Işıksal Çözülmüş İki foton Mikroskop kullanarak G Protein Coupled Reseptör Etkileşmeleri in vivo Niceleme

Aşağıdaki deneyin genel amacı, protein hakkında stoia metrik ve yapısal bilgilerini belirlemektir. Canlı biyolojik hücreleri ifade eden tüm bağ kompleksleri, maya hücreleri, bir donör veya bir alıcı floresan probuna bağlı ilgili proteinleri ifade etmek için genetik olarak tasarlanmıştır. Donör probları doğrudan bir lazerle uyarılabilir.

Alıcılar yalnızca yakındaki uyarılmış bir donörden gelen bir enerji transferi yoluyla uyarılabilirken, hücreler darbeli bir yakın kızılötesi lazerden gelen ışığa maruz bırakılır. Problardan döllenen floresan, bir iletim ızgarası ile spektral bileşenlerine ayrılır ve elektron çoğaltan bir CCD dizisinin yüzeyine yansıtılır. Bu nedenle, numunedeki her pozisyon için bireysel, tüm bağlardan tam floresan spektrumları elde edilir.

Tespit edilen floresanın spektral profili, ilgilenilen proteinlerin spesifik etkileşimine bağlıdır. Veriler, bir tarama hücresinin her bir görüntü pikseli için, verici ve alıcı problardan gelen ayrı emisyonları belirlemek için analiz edilir. Enerji transferinin verimliliği her görüntü pikselinde belirlenir ve ardından pikseller perde verimliliklerine ve histogramlarına göre bükülür.

Histogram yorumu, proteinin, kompleks boyutun ve konfigürasyonun in vivo olarak belirlenmesine izin verir. Merhaba, benim adım Wisconsin Milwaukee Üniversitesi'ndeki Riku Araştırma Grubu'ndan Michael Stoneman. Benim adım Singh.

Wisconsin, Milwaukee'deki Rikus Lab'denim. Bu tekniğin ana avantajı, bir hücre içindeki yüzlerce tüm bağ kompleksinden elde edilen tam emisyon profillerinin, hücrenin tam bir taraması ile elde edilmesidir. Tipik olarak, çoğu floresan mikroskobu yöntemi, hücre içindeki çeşitli ilgi bölgelerindeki fret verimliliğini belirlemek için yeterli spektral bilgi toplamak için ilgilenilen hücrenin birden çok kez taranmasını gerektirir.

Bununla birlikte, difüzyon biyokimyasal reaksiyonları, bu ilgi alanlarının moleküler yapısını değiştirebilir ve böylece görüntünün taranmasında elde edilen bilgileri sınırlayabilir. Bu yöntem, protein çalışmalarında, canlı hücrelerde protein etkileşimi, oligomerlerin zararının boyutu nedir gibi temel soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir. Oligomerler protein yaşam döngüsünün hangi aşamasında çiftçilik yapar ve bu proteinin oligomerinin hücresel fonksiyondaki rolü nedir?

Spektral olarak çözülmüş iki fotomikroskop, uyarma demetinin odağını bir dizi yerde ilgilenilen numune boyunca tarayarak görüntü hücresindeki olima kompleksleri hakkında spektral bilgi biriktirir. Lazer ışınının odağını numune boyunca iki farklı yönde çevirmek için bir çift ortogonal tarama aynası kullanılır. Tarama aynalarının hareketi bilgisayar kontrollüdür ve CCD kameradan floresan yoğunluğu verilerinin çizgi taramalarından çıkarılması ile senkronize edilir, floresan yoğunluğu belirli bir dalga boyuna karşılık gelen floresan yoğunluğu haritaları yeniden oluşturulabilir.

X-ışını floresan yoğunluğu uzamsal haritalarını doğru bir şekilde yeniden oluşturmak ve bu haritaların her birine karşılık gelen gerçek dalga boyunu hesaplamak için, çizgi tarama protokolü floresein çözeltisi kullanılarak kalibre edilmelidir. Kalibrasyon prosedürüne başlamak için, uyarma spektrumuna göndermek için donör etiketi GFP'nin maksimum uyarma dalga boyunun iki katı olan 800 nanometrelik bir dalga boyunda uyarma spektrumuna gönderin, kameranın arayüzlü olduğu bilgisayar programını kullanarak grup hız dağılımını değiştirmek için lazer boşluğu içinde bulunan prizmayı çevirin. CCD çipinin sıcaklığını ulaşılabilir en düşük sıcaklığa düşürmek için CCD çipine bir komut gönderin.

