İyon Kanalları incelenmesi için yama Kelepçe ve Perfüzyon Teknikleri cinsinden ifade edilir Xenopus Oosit

Bu prosedürün genel amacı, hücre içi çözeltiyi kontrol altında tutarken, kontrollü voltaj altında BK kanalı aktivasyonunu kaydetmektir. Bu işlem, öncelikle Xenopus hücrelerine BK kanalı mRNA'sı enjekte edilerek BK kanallarının eksprese edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise perfüzyon sisteminin hazırlanmasıdır.

Prosedürün üçüncü adımı, oosit membranı ile patch pipet arasında bir giga sızdırmazlık (giga seal) oluşturmaktır. Prosedürün son adımı ise membran yamasının kesilip çıkarılmasıdır. Nihayetinde, bir perfüzyon sistemi ile birleştirilmiş patch clamp teknolojisi kullanılarak elde edilen sonuçlar, BK kanallarının voltaj ve kalsiyum konsantrasyonundaki değişikliklerle aktive olduğunu göstermektedir.

Merhaba, ben Washington Üniversitesi'ndeki Dr. Jamie Zus laboratuvarından Jin Cho Young. Bu yöntem, iyon kanalı aktivasyonunun moleküler mekanizmasıyla ilgili sorular da dahil olmak üzere, nörobilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Öyleyse başlayalım.

Prosedürün ilk adımı, patch clamping işleminden birkaç gün önce başlar ve in vitro olarak transkribe edilmiş BK kanalı mRNA'sını kullanır. Xenopus Lavu Cytes evre beş veya altı toplandıktan sonra, bir oocyte içine 0,05 ile 50 nanogram arasında BK kanalı mRNA'sı enjekte edin. Enjeksiyon için nano inject two auto nanoliter enjektör kullanın.

Enjeksiyondan sonra, her bir mRNA için bir düzine oosit üzerinde enjeksiyon işlemini tekrarlayın. Oositleri ND 96 çözeltisi kullanarak iki kez durulayın. Ardından oositleri bir kültür plağına yerleştirin ve oositlerin BK kanalını eksprese etmeleri için iki veya daha fazla gün boyunca 18 degrees Celsius sıcaklıkta inkübe edin.

İki ila beş günlük inkübasyonun ardından, oositlerin BK kanallarını eksprese etmesi beklenir ve böylece patch clamp işlemi için hazır hale gelirler. Oositlerle çalışmaya başlamadan önce, perfüzyon sistemiyle başlayarak patch clamp için ihtiyaç duyacağınız diğer tüm düzenekleri kurun. Burada gösterilen sistem automate valve link sistemidir.

Basınçlı nitrojen, profüzyon çözeltilerini çözelti rezervuarlarından profüzyon tüplerine, oradan da profüzyon kalemine ve ucuna doğru iter. Her bir profüzyon çözeltisi akışının debisi, bir rezervuar valfi ve bir elektronik valf tarafından kontrol edilir. Bu protokolde, rezervuarlardan biri basınçlandırılmamıştır ve hem bir atık toplayıcı hem de bir basınç tahliye mekanizması olarak işlev görür.

Deneylerden önce farklı kalsiyum veya magnezyum konsantrasyonlarına sahip perfüzyon çözeltileri hazırlanabilir. Perfüzyon çözeltilerini rezervuarlara ekleyin ve her birini kalsiyum veya magnezyum konsantrasyonunu belirtecek şekilde etiketleyin. Perfüzyon sistemini kurmak için öncelikle tüpleri perfüzyon kalemine bağlayın.

Ardından, boruların ve profüzyon kaleminin tıkanıklıklardan ve hava kabarcıklarından arındırıldığından emin olmak için elektronik valf kontrolörünü açın ve elektronik valfleri açın. Deiyonize su ile doldurulmuş bir şırınga kullanarak her bir borudan deiyonize su itin. Bu aşamada, boruları çözelti rezervuarlarına bağlayın ve basınçlı azot uygulamak için gaz silindirinin valfini açın.

