Name: Işıksal Çözülmüş İki foton Mikroskop kullanarak G Protein Coupled Reseptör Etkileşmeleri in vivo Niceleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-19T17:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 26 s
Description: Öğrenin, iki foton mikroskopi ve FRET analizi kullanarak canlı hücrelerde G protein çift reseptör etkileşimlerini ve oligomerik komplekslerin stoikyometrisini nasıl nicelersiniz. Bu yöntem, reseptör kompleks oluşumunu in vivo çalışmak için güçlü bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, UW-Milwaukee Araştırma Büyüme Girişimi Wisconsin Enstitüsü, Biyomedikal ve Sağlık Teknolojileri ve Bulut Vakfı tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Raicu, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRaicu%2C+V+%22Nanoscopy+and+Multidimensional+Optical+Fluorescence+Microscopy%22">Nanoscopy and Multidimensional Optical Fluorescence Microscopy</a>. Diaspro, A. , CRC Press. Boca Raton. (2010).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+Fluorescence+Spectroscopy%22">Principles of Fluorescence Spectroscopy</a>. , Springer. New York. (2006).</li>
<li>Raicu, V., Popescu, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRaicu%2C+V+%22Integrated+Molecular+and+Cellular+Biophysics%22">Integrated Molecular and Cellular Biophysics</a>. , Springer. London. (2008).</li>
<li>Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+renaissance+of+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">The renaissance of fluorescence resonance energy transfer.</a> Nat Struct Biol. 7, 730-734 (2000).</li>
<li>Raicu, V., Jansma, D. B., Miller, R. J., Friesen, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+interaction+quantified+in+vivo+by+spectrally+resolved+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Protein interaction quantified in vivo by spectrally resolved fluorescence resonance energy transfer.</a> Biochem J. 385, 265-277 (2005).</li>
<li>Maurel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-surface+protein-protein+interaction+analysis+with+time-resolved+FRET+and+snap-tag+technologies%3A+application+to+GPCR+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization.</a> Nat Methods. 5, 561-567 (2008).</li>
<li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+AP-1+NF-kappaB+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105, 151-156 (2008).</li>
<li>Demarco, I. A., Periasamy, A., Booker, C. F., Day, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+dynamic+protein+interactions+with+photoquenching+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Monitoring dynamic protein interactions with photoquenching FRET.</a> Nat Methods. 3, 519-524 (2006).</li>
<li>Wallrabe, H., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein+molecules+using+FRET+and+FLIM+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy.</a> Curr Opin Biotechnol. 16, 19-27 (2005).</li>
<li>Wlodarczyk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+FRET+signals+in+the+presence+of+free+donors+and+acceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Analysis of FRET signals in the presence of free donors and acceptors.</a> Biophys J. 94, 986-1000 (2008).</li>
<li>Förster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimentelle+und+theoretische+Untersuchung+des+zwischenmolekularen+bergangs+von+Elektronenanregungsenergie.+Z.+Naturforsch%5BTitle%5D)+AND+%22A%3A+Astrophys+Phys+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">Experimentelle und theoretische Untersuchung des zwischenmolekularen bergangs von Elektronenanregungsenergie. Z. Naturforsch.</a> A: Astrophys Phys Phys Chem. 4, 321-321 (1949).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312, 217-2124 (2006).</li>
<li>Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+imaging+and+linear+un-mixing+enables+improved+FRET+efficiency+with+a+novel+GFP2-YFP+FRET+pair%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair.</a> FEBS Lett. 531, 245-249 (2002).</li>
<li>Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li>
<li>Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+cyan+fluorescent+protein+variant+useful+for+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET.</a> Nat Biotechnol. 22, 445-449 (2004).</li>
<li>Raicu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+Resonance+Energy+Transfer+in+Homo-Oloigomeric+Complexes+of+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Phys%22%5BJournal%5D)">Efficiency of Resonance Energy Transfer in Homo-Oloigomeric Complexes of Proteins.</a> J Biol Phys. 33, 109-127 (2007).</li>
<li>Raicu, V., Fung, R., Melnichuk, M., Chaturvedi, A. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences VII, 2007 Jan 1, San Jose, CA, USA , , (2007).</li>
<li>Raicu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+supramolecular+structure+and+spatial+distribution+of+protein+complexes+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Photonics%22%5BJournal%5D)">Determination of supramolecular structure and spatial distribution of protein complexes in living cells.</a> Nat Photonics. 3, 107-113 (2009).</li>
<li>Rath, S., Sullivan, A. P., Stoneman, M. R., Raicu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microspectroscopic+method+for+determination+of+size+and+distribution+of+protein+complexes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+of+SPIE%22%5BJournal%5D)">Microspectroscopic method for determination of size and distribution of protein complexes in vivo.</a> Proc of SPIE. 7378, 737829-737829 (2009).</li>
<li>Kurjan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromone+response+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Pheromone response in yeast.</a> Annu Rev Biochem. 61, 1097-1129 (1992).</li>
<li>Overton, M. C., Chinault, S. L., Blumer, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+of+G-protein-coupled+receptors%3A+lessons+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Oligomerization of G-protein-coupled receptors: lessons from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Eukaryot Cell. 4, 1963-1970 (2005).</li>
</ol>

