Name: Transgenik kullanarak Assaying β-amiloid Toksisite C. elegans Model (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: Öğrenin, transgenik C. elegans kullanarak β-amiloid toksisitesini nasıl ölçeceğinizi. Bu yöntem, Alzheimer hastalığı araştırmalarında ilaç ve genetik modifikasyonları hızlıca test etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz protokolleri geliştirmeye yardımcı oldu, özellikle de burada özgün yordamı geliştirmiştir Cin Fonte açıklanan Link laboratuarı mevcut ve eski üyeleri teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma CDL NIH (AG12423) ve Alzheimer Derneği (Zenith Ödülü) ödül tarafından desteklenmektedir

1) felç tayini için nematodu Büyüme Medya plakaları hazırlamak. Felç Testler, C için rutin olarak kullanılan standart nematodu Büyüme Medya (NGM) tabaklarda yapılmaktadır elegans yayılma ve genetik (Stiernagle 2006). <ol><li> NaCl, Erlenmeyer şişesinin Agar ve Peptonlu içinde bulunduğu NGM çözüm Otoklav ve steril CaCl 2, Urasil, Kolesterol, 1M MgSO 4 ve 1M KPO 4 uygun miktarda ekleyebilirsiniz . , Her biri 60 mm x 15 mm Petri Dish içine sıvı NGM kısım 10 ml. NGM gece oda sıcaklığında katılaşmasını sağlayın. </li><li> Her tabağa bileşikleri / özleri, kısım özü etkilerini test ve özü plaka yüzeyi üzerinde eşit olarak dağıtmak için bir ayırıcı kullanabilirsiniz. Gece oda sıcaklığında kuru ekstresi izin verin. 1 ml ciltlik kuruması için daha fazla zaman gerektirecektir. </li><li> E. 250 mcL ile her plaka Nokta coli suşu OP5O 0.4-0.6 bir optik yoğunluk için bir gecede LB Medya büyüdü. Bakteriler oda sıcaklığında bir gece kurumaya bırakın. </li></ol> İlgili değişkenlerin Plakaların yaş büyük plakalar kurumaya eğilimi gibi, felç tahlil üzerinde önemli bir etkisi vardır. Kullanım plakaları felç testinin bir hafta içinde dökülür. İdeal sonuçlar için, [(2) aşağıya bakınız] senkron solucan popülasyonlarının başlamadan 3-4 gün önce plakaları dökün. Herhangi bir deneme için, aynı partiden dökülür tabak kullanın. Çim boyutu (yani benekli vs. Yayılma) ve / veya bakteri türü değiştirme solucanlar davranışını değiştirebilir. Felç testleri alternatif E. kullanılarak yapılabilir coli suşlarının bir besin kaynağı (örneğin, RNAi deneyler beslenmesinde kullanılan HT115 zorlanma), fakat bu, böylece uygun iç kontrol gerektiren, felç kinetiği değiştirebilirsiniz . 2) Yaş eşzamanlı Worm Populasyonlarının Hazırlık Gerilme CL4176 (smg-1 (cc546 ts); dvIs27 [myo-3 / Aβ ​​minigene + rol-6 (su1006) işaretleyici gen X en sık Aβ indüklenen felç assaying için kullanılır Bu gerginlik ve diğer transgenik modelleri mevcuttur. Caenorhabditis Genetik Merkezi (http://www.cbs.umn.edu/CGC/) nominal ücret karşılığında akademik araştırmacılar. <ol><li> Yaş senkronize, senkronize bir ebeveyn nesil başlatmak için tercih edilir test nüfusun en üst düzeye çıkarmak için. Bir hafta önce test nüfusun felç tahlil başlatarak, 16 yaşında yatıyordu 20-30 gravid yetişkin 2 saatlik bir yumurta için OP50 yayılmış çok 10 cm NGM plakalar üzerine aktarmak için bir platin solucan toplayıcı ° C (müsamahakar sıcaklık CL4176 .) Gravid yetişkin çıkarın ve döl hangi zaman gravid yetişkin "ikinci gün" olacak, 7 gün boyunca büyümeye izin verir. </li><li> (Gün 1) ikinci gün gravid yetişkin yaşa eşzamanlı test nüfusu hazırlamak için kullanılır. Her deneysel koşul için 50-75 yaş senkron solucanları içeren üç nüsha plakaları oluşturmak için nesne. Platin solucan seçici kullanarak, OP50 ile fark 60 mm (10 ml hacim) NGM plakalar üzerine 2 gün gravid yetişkinlerin 10-12 aktarmak. Solucanların sonra yetişkinler almak ve yumurta kuluçkaya yatmak için izin ve 16 büyümeye, 2 saat boyunca 16 ° C'de yumurtalarını ° C izin verin Bu noktada onlara kod plakaları puanlama olmayacak birisi için en iyi golcü deneysel koşullara kör olacak. </li></ol> İlgili değişkenlerin Yumurtladığı embriyonik gelişim evresi (~ optimal koşullar altında vahşi tip solucanlar için 26-hücreli aşama), yetişkin yaş ve beslenme bir fonksiyonudur. Test nüfusun hazırlanması için kullanılan gravid yetişkin, eski ya da açlıktan iseniz, daha sonraki aşamalarda yumurta, nüfus ve felç kinetiği tekrarlanabilirlik yaş senkronize azaltarak belirtilen olacaktır. Farklı kültürlerin (mikrobik kirleticiler Bu testte ciddi etkiler) mono-axenic (yani, sadece OP50 bakteriler) daha önemlidir ve üç nüsha plakalar solucanlar benzer numaraları varsa tekrarlanabilirliği yüksek. 