Nöronal Kültürler Midgastrula Sahne Drosophila Embriyolar hazırlanması

Benim adım Diana Dowd ve UC Irvine'de Gelişim ve Hücre Biyolojisi ile anatomi ve nörobiyoloji bölümünde profesörüm. Ve bugün drosophila embriyolarından primer nöronal kültürlerin hazırlanışını göstereceğim. Ve bu aslında orta gastro aşamadaki drosophila embriyosundan tüm hücrelerin çıkarılması ve bunların hücre kültürüne yerleştirilmesi anlamına geliyor.

Ve bu kültürleri kullandığımız şey, drosophila nöronları arasındaki elektriksel uyarılabilirlik ve sinaptik iletimin düzenlenmesi için önemli olan genlerin ve çevresel faktörlerin neler olduğunu gerçekten anlamak. Bu işleme başlamak için drosophila embriyolarını toplamamız gerekiyor. Bunu yapmak için yumurta toplama plakaları alıyoruz, üzerlerine biraz maya ezmesi sürüyoruz.

Yetişkin sineklerin yumurtalarını bırakmaları için uygun bir substrattır. Bu tabakları, genellikle yüz ila 200 sinek olmak üzere yetişkin sinek popülasyonu içeren şişelere koyuyoruz. Sonra sineklerin, yetişkin sineklerin yumurtalarını yaklaşık iki ila üç saat bırakmalarına izin verdik.

Daha sonra yumurta toplama plakalarını çıkarıyoruz ve bunlar Kültür işlemi için kullandığımız embriyolar. Prosedürdeki bir sonraki adım, embriyoları aralıkta kaplamaktır ve bu, aslında corion'u çıkardığımız anlamına gelir. Bunu, embriyoları yakalamak için üzerinde bir parça filtre kağıdımız olan bir Buechner hunisine yıkayarak yapıyoruz.

Buchner hunisinde% 50 çamaşır suyu çözeltisinde oturmalarına izin veriyoruz. Bu %50'lik ağartma solüsyonu sadece corion'u çözmekle kalmaz, aynı zamanda sterilizasyon prosedürümüzün bir parçası olarak da hizmet eder. Bu işlemi aslında kaputun içinde değil, kaputun dışında yapıyoruz, bu yüzden embriyolar, klorsuzlaştırıldıktan sonra, onları bir Petri kabına yıkıyoruz.

Aslında, Corian gittiğinde, viel zarı oldukça yapışkandır ve bir Petri kabına güzel bir şekilde yapışır. Daha sonra üzerlerine damıtılmış su dökebilir ve damıtılmış suyu iki veya üç kez çıkarabilir ve aslında sadece suyu atabilirsiniz ve embriyolar Petri kabına yapışacaktır. Doku kültürü plastik kabı kullanmayın.

Buna bağlı kalmıyorlar. İşlemin steril kısmına, embriyoların Petri Kaplarını alıp laminer akış başlığına alarak başlıyoruz. Bunlar bellco kapak fişleridir.

Kaplamasızlar, ancak otoklavlandılar ve yıkanmadılar. Çok iyi çalışmadıklarını görüyoruz. Yıkandıklarında, genellikle dört kapak fişi çıkarırız ve bunları tek bir Petri kabına koyarız.

Bu yüzden her bir Petri kabında dört embriyo kültürü yapacağız. Tamam, bu Petri kabı temelde kültürlemeye başlamamız için hazır ve ben genellikle 12 kültür, bir seferde 12 ila 16 kültür yapıyorum. Tamam? Kullandığımız kültür ortamı nispeten basit tanımlanmış bir ortamdır.

Bu ADM-E-M bazıdır ve bu sıvı ortamı iki haftada bir yapıyoruz, böylece buzdolabında iki hafta boyunca iyi kalır. Bu sterilize edildi. 0.2 mikronluk steril bir filtreden geçirildi ve daha sonra ortama beş takviye ekliyoruz.

Her iki ayda bir hazırlanırlar ve daha sonra 10 mil sıvı ortama eklenen alikotlarda dondurulurlar. Bu yüzden sadece içeriği kaldırıyoruz. Sonuncusu, o zaman bu sadece, karıştırmak için bu medyayı nazikçe ters çeviriyoruz ve gitmeye hazırız. Tamam.