Bu sunumda, in vivo bir protein oligomer kompleksi hakkında boyutu ve yapısal bilgiler nasıl belirleneceği gösterilmiştir. Sunulan veriler, maya hücreleri ifade belirli bir membran reseptör (yani Ste2p) elde iken, yöntem herhangi bir hücre tipi, tek şart olarak ifade herhangi bir protein türüne uygulanabilir ki her şeyi kuşatan proteinler Uygun floresan işaretleri ile etiketlenir. Bu protokol gelecek değişiklikler zamana bağımlı protein oligomer boyutu ve yapısı değişiklikleri izlemek için bir girişimde daha yü...

<table><tbody><tr><td>Pepton</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1420</td><td></td></tr><tr><td>Maya Ekstraktı</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422</td><td></td></tr><tr><td>Polietilen Glikol 4000</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-605</td><td></td></tr><tr><td>Azotsuz Maya Azot Bazı (NH4)&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; ve amino asitler</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0335-15-9</td><td></td></tr><tr><td>Maya Sentetik Eksik Besiyeri Takviyeleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2001</td><td></td></tr><tr><td>D-Glikoz</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>S70210</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum Sülfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>A702-500</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Klorür</td><td>Acros Organics</td><td>424090010</td><td></td></tr><tr><td>Lösin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP385</td><td></td></tr><tr><td>Histidin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP382</td><td></td></tr><tr><td>Plan Akromat Sonsuz Düzeltmeli 100x Yağlı İmmerziyon Objektif NA=1,43</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektral olarak çözümlenmiş iki foton mikroskobu</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

işıksal Çözülmüş İki foton mikroskop kullanarak g protein coupled reseptör etkileşmeleri in vivo niceleme

