td><td>Supertech</td><td>TMP-5b</td><td></td></tr><tr><td>Filamanlı borosilikat tüp</td><td>malzeme</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF120-69-10</td><td>Cam iğne</td></tr><tr><td>Tek kullanımlık matkap uçları</td><td>malzeme</td><td>Meisinger</td><td>HP 310 104 001 001 008</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeco&amp;rsquo;s PBS 10X</td><td>reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 pens, 110 mm</td><td>ekipman</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>Cerrahi manipülasyonlarda kullanmadan önce dezenfeksiyon için %70 etanol ile işlem yapın</td></tr><tr><td>Ealing mikro&amp;#8211;elektrot çekici</td><td>ekipman</td><td>Ealing</td><td>50-2013</td><td>Dikey elektrot cam çekici</td></tr><tr><td>Ethilon monofil poliamid 6-0 FS-3 16 mm 3/8c</td><td>malzeme</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson</td><td>EH7177H</td><td>Cerrahi iplikler</td></tr><tr><td>Exmire mikro şırınga 10.0 ml</td><td>ekipman</td><td>Exmire</td><td>MS*GLLX00</td><td>Sızdırmaz şırınga</td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>Pens elektrotlar</td><td>ekipman</td><td>BEX</td><td>LF650P3</td><td>Kullanmadan önce dezenfeksiyon için %70 etanol ile işlem yapın</td></tr><tr><td>Foredom matkap kontrol ünitesi</td><td>ekipman</td><td>Foredom</td><td>FM3545</td><td>Cerrahi matkap güç kaynağı ve kontrol ünitesi. Şu an mevcut olan analogu K.1070 mikromotor kitidir (Foredom)</td></tr><tr><td>Foredom mikro motor el parçası</td><td>ekipman</td><td>Foredom</td><td>MH-145</td><td>Şu an mevcut olan analogu K.1070 mikromotor kitidir (Foredom)</td></tr><tr><td>Fareler için gaz anestezi platformu</td><td>ekipman</td><td>Stoelting Co.</td><td>50264</td><td>Stereotaksik cihaza monte edilmiş</td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>reaktif</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>FDG9623</td><td></td></tr><tr><td>Mikro pansuman pensi, 105 mm</td><td>ekipman</td><td>Aesculap</td><td>BD302R</td><td>Cerrahi manipülasyonlarda kullanmadan önce dezenfeksiyon için %70 etanol ile işlem yapın</td></tr><tr><td>Microfil</td><td>malzeme</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MF34G-5</td><td>Mikro şırınga doldurma kapilerleri</td></tr><tr><td>Mineral yağ</td><td>reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>NanoFil Şırınga 10 mikrolitre</td><td>ekipman</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>NANOFIL</td><td>Hamilton şırınga</td></tr><tr><td>plazmid CAG-EGFP</td><td>reaktif</td><td></td><td></td><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen) ile ekstrakte edilip saflaştırılmış ve nükleaz içermeyen su ile 1.5 mg/ml konsantrasyona getirilmiş</td></tr><tr><td>Pulse jeneratörü CUY21Vivo-SQ</td><td>ekipman</td><td>BEX</td><td>CUY21Vivo-SQ</td><td></td></tr><tr><td>Schiller elektrot jeli</td><td>reaktif</td><td>Schiller AG</td><td>2.158000</td><td>İletken jel</td></tr><tr><td>Küçük hayvan stereotaksik cihazı</td><td>ekipman</td><td>David Kopf Instruments</td><td>900</td><td></td></tr><tr><td>St&amp;#8211;lting fare ve neonatal sıçan adaptörü</td><td>ekipman</td><td>Stoelting Co.</td><td>51625</td><td>Stereotaksik cihaza monte edilmiş. Cerrahi manipülasyonlarda kullanmadan önce kulak çubuklarını dezenfeksiyon için %70 etanol ile işlem yapın</td></tr><tr><td>Student iris makası, düz 11.5 cm</td><td>ekipman</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td>Cerrahi manipülasyonlarda kullanmadan önce dezenfeksiyon için %70 etanol ile işlem yapın</td></tr><tr><td>Sugi emici tamponlar 17 x 8 mm</td><td>malzeme</td><td>Kettenbach</td><td>31602</td><td>Cerrahi tamponlar</td></tr><tr><td>UMP3 mikrosyringe pompası ve Micro 4 mikrosyringe pompa kontrolörü</td><td>ekipman</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>UMP3-1</td><td>Mikroenjektör ve kontrolörü</td></tr><tr><td>Univentor 400 Anestezi Ünitesi</td><td>ekipman</td><td>Univentor</td><td>8323001</td><td></td></tr></tbody></table>