Hortumu rezervuar çözeltilerinden biriyle doldurmak için rezervuar valflerinden birini açın. Gerekirse, çözeltideki kabarcıkları gidermek için rezervuar valfine tıklayın. Hortum çözeltiyle dolduktan sonra rezervuar valfini kapatın, perfüzyon ucunu suyla doldurun ve perfüzyon kaleminin üzerine vidalayın.

Hava kabarcığı kalmamasına dikkat edin. Ucu bağlarken, perfüzyon kalemini modelleme kili kullanarak banyo tablasına sabitleyin ve perfüzyon ucunun banyo alanında olduğundan emin olun. Perfüzyon sistemi şu an kurulmuş durumdadır.

Bu aşamada, banyoya deiyonize su ekleyin. Perfüzyon ucunun suyun içinde olduğundan emin olun. Her bir perfüzyon solüsyonunun perfüzyon ucundan doğru şekilde çıktığını test edin.

Atık toplayıcının hortumuna bağlı elektronik vanayı kapatın ve perfüzyon solüsyonlarından birinin vanasını açın. Mikroskop altında, perfüzyon ucundan çıkan perfüzyon sıvısı jetini gözlemleyin. Söz konusu perfüzyon solüsyonunun vanasını kapatın ve atık toplayıcının vanasını açın.

Perfüzyon jeti neredeyse kaybolmalıdır. Aynı testi her bir perfüzyon çözeltisi için tekrarlayın. Tüm perfüzyon çözeltilerinin doğru şekilde aktığını doğruladığınızda, banyodaki deiyonize suyu istenen banyo çözeltisiyle değiştirin.

Şimdi kayıt düzeneğini kurma zamanı. Her patch clamping oturumundan önce gümüş kayıt elektrodunu gümüş klorür ile yeniden kaplamalısınız. İlk olarak, elektrot telini pipet tutucudan çıkarın ve elektrot telinin uç kısmını taze çamaşır suyu içeren bir şişeye en az 15 dakika boyunca daldırın.

Bu işlem, tel üzerinde bir gümüş klorür tabakası oluşturur. Elektrot telini deiyonize su ile durulayın ve kurulayın. Ardından, gümüş gümüş klorür elektrodunu tekrar pipet tutucuya yerleştirin.

Şimdi bilgisayarınızı açın. Donanım anahtarını bilgisayarınızın yazıcı portuna takın. HEA pulse adlı veri toplama yazılımını kullanabilmeniz için donanım anahtarının takılı olması gerekir.

Amplifikatörü açın ve veri toplama yazılımını başlatın. HEA pulse. Protokol dosyasını yükleyin ve stimülasyon ölçeği gibi konfigürasyon ayarlarını düzenleyin.

Yapılandırma ayarlarını düzenlemenin amacı, test potansiyelinin komut potansiyeline tam olarak eşit olmasını sağlamaktır. Artık oositleri hazırlamaya hazırız. Oositleri inkübatörden çıkarın.

Oositi beş ila 10 dakika boyunca sıyırma solüsyonunda bekletin. Sıyırma solüsyonu, vitellin membranını plazma membranından ayırarak vitellin membranının sıyırılmasını mümkün kılar. Beş ila 10 dakika sonra, vitellin membranını oositten nazikçe sıyırın.

İki adet pens kullanın. Divi oosit bölgesi son derece hassastır ve bu nedenle mümkün olduğunca az hareket ettirilmelidir. Divi oositin havaya veya kabarcıklara maruz kalmasını önlemeye dikkat ederek, oositi banyoya aktarmak için yeterli miktarda solüsyonla doldurulmuş bir cam pipet kullanın.

Oosit membranındaki kanallar artık açık ve patch pipet için hazırdır. Bir cam kapiler tüpü mikro pipet çekiciye yerleştirerek bir patch pipet çekin. Uç şeklini ve açıklık çapını belirlemek için pipetleri mikroskop altında inceleyin.

Kayıt sırasında kapasitif akımı azaltmak için açıklık çapı iki ila dört mikrometre olmalıdır; pürüzsüz bir uç elde etmek için ucu balmumu ile kaplayıp ardından ısıtın. Mikroskop altında cilalayın. Pipet ucunu, pipetin ucunu pipet solüsyonunun içine yerleştirip pistonu geri çekerek doldurun.

