Transgenik kullanarak Assaying β-amiloid Toksisite C. elegans Model

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir InVivo model sisteminde beta amiloid peptidin toksisitesini analiz etmektir. Bu testin tekrarlanabilirliği ve göreceli basitliği, ilaçların, çevresel koşulların veya beta amiloid toksisitesi üzerindeki genetik modifikasyonların hızlı bir şekilde test edilmesini sağlar. Bu testin geliştirilmesinde önemli bir faktör, beta amiloid peptidin kas özgül sıcaklığıyla indüklenebilen ekspresyonu ile transgenik cl egan solucanlarının üretilmesidir.

Bu sıcaklığa duyarlı ekspresyon, anormal derecede uzun, üç asal çevrilmemiş bölge içeren bir transgen inşa edilerek tasarlanır, bu transgen mRNA'yı mRNA sürveyans ekspresyonu haline getirir, bu nedenle, transgen mRNA'sının bozunması nedeniyle işlevsel bir mRNA gözetim sistemine sahip vahşi tip solucanlarda zayıftır. Bu transgen, mRNA gözetim sisteminin temel bir bileşeninde bir mutasyon içeren bir genetik arka plana dahil edilirse, transgen ekspresyonu önemli ölçüde daha yüksek olacaktır. Genetik arka plan, mRNA gözetim sisteminde sıcaklığa duyarlı bir mutasyon içeriyorsa, bu hendek genli suşun izin verilmeyen sıcaklıkta yayılması, siper geni mRNA bozulmasını engelleyecek ve bu sistemi beta amiloid peptit sıcaklığının vücut duvarı kas ekspresyonunu düzenlemek için kullanan yüksek siper gen ekspresyonu hendekojenik solucanlara neden olacaktır. Beta amiloid peptit birikiminin yüksek olmasına, kas hücrelerinin disfonksiyonuna ve solucanların felç zamanının ölçülmesine neden olur.

Sıcaklıktan sonra felç olmak için bu kazı solucanlarının bir popülasyonu gerekir. Upshift, beta amiloid toksisitesi için hassas bir testtir. Bu, felç oranlarını etkileyebilecek çevresel değişkenleri en aza indirmeye yardımcı olan felç testi için taze nematod büyüme ortamı plakaları yapılarak elde edilir.

İkinci bir adım olarak, yaşla senkronize kazma solucanı popülasyonları veya başlatılmış olarak, bu, gelişimsel aşamanın transgen ekspresyonu üzerindeki etkilerini en aza indirir. Daha sonra, senkronize üçüncü larva evreleri, 16 santigrat dereceden 25 santigrat dereceye yükseltilir, bu da transgen mRNA'nın stabilitesini arttırır ve beta amiloid peptidinin birikimine yol açar. Her bir solucan için vites yükseltmeden felce kadar geçen sürenin ölçülmesi, kas disfonksiyonunun oranını yakalar, böylece beta amiloid peptit birikiminin toksik etkilerini test eder, bu da spesifik tedavilerin endojen olarak eksprese edilen beta amiloid peptidin toksisitesi üzerindeki etkisini gösteren sonuçlar elde edilir.

Bu nedenle, tekniğimizin ana avantajı, ilaç aktivitesini test etmek için transgenik fare modellerini kullanmanın aksine, bizimkini çok daha hızlı ve çok daha ucuza yapabilmemizdir. Bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir. Bir felç testinde L dört solucanın puanlanmasını öğrenmek çok zordur.

Yani felçli bir L dört solucanı puanlarken, bakmak istediğiniz şey solucanın baş bölgesinin izole hale hareketidir. Bu hareket etmeye başladığında ve solucanın tüm vücudu felç olduğunda, o solucanı felçli olarak puanlarız. Felç denemeleri, CL egan'ın yayılması ve genetiği için rutin olarak kullanılan standart nematod büyüme ortamı veya NGM plakaları üzerinde gerçekleştirilir.

Plakaları otoklav hazırlamak için, bir erlenmeyer şişesinde sodyum klorür, agar ve peptit içeren NGM çözeltisi, ardından ekteki yazılı protokolde bulunabilecek aşağıdaki steril çözeltilerin uygun miktarlarını ekleyin. Her 60 milimetreye 15 milimetre Petri kabına 10 mililitre sıvı NGM ekleyin. NGM'nin gece boyunca oda sıcaklığında katılaşmasına izin verin.

Bileşiklerin veya ekstraktların etkilerini test ediyorsanız, ekstraktı her bir plakaya ayırın ve plakanın yüzeyine eşit olarak dağıtmak için bir yayıcı kullanın. Plakaların gece boyunca oda sıcaklığında kurumasını bekleyin. Bir mililitrenin üzerindeki hacimlerin kuruması için daha fazla zaman gerekir.