3) Transgen İndüksiyon ve Felç Testi <ol><li> (Gün 3) 25 ° C senkron yumurta sona ermesinden sonra 48 saat Upshift plakaları yatıyordu; solucanlar üçüncü larva dönemi (L3) olmalıdır. Levhalar, plakalar, aynı zamanda 25 ° C ulaşmak için izin vermek için 25 ° C inkübatör istifleme olmadan düzenlenmelidir. </li><li> (4. Gün) upshift başlandıktan sonra 18-20 saat solucanlar felç (zorlanma CL4176) puanlama başlayın. Bu noktada, nüfusun tüm solucanlar, dördüncü larval (L4) evre ulaşmış olması gerekir. Her plakalar tüm solucanlar felç kadar iki saat aralıklarla puanlama devam edin. Bilinmeyen nedenlerden dolayı, felç, vücut uzunluğu boyunca bile değildir: baş bölgeye hareket durdurma solucanın son parçasıdır. Böylece, wfelç son zamanlarda başlatılan ORMs plaka üzerinde çevirmeyin, ancak böylelikle kendi anterior etrafında bakteri takas ve temizlenir bakteri "halo" bırakarak, başlarını taşıyabilirsiniz. Bu solucanlar değişmez tamamen felç olacak ve bu nedenle felç olarak haleler ile solucanlar kategorize edilir. Bazı solucanlar haleler yok ama spontan hareket göstermez, bu solucan seçici dürtüsüyle tarafından test edilmektedir. Kışkırtılması solucan dürtüsüyle üzerine bir tam vücut dalga yayılımı uğramaz, felç gibi, o da atılırsa. Verimli puanlama için, onlar istemeden bir sonraki puanlama süresi rescored olamaz böylece plaka lekesiz sektörü felç solucanlar taşımak için en kolay yoldur. (Bu aynı zamanda bir skor düzeltilmesine imkân verir, yanlış kategorize solucanlar hareketi göstermek için izin verir). </li><li> Bir felç eğrisi oluşturmak için her zaman bir noktada solucanlar kesir felç edilmiş her bir plaka üzerinde bir yüzdesi dönüştürülür ve ortalama "unparalyzed" yüzde upshift başlatılması zaman karşı çizilmiştir. (Bu şekilde çizmek için gerekçe çıkan eğri bir hayatta kalma eğrisi resmen benzer olduğunu ve bu nedenle standart non-parametrik sağkalım istatistikleri kullanılarak analiz edilebilir.) </li></ol> İlgili değişkenlerin Transgenik myo-3/Aβ solucanlar upshift myo-3 organizatörü gelişimsel düzenlenir başlanmalıdır, ve anlamlı geç L4 veya erişkin solucanlar ifade azalttı felç için orta aşama L4 ulaşmadan önce gerçekleşmesi gerekir. Benzer şekilde, solucanlar hasret kalırsanız bu transgen ifadesi engelleniyorsa, bu yüzden solucanları deney boyunca, iyi beslenmiş olması esastır. 16 ° C'ye kadar downshifted olsa bile, biz her türlü şartlar altında kurtarmak için bir felç solucan gözlenen asla ve 12-16 saat upshift sonra, tüm CL4176 solucanlar felç olacak Suşu CL4176, transgen ifadesi yeterli upregülasyonu neden felç zamanı değişmiş olmasına rağmen paralizi (yani, 20-25 ° C) daha düşük sıcaklıklarda oluşabilir. Felç oranı, kullanılan özel transgenik suşu (CL4176 daha hızlı ve yavaş oranları ile myo-3/Aβ suşları inşa ettik) bağlıdır, bu nedenle alternatif suşları ile skor penceresi ayarlanması gerekiyor olabilir. 4) Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1'de gösterildiği gibi tedavi edilmemiş ve 6.27 mM kafein (NGM plaka final konsantrasyon) maruz CL4176 bir felç eğri bir arsa. Bu tedavi, bu modeli Aβ toksisite baskılanması itibariyle gösterge niteliğindeki yorumlamak yaklaşık 4 saat, felç bir çok istatistiksel olarak anlamlı bir gecikme ile sonuçlanır. Şekil 2'de gösterildiği gibi, kafestol, kahve bulunan başka bir bileşik etkileri assaying bağımsız bir deney. Bu arsa Aβ zehirlilik etkisi olmayan tedaviler için tipik bir örneğidir. Iki deneylerde tedavi edilmezse CL4176 popülasyonları yaklaşık yarısı 24 saat felç, felç, 28 saat olduğunu unutmayın. Bu kontrolü CL4176 popülasyonlarının felç için tipik zaman dilimleri. Bu zamanlama önemli sapmalar, değişen çevre koşullarına veya transgen kopya kendiliğinden silme göstergesidir. Sıcaklıklarda suşu (CL4176 myo-3/Aβ transgen birden fazla kopya ile kromozomal entegre transgenik dizi içerir. Bu transgenik dizi normalde oldukça istikrarlı olmasına rağmen, herhangi bir yayılma&gt; 16 ° C bir geçirmiş nadir solucanlar için seçecek Aβ ifade ve yavaş felç sonucu düşer varyantları çıkan transgenlerin kendiliğinden silme.) <img src="/files/ftp_upload/2252/2252fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. CL4176 solucanlar tedavi edilmezse veya 6.27 mM kafein (Sigma) maruz gerginlik Felç eğrisi Belirtilen sıcaklık upshift başlangıcından itibaren vardır. Hata çubukları = SEM <img src="/files/ftp_upload/2252/2252fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. 0.48 mM kafestol (Sigma) maruz CL4176 solucanlar Felç eğrisi. Hata çubukları = SEM