Bu işlem pipet ucunu ıslatır. Ardından, pipetin üçte birini bir şırınga yardımıyla pipet çözeltisi ile doldurun. Sonra, içinde gümüş, gümüş klorür elektrot bulunan pipeti pipet tutucuya yerleştirin.

Tel elektrodun pipet çözeltisiyle temas ettiğinden emin olun. Bir sonraki adım, hazırlanan oositinden ters yüz edilmiş (inside-out) bir yama kesip almaktır. Öncelikle, mikroskop altında oositin net kenarını bulun.

Manipülatörü kullanarak, patch pipetini oositin yakınına getirin ve tamamen daldırıldığından emin olun. Banyo solüsyonu içerisinde, pipetin seri direncini kaydedin. Pipet solüsyonu ile doldurulmuş ve banyo solüsyonuna daldırılmış patch pipetinin ideal seri direnci 1 ile 1.5 milli ohm arasındadır.

Şimdi, direnci yaklaşık iki katına çıkana kadar pipeti yavaşça oosit üzerine itin. Pipet tutucuya bağlı bir vakum tüpü aracılığıyla ağızla hafif vakum uygulayarak giga ohm sızdırmazlık sağlayın. Giga sızdırmazlığın oluştuğunu onayladıktan sonra, yamayı birkaç dakika boyunca minus 30 millivolt değerinde tutarak stabilize edin.

Tersyüz edilmiş (inside-out) bir yama elde etmek için, pipeti hızlıca OO bölgesine doğru daha ileri itip ardından nazikçe geri çekerek yamayı kesin. Tersyüz edilmiş yama artık yama kenetleme (patch clamping) işlemi için hazırdır. Tersyüz edilmiş yamayı tutan pipeti, perfüzyon ucunun açıklığından yaklaşık 100 mikron uzağa taşıyın.

Atık toplama için elektronik valfi kapatın ve istenen profüzyon çözeltisi için rezervuar valfini açın. Yama üzerindeki akımları kaydetmeye başlayın. Voltajı ve profüzyon çözeltilerini isteğe göre değiştirin.

Kayıt işlemi tamamlandığında, tıkanmaları önlemek için deiyonize su geçirerek perfüzyon tüplerini ve ucunu temizleyin. Burada elde edilen patch clamp kayıtları, oosit membran patch'indeki vahşi tip BK kanallarının hem voltaja hem de kalsiyuma yanıt verdiğini göstermektedir. Bu şekil, perfüzyon solüsyonunda nominal sıfır kalsiyum içeren bir patch kaydını göstermektedir.

Akım izlerinin üzerindeki kare dalgalar, patch'e uygulanan voltajı göstermektedir. 50 millivolt'tan 200 millivolt'a kadar, 50 millivolt'luk artışlarla dört farklı voltaj uygulanmıştır. Yaklaşık iki nano amp olan maksimum akım, 200 millivolt'luk maksimum voltaj ile elde edilmiştir.

Gerilim artışıyla birlikte akım genliğinde meydana gelen bu artış, BK kanallarının açık olma olasılığının gerilimle birlikte arttığını göstermiştir. Bu şekil, içeri-dışarı (inside out) yamayı farklı gerilimlere karşı verdiği yanıtı göstermektedir. Perfüzyon solüsyonunda bir mikromolar kalsiyum varken, gerilim basamakları uygulanmıştır.

Önceki şekilde olduğu gibi, 200 millivolt voltaj basamağına verilen yanıtta, Perfu sekiz içerisinde kalsiyum bulunduğunda üst yanıt, kalsiyum bulunmadığı durumdaki iki nano amps değerine kıyasla yaklaşık üç nano amps değerine yükselmiştir. Bu durum, BK kanallarının açık olma olasılığının kalsiyum varlığında arttığını göstermektedir. Özetle, bu patch clamping prosedürü, BK kanallarının voltaj ve kalsiyum bağımlı olduğunu ortaya koymuştur.

Bu videoyu izledikten sonra, pro yakıt sistemi ile birleştirilmiş patch clamp tekniğini kullanarak Demir Kanalı aktivasyonunun nasıl kaydedileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.