non-ventriküler plazmid enjeksiyon ve elektroporasyon postnatal rat beyin gen teslimat

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Transgenik hayvanlar oluşturulması, in vivo olarak ilgi çekici bir gen fonksiyonları okuyor standart bir yaklaşımdır. Ancak, birçok nakavt veya transgenik hayvanlar değiştirilmiş gen ifade ya da tüm organizmanın silinir bu durumda uygulanabilir değildir. Ayrıca, telafi edici mekanizmaların çeşitli genellikle sonuçları yorumlamak zor. Telafi edici etkileri ya zamanlama gen ekspresyonu veya transfekte hücrelerinin miktarını sınırlayarak kontrol altına alınabilir. Postnatal olmayan ventriküler mikroenjeksiyon ve in vivo elektroporasyon yöntemi, yeni doğan kemirgen beyin ilgi küçük bir bölgeye doğrudan genler, siRNA veya boya molekülleri hedeflenen teslim sağlar . Geleneksel ventrikül enjeksiyon tekniği aksine, bu yöntem, göçmen olmayan hücre tiplerinin transfeksiyon sağlar. Burada açıklanan yöntem vasıtasıyla transfekte Animals in vivo görüntüleme veya akut beyin dilimleri elektrofizyolojik deneylerde, örneğin, iki foton kullanılabilir.

Bu protokol, belli bir alanda yaşayan kemirgen beyin için genetik yapıları teslim olmayan bir viral yöntem açıklanır. Yöntemi plazmid hazırlanması, mikropipet imalat, yenidoğan sıçan yavru cerrahi, yapı mikroenjeksiyon, ve oluşur<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroporasyon.

Non-ventriküler Plazmid Enjeksiyon ve Elektroporasyon Postnatal Rat Beyin Gen Teslimat

Transgenik hayvanların oluşturulması, ilgilenilen bir genin in vivo fonksiyonlarının incelenmesinde standart bir yaklaşımdır. Bununla birlikte, birçok nakavt veya transgenik hayvan...