<ol><li>Arya, U., Dwivedi, H., Subramaniam, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reserpine+ameliorates+Abeta+toxicity+in+the+Alzheimer%27s+disease+model+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Reserpine ameliorates Abeta toxicity in the Alzheimer's disease model in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 44, 462-466 (2009).</li>
<li>Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+activities+protect+against+age-onset+proteotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity.</a> Science. 313, 1604-1610 (2006).</li>
<li>Dosanjh, L. E., Brown, M. K., Rao, G., Link, C. D., Luo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+phenotyping+of+a+transgenic+C.+elegans+expressing+neuronal+amyloid-beta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Behavioral phenotyping of a transgenic C. elegans expressing neuronal amyloid-beta.</a> J Alzheimers Dis. , (2009).</li>
<li>Drake, J., Link, C. D., Butterfield, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+precedes+fibrillar+deposition+of+Alzheimer%27s+disease+amyloid+beta-peptide+%281-42%29+in+a+transgenic+Caenorhabditis+elegans+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress precedes fibrillar deposition of Alzheimer's disease amyloid beta-peptide (1-42) in a transgenic Caenorhabditis elegans model.</a> Neurobiol Aging. 24, 415-4120 (2003).</li>
<li>Fay, D. S., Fluet, A., Johnson, C. J., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+aggregation+of+beta-amyloid+peptide+variants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">In vivo aggregation of beta-amyloid peptide variants.</a> J Neurochem. 71, 1616-1625 (1998).</li>
<li>Florez-McClure, M. L., Hohsfield, L. A., Fonte, G., Bealor, M. T., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+insulin-receptor+signaling+promotes+the+autophagic+degradation+of+beta-amyloid+peptide+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Decreased insulin-receptor signaling promotes the autophagic degradation of beta-amyloid peptide in C. elegans.</a> Autophagy. 3, 569-580 (2007).</li>
<li>Fonte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+in+vivo+beta-amyloid+peptide+toxicity+by+overexpression+of+the+HSP-16.2+small+chaperone+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Suppression of in vivo beta-amyloid peptide toxicity by overexpression of the HSP-16.2 small chaperone protein.</a> J Biol Chem. 283, 784-7891 (2008).</li>
<li>Hassan, W. M., Merin, D. A., Fonte, V., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AIP-1+ameliorates+beta-amyloid+peptide+toxicity+in+a+Caenorhabditis+elegans+Alzheimer%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">AIP-1 ameliorates beta-amyloid peptide toxicity in a Caenorhabditis elegans Alzheimer's disease model.</a> Hum Mol Genet. 18, 2739-2747 (2009).</li>
<li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+human+beta-amyloid+peptide+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 9368-9372 (1995).</li>
<li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+analysis+in+a+transgenic+Caenorhabditis+elegans+Alzheimer%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Gene expression analysis in a transgenic Caenorhabditis elegans Alzheimer's disease model.</a> Neurobiol Aging. 24, 397-413 (2003).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta-induced+pathological+behaviors+are+suppressed+by+Ginkgo+biloba+extract+EGb+761+and+ginkgolides+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta-induced pathological behaviors are suppressed by Ginkgo biloba extract EGb 761 and ginkgolides in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> J Neurosci. 26, 13102-13113 (2006).</li>
</ol>