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

Canlı hücreler protein etkileşimleri çalışma, bilgi hem faydaları yanı sıra endüstriyel uygulamalar temel temel biyolojik bilgi artar birikmiş çünkü önemli bir araştırma alanıdır. Elektronik heyecanlı bir devlet bir bağış molekülü ve yakındaki bir alıcısı molekül arasında Förster (Floresan) Rezonans Enerji Transferi (FRET) canlı hücreler protein-protein etkileşimleri çalışmaları için sık sık kullanılmıştır. Ilgi proteinler, floresan probları iki farklı tipleri ile etiketlenen ve biyolojik hücreleri ifade edilir. Sonra floresan probları genellikle lazer ışığı kullanarak, heyecanlı, ve floresan probları yayılan floresan emisyon spektral özellikleri toplanmakta ve analiz edilmektedir. Protein etkileşimleri derecesi ile ilgili bilgiler, spektral emisyon verileri yerleştirilmiştir. Tipik olarak, hücre, hücre içindeki ilgi her bölge için protein etkileşimleri ölçüde doğru ölçmek için yeterli spektral bilgi biriktirmek için birkaç kez tarandıktan olmalıdır. Ancak, bu bölgelerde moleküler bileşimi tüm hücreleri üzerinde bir ortalama belirgin FRET verimlilikleri nicel değerler mekansal belirlenmesi sınırlayarak, satın alma sürecinin seyri sırasında değişebilir. Işıksal çözülmesi iki foton mikroskop sayesinde biz faiz örnek sadece bir uyarma tarama sonra Işıksal çözüme tam bir set görüntüleri elde edebiliyoruz. Bu piksel düzeyinde spektral veri, bir harita FRET hücre boyunca verimliliği hesaplanır. Deneysel olarak elde edilen dağıtım oligomerik komplekslerinde FRET basit bir teori uygulayarak hücre boyunca verimliliği FRET, tek bir Işıksal çözülmesi tarama çalışma kapsamında oligomer kompleksi hakkında stokiyometrik ve yapısal bilgiler ortaya koymaktadır. Burada floresan probları iki farklı tipleri ile etiketlenen membran reseptörleri (steril 2 α-faktörü reseptörleri) ifade biyolojik hücreleri (maya Saccharomyces cerevisiae) hazırlama prosedürü açıklar. Ayrıca, spektral çözülmesi iki foton mikroskobu görüntüleme sistemi kullanılarak floresans veri toplama dahil kritik faktörler göstermektedir. Bu protokolün, bir floresan işaretleyici ile ona bağlı yaşayan bir hücre olarak ifade edilebilir protein her türlü çalışma uzatılabilir.

Işıksal çözülmesi iki foton mikroskobu görüntüleme sistemi kullanılarak, piksel düzeyinde Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) verimlilik haritaları, homo-oligomerik komplekslerini oluşturmak için hipotez membran reseptörleri hücre elde edilir. Verimlilik haritaları FRET, çalışma kapsamında oligomer kompleksi hakkında stokiyometrik bilgi tahmin etmek mümkün.

Işıksal Çözülmüş İki foton Mikroskop kullanarak G Protein Coupled Reseptör Etkileşmeleri in vivo Niceleme