Merhaba, ben RI Ov. Ben de Alexia Ying. Cent Üniversitesi'nde lisansüstü öğrencileriyiz. Bu videoda, beynin öncü dokusunun belirli bir alanına hedef gen iletimi için in vivo elektroporasyon yöntemini sunacağız.Bakalım. İn vivo elektroporasyon yöntemi, ilgi duyulan genlerin veya küçük müdahale edici RNA'ların canlı beyin dokusuna iletilmesi için hızlı ve etkili bir yol sunmaktadır.Transgenik hayvanların oluşturulmasına ve viral gen iletim yaklaşımına düşük maliyetli bir alternatif sunar. Bu videoda, neonatal rad korteksine postnatal gen iletiminin ayrıntılı bir prosedürünü göstereceğiz. Geliştirilmiş yeşil floresan proteini ve CMV enhancer'lı tavuk beta aktin promotörünü kodlayan plazmidi kullanacağız.Steriliteyi korumak ve hayvanın bakteriyel veya fungal kontaminasyon riskini minimize etmek için tüm cerrahi manipülasyonları laminar akış kabininde gerçekleştiriyoruz. Kortekse plazmid iletimi için, elektronik kontrollü bir WPI mikro enjektörü ve stereotaktik bir manipülatöre bağlı 10 µL'lik bir Hamilton şırıngası kullanıyoruz. Kırmızı yavru, bir kutu ve maskeden oluşan bir anestezi ünitesi kullanılarak anestezi altına alınıyor.Ardından yavru, stereotaktik manipülatöre bağlı ısıtma tablası üzerindeki kulak barları kullanılarak sabitlenir. Cerrahi manipülasyon ve mikroenjeksiyonun izlenmesi için binoküler mikroskop kullanıyoruz. Elektroporasyon için ise pens şeklindeki elektrotlarla birlikte CYV 21 in vivo elektro operatörü kullanıyoruz.Yavruların iyileşme süreci için. Anestezi sonrası, ısıtmalı bir hazne kullanılır. Genellikle 200 µL'lik ince duvarlı bir tüp içerisinde 10 µL plazmid enjeksiyon çözeltisi hazırlarız. Bu çözelti, birkaç deney için yeterlidir.Sekiz mikrolitre plazmit çözeltisini bir mikrolitre 10 XPBS ve bir mikrolitre %0,1'lik fast green su çözeltisi ile karıştırırız. Enjeksiyon çözeltisindeki plazmitin nihai konsantrasyonu mikrolitre başına bir ile üç mikrogram arasında olmalıdır. Daha düşük plazmit DNA konsantrasyonlarının kullanımı transfeksiyon verimliliğini azaltacak, daha yüksek DNA konsantrasyonu ise cam kılcal borunun ince ucundan enjeksiyon yapmak için çok viskoz olacaktır.Cam pipet hazırlama işlemi için, bir filamentle birlikte borosilikat cam kapiler ve maksimum çekme ve ısıtma parametreleri ayarlanmış dikey elektrot cam çekici kullanıyoruz. Ardından, 10 ila 20 mikrometre çapında bir uç elde etmek için pipetin ucunu bir parça kâğıt kullanarak kırıyoruz. Ucun çapını ve şeklini mikroskop objektifi altında kontrol ediyoruz.İnce bir polimer kapiler kullanarak, 10 µL'lik bir Hamilton şırıngasının hacminin yaklaşık üçte birini dolduruyoruz. Hava kabarcıklarını önlemek için mineral yağı kullanıyoruz. Ardından cam pipeti mineral yağı ile dolduruyoruz ve pipeti Hamilton şırıngasının içine yerleştiriyoruz.Yine, hava kabarcıklarından kaçınılmalıdır. Cam pipetli şırınga daha sonra bir kontrolöre bağlı bir mikroenjektöre sabitlenir. Stereotaktik bir cihaza sabitlenmiş mikroenjeksiyon düzeneği, cam pipetin ucunu plazmid enjeksiyon çözeltisi içeren tüpün içine güvenli bir şekilde daldırmamıza olanak tanır.Uç çözeltinin yüzeyine değdiğinde, onu bir ila iki milimetre daha derinliğe daldırırız. Ardından, pipeti yaklaşık bir mikrolitre enjeksiyon karışımıyla doldurmak için mikro enjektör kontrol cihazını kullanırız. Burada sunulan tüm deneyler, Helsinki Üniversitesi'nin hayvan deneyleri yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.Her bir deney için, gaz sızdırmaz bir şırıngayı izofluran ile doldururuz. Şırıngayı, hava akış kaynağına bağlı anestezi ünitesine sabitleriz; hayvan yürür ve maske stereotaktik düzeneğe sabitlenir. Anestezi ünitesinde, hava akışını yaklaşık 250 mililitre/dakika ve izofluran seviyesini %4 olarak ayarlarız. Kırmızı kapağı iki ila beş dakika boyunca hayvan kutusuna yerleştiririz.P hareket etmeyi bıraktığında, onu stereotaktik düzeneğe bağlı ısıtıcı pedin üzerine yerleştiriyoruz. P'nin başının rostral kısmını maskenin içine konumlandırıyoruz. Yavrunun derin anesteziye girmesi genellikle beş ila 10 dakika sürer.Bu durum sağlandığında, akıştaki izofluran oranını yaklaşık %1,5 ile %2'ye düşürürüz. Yavrunun başındaki deriyi, küçük pamuklar ve ince pensler kullanarak %70 etanol ile temizleriz. Deriyi yavrunun ensesinden alnına kadar keseriz, deri parçalarını yanlara doğru katlarız ve baş ile deri fiksasyonu için kulak barlarını kafatasının oral açıklıklarına hafifçe çekeriz. Binoküler mikroskop kullanarak, stereotaktik koordinatları yardımıyla kafatasındaki hedef bölgeyi belirleriz; ardından enjeksiyon pipetini bu bölgenin üzerine konumlandırırız ve kafatası yüzeyine 25 ila 50 nanolitre enjeksiyon solüsyonu damlatarak bölgeyi işaretleriz.Mikroskop altında, yüksek hızlı cerrahi bir matkap kullanarak, delinen bölgede sıvı görünene kadar işaretli noktadan kafatasını nazikçe ve dikkatlice deliyoruz. Elektroporasyon penslerini ve elektrotları kafatasının yanlarına sabitliyoruz. Daha iyi iletkenlik sağlamak için iletken bir jel uyguluyoruz.Küçük bir tampon kullanarak delinmiş bölgedeki sıvı damlasını temizliyoruz ve cam iğneyi deliğe daldırıyoruz. Enjeksiyon bölgesinin koordinatlarına göre, enjeksiyon solüsyonundan 25 ila 100 nanolitre miktarını, saniyede 5 ila 20 nanolitre hızla infüze ettik. Ardından pipeti hızla çıkarıyoruz ve vakit kaybetmeden elektroporasyona geçiyoruz.Elektroporasyon, 99 volt darbe genliğinde ve bir hertz frekansında, 50 milisaniye süreli beş darbe uygulanarak gerçekleştirilir. Elektrotları ve kulak barlarını çıkarırız. Kesilen cildi, küt ve sivri penslerin yanı sıra cerrahi dikiş iplikleri kullanarak diktik.Anestezi sonrası iyileşmesini desteklemek amacıyla yavruyu 15 ila 30 dakika boyunca sıcak bir hazneye yerleştirdik. Ardından yavruyu tekrar annesinin kafesine koyduk. Başarıyla transfekte edilen hücrelerde transgen ekspresyonu, elektroporasyondan yaklaşık 10 saat sonra ortaya çıkacak ve birkaç hafta boyunca stabil kalacaktır.Her şey bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz. Hoşça kalın.