Açıklanan protokol etkili Aβ toksisite bileşiklerin etkilerini tahlil etmek için kullanılabilir. Yayınlandı örnekler Ginkgo biloba ekstresi bileşenlerinin etkileri (Wu ve ark 2006) ve reserpin (Arya ve ark 2009) içerir. Diğer sistemlerde Aβ toksisitesine karşı koruyucu bileşikler de (örneğin, memantin, yayımlanmamış sonuçlar) bu modelde koruyucu olduğu gösterilmiştir. Bu modelin kurulması için önemli bir gerekçe C ile iyi geliştirilmiş genetik ve moleküler araçlar kullanılabilir. elegans Aβ toksisite mekanizmaları araştırmak için kullanılabilir. Böylece, Aβ toksisitesi üzerindeki etkileri özel mutasyonlar (örneğin, daf-2-fonksiyon kaybı mutasyonu, Florez-McClure ve ark, 2007 tanıtan tarafından sinyalizasyon gibi insülin azaltmada etkisi) test ve bu model de olabilir (Fonte ve ark 2008) aşırı ifade transgenlerin etkilerini incelemek için kullanılır. Biz son zamanlarda Aβ tek bir amino asit değiştirmelerin (yayınlanmamış veri) toksisitesi üzerindeki etkilerini incelemek için bu modelin geniş kullanımı yaptık. Transgenik bir model deneyleri burada kas hücre fonksiyonu akut Aβ ifade etkisi nitelendirdi. Felç kas hücreleri ve bunların sarkomer zamanda bozulmamış; felç fenotip kas hücre ölümü sonucu değildir. Ancak, kas bütünlüğünü ve solucanlar nihai ölümünden sonra felç (ilk upshift sonra ~ 48 saat) bir arıza var. Biz bu Aβ ifade aşağı etkisi araştırılmıştır veya bir toksisite belirteci olarak kullanılır. Burada açıklanan indüklenebilir Aβ ifade modeli başına β-amiloid oluşumunu modüle tedavileri araştırmak için uygun değildir. (. Fay ve ark 1998; Link ve ark 2001) kurucu Aβ ifade formu kolaylıkla saptanabilir amiloid mevduat transgenik solucanlar rağmen, indüklenebilir Aβ ifade ile transgenik solucanlar nadiren amiloid mevduat ve felç fenotip amiloid birikimi (Drake ve ark bağımsız görünür. 2003). Çözünen oligomerik Aβ birikimi değil, amiloid birikimi bağlı Aβ ifade sonuçlarının akut toksisite sonuçları görünümü ile uyumlu.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifler </td><td> Quantity/2L </td><td> Şirket / Katalog # </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 6g </td><td> Sigma-Aldrich / S9888 </td><td></td></tr><tr><td> Agar </td><td> 40g </td><td> Sigma-Aldrich / A7002 </td><td></td></tr><tr><td> Pepton </td><td> 5g </td><td> Sigma-Aldrich / P0556 </td><td></td></tr><tr><td> GKD 2 O </td><td> 2L </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1M CaCl 2 </td><td> 2mL </td><td></td><td> GKD 2 O içinde 147.02mg/mL </td></tr><tr><td> Urasil </td><td> 2mL </td><td></td><td> GKD 2 O içinde 2mg/mL </td></tr><tr><td> Kolesterol </td><td> 2mL </td><td></td><td> Etanol içinde 5mg/mL (otoklav değil) </td></tr><tr><td> 1M MgSO 4 </td><td> 2mL </td><td></td><td> GKD 2 O içinde 246.5mg/mL </td></tr><tr><td> 1M KPO 4 </td><td> 50ml </td><td></td><td> 98mg KH 2 PO 4 mL, 48mg K2HPO4/mL GKD 2 O, pH </td></tr><tr><td> Erlenmeyer Flask </td><td></td><td> VWR </td><td></td></tr></tbody></table>

transgenik kullanarak assaying β-amiloid toksisite c. elegans model

Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

Β-amiloid peptid (Aβ) birikmesi genellikle Alzheimer hastalığının indüksiyon merkezi inanıyordu, ancak ilgili toksisite mekanizma (lar) hala belirsiz. Aβ da İçerme Vücut Miyozit, ciddi bir insan miyopati intramüsküler yatırılır. Yoğun çalışılan nematod solucan Caenorhabditis elegans transgenically insan Aβ ifade etmek için tasarlanmış olabilir. Aβ ifade doku ya da zamanlama olarak, transgenik solucanlar Aβ toksisite okuma olarak hizmet kolaylıkla ölçülebilir fenotipleri olabilir. Cohen ve ark; Örneğin, Pan-nöronal Aβ ifade ile transgenik solucanlar kurucu kas-özel ifadesi ile transgenik solucanlar ilerici, yaşa bağlı felç fenotip (Link, 1995, kusurlar, ilişkisel öğrenme (. Dosanjh ve ark 2009) 2006). Bir özellikle yararlı C. elegans modeli, tekrarlanabilir bir felç fenotip sıcaklık upshift (Link ve ark 2003) üzerine çıkan bir Aβ transgen sıcaklık indüklenebilir kas ifade mühendisi mRNA gözetim sistemi ısıya duyarlı bir mutasyon istihdam. Bu modelde karşı Aβ toksisite [örneğin, bir koruyucu transgen (Hassan ve ark 2009) ifade Ginkgo biloba ekstreleri (Wu ve ark 2006) maruz kalma] tekrarlanabilir bu transgenik sıcaklık upshift tarafından tetiklenen felç oranı değiştiren tedaviler solucanlar. İşte biz bu transgenik C. felç oranı ölçmek için bizim protokol tarif Bu ölçüm etkisi deneysel değişkenlerin özellikle dikkat elegans modeli.

Yoğun çalışılan bir nematod solucanı<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Transgenically insan β-amiloid peptid (Aβ) ifade etmek için tasarlanmış olabilir. Aβ, İndüklenmiş ifade<em&gt; C. elegans</em&gt; Kas hızlı, tekrarlanabilir felç fenotip Aβ toksisite modüle tedavileri izlemek için kullanılabilecek bir yol açar.