Daha sonra, gece boyunca LB ortamında 0,4 ila 0,6 optik yoğunluğa kadar büyütülen 250 mikrolitre e coli suşu OP 50 ile her bir plakayı tespit edin, bakterilerin gece boyunca oda sıcaklığında kurumasına izin verin. Plakanın yaşı felç oranı üzerinde önemli bir etkiye sahiptir ve bu nedenle eski plakalar kuruma eğilimindedir. Plakalar felç testinden sonraki bir hafta içinde dökülmelidir.

İdeal olarak, herhangi bir deneyde kullanılan senkron yumurta bırakma plakalarınızdan üç ila dört gün önce dökülmüş plakaları kullanmak istersiniz, bu da çimin boyutunu değiştirerek aynı partiden gelmelidir ve/veya bakteriler de solucanların davranışını değiştirecektir. Örneğin, HT bir 15, RNAi deneylerinde kullanılır. Bununla birlikte, bu felç testinin kinetiğini değiştirebilir.

Bu nedenle, uygun olan iç kontrolleri kullanmanız gerekir Zorlanma. CL 476 en yaygın olarak betanın neden olduğu bir felci test etmek için kullanılır. Bu suş ve diğer transgenik modeller, Saint Ahadi Genetik Merkezi'nden nominal bir ücret karşılığında akademik araştırmacılara sunulmaktadır.

Test popülasyonunun yaş senkronizasyonunu en üst düzeye çıkarmak için tercih edilir. Senkronize bir ebeveyn nesli ile başlayın. Test popülasyonunun felç testine başlamadan bir hafta önce, 20 ila 30 mezar yetişkinini birkaç 10 santimetrelik NGM plakasına aktarmak için bir platin solucan toplayıcı kullanın.

OP 50 ile iki saat boyunca yayın, CL 4 1 76 için izin verilen sıcaklık olan 16 santigrat derecede yumurtlayın. GR yetişkinlerini çıkarın ve döllerin yedi gün boyunca büyümesine izin verin, bu zamana kadar ikinci gün mezar yetişkinleri olacaklar. İkinci gün yerçekimi.

Yetişkinler, her deneysel koşul için yaş senkron test popülasyonlarını hazırlamak için kullanılır. Amaç, OP 50 ile tespit edilen 60 milimetrelik NGM plakalarına günde 10 ila 12 arasında iki daha graver yetişkin olan bir platin solucan toplayıcı kullanarak 50 ila 75 yaş senkron solucan içeren üçlü plakalar oluşturmaktır. Solucanların iki saat boyunca 16 santigrat derecede yumurta bırakmasına izin verin, ardından yetişkinleri toplayın ve yumurtaların yumurtadan çıkmasına ve 16 santigrat dereceye kadar büyümesine izin verin.

Bu noktada, plakaları puanlamayacak birinin bunları kodlaması en iyisidir, böylece skor deneysel koşullara kör olacaktır. Yumurtaların bırakıldığı embriyonik gelişim aşaması, en uygun koşullar altında yabani tip solucanlar için yaklaşık 26 hücre aşaması, yetişkin yaşı ve beslenmenin bir fonksiyonudur. Yumurtlama için kullanılan yerçekimi yetişkinleri daha yaşlı veya aç kalmışsa, daha sonra aşamalı yumurtalar bırakılacak ve senkron popülasyon elde edilemeyecek, böylece felç testinin kinetiğini etkileyecektir.

E coli, OP 50 gibi monogenik bakteri kültürlerinin kullanılması önemlidir, çünkü her türlü bakteriyel kontaminasyon bu testi ciddi şekilde etkileyebilir. Üçlü plakalarınız benzer sayıda solucana sahipse tekrarlanabilirlik en yüksektir Transgeni indüklemek ve felç testini gerçekleştirmek için. Plakaları 25 santigrat dereceye yükseltin.

Senkron yumurtanın bitiminden 48 saat sonra kurt üçüncü larva aşamasında olmalıdır. Plakalar, plakaların bu sıcaklığa ulaşmasını sağlamak için 25 derecelik bir inkübatörde istiflenmeden düzenlenmelidir. Aynı zamanda, vites yükseltme başlatıldıktan 18 ila 20 saat sonra solucanların felcini puanlamaya başlayın.

Bu noktada, popülasyondaki tüm solucanlar dördüncü larva aşamasına ulaşmış olmalı, plakaların her birindeki tüm solucanlar felç olana kadar iki saatlik artışlarla puanlamaya devam etmelidir. Bilinmeyen nedenlerden dolayı, felç vücut uzunluğu boyunca bile değildir. Baş bölgesi, solucanın hareket etmeyi bırakan son kısmıdır.