Canlı hücrelerdeki protein etkileşimlerinin incelenmesi, elde edilen bilgilerin hem endüstriyel ... fayda sağlaması nedeniyle önemli bir araştırma alanıdır.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, protein hakkında stokiyometrik ve yapısal bilgiler belirlemektir. Canlı biyolojik hücreler olan maya hücrelerini eksprese eden tüm ligand kompleksleri, ilgi duyulan proteinleri bir donör veya akseptör floresan proba bağlı olarak eksprese edecek şekilde genetik olarak mühendislenmiştir. Donör problar bir lazer tarafından doğrudan uyarılabilir.Akseptörler yalnızca yakınlardaki uyarılmış bir donörden enerji transferi yoluyla uyarılabilirken, hücreler darbeli bir yakın kızılötesi lazerden gelen ışığa maruz bırakılır. Problardan gelen floresan ışınım, bir transmisyon ızgarası ile spektral bileşenlerine ayrılarak elektron çoğaltıcı bir CCD dizisi yüzeyine yansıtılır. Böylece, numunedeki her konum için tekil tüm bağların eksiksiz floresan spektrumları elde edilir.Saptanan floresansın spektral profili, ilgilenilen proteinlerin spesifik etkileşimine bağlıdır. Veriler, bir tarama hücresinin her bir görüntü pikseli için donör ve akseptör problardan gelen ayrı emisyonları belirlemek üzere analiz edilir. Enerji transfer verimliliği her bir görüntü pikselinde belirlenir ve ardından pikseller, FRET verimliliklerine ve histograma göre renklendirilir.Histogram yorumlaması, proteinin, kompleks boyutunun ve konfigürasyonunun in vivo olarak belirlenmesine olanak tanır. Merhaba, ben University of Wisconsin Milwaukee'deki Riku Araştırma Grubu'ndan Michael Stoneman. Benim adım Singh.Wisconsin, Milwaukee'deki Rikus Laboratuvarı'ndanım. Bu tekniğin temel avantajı, bir hücre içindeki tüm ligament komplekslerinin yüzlercesinden gelen tam emisyon profillerinin, hücrenin tek bir tam taramasıyla elde edilmesidir. Genellikle çoğu floresan mikroskopi yöntemi, hücre içindeki çeşitli ilgi bölgelerinde FRET verimliliğini belirlemek için yeterli spektral bilgiyi toplamak amacıyla, incelenen hücrenin defalarca taranmasını gerektirir.Bununla birlikte, difüzyon biyokimyasal reaksiyonları, bu ilgi bölgelerinin moleküler yapısını değiştirebilir ve böylece görüntünün taranmasıyla elde edilen bilgileri kısıtlayabilir. Bu yöntem; oligomerlerin zararlı boyutu nedir? Oligomerler protein yaşam döngüsünün hangi aşamasında oluşur ve bu proteinin oligomerinin hücresel işlevdeki rolü nedir? gibi, canlı hücrelerdeki protein ve protein etkileşimlerinin incelenmesindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Spektral olarak çözünürlüklü iki foton mikroskobu, eksitasyon ışınının odağını ilgilenilen numunenin üzerinde bir dizi konumda tarayarak, görüntü hücresindeki olima kompleksleri hakkında spektral bilgiler toplar. Lazer ışınının odağını numune üzerinde iki farklı yönde kaydırmak için bir çift dik tarama aynası kullanılır. Tarama aynalarının hareketi bilgisayar kontrollüdür ve CCD kameradan floresans yoğunluk verilerinin alınmasıyla senkronize edilmiştir; böylece çizgi taramalardan, ışığın belirli bir dalga boyuna karşılık gelen floresans yoğunluğu uzamsal haritaları yeniden oluşturulabilir.X-ışını floresan yoğunluğu mekansal haritalarını doğru şekilde yeniden oluşturmak ve bu haritaların her birine karşılık gelen gerçek dalga boyunu hesaplamak için, çizgi tarama protokolü floresein çözeltisi kullanılarak kalibre edilmelidir. Kalibrasyon prosedürüne başlamak için, donör etiket GFP 22'nin maksimum eksitasyon dalga boyunun iki katı olan 800 nanometre dalga boyunda eksitasyon spektrumunu gönderin. Eksitasyon spektrumunu göndermek için, kameranın bağlı olduğu bilgisayar programını kullanarak lazer boşluğu içindeki prizmayı kaydırarak grup hız dağılımını değiştirin. CCD çipinin sıcaklığını ulaşabileceği en düşük seviyeye indirmek için CCD çipine bir komut gönderin.Karanlık gürültüyü azaltmak için, fluorescein