Transgenik kullanarak Assaying β-amiloid Toksisite C. elegans Model

&beta;-amiloid peptidin (A&beta;) birikiminin genel olarak Alzheimer hastalığının indüklenmesinde merkezi bir rol oynadığına inanılmaktadır, ancak ilgili...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir InVivo model sisteminde beta amiloid peptidin toksisitesini analiz etmektir. Bu analiz yönteminin tekrarlanabilirliği ve nispeten basit olması; ilaçların, çevresel koşulların veya genetik modifikasyonların beta amiloid toksisitesi üzerindeki etkilerinin hızlı bir şekilde test edilmesine olanak tanır. Bu analizin geliştirilmesindeki temel faktör, beta amiloid peptidin kas spesifik ve sıcaklıkla indüklenebilir ekspresyonuna sahip transgenik c. elegans solucanlarının üretilmesidir.Sıcaklığa duyarlı bu ekspresyon, transgen mRNA'sını mRNA gözetim sisteminin hedefi haline getiren anormal derecede uzun bir üç prime çevrilmeyen bölge içeren bir transgen oluşturularak tasarlanmıştır; bu nedenle, fonksiyonel bir mRNA gözetim sistemine sahip vahşi tip solucanlarda, transgen mRNA'sının degradasyonu nedeniyle bu transgenin ekspresyonu düşüktür. Eğer bu transgen, mRNA gözetim sisteminin temel bir bileşeninde mutasyon içeren bir genetik arka plana aktarılırsa, transgen ekspresyonu önemli ölçüde daha yüksek olacaktır. Genetik arka plan, mRNA gözetim sisteminde sıcaklığa duyarlı bir mutasyon içeriyorsa, bu transgenik suşun uygun olmayan sıcaklıkta çoğaltılması transgen mRNA degradasyonunu engelleyecek ve yüksek transgen ekspresyonu ile sonuçlanacaktır. Beta amiloid peptidinin vücut duvarı kas ekspresyonunu düzenlemek için bu sistemi kullanan transgenik solucanlarda, sıcaklığın 16 °C'den 25 °C'ye yükseltilmesi, beta amiloid peptidinin yüksek birikimine, kas hücrelerinin disfonksiyonuna ve solucanların felç olmasına yol açar; sürenin ölçümü.Sıcaklık artışı sonrası bu transgenik solucan popülasyonunun felç olması zaman alır. Sıcaklık artışı, beta amiloid toksisitesi için hassas bir analiz yöntemidir. Bu, felç oranlarını etkileyebilecek çevresel değişkenleri en aza indirmeye yardımcı olan, felç analizi için taze nematod büyüme ortamı plakaları hazırlanarak gerçekleştirilir.İkinci adım olarak, gelişim aşamasının transgen ekspresyonu üzerindeki etkilerini minimize etmek amacıyla transjenik solucanların yaş senkronizasyonlu popülasyonları başlatılır. Ardından, senkronize edilmiş üçüncü larva evresindeki solucanlar 16 °C'den 25 °C'ye yükseltilerek transgen mRNA stabilitesi artırılır ve bu durum beta amiloid peptidinin birikimine yol açar. Her bir solucan için sıcaklık artışından paralize olana kadar geçen sürenin ölçülmesi kas disfonksiyon hızını belirler, böylece beta amiloid peptidi birikiminin toksik etkileri değerlendirilir; bu sayede spesifik tedavilerin endojen olarak eksprese edilen beta amiloid peptidinin toksisitesi üzerindeki etkisini gösteren sonuçlar elde edilir.Dolayısıyla, ilaç aktivitesini değerlendirmek için transgenik fare modelleri kullanmaya kıyasla tekniğimizin temel avantajı, işlemini çok daha hızlı ve çok daha düşük maliyetle gerçekleştirebilmemizdir. Bu yöntemin görsel olarak gösterimi kritik önem taşımaktadır. Bir felç analizinde L4 solucanlarının skorlanmasını öğrenmek oldukça zordur.Felçli bir L4 solucanını skorlarken, solucanın baş bölgesinin izole hale hareketine bakmanız gerekir. Baş bölgesi hareket ettiğinde ve solucanın tüm vücudu felç olduğunda, bu solucanı felçli olarak skorlarız. Felç deneyleri, C. elegans çoğaltılması ve genetiği için rutin olarak kullanılan standart nematod büyüme ortamı veya NGM plakalarında gerçekleştirilir.Plakaları hazırlamak için; sodyum klorür, agar ve peptit içeren NGM çözeltisini bir erlenmeyer flask içerisinde otoklavlayın, ardından ekteki yazılı protokolde belirtilen uygun miktarlardaki steril çözeltileri ekleyin. Her bir 60 milimetre x 15 milimetre Petri kabına 10 mililitre sıvı NGM paylaştırın. NGM'nin oda sıcaklığında gece boyunca katılaşmasını bekleyin.Bileşiklerin veya ekstraktların etkileri test ediliyorsa, ekstraktı her plakaya paylaştırın ve bir yayma çubuğu kullanarak plaka yüzeyine eşit şekilde dağıtın. Plakaların oda sıcaklığında gece boyunca kurumasına izin verin. Bir mililitrenin üzerindeki hacimlerin kuruması daha fazla zaman gerektirecektir.Ardından, her plak üzerine LB besiyerinde gece boyunca 0,4 ila 0,6 optik yoğunluğa kadar büyütülmüş 250 µL E. coli suşu OP 50 damlatın ve bakterilerin oda sıcaklığında gece boyunca kurumasına izin verin. Plağın yaşı, paralizi oranı üzerinde önemli bir etkiye sahiptir ve bu nedenle eski plaklar kurumaya meyillidir. Plaklar, paralizi analizinden önce bir hafta içinde dökülmelidir.