Her şey ayarlandı. Hazır olan kültür kabım var, o ya da içinde dört kapak fişi olan Petri kabım hazır. Ve şimdi embriyolarla olan yemeğimi alacağım ve yapacağım, şimdi damıtılmış suda oturuyorlar.

Damıtılmış suyu sadece silkeleyerek çıkaracağım. Çöp tenekesine böyle yapıyorum. Ve şimdi bu embriyoların üzerine yaklaşık iki değirmen besiyeri dökeceğim, ve şimdi benim için cam iğneyi tek tek embriyolara sokmak ve içindekileri çıkarmak için hazırlar.

Medyanın dışarıda olması gerekiyor. Açıkçası orada su olsaydı, o zaman ozmotik şok yaşardınız. Şimdi, embriyonun içeriğini çıkarmadan hemen önce kültürleri hazırlamaya hazırlanmak için, aslında beş mikrolitrelik damlayı kapak fişlerinin üzerine koyuyorum.

Çok uzun süre bırakırsanız, ortamın pH'ı değişir. Tamam, şimdi dört kapak fişinin her birinin ortasına beş mikrolitrelik bir damla koyacağım. Bu damlaların olabildiğince sağlam kalması aslında önemlidir.

Ortam kapak kaymasının her tarafına yayılırsa, hücreler bazılarına kaplanır, çok ince bir sıvı tabakası zordur. Hücreleri güzel bir yuvarlak sıvı damlasına yerleştirmelerini istiyorsunuz. Orada gördüğünüz gibi, gitmeye hazır dört güzel yuvarlak sıvı damlamız var.

Ve şimdi çektiğim pipetlerden birini alacağım ve sonra onu bu ağız pipet tüpüne takacağım. İstediğiniz herhangi bir tüpü kullanabilirsiniz, ancak bu tüple ilgili iyi olan şey, aslında VWR boru kalibrasyonlu 100 mikrolitrelik pipetlerle birlikte gelmesidir. Ve bunların içinde, küçük bir lastik conta var.

Pipetleyicinin bu ucuna ağız pipetini, yani cam pipeti yerleştirebilirim. Ve sonra embriyonun içeriğini emdiğimde, bundan daha fazla yukarı çıkmayacağım, daralmaya başladığı bölgeye. Burada fare emişini kullanmamı ve hücrelerin olduğu yeri ayıran çok büyük bir alan var.

Yani yok, kirlenme ile ilgili bir sorun yok. İçeriği yanlışlıkla bu alana çekerseniz, o zaman büyük kontaminasyon sorunları yaşarsınız. Laminer akış davlumbazlarımızda skopik olarak çalışan Diseksiyon mikroskoplarımız bulunmaktadır.

Bu, ışığın embriyonun altından içeri girmesine izin verir ve bu da gerçek embriyolara baktığımızda göreceğiniz sefalik karıkları, orta bağırsağı ve hayal gücünü görmemizi sağlar. Ve bu, embriyonun içeriğini çıkarmak için kültür için önemli olan embriyonun aşamasını nasıl seçtiğimizdir. Cam pipetler kullanıyoruz, yama kayıt pipetlerimizi yapmak için kullandığımız normal bir mikro elektrot çektirmesini çekiyoruz.

Ayarların ne olduğu gerçekten umurumuzda değil. Oldukça ince pipetler çekiyoruz çünkü embriyonun yanındaki tabakta gerçekten istediğimiz boyutta pipeti kıracağız. Daha sonra bu cam pipetleri alıyoruz, bunları embriyonun viel zarından geçiriyoruz ve pipetin arkasına bağlı bir ağız emme tüpü kullanıyoruz.

Daha sonra tüm embriyonun içeriğini çıkarıyoruz. Daha sonra onu hareket ettiriyoruz, alıyoruz, pipeti çıkarıyoruz ve beş mikrolitrelik bir medya damlası ile kapak fişi olan başka bir tabağa geçiyoruz. Ve embriyonun içeriğini bu beş mikrolitrelik damlanın içine atıyoruz.