çözeltisinin 10 µL'sini bir mikroskop lamı üzerine pipetleyin ve bir lamel yerleştirerek numunenin ince bir tabakasının lamel ile mikroskop lamı arasındaki bölgeye homojen şekilde dağılmasını sağlayın; ardından lamel yüzeyine küçük bir damla imersiyon yağı damlatın. Şimdi mikroskop lamını XY, Z translasyon tablasına sabitleyin ve lam ile tablayı optik eksen yönünde hareket ettirin. Lineer aktüatörü manuel olarak ayarlayarak, mikroskop objektifi imersiyon yağı damlasıyla temas edene kadar lamı kaydırın; CCD dizisine çarpan ışığın bilgisayar ekranında gerçek zamanlı olarak görüntülenmesi için kamerayı video veri toplama moduna getirin.CCD dizisinde tespit edilen arka plan gürültüsünü azaltmak için odadaki tüm ortam ışıklarını kapatın. Örneği lazer ışınının odak noktasına getirmek için optik eksen yönündeki taşıma tablasını kontrol eden mikrometriyi yavaşça ayarlayın. Fluorescein örneği odaklandığında, emisyon CCD dizisinde keskin bir çizgi şeklinde görünecektir.CCD dizisinden elde edilen piksel yoğunluğu okumalarını bilgisayara indirin. İndirilen yoğunluk değerleri matrisini ImageJ'de açarak ve floresan bölgeden geçen bir çizgi çizerek, piksel yoğunluğunu CCD dizisindeki konumun bir fonksiyonu olarak ölçün. Image day komutunu kullanın.Floresein örneğinin emisyon spektrumunu gösteren bir grafik oluşturmak için grafik profilini analiz edin. Lazerin hareketini kontrol eden aynanın artış parametresini ayarlayın. Y yönünde odaklama yaparak, örnek içindeki ardışık y konumlarının, floresan spektrumlarının zirvesinin CCD dizisindeki spektral boyut boyunca tam olarak bir piksel hareket etmesini sağlayın.Bunu izlemek için, örnekteki iki farklı Y konumuna ait floresein spektra yoğunluğunu indirin. Ardından, yoğunluk görüntülerini ImageJ ile açın ve her bir floresan spektrumun için pik piksel konumunu bulun. CCD panjurunu açık bırakarak ImageJ imlecini kullanarak lazer odağını örneğin X yönünde tarayın.Tarama hattı boyunca her bir vokselden yayılan ışık, her bir hat taramasının sonundaki CCD dizisinin üzerine düşmelidir; bu hat taraması için CCD dizisinden elde edilen verileri kaydedin ve ardından CCD dizisinin piksellerini temizleyin. Lazerin konumunu değiştirin. Daha önce belirlenen miktarda Y yönünde odaklama yapın.Ardından, lazer ışınını numune boyunca X yönünde taratın. CCD panjurunu açık bırakarak verileri bir kez daha kaydedin. Tek bir biyolojik hücrenin boyutlarından yaklaşık %50 daha büyük bir fiziksel alan lazer ışığıyla aydınlatılana kadar bu hat tarama işlemini tekrarlayın.Farklı dalga boylarında birden fazla eksitasyon floresan yoğunluk yüzey haritası elde etmek için, belirli bir hat tarama görüntüsünün satır numarası ile dalga boyu arasındaki ilişki, görüntüleri yeniden oluşturmak için kullanılmalıdır. Belirli bir dalga boyu için eksitasyon floresan emisyon görüntüsünü elde etmek için, ilk hat taramasından elde edilen görüntüde bu dalga boyuna karşılık gelen satır numarasını bulun. Ardından, sonraki hat tarama görüntüsünün bitişik satırı, floresan emisyon görüntüsünün bir sonraki satırına karşılık gelir.Belirtilen dalga boyu için, bu dalga boyuna karşılık gelen tüm görüntü satırlarını üst üste ekleyerek numunenin o dalga boyundaki XY floresan yoğunluk uzay haritalarını elde edin. Numunelerinizle ilgili verileri toplamak için bu prosedürü elde edilebilen diğer tüm dalga boyları için tekrarlayın. İlk olarak, transforme edilmiş maya kolonilerinin bulunduğu plakaları inkübatörden çıkarın.En az üç tip transform edilmiş hücre bulunmalıdır. Her iki tip floresan prob ile işaretlenmiş ilgilenilen proteinleri eksprese eden hücreler, sadece donör floresan problarla işaretlenmiş proteinleri eksprese eden hücreler ve sadece akseptör floresan problarla işaretlenmiş proteinleri eksprese eden hücreler.Bir mikro santrifüj tüpüne 100 µL 100 mM potasyum klorür ekleyin. Ardından, bir mikropipet ucu