gene-delivery-to-postnatal-rat-brain-non-ventricular-plasmid

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

E16 Rat Embriyolar Utero İntraventriküler Enjeksiyon ve Elektroporasyon

Utero elektroporasyon nöronal progenitör hücrelerinin in vivo transfecting için değerli bir yöntemdir. Elektrotlar ve elektroporasyon gelişimsel timepoint yerleştirme bağlı kortikal hücrelerin bazı altkümelerini hedeflenebilir. Hedeflenen hücreler daha sonra in vivo veya in vitro genetik değişiminin etkileri analiz edilebilir.

In utero Elektroporasyon Kortikal nöronlar Altküme Gen Fonksiyonu Öğrenmenin İlköğretim Nöronal Kültür takip

Utero elektroporasyon gelişmekte olan merkezi sinir sistemi (MSS) bir mekansal ve zamansal olarak kontrollü bir şekilde hızlı bir gen teslimat için izin verir. Burada son derece uyarlanabilir tarif telencephalon diensefalon ve retina da dahil olmak üzere birden fazla embriyonik MSS etki alanı ifade yapıları sunmak için kullanılabilir utero elektroporasyon protokol.

Verimli kullanarak birden çok CNS Topraklar&#39;da Gen Teslimat In Utero Elektroporasyon

Kaynak: Denaxa, M., el al., Kemogenetik Olarak Tasarlanmış Kortikal İnternöron Progenitörlerinin Erken Doğum Sonrası Fare Beyinlerine Nakli. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, ilgilenilen geni taşıyan bir plazmit vektörünün embriyonik bir beyin dilimindeki internöron progenitörlerine enjekte edilmesi ve ardından plazmit girişi ve gen ekspresyonu için elektroporasyon prosedürünü göstermektedir. Bu modifiye edilmiş progenitörler daha sonra beyin bozukluklarını tedavi etmek için kullanılabilir.