Karanlık gürültüyü azaltmak için. 10 mikrolitre floresein solüsyonunu, kapak kaymalı bir mikroskop lamı kapağına pipetleyin, böylece numunenin ince bir tabakası kapak lamı ile mikroskop lamı arasındaki bölgede eşit şekilde dağılır, küçük bir damla daldırma yağı yerleştirin kapak kaymasının yüzeyine. Şimdi mikroskobu sabitleyin, XY, Z çeviri aşamasına kaydırın ve slaytı ve aşamayı optik eksen yönünde çevirin Doğrusal aktüatörü manuel olarak ayarlayarak, mikroskop objektifi daldırma yağı damlası ile temas edene kadar slaytı çevirin, kamerayı bir video veri toplama moduna geçirin, böylece CCD dizisine çarpan kabul edilen ışık bilgisayar ekranında gerçek zamanlı olarak görüntülenir.

CCD dizisinde algılanan arka plan gürültüsünü azaltmak için ortamdaki tüm oda ışıklarını kapatın. Numuneyi lazer ışınının odak noktasına getirmek için translasyon aşamasını optik eksen yönünde kontrol eden mikrometreyi yavaşça ayarlayın. Floresein numunesi odakta olduğunda, emisyon CCD dizisinde keskin bir çizgi olarak görünecektir.

Piksel yoğunluklarının okunmasını CCD dizisinden bilgisayara indirin. Görüntü J'de indirilen yoğunluk değerleri matrisini açarak ve floresan bölge boyunca bir çizgi çizerek CCD dizisi üzerindeki konumun bir fonksiyonu olarak piksel yoğunluğunu ölçün. image day komutunu kullanın.

Floresein numunesinin emisyon spektrumunu gösteren bir çizim oluşturmak için çizim profilini analiz edin. Lazerin hareketini kontrol eden aynanın artımlı parametresini ayarlayın. Y yönünde odaklanın, böylece örnek içindeki bitişik y konumları, floresan spektrumlarının tepe noktasının CCD dizisi üzerindeki spektral boyut boyunca tam olarak bir piksel hareketine neden olur.

Bunu izlemek için, numunedeki iki farklı Y konumu için floresein spektrum yoğunluğunu indirin. Ardından J görüntüsü ile yoğunluk görüntülerini açın ve floresan spektrumlarının her biri için en yüksek piksel konumunu bulun. Görüntü J imlecini kullanarak, CCD'nin deklanşörünü açık bırakarak, lazer odağını örnek boyunca X yönünde tarayın.

Tarama hattı boyunca her bir vokselden yayılan ışık, her satır taramasının sonunda CCD dizisine düşmeli, bu satır taraması için elde edilen CCD dizisinden verileri depolamalı ve ardından CCD dizisinin piksellerini temizlemelidir. Lazerin konumunu hareket ettirin. Daha önce belirlenen miktara göre Y yönünde odaklanın.

Ardından lazer ışınını numune boyunca X yönünde tarayın. Bir kez daha, CCD'nin deklanşörünü açık bırakarak verileri saklayın. Tek bir biyolojik hücrenin boyutlarından yaklaşık %50 daha büyük bir fiziksel alan lazer ışığı ile aydınlatılana kadar bu çizgi tarama prosedürünü tekrarlayın.

Belirli bir çizgi tarama görüntüsünün satır numarası ile dalga boyu arasındaki ilişki, farklı dalga boylarında birden fazla eski eş floresan yoğunlukta yüz haritası elde etmek için görüntüleri yeniden oluşturmak için kullanılmalıdır. Belirli bir dalga boyu için eski eş floresan gönderme görüntüsünü elde etmek için, bu dalga boyuna karşılık gelen ilk satır taramasından elde edilen görüntüdeki satır numarasını bulun. Ardından, sonraki satır tarama görüntüsünün bitişik satırı, floresan emisyon görüntüsünün bir sonraki satırına karşılık gelir.

Söz konusu dalga boyu için, o dalga boyundaki numunenin XY floresan yoğunluğu uzamsal haritalarını elde etmek için bu dalga boyuna karşılık gelen tüm görüntü satırlarını yığınlayın. Numuneleriniz hakkında veri toplamak için elde edilebilecek diğer tüm dalga boyları için bu prosedürü tekrarlayın. İlk olarak, inkübatörden dönüştürülmüş maya kolonileri olan plakaları çıkarın.

En az üç tip dönüştürülmüş hücre olmalıdır. İlgilenilen proteinleri ifade eden hücreler, her iki tip floresan prob ile etiketlenmiştir. Yalnızca donör floresan probları ile etiketlenmiş proteinleri ifade eden hücreler ve yalnızca alıcı floresan probları ile etiketlenmiş proteinleri ifade eden hücreler.