kullanarak, hem donör hem de akseptör floresan problarla işaretlenmiş proteinler eksprese eden hücre plakalarından üç ila beş maya kolonisini sıyırın ve 100 mM potasyum klorür içerisine inoküle edin. Bu hücrelerle, hücre süspansiyonundan 10 µL alın ve taze bir mikroskop lamı üzerine damlatın.Damlanın üzerine bir lamellesle kapatın ve lamellenin yüzeyine bir damla yağ damlatın. Ardından, lazer ışığının mikroskop objektifine ulaşmasını engellemek için lazer ışını yolundaki perdeyi manuel olarak kapatın. Mikroskop lamını XY, Z translasyon tablasına sabitleyin ve mikroskop objektifi imersiyon yağı damlasıyla temas edene kadar lam tablasını optik eksen yönünde kaydırın.Şimdi geniş alan ışık aydınlatmasını açın ve kamera ayarlarına gidin. Veri toplama için video modunu seçin. Emisyon yolunda transmisyon ızgarasının bulunması nedeniyle, numunenin geniş alan görüntüsü oldukça bulanık olacaktır.Bu nedenle, iletim ızgarasından önceki optik yola, dar tam genişlikte yarı maksimum değerine sahip bir bant geçiren filtre yerleştirin. Hücrelerin görüntüsü kamera ekranında izlenirken, hücreler odaklanana kadar taşıma tablasını optik eksen yönünde yavaşça hareket ettirin. Tek bir hücreyi lazer ışını odağına getirmek için tablayı X veya Y yönünde hareket ettirin.Geniş alan aydınlatma kaynağını kapatın ve emisyon yolundaki bant geçiren filtreyi çıkarın. CCD dizisinde alınan sinyali aynı anda izlerken lazer ışınını kısa bir süreliğine açın. Lazer ışını hücreye çarptığı sırada CCD dizisinde bir floresan sinyali tespit edilirse, bu hücrenin tam floresan veri toplama taramasını gerçekleştirin.Daha önce gösterilen kalibrasyon prosedüründe belirlenen tarama parametrelerinin, özellikle hat sayısının ve y ekseni artışının aynı şekilde kullanılması hayati önem taşır. Hem donör etiketlere hem de akseptör etiketlere bağlı proteinler eksprese eden çok sayıda hücre için hücre konumlandırma ve floresan veri toplama işlemini tekrarlayın. Her iki reseptörle etiketlenmiş proteinleri eksprese eden hücrelere ait yeterli floresan görüntü toplandıktan sonra, tüm süreci hem yalnızca donör floresan problarla etiketlenmiş proteinleri eksprese eden hücreler hem de yalnızca akseptör floresan problarla etiketlenmiş proteinleri eksprese eden hücreler için tekrarlayın.Son olarak, daha önce açıklanan prosedürü kullanarak spektral olarak çözümlenmiş XY floresan yoğunluk uzaysal haritalarını elde etmek için tüm taramaları yeniden oluşturun. Bu üç şekilde gösterilenler, steril to alpha faktör reseptörü eksprese eden bir maya hücresi üzerinde gerçekleştirilen spektral olarak çözümlenmiş iki foton mikroskopi ölçümlerinden hesaplanan sonuç uzaysal haritalardır. Donör ve akseptör sinyallerinin iki boyutlu haritaları, hücrenin her bir konumundan elde edilen spektral emisyon profillerinin analiz edilmesiyle elde edilmiştir.Floresans yoğunluklarına değerlerine göre yalancı renkler atanmış olup ölçek bir ek olarak gösterilmiştir. Ardından, KDA ve KAD görüntüleri kullanılarak görünür FRET verimliliklerinin iki boyutlu bir haritası hesaplanmıştır; az önce gösterilen hücrenin görünür FRET verimlilikleri haritasından çıkarılan değerler kullanılarak bir histogram grafiği hazırlanmıştır. Hücrenin ölçülen EAPP değerleri dairelerle temsil edilmektedir.Kırmızı düz çizgi, düz yeşil çizgilerle temsil edilen bireysel kalsiyum fonksiyonlarının toplamu kullanılarak ölçülen verilere yapılan en iyi uyumu temsil etmektedir. Protokol metninde açıklanan histogram analizi, steril iki alfa faktör reseptörü tüm ligament kompleksinin in vivo ortamda RBA şeklinde bir tetramer formunu aldığını doğrulamaktadır. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde yürütüldüğü takdirde 12 saatte tamamlanabilir.Bu deney yapılırken, uyarma kaynağının gücünün düşük tutulması önemlidir. Donörün tek bir darbe ile birden fazla kez uyarılmasından kaçınmak önemlidir.

