Non-ventriküler Plazmid Enjeksiyon ve Elektroporasyon Postnatal Rat Beyin Gen Teslimat

Merhaba, ben RI Ov. Ben de Alexia Ying. Cent Üniversitesi'nde lisansüstü öğrencileriyiz. Bu videoda, beynin öncü dokusunun belirli bir alanına hedef gen iletimi için in vivo elektroporasyon yöntemini sunacağız.

Bakalım. İn vivo elektroporasyon yöntemi, ilgi duyulan genlerin veya küçük müdahale edici RNA'ların canlı beyin dokusuna iletilmesi için hızlı ve etkili bir yol sunmaktadır.

Transgenik hayvanların oluşturulmasına ve viral gen iletim yaklaşımına düşük maliyetli bir alternatif sunar. Bu videoda, neonatal rad korteksine postnatal gen iletiminin ayrıntılı bir prosedürünü göstereceğiz. Geliştirilmiş yeşil floresan proteini ve CMV enhancer'lı tavuk beta aktin promotörünü kodlayan plazmidi kullanacağız.

Steriliteyi korumak ve hayvanın bakteriyel veya fungal kontaminasyon riskini minimize etmek için tüm cerrahi manipülasyonları laminar akış kabininde gerçekleştiriyoruz. Kortekse plazmid iletimi için, elektronik kontrollü bir WPI mikro enjektörü ve stereotaktik bir manipülatöre bağlı 10 µL'lik bir Hamilton şırıngası kullanıyoruz. Kırmızı yavru, bir kutu ve maskeden oluşan bir anestezi ünitesi kullanılarak anestezi altına alınıyor.

Ardından yavru, stereotaktik manipülatöre bağlı ısıtma tablası üzerindeki kulak barları kullanılarak sabitlenir. Cerrahi manipülasyon ve mikroenjeksiyonun izlenmesi için binoküler mikroskop kullanıyoruz. Elektroporasyon için ise pens şeklindeki elektrotlarla birlikte CYV 21 in vivo elektro operatörü kullanıyoruz.

Yavruların iyileşme süreci için. Anestezi sonrası, ısıtmalı bir hazne kullanılır. Genellikle 200 µL'lik ince duvarlı bir tüp içerisinde 10 µL plazmid enjeksiyon çözeltisi hazırlarız. Bu çözelti, birkaç deney için yeterlidir.

Sekiz mikrolitre plazmit çözeltisini bir mikrolitre 10 XPBS ve bir mikrolitre %0,1'lik fast green su çözeltisi ile karıştırırız. Enjeksiyon çözeltisindeki plazmitin nihai konsantrasyonu mikrolitre başına bir ile üç mikrogram arasında olmalıdır. Daha düşük plazmit DNA konsantrasyonlarının kullanımı transfeksiyon verimliliğini azaltacak, daha yüksek DNA konsantrasyonu ise cam kılcal borunun ince ucundan enjeksiyon yapmak için çok viskoz olacaktır.

Cam pipet hazırlama işlemi için, bir filamentle birlikte borosilikat cam kapiler ve maksimum çekme ve ısıtma parametreleri ayarlanmış dikey elektrot cam çekici kullanıyoruz. Ardından, 10 ila 20 mikrometre çapında bir uç elde etmek için pipetin ucunu bir parça kâğıt kullanarak kırıyoruz. Ucun çapını ve şeklini mikroskop objektifi altında kontrol ediyoruz.

İnce bir polimer kapiler kullanarak, 10 µL'lik bir Hamilton şırıngasının hacminin yaklaşık üçte birini dolduruyoruz. Hava kabarcıklarını önlemek için mineral yağı kullanıyoruz. Ardından cam pipeti mineral yağı ile dolduruyoruz ve pipeti Hamilton şırıngasının içine yerleştiriyoruz.