Bir mikro santrifüj tüpüne 100 mikrolitre 100 milimolar potasyum klorür ekleyin. Daha sonra bir mikro pipet ucu kullanarak, hem donör hem de bir floresan prob dışında etiketlenmiş proteinleri ifade eden hücre plakasından üç ila beş maya kolonisini kazıyın ve 100 milimolar potasyum klorürü aşılayın. Bu hücrelerle, hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresini çıkarın ve yeni bir mikroskopta dağıtın. Kaydırak.

Damlacığı bir kapak fişi ile örtün ve kapak fişinin yüzeyine bir damla yağ damlatın. Ardından, lazer ışığının mikroskop objektifine ulaşmasını engellemek için lazer ışını yolundaki deklanşörü manuel olarak kapatın. Mikroskop slaytını XY, Z translasyon aşamasına sabitleyin ve mikroskop objektifi daldırma yağı damlası ile temas edene kadar slayt aşamasını optik eksen yönünde çevirin.

Şimdi geniş alan ışığı aydınlatmasını açın ve kameraya gidin. Veri toplamanın video modu. Numunenin geniş alan görüntüsü, emisyon yolundaki iletim ızgarasının varlığı nedeniyle ciddi şekilde bulanık olacaktır.

Bu nedenle, şanzıman ızgarasından önceki optik yola tam genişlikte yarı maksimumda bir bant geçiren filtre yerleştirin. Hücreler odak haline gelene kadar kamera ekranında hücrelerin görüntüsünü görüntülerken çeviri aşamasını optik eksen yönünde yavaşça çevirin. Tek bir hücreyi lazer ışını odağının konumuna getirmek için sahneyi X veya Y yönünde çevirin.

Geniş alan aydınlatma kaynağını kapatın ve bant yolu filtresini emisyon yolundan çıkarın. CCD dizisinde alınan sinyali aynı anda görüntülerken lazer ışınının engelini kısa bir süre için kaldırın. Lazer ışınının hücreye çarptığı süre boyunca CCD dizisinde bir floresan sinyali algılanırsa, bu hücrenin tam bir floresan veri toplama taramasını gerçekleştirin.

Aynı tarama parametrelerini, özellikle satır sayısını ve daha önce gösterilen kalibrasyon prosedüründe belirlendiği gibi neden artışı kullanmak çok önemlidir. Hem donör etiketlerine hem de alıcı etiketlere bağlı proteini ifade eden çok sayıda hücre için hücre konumu ve floresan veri toplama işlemini tekrarlayın. Her iki reseptörle etiketlenmiş proteinleri eksprese eden hücrelerin yeterli floresan görüntülerini biriktirdikten sonra, her iki hücre için de tüm işlemi tekrarlayın, sadece donör floresan probları ile etiketlenmiş proteinleri ifade eden proteinleri ve sadece alıcı floresan probları ile etiketlenmiş proteinleri eksprese eden hücreleri ifade edin.

Son olarak, spektral olarak çözülmüş elde etmek için tüm taramaları yeniden oluşturun. Bu üç şekilde daha önce gösterilen prosedürü kullanan her bir veri seti için XY floresan yoğunluk uzamsal haritaları, steril ila alfa faktör reseptörünü ifade eden bir maya hücresi üzerinde gerçekleştirilen spektral olarak çözülmüş iki foton mikroskobu ölçümünden hesaplanan sonuç uzamsal haritalardır. Hücrenin her bir konumundan elde edilen spektral emisyon profillerinin analizinden verici ve alıcı sinyallerin iki boyutlu haritaları elde edildi.

Floresan yoğunlukları, değerlerine göre sahte renkler atanır ve ölçek bir iç kısım olarak gösterilir. Daha sonra, görünür perde verimliliklerinin iki boyutlu bir haritası, az önce gösterilen hücrenin görünür perde verimlilikleri haritasından çıkarılan değerler kullanılarak KDA ve KAD görüntüleri kullanılarak hesaplandı, bir histogram grafiği hazırlandı. Hücrenin ölçülen EAPP değerleri dairelerle temsil edilir.

Kırmızı düz çizgi, düz yeşil çizgilerle temsil edilen bireysel kalsiyum fonksiyonlarının toplamını kullanarak ölçülen verilere en uygun olanı temsil eder. Protokol metninde açıklanan histogramın analizi, steril iki alfa faktör reseptörü tüm ligament kompleksinin in vivo olarak RBA şeklinde bir tetramer şeklini aldığını doğrulamaktadır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 12 saat içinde gerçekleştirilebilir.

Bu deneyi yaparken uyarma kaynağının gücünü düşük tutmak önemlidir. Donörün tek bir nabızla birden fazla uyarılmasını önlemek önemlidir.