in-vivo-quantification-g-protein-coupled-receptor-interactions-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol bir FRET tabanlı yakınlık tahlil kullanarak nasıl görüntü protein-protein etkileşimleri açıklar.

Görüntüleme Protein-protein etkileşimleri In vivo</em

Burada, kemotaksis soruşturma için ayrıntılı canlı hücre görüntüleme yöntemleri açıklanmaktadır. Biz göç eden hücreleri olayları sinyal Spatiotemporal dinamiklerini izlemek için floresan mikroskobik yöntemler sunuyoruz. Ölçüm sinyal olayların bir GPCR sinyal ağı daha chemoattractants ve kontroller ökaryotik hücrelerin yönlü göç algılama degrade nasıl elde ettiğini anlamak için bize izin verir.

Görüntüleme G-protein Coupled Reseptör (GPCR) aracılı Sinyal Olaylar Kontrolü Kemotaksis Diktiyostelyum diskodeyum</em

Biz tek hücrelerin üç boyutlu konfokal floresans alınan tanımsız bir şekil morfolojisi değişiklikleri ölçmek için Imaris Nörobilim, ImarisXT ve MATLAB kullanan bir yazılım platformu geliştirdi. Bu yeni yaklaşım, reseptör aktivasyonunu takiben hücre şekli değişiklikleri ölçmek için kullanılır ve bu nedenle ilaç keşfi için olası ek bir araç temsil edilebilir.

Üç boyutlu Floresans Images Hücresel Morfoloji Değişiklikleri rakamlarla Analitik Aracı

Bu protokol, canlı hücrelerin yüzeyindeki tek reseptörleri görselleştirmek ve izlemek ve böylece reseptör yanal hareketliliğini, reseptör komplekslerinin boyutunu analiz etmek ve ayrıca geçici reseptör-reseptör etkileşimlerini görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan mikroskobunun nasıl kullanılacağını açıklar. Bu protokol diğer zar proteinlerine genişletilebilir.

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

G proteinlerinin G proteinine bağlı reseptörler tarafından seçici aktivasyonunu tespit etmek için basit yöntemler, hücre sinyalizasyonunda olağanüstü bir zorluk olmaya devam etmektedir. Burada, Fӧrster rezonans enerji transferi (FRET) biyosensörleri, canlı hücrelerde kontrollü konsantrasyonlarda konformasyonel değişiklikleri araştırmak için bir GPCR'nin G protein peptitlerine çift olarak bağlanmasıyla geliştirilmiştir.

G Protein-seçici GPCR konformasyoları Canlı Hücre Süspansiyon Fluorometer Deneyinde FRET sensörleri kullanılarak ölçülebilir

Guanozin trifosfat (GTP) bağlanması, G-Protein-Çiftleşmiş Reseptör (GPCR) aktivasyonundaki en erken olaylardan biridir. Bu protokol, radyo-etiketli GTP analoğu, [35S] guanozin-5'-O- (3-tio) trifosfatın ([35S] GTPyS) bağlanmasını izleyerek spesifik GPCR-ligand etkileşimlerinin farmakolojik olarak nasıl karakterize edildiğini açıklamaktadır. Ilginin bir ligandına cevap.