Hücreleri dağıtmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetledik ve ardından tabağı iki değirmen ortamla doldurmadan önce bu kapağın yaklaşık 10 dakika tabakta oturmasına izin verdik. Hücrelerin tabakları Kaplandıktan sonra %5'lik bir CO2 inkübatöre konur. Bu çok önemlidir çünkü kullandığımız ortam bikarbonat tamponlu bir ortamdır.

Orada bazı HEP'lerimiz var, ancak hava ortamında tamponlamak için yeterli değil. Ve bu yüzden %5 CO2 inkübatörü kullanmanız gerekiyor. Bununla birlikte, 22 ila 23 derece civarında nispeten düşük bir sıcaklıkta olması idealdir.

Bu yüzden memeli kültürlerinden kullanılacak standart bir CO2 inkübatörü alıyoruz ve 37 dereceye kadar ısıtıyoruz. Yaptığımız şey ısıtıcıyı kapatmak, laboratuvarımızda oturtmak ve kuluçka makinesinin dibine buz koyabilmek, ve bu da sıcaklığı 21 ila 25 derece arasında tutmak. Kullandığımız diğer teknik, yine bu standart ısıtma CO2 inkübatörlerinden birini alıyoruz ve inkübatörü soğuk bir odaya koyuyoruz.

Daha sonra, ortam sıcaklığı soğuk oda sıcaklığındaysa, inkübatörü oldukça etkili bir şekilde 23 dereceye kadar ısıtabilirsiniz. Ve işte bunlar, standart bir mühüre sahip olmak için kullandığımız iki yöntem, memeli mührünü kuluçka makinesine dönüştürmek ve hayatta kalmamıza izin vermek. Pekala, bu, kaplamadan bir saat sonra kaplamadan hemen sonra gördüğümüz aynı büyütme oranında bir saat önce kaplanan bir Kültür.

Burada yaklaşık iki gündür farklılaşmış nöronları görüyoruz. Kültürde, nöroblast bir veya daha fazla kez bölünür ve daha sonra nöronlara yol açar, bu da geniş örtüşen nevrotik ağlar oluşturan süreçleri genişletir. Burada kafa kafaya olan iki hücre bedenimiz var.

Üstteki saat 11 pozisyonunda bir işlemi uzatıyor ve alttaki saat beş pozisyonunda bir işlemi uzatıyor. Bunlar onların ana uzantılarıdır. Ve sonra daha ince dallar oluşturduklarını görebilirsiniz.

Bunlar cam alt tabakaya çok sıkı bir şekilde yapışıyor ve diğer hücrelerden gelen ve bunlarla örtüşen süreçler de görebileceğiniz süreçler var. Ve bunlar potansiyel sinaptik bağlantı bölgeleridir. Bu hücrelerden birine yama yapardık ve genel olarak, bu düzeyde bir süreç detaylandırmasıyla, sinaptik fonksiyonel sinaptik akımlara sahip olurlar.

Şimdi hücrelerimiz kaplamadan 12 saat sonra kültürde büyüyor. Oldukça güzel süreçleri uzatmış olacaklar. Standart fizyolojimizi, kültürlemeden sonra yaklaşık bir ila iki tane yapmaya başlıyoruz.

Ve gördüğünüz gibi, önümüzdeki dört ya da beş gün boyunca süreçleri büyütmeye devam ediyorlar. Ve kültürde iki haftaya kadar hücrelerden kayıt yaptık, ancak kayıtlarımızın çoğu bu kültürlerle kültürde iki ila altı gün arasında, o zaman orta gastro evre drosophila embriyolarından yeni hazırladık, kültürde iletişim kuran nöron ağlarımız var. Aslında bu hücrelerin ateşleme özelliklerine bakabiliyoruz.

Çeşitli ateşleme özelliklerine sahiptirler. Tekrarlayıcı olarak ateşlenirler, bazı hücreler tekrar tekrar ateşlenir, diğer hücreler doğumda ateşlenir ve bu hücreler esas olarak kolinerjik veya GABAerjiktir. Ve bunların aracılık ettiği sinaptik akımlara bakabiliriz, nikotinik, Aach, H reseptörleri ve GABA reseptörleri.