İdeal olarak, senkronize yumurta bırakma plakalarınızdan üç ila dört gün önce dökülmüş plakalar kullanmanız önerilir; herhangi bir deneyde kullanılan plakaların tamamı aynı seriden olmalıdır. Bakteri çiminin boyutunun veya bakterinin değiştirilmesi, solucanların davranışını da değiştirecektir. Paraliz analizleri alternatif E. coli suşları kullanılarak gerçekleştirilebilir. Örneğin, RNAi deneylerinde HT115 kullanılır. Ancak bu durum, paraliz analizinin kinetiğini değiştirebilir.Bu nedenle, uygun suşlara ait iç kontroller kullanmanız gerekir. Beta kaynaklı paralizi analizleri için en yaygın olarak CL 476 suşu kullanılır. Bu suş ve diğer transgenik modeller, Saint Ahadi Genetik Merkezi'nden akademik araştırmacılara nominal bir ücret karşılığında sağlanmaktadır.Test popülasyonunun yaş senkronizasyonunu maksimize etmek için, senkronize bir ebeveyn nesli ile başlamak tercih edilir. Test popülasyonunun paralizi deneyini başlatmadan bir hafta önce, platin bir solucan seçici kullanarak 20 ila 30 adet yetişkin bireyi birkaç adet 10 santimetrelik NGM plakasına aktarın.CL 4 1 76 için uygun sıcaklık olan 16 °C'de, yumurtlama için iki saat boyunca OP 50 ile birlikte yayın. GR yetişkinlerini uzaklaştırın ve dölün yedi gün boyunca büyümesine izin verin; bu süre sonunda ikinci gün gebe yetişkinler haline geleceklerdir. İkinci gün gebeliği.Her bir deneysel koşul için yaş senkronize test popülasyonları hazırlamak amacıyla yetişkinler kullanılır. Amaç, platin solucan seçici kullanarak 50 ila 75 yaş senkronize solucan içeren üç tekrarlı plakalar oluşturmaktır. Gün iki graver aşamasındaki yetişkinlerden 10 ila 12 tanesini OP 50 damlatılmış 60 milimetrelik NGM plakalarına aktarın. Solucanların 16 °C'de iki saat boyunca yumurta bırakmalarına izin verin, ardından yetişkinleri toplayın ve yumurtaların 16 °C'de açılıp büyümesine izin verin.Bu aşamada, plakaları değerlendirecek kişi olmayan birinin, değerlendirme işleminin deneysel koşullara karşı körleme yapılması amacıyla plakaları kodlaması en iyisidir. Yumurtaların bırakıldığı embriyonik gelişim evresi (optimal koşullar altında yaban tipi solucanlar için yaklaşık 26 hücre evresidir), erişkin yaşının ve beslenmenin bir fonksiyonudur. Yumurta bırakımı için kullanılan erişkinler daha yaşlıysa veya aç bırakılmışlarsa, daha ileri evreli yumurtalar bırakılacak ve senkronize popülasyon sağlanamayacaktır; bu durum felç deneyi kinetiğini etkileyecektir.Her türlü bakteriyel kontaminasyon bu analizi ciddi şekilde etkileyebileceğinden, e coli OP 50 gibi monojenik bakteri kültürlerinin kullanılması esastır. Tekrarlı plaklarınızda benzer sayıda solucan bulunması durumunda tekrarlanabilirlik en yüksek düzeydedir. Transgeni indüklemek ve paralizi analizini gerçekleştirmek için plakları 25 °C'ye yükseltin.Senkronize yumurtlama işleminin sona ermesinden 48 saat sonra solucanlar üçüncü larva evresinde olmalıdır. Plakaların bu sıcaklığa ulaşmasını sağlamak için plakalar, üst üste yığılmadan 25 °C'lik bir inkübatöre yerleştirilmelidir. Aynı zamanda, sıcaklık artırımı başlatıldıktan 18 ila 20 saat sonra solucanların paralizi skorlamasına başlanmalıdır.Bu noktada, popülasyondaki tüm solucanlar dördüncü larva evresine ulaşmış olmalıdır; her bir plaka üzerindeki tüm solucanlar felç olana kadar iki saatlik artışlarla puanlamaya devam edin. Bilinmeyen nedenlerle felç durumu vücut uzunluğu boyunca homojen değildir. Baş bölgesi, solucanın hareket etmeyi bırakan son kısmıdır.Bu nedenle, felç durumu yeni başlamış olan solucanlar plaka üzerinde yer değiştiremezler, ancak başlarını hareket ettirebilirler; böylece ön