Yine, hava kabarcıklarından kaçınılmalıdır. Cam pipetli şırınga daha sonra bir kontrolöre bağlı bir mikroenjektöre sabitlenir. Stereotaktik bir cihaza sabitlenmiş mikroenjeksiyon düzeneği, cam pipetin ucunu plazmid enjeksiyon çözeltisi içeren tüpün içine güvenli bir şekilde daldırmamıza olanak tanır.

Uç çözeltinin yüzeyine değdiğinde, onu bir ila iki milimetre daha derinliğe daldırırız. Ardından, pipeti yaklaşık bir mikrolitre enjeksiyon karışımıyla doldurmak için mikro enjektör kontrol cihazını kullanırız. Burada sunulan tüm deneyler, Helsinki Üniversitesi'nin hayvan deneyleri yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

Her bir deney için, gaz sızdırmaz bir şırıngayı izofluran ile doldururuz. Şırıngayı, hava akış kaynağına bağlı anestezi ünitesine sabitleriz; hayvan yürür ve maske stereotaktik düzeneğe sabitlenir. Anestezi ünitesinde, hava akışını yaklaşık 250 mililitre/dakika ve izofluran seviyesini %4 olarak ayarlarız. Kırmızı kapağı iki ila beş dakika boyunca hayvan kutusuna yerleştiririz.

P hareket etmeyi bıraktığında, onu stereotaktik düzeneğe bağlı ısıtıcı pedin üzerine yerleştiriyoruz. P'nin başının rostral kısmını maskenin içine konumlandırıyoruz. Yavrunun derin anesteziye girmesi genellikle beş ila 10 dakika sürer.

Bu durum sağlandığında, akıştaki izofluran oranını yaklaşık %1,5 ile %2'ye düşürürüz. Yavrunun başındaki deriyi, küçük pamuklar ve ince pensler kullanarak %70 etanol ile temizleriz. Deriyi yavrunun ensesinden alnına kadar keseriz, deri parçalarını yanlara doğru katlarız ve baş ile deri fiksasyonu için kulak barlarını kafatasının oral açıklıklarına hafifçe çekeriz. Binoküler mikroskop kullanarak, stereotaktik koordinatları yardımıyla kafatasındaki hedef bölgeyi belirleriz; ardından enjeksiyon pipetini bu bölgenin üzerine konumlandırırız ve kafatası yüzeyine 25 ila 50 nanolitre enjeksiyon solüsyonu damlatarak bölgeyi işaretleriz.

Mikroskop altında, yüksek hızlı cerrahi bir matkap kullanarak, delinen bölgede sıvı görünene kadar işaretli noktadan kafatasını nazikçe ve dikkatlice deliyoruz. Elektroporasyon penslerini ve elektrotları kafatasının yanlarına sabitliyoruz. Daha iyi iletkenlik sağlamak için iletken bir jel uyguluyoruz.

Küçük bir tampon kullanarak delinmiş bölgedeki sıvı damlasını temizliyoruz ve cam iğneyi deliğe daldırıyoruz. Enjeksiyon bölgesinin koordinatlarına göre, enjeksiyon solüsyonundan 25 ila 100 nanolitre miktarını, saniyede 5 ila 20 nanolitre hızla infüze ettik. Ardından pipeti hızla çıkarıyoruz ve vakit kaybetmeden elektroporasyona geçiyoruz.

Elektroporasyon, 99 volt darbe genliğinde ve bir hertz frekansında, 50 milisaniye süreli beş darbe uygulanarak gerçekleştirilir. Elektrotları ve kulak barlarını çıkarırız. Kesilen cildi, küt ve sivri penslerin yanı sıra cerrahi dikiş iplikleri kullanarak diktik.

Anestezi sonrası iyileşmesini desteklemek amacıyla yavruyu 15 ila 30 dakika boyunca sıcak bir hazneye yerleştirdik. Ardından yavruyu tekrar annesinin kafesine koyduk. Başarıyla transfekte edilen hücrelerde transgen ekspresyonu, elektroporasyondan yaklaşık 10 saat sonra ortaya çıkacak ve birkaç hafta boyunca stabil kalacaktır.

Her şey bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz. Hoşça kalın.