Radyo-etiketli GTP Bağlanması vasıtasıyla G-protein ile birleşmiş Reseptör Sinyalizasyonunun Ölçümü

Bir prosedür protein kinaz görselleştirmek için sunulmuştur baş-sabit, davranan fareler bir aktivite. Gelişmiş A-kinaz aktivite muhabiri, tAKARα, kortikal nöronlar içinde ifade edilir ve kafatası penceresinden görüntüleme için erişilebilir hale gelmiştir. İki foton floresans ömür boyu görüntüleme mikroskopisi, uygulanan lokomotif sırasında PKA etkinliklerini görselleştirmek için kullanılır.

In vivo Iki foton floresans ömür boyu görüntüleme mikroskobu kullanarak kafa-sabit davranan fareler Içinde bir aktivite, protein kinaz görselleştirme

Morfolojik değişiklikler, aktivasyon sonrasında bağışıklık duyarlı fibroblast hücrelerinde ortaya çıkar ve hücresel işe alma değişiklikleri teşvik. Genetik olarak tasarlanan fibroblast spesifik protein 1 (FSP1)-CRE ile birlikte 2-foton görüntülemenin kullanılması; tdtomato floxed-dur-floxed (TB/TB) fare hattı ve yeşil floresan etiketlenmiş lipopolisakkarid-fitc, biz dermal fibroblastlar ve morfolojik değişiklikler içinde lipopolisakkarid son derece spesifik alımı göstermek olabilir vivo.

İn vivo Iki renkli 2-foton görüntüleme genetiği etiketlenmiş Reporter hücrelerinin cilt içinde

Fӧrster rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı sensörlerin doğal düşük sinyal-gürültü oranı (SNR) nedeniyle, cAMP sinyallerinin ölçümü, özellikle üç uzamsal boyutta zor olmuştur. Burada, cAMP dağılımının üç mekansal boyutta ölçülemesine izin veren hiperspektral FRET görüntüleme ve analiz metodolojisini açıklıyoruz.

4 Boyutlu (x, y, z ve φ) Hiperspektral FRET Görüntüleme ve Analizi Kullanılarak Canlı Hücrelerde 3 Boyutlu cAMP Dağılımlarının Ölçümü

İn vivo görüntüleme, sağlık ve hastalıkta biyoloji çalışmaları için güçlü bir araçtır. Bu protokol, standart iki foton mikroskobu ile fare retinasının transpupiller görüntülemesini tanımlar. Ayrıca, retinanın birden fazla hücresel kohortunu floresan olarak etiketlemek için farklı in vivoimaging yöntemleri göstermektedir.

Transpupiller İki Foton Fare Retinasının In vivo Görüntülenmesi

Uyarılmış Raman saçılması (SRS) mikroskopisi, biyomoleküllerin spesifik kimyasal bağların içsel titreşimine dayanarak etiketsiz görüntülenmesini sağlar. Bu protokolde, canlı farelerin omuriliğindeki hücresel yapıları görselleştirmek için entegre bir SRS ve iki fotonlu floresan mikroskobun enstrümantal kurulumu açıklanmaktadır.

İn vivo Kombine İki Foton Floresan ve Stimüle Raman Saçılma Mikroskobu ile Biyolojik Dokuların Görüntülenmesi

Öğrenin, iki foton mikroskopi ve FRET analizi kullanarak canlı hücrelerde G protein çift reseptör etkileşimlerini ve oligomerik komplekslerin stoikyometrisini nasıl nicelersiniz. Bu yöntem, reseptör kompleks oluşumunu in vivo çalışmak için güçlü bir yaklaşım sunar.

Işıksal Çözülmüş İki foton Mikroskop kullanarak G Protein Coupled Reseptör Etkileşmeleri in vivo Niceleme

Daha fazla video keşfet