Bu nedenle, yakın zamanda felç başlatan solucanlar plaka boyunca tercüme edemezler, ancak başlarını hareket ettirebilirler, böylece ön kısımlarındaki bakterileri temizler ve temizlenmiş bir bakteri halesi bırakırlar. Bu solucanlar her zaman tamamen felç olur ve bu nedenle haleli solucanlar felçli olarak nitelendirilir. Bazı solucanların haleleri olmaz, ancak kendiliğinden hareket de göstermez.

Bunlar, solucan toplayıcı ile dürtülerek test edilir. Dürtülmüş bir solucan, dürtüldükten sonra tam vücut dalgası yayılımına maruz kalamazsa, verimli puanlama için felçli olarak da puanlanır. Felçli solucanları plakanın lekelenmemiş bir sektörüne taşımak en kolay yoldur, böylece bir sonraki puanlama periyodunda istemeden yeniden puanlanmazlar.

Bu aynı zamanda yanlış kategorize edilmiş solucanların hareket göstermesine izin vererek, bir felç eğrisi oluşturmak için bir puanlama düzeltmesine izin verir. Her zaman noktasında, felç olmamış her bir plakadaki solucanların oranı bir yüzdeye dönüştürülür ve ortalama benzersiz yüzde, vites yükseltmenin başlatıldığı andan itibaren zamana karşı çizilir. Ortaya çıkan eğri resmi olarak bir sağkalım eğrisine benzer ve bu nedenle standart parametrik olmayan sağkalım istatistikleri kullanılarak analiz edilebilir.

Paralizinin başlayabilmesi için transgenik myo üç A beta solucanının vites yükseltmesi orta L dört aşamada yapılmalıdır. Myo üç destekleyicisi gelişimsel olarak düzenlenir. Solucanlar geç L dördüne veya yetişkinliğe ulaştığında, ekspresyon seviyesi önemli ölçüde azalmıştır.

Solucanlar açlıktan ölürse transgenin ekspresyonu engellenir, bu nedenle solucanların deney boyunca iyi beslenmesi çok önemlidir. Felçli bir solucanın hiçbir koşulda iyileşmesini gözlemlemedik. 12 ila 16 saatlik Vites Büyütmeden sonra, CL 41 76, vitesi 16 dereceye düşürseniz de felç olur, CL 41 76 felce neden olan transgen ekspresyonunun yukarı regülasyonu daha düşük sıcaklıklarda meydana gelebilir.

Ancak, felç oranının zamanlamasında etkileneceğini lütfen unutmayın. Felç oranı, kullanılan spesifik transgen suşuna bağlıdır. CL 41 76'dan daha hızlı ve daha yavaş felç oranına sahip myo üç A beta suşları oluşturduk ve bu nedenle, felç testi için puanlama pencerenizi buna göre ayarlamanız gerekiyor.

Burada, hem tedavi edilmemiş hem de 6.27 milimolar kafeine maruz bırakılmış CL 4 1 76 için bir felç eğrisinin bir grafiği gösterilmektedir. Bu tedavi, yaklaşık dört saatlik felçte istatistiksel olarak anlamlı bir gecikme ile sonuçlanır ve bu, bir beta toksisitesinin baskılanmasının göstergesi olarak yorumluyoruz. Bu modelde, bu deney kahvede bulunan başka bir bileşiğin etkilerini analiz etti.

Arsa, bir beta toksisitesini etkilemeyen tedaviler için tipiktir. Her iki deneyde de, tedavi edilmeyen CL 4 1 76 popülasyonlarının yaklaşık yarısının 24 saatte felç olduğunu ve felcin 28 saat içinde tamamlandığını unutmayın. Bunlar, kontrolün felç olması için tipik zaman dilimleridir.

CL 4 1 7 6 popülasyonlarının bu zamanlamadan önemli sapmaları, değişen çevresel koşulların veya transgen kopyalarının kendiliğinden silinmesinin göstergesidir. CL 4 1 76 suşu hakkında ek bilgi için ekteki protokole bakınız. Bu prosedürü denerken, plakaların yaşını, solucan popülasyonunun evresini ve solucanların felç oranını puanlama yeteneğini akılda tutmak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, beta amiloid toksisitesini dikkatli bir şekilde analiz etmek için bu deniz elgan sistemini nasıl kullanacağınız hakkında iyi bir fikre sahip olmalısınız. Çeşitli çevresel veya ilaç tedavilerinin bu toksisitesi üzerindeki oldukça ince etkileri tespit edebilmelisiniz. Bahsettiğimiz değişkenlere dikkat etmek önemlidir çünkü bu, testi çok tekrarlanabilir bir şekilde ve tutarlı bir felç kinetiği ile yapmanızı sağlayacaktır.

Laboratuvarınızda farklı zamanlarda farklı kişiler tarafından yapılan sonuçlarınızı karşılaştırmak veya sonuçlarınızı bu model sistemi kullanarak diğer araştırmacılarla karşılaştırmak istiyorsanız bu aslında oldukça önemlidir.