Name: İyon Kanalları incelenmesi için yama Kelepçe ve Perfüzyon Teknikleri cinsinden ifade edilir Xenopus Oosit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-10T18:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Öğrenin BK kanallarının aktivasyonunu yama kelepçe ve perfüzyon teknikleriyle Xenopus oositlerinde nasıl kaydedilir. Bu yöntem iyon kanalı davranışlarını incelemek için kullanılabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Sağlık hibe, R01-HL70393 ve R01-NS060706 JCJC için Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen Biyomedikal Mühendisliği profesörü Spencer T. Olin Endowment.

1. Oosit içine mRNA enjeksiyon <ol><li> Enjekte 0.05 - 50 ng mesajcı RNA Nanoject II Auto-Nanoliter Enjektör (Drummond Bilimsel Şirket, modeli 3-000-204) kullanarak Xenopus laevis oosit (Evre V-VI), in vitro transkripsiyonu da yapılmıştır . Her mRNA için bir düzine oosit enjeksiyon tekrarlayın. </li><li> Iki kez kullanarak enjekte oosit durulayın ND-96 solüsyonu (96 mM sodyum klorür (NaCl, Bay 58,44 g / mol), 2 mM potasyum klorür (KCl, Bay 74,56 g / mol), 1.8 mM kalsiyum klorür (CaCl 2 • 2H 2 O , Bay 147,02), 1 mM magnezyum klorür (MgCl 2 • 6H 2 O, Bay 203,31 g / mol), 5 mM 4 - (2-hidroksietil)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES, Bay 238,31 g / mol), 2.5 mM sodyum piruvat (Bay 110,04 g / mol), 1x Penisilin-Streptomisin pH 7.6), daha sonra 18 yaşında bir kültür plaka ve inkübe koyun ° C 2 + gün. </li></ol> 2. Perfüzyon Sistemi hazırlanması <img src="/files/ftp_upload/2269/2269fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> İllüstrasyon otomatikleştirin ValveLink 16 perfüzyon sistemi. Perfüzyon sistemi perfüzyon borulama ile perfüzyon çözümler, çözüm rezervuarların dışarı itmek için basınçlı azot kullanır ve perfüzyon kalem ve ucu. Perfüzyon çözüm her akarsuyun akış biri rezervuar valfi ve bir elektronik vana ile kontrol edilir. Bu protokol, rezervuarların bir atık toplayıcı yanı sıra bir basınç serbest bırakma mekanizması gibi basınçlı ve işlevleri değildir. (Resim üreticisinin web sitesine http://www.autom8.com adapte) <ol><li> Borulama perfüzyon kalem bağlayın. Elektronik supap kontrol açın ve elektronik vanalarının açık. </li><li> Deiyonize su ile dolu bir şırınga kullanarak her bir tüp yoluyla deiyonize (DI) su itme, borulama ve perfüzyon kalem yapışmasına neden olabilir ve hava kabarcıkları serbest olduğu sağlamak için. </li><li> Çözüm rezervuarları borulama bağlayın ve basınçlı azot uygulamak için silindir gaz valfi açık. </li><li> Rezervuar çözüm tüp doldurmak için rezervuar vanasını açın. Gerekirse çözüm kabarcıkları rezervuar valf Flick. Hortumun çözümü ile doldurulduktan sonra vanasını kapatın. </li><li> Perfüzyon ucunu su ile doldurun ve perfüzyon kalem üzerine vida. Ucu bağlarken herhangi bir kabarcıklar yakalamak için dikkatli olun. </li><li> Modelleme kil ile banyo aşamasına perfüzyon kalem sabitleyin. Perfüzyon ucu banyo alanı içinde olduğundan emin olun. Perfüzyon sistemi artık ayarlandı. </li><li> Banyo DI su ekleyin. Perfüzyon ucu suya batmış olduğundan emin olun. </li><li> Her perfüzyon çözüm perfüzyon ucu doğru geldiğini sınayın. Atık kolektör boru bağlı elektronik vanasını kapatın ve bir seferde bir perfüzyon çözeltisi (140 mM potasyum hidroksit (KOH, valfi açık M r 56.1 g / mol), 20 mM 4 - (2-hidroksi) -1 - piperazineethanesulfonic asit (Hepes, M r 238,31 g / mol), 2 mM potasyum klorür (KCl, M r 74,56 g / mol), 1 mM Etilen glikol-bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'- tetraasetik asit (EGTA, M r 380,35 g / mol), pH metansülfonik asit (MESO 3, M r 96.1 g / mol), Ca 2 7,1-7,2 'e ayarlanır + veya Mg2 + gerektiğinde) istenilen konsantrasyona eklenir . Mikroskop altında, perfüzyon