bölgelerindeki bakterileri temizleyerek temizlenmiş bakterilerden oluşan bir hale yol açarlar. Bu solucanlar kaçınılmaz olarak tamamen felç olacaklardır ve bu nedenle halesi olan solucanlar felçli olarak tanımlanır. Bazı solucanların halesi olmayacaktır, ancak bu solucanlar kendiliğinden hareket de sergilemeyecektir.Bunlar, solucan seçici ile dürtülerek test edilir. Dürtülen bir solucan, dürtülme üzerine tüm vücut boyunca dalga yayılımı gerçekleştiremiyorsa, verimli bir skorlama için o da felçli olarak kaydedilir. Felçli solucanların, bir sonraki skorlama döneminde yanlışlıkla tekrar skorlanmamaları için plakanın işaretlenmemiş bir sektörüne taşınması en kolay yoldur.Bu durum aynı zamanda yanlış kategorize edilmiş solucanların hareket sergilemesine olanak tanıyarak, bir paralizi eğrisi oluşturmak için skor düzeltmesi yapılmasını sağlar. Her zaman noktasında, her plaka üzerindeki paralize olmamış solucanların oranı yüzdeye dönüştürülür ve ortalama paralize olmamış yüzdesi, sıcaklık artırımı başlatıldığı andan itibaren geçen zamana karşı grafiğe dökülür. Elde edilen eğri biçimsel olarak bir sağkalım eğrisi ile benzerdir ve bu nedenle standart parametrik olmayan sağkalım istatistikleri kullanılarak analiz edilebilir.Felcin başlayabilmesi için transgenik myo three A beta solucanlarının vites yükseltme işlemi (upshift) L4 evresinin ortasına kadar gerçekleştirilmelidir. Myo three promotörü gelişimsel olarak düzenlenmektedir. Solucanlar geç L4 evresine veya yetişkinliğe ulaştığında, ekspresyon düzeyi önemli ölçüde azalmış olur.Solucanlar aç bırakılırsa transgenin ekspresyonu engellenir, bu nedenle deney boyunca solucanların iyi beslenmesi oldukça önemlidir. Felç olmuş bir solucanın hiçbir koşulda iyileştiğine rastlamadık. Upshift sonrası 12 ila 16 saat içinde, CL 41 76 suşunda, sıcaklığı tekrar 16 dereceye düşürseniz bile felç meydana gelecektir; transgen ekspresyonunun felce neden olan yukarı regülasyonu daha düşük sıcaklıklarda da gerçekleşebilir.Ancak, paralizi oranının zamanlamasının etkileneceğini lütfen unutmayın. Paralizi oranı, kullanılan spesifik transgen suşuna bağlıdır. CL 41 76'dan daha hızlı ve daha yavaş paralizi oranına sahip üç farklı myo A beta suşu oluşturduk; bu nedenle, paralizi deneyi için değerlendirme pencerenizi buna göre ayarlamanız gerekmektedir.Burada, hem işlem görmemiş hem de 6.27 millimolar kafeine maruz bırakılmış CL 4 1 76 için bir felç eğrisi grafiği gösterilmektedir. Bu işlem, yaklaşık dört saatlik, istatistiksel olarak oldukça anlamlı bir felç gecikmesiyle sonuçlanmıştır ve biz bunu beta toksisitesinin baskılandığının bir göstergesi olarak yorumluyoruz. Bu modelde, söz konusu deney kahvede bulunan başka bir bileşiğin etkilerini incelemiştir.Grafik, beta toksisitesini etkilemeyen uygulamalar için tipiktir. Her iki deneyde de, işlem görmemiş CL 4 1 76 popülasyonlarının yaklaşık yarısının 24. saatte felç olduğuna ve felcin 28. saate kadar tamamlandığına dikkat edin. Bunlar, kontrol grubu felci için tipik zaman dilimleridir.CL 4 1 7 6 popülasyonlarında bu zamanlamadan meydana gelen belirgin sapmalar, değişmiş çevresel koşulların veya transgen kopyalarının spontan delesyonunun göstergesidir. CL 4 1 76 suşu hakkında ek bilgi için beraberindeki protokole bakınız. Bu prosedürü uygularken plakların yaşı, solucan popülasyonunun evresi ve solucanların paralizi oranını skorlama yeteneğinin göz önünde bulundurulması önemlidir.Bu videoyu izledikten sonra, beta amiloid toksisitesini dikkatli bir şekilde analiz etmek için bu sea elgan sisteminin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız. Çeşitli çevresel veya ilaç tedavilerinin bu toksisite üzerindeki oldukça hafif etkilerini tespit edebilmeniz gerekir. Bahsettiğimiz değişkenlere dikkat etmek önemlidir; çünkü bu, analizi oldukça tekrarlanabilir bir şekilde ve tutarlı bir paraliz kinetiği ile gerçekleştirmenizi sağlayacaktır.Bu durum, laboratuvarınızda farklı zamanlarda farklı kişiler tarafından elde edilen sonuçları karşılaştırmak veya sonuçlarınızı bu model sistemi kullanan diğer araştırmacılarınkilerle kıyaslamak istediğinizde aslında oldukça önemlidir.