Fare Kortikal İnternöron Progenitörlerinde Agaroz Gömülü Elektroporasyon Destekli Gen Transferi

Genler yetişkin hayvanlarda davranış veya nöropatoloji sonraki çalışmalar için nöronal bağlantı hızlı ve hedeflenen değişiklikleri mümkün kılmak için, E16 de utero elektroporasyon (IUE) in ile korteks veya sıçanın hipokampusun gelişimi sırasında manipüle edilebilir. IUE başarı kontrolü için in vivo görüntüleme doğum sonrası ko-transfekte edilmiş lusiferaz aktive biyolüminesans ile gerçekleştirilir.

Topikal Transgenik Rats nesil tarafından<em&gt; Utero</em&gt; Elektroporasyon ve<em&gt; In vivo</em&gt; Biyoparlaklık Eleme

Biz yenidoğan subventricular dilimi elektroporasyon olarak adlandırılan minimal invaziv tekniği göstermek. Tekniği yenidoğan yavruların lateral ventriküllerin içine plazmid DNA enjekte ve sunmak için elektrik akımı uygulayarak oluşur ve genetik nöral kök hücreleri...

Yenidoğan subventricular Bölge Elektroporasyon

Pial yüzey artan bir ilgi alıyor MSS benzersiz bir ata bölgesi. Burada, detay değiştirilmiş elektroporasyon yöntemi kullanarak bu progenitör bölgenin hızlı genetik manipülasyon için bir yöntemi biz. Bu prosedür, hücre soyları ve hücre farklılaşması dahil sinyal yollarının hücresel ve moleküler araştırmalar için kullanılabilir ve kız hücrelerin kaderini ve özellikleri ortaya çıkarmak için.

Yenidoğan Pial Yüzey Elektroporasyon

Burada, adeno-ilişkili virüsün yenidoğan fare beynine intraventriküler enjeksiyonu ile yaygın nöronal transdüksiyon için bir teknik gösteriyoruz.  Bu yöntem, viral olarak verilen transgenlerin yaşam boyu ekspresyonunu elde etmek için hızlı ve kolay bir yol sağlar.

Kalıcı ve yaygın Nöronal İletim için Yenidoğan Fare Beyin intraserooroventriküler Viral Enjeksiyon

Biz'DNA plazmid dır fare mesane vivo içinde İdrar Kateterizasyon ve elektroporasyon ürotelyal hücre içine bir roman yöntemi açıklanmaktadır. Kesesi hastalıkları otokton fare modelleri oluşturmak için hızlı ve kolay bir yol sunar.

Plazmid DNA teslimat için fare mesane Urothelium elektroporasyon tarafından roman yöntemi

Burada plazmid DNA dağıtımı ve yetişkin zebrabalığı telencephalon ependymoglial hücre etiketleme için bir elektroporasyon yöntemi dir. Bu protokol, tek tek ependymoglial hücreleri görselleştirmek ve izlemek için hızlı ve etkili bir yöntemdir ve çok çeşitli genetik manipülasyonlara elektroporasyon uygulamak için yeni olanaklar sunar.

Yetişkin Zebrafish Telencephalon Plazmid DNA In Vivo Teslim için Elektroporasyon Yöntemi

Mevcut protokol, gen düzenleme ve ilaç dağıtımı için yenidoğan farelerde intratekal enjeksiyonların gerçekleştirilmesi için adım adım talimatları özetlemektedir.

Genom Düzenleme ve İlaç Dağıtımı için Yenidoğan Farenin İntratekal Enjeksiyonu

Öğrenin, postnatal sıçan beynine plazmid enjeksiyonu ve elektroporasyon ile hedefli gen teslimatı yapmayı. Bu yöntem, nörobilim araştırmalarında hızlı ve etkili gen aktarımı sağlar.

Non-ventriküler Plazmid Enjeksiyon ve Elektroporasyon Postnatal Rat Beyin Gen Teslimat

Daha fazla video keşfet