assaying-amyloid-toxicity-using-a-transgenic-c-elegans-model

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video C. elegans dopaminerjik nöron nörodejenerasyon, Parkinson hastalığı için bir model olarak değerlendirmek için nasıl kullanılacağını göstermektedir. Ayrıca, genetik ekranlar ya dejenerasyon geliştirmek veya nöroprotektif faktörleri tanımlamak için kullanılır.

Potansiyel Parkinson Hastalığı Genler Doğrulama için C. elegans Dopamin Nöron Dejenerasyonu Testi Uygulama

Bu videoda, bir test bileşiği olan astragalan'ın, poliQ aracılı nörotoksisiteden Caenorhabditis elegans'ta nöronal sağkalım üzerindeki nöroprotektif etkisini değerlendirmek için bir yöntem açıklıyoruz. Test, test bileşiği tedavisini takiben nöronal sağkalımı ölçmek için ASH nöronlarında GFP'ye kaynaşmış anormal şekilde genişlemiş poliQ tekrarlarını ifade eden Caenorhabditis elegans'ı kullanır.

Solucanlarda PolyQ Aracılı Nörotoksisiteye Karşı Test Bileşiğinin Etkisini İncelemek İçin Bir Test

Biz solucan amylopathies yönlerini incelemek için yöntemler...

Bir<em&gt; Caenorhabditis elegans</emAmylopathy Çalışmaları&gt; Model Sistemi

Protein agregatlarının prion benzeri yayılımı, son zamanlarda birçok nörodejeneratif hastalıkta rol oynadığı ortaya çıkmıştır. Bu protokolün amacı, nematod C. elegans'ın protein yayılımını izlemek ve prion benzeri olayları araştırmak için bir model sistem olarak nasıl kullanılacağını açıklamaktır.

Metazoan Model Organizma kullanma Serim ve toksisitesi prion-benzeri Proteinler incelenmesi<em&gt; ° C. elegans</em

Burada, β-amiloidoz ve tauopatinin transgenik fare modellerinde bilişsel ve fonksiyonel motor davranışlarda in vivo etkinlik gösteren bileşiklerin taranması için kullanılabilen aşamalı, davranışsal tarama yaklaşımı anlatılmaktadır. Bu yöntemler, bileşikleri kısa süreli ve hafızadaki işlerde etkinlik açısından taramak için optimize edilmiştir.

Amiloid-β ve Tau Nöropatolojisinin Transgenik Fare Modellerinde Spontan Dalgalanmanın Değerlendirilmesi, Yeni Nesne Tanıma ve Limb Klapması

Biz yüksek üretilen iş Caenorhabditis elegansbüyük popülasyonlarda fenotipik karakterizasyonu sağlayan geniş görüş alanı nematodunun izleme platformu (WF-NTP) kullanarak iletişim kurallarını açıklar. Bu protokoller mutant suşları veya yüksek ölçeklenebilir bir moda farmakolojik tedaviye yanıt ince davranış değişiklikleri tanımlamak için kullanılabilir.

Otomatik davranış analizi büyük C. elegans nüfus kullanarak bir geniş alan bakış açısı izleme platformu

Nicel bir yöntem tanımlamak ve fenotipik Caenorhabditis elegansprofil oluşturma otomatik olarak analiz ederek kimyasal maddeler akut toksisite tahmin etmek için geliştirilmiştir. Bu iletişim kuralı, bir 384-şey tabak içinde solucanlar kimyasallar ile tedavi, video esir alma ve toksikolojik ilgili fenotipleri ölçmek açıklar.

Bir yüksek-den geçerek tahlil tarafından otomatik fenotipik profil oluşturma Caenorhabditis elegans ve kimyasal toksisitesi tahmin için

Tekrarla ilişkili olmayan ATG bağımlı çeviri ürünleri, tekrarlayan genişleme tabanlı hastalıkların patojenik özellikleridir. Açıklanan protokolün amacı, c. elegansmodel sisteminde davranışsal ve hücresel tahliller kullanarak bu peptidlerin neden olduğu toksisiteyi değerlendirmektir.

C. elegans RAN Peptid Toksisitesi Ölçme

Proteostatik düşüş, nörodejeneratif hastalıkların başlangıcını kolaylaştıran yaşlanmanın ayırt edici bir özelliğidir. İki farklı Caenorhabditis elegans dokularındaki proteostazları, floresan bir muhabire kaynaşmış poliglutamin tekrarlarının heterolog ifadesiyle ölçülebilir bir şekilde ölçmek için bir protokol özetliyoruz. Bu model proteostazın hızlı in vivo genetik analizine izin verir.

Caenorhabditis eleganlarında Dokuya Özgü Proteostatik Düşüşün Ölçülmesi

Burada, yaşla ilişkili nörodejeneratif hastalıkların hücresel ve moleküler temellerini izlemek ve incelemek için hiperaktive iyon kanal kaynaklı nekroz ve protein agrega kaynaklı nörotoksisite gibi çok yönlü nematod modellerini kullanan yaygın olarak erişilebilir metodolojileri tanıtıyor ve tanımlıyoruz.

Caenorhabditis elegans Yaş İlişkili Nörodejeneratif Hastalıkların Modellendirilmesi

Burada, Caenorhabditis elegans'taki test bileşiklerinin poliglutamin agregasyonu, nöronal ölüm ve kemoavoidans davranışı dahil olmak üzere nöroprotektif aktivitelerini ve çoklu fenotiplerin örnek bir entegrasyonunu değerlendirmek için bir protokol sunuyoruz.

Poliglutamin aracılı nörotoksisiteye karşı biyoaktif bileşiklerin keşfedilmesi için bir model sistem olarak Caenorhabditis elegans

Öğrenin, transgenik C. elegans kullanarak β-amiloid toksisitesini nasıl ölçeceğinizi. Bu yöntem, Alzheimer hastalığı araştırmalarında ilaç ve genetik modifikasyonları hızlıca test etmenizi sağlar.

Transgenik kullanarak Assaying β-amiloid Toksisite C. elegans Model

Daha fazla video keşfet