ucu çıkan perfüzyon sıvısına jet gözlemliyoruz. Perfüzyon çözümü için vanayı kapatın ve atık toplayıcı valfi açık. Perfüzyon jet hemen hemen kaybolur. Perfüzyon tüm çözümler için aynı test tekrarlayın. </li><li> Doğru tüm perfüzyon çözümler akış kontrol ettikten sonra, banyo solüsyonu ile banyo (140 mM potasyum hidroksit (KOH, DI su yerine M r 56.1 g / mol), 20 mM 4 - (2-hidroksietil)-1-piperazineethanesulfonic asit (Hepes, M r 238,31 g / mol), 2 mM potasyum klorür (KCl, M r 74,56 g / mol), pH 7,1-7,2 metansülfonik asit (MESO 3, M r 96.1 g / mol)) tarafından ayarlanır. </li></ol> 3. Patch Sıkma <ol><li> İkinci kat uygulama, AgCl Ag kayıt elektrot her yama oturumda sıkma önce. Birincisi, pipet tutucu ve batığın en az 15 dakika süreyle taze çamaşır suyu içeren bir şişe elektrot teli ucu yarım elektrot teli çıkarın. Bu mevduat tel AgCl bir katman. </li><li> Elektrot teli deiyonize su ile çalkalayın ve kuru kurulayın. Sonra pipet tutucu Ag / AgCl elektrot geri yükleyin. </li><li> Headstage, banyo (referans) elektrodu bağlayın ve banyo yerleştirin. Bu kayıt için elektrotlar hazırlar. </li><li> Şimdi veri toplama için hazırlar. Bilgisayarınızı açın ve donanım anahtarı bilgisayarınızın yazıcı bağlantı noktasına takın. Heka darbe veri toplama yazılımı kullanmak için donanım anahtarı takılı olmalıdır. </li><li> Amplifikatör açın (Axon Instruments, AXOYAMA 200B) ve başlangıç ​​Heka Darbe. Stimulus Ölçek olarak, protokol dosya yükleyin ve yapılandırma ayarları. Yapılandırma ayarlarını ayarlamak için hedef test potansiyeli komut potansiyeli tam olarak eşit olduğunu güvence altına almak. Bu veri toplama ekipmanları hazırlar. </li><li> Oosit hazırlayın. Batmak sıyırma çözüm oosit (200 mM N-metil D-glucamine (NMG, M r 195,22 g / mol), 200 mM Aspartat (ve K +) (M r 133,1 g / mol), 2 mM potasyum klorür (KCl , M r 74,56 g / mol), 10 mM Etilen glikol-bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'-tetraasetik asit (EGTA M r 380,35 g / mol), 1 mM magnezyum klorür (MgCl 2 • 6H 2 O, M r 203,31 g / mol), 10 mM 4 - (2-hidroksi)-1-piperazineethanesulfonic asit (Hepes, M r 238,31 g / mol), pH, sodyum hidroksit (NaOH, 7.4 'e ayarlanır . 5 M r 40.0 g / mol) - 10 dakika vitellin membran şerit mümkün kılan plazma membran sıyırma çözüm vitellin zar ayırır. </li><li> Yavaşça, forseps, iki çift kullanarak oosit vitellin membran şerit. Devitellinized oosit az gerektiğinde son derece hassastır ve bu nedenle hareket ettirilmelidir. </li><li> Hava veya kabarcıklar devitellinized oosit dökülmesini önlemek için bakımı, banyo oosit transfer için yeterli bir çözüm ile dolu bir cam pipet kullanın. Bu kayıt için oosit hazırlar. </li><li> Yama pipetler hazırlayın. Sutter P-97 Flaming / Brown Mikropipet Çektirme içine bir cam kapiller tüp (VWR International, Kedi # 53.432-921) taktıktan sonra cam pipetler çekin. Ucu şeklini ve açılış çapı belirlemek için mikroskop altında pipetler dikkat edin. Açılış çapı 2-4 mikrometre olmalıdır. </li><li> Kapasitif akım kayıt sırasında azaltmak için düzgün bir ucu, mont, balmumu ile ucu sağlamak ve daha sonra yangın lehçe. </li><li> Pipet pipet ucu (2-hidroksi)-1-piperazineethanesulfonic asit (Hepes M r - pipet çözüm (140 mM potasyum hidroksit (KOH, M r 56.1 g / mol), 20 mM 4 içine koyarak doldurun 238,31 g / mol), 2 mM potasyum klorür (KCl, M r 74,56 g / mol), 2 mM magnezyum klorür (MgCl 2 • 6H 2 O, K r 203,31 g / mol), pH 7,1-7,2 için metansülfonik tarafından ayarlanır. asit (MESO 3, M r 96.1 g / mol)) ve piston çizimi. Bu ucu ıslatır. </li><li> Bir şırınga kullanarak pipet çözüm ile pipet tam 1 / 3 doldurun ve Ag / AgCl elektrot iç ve pipet çözüm ile temas pipetle tutucu pipet yerleştirmek. Bu yama pipet hazırlamaktadır. </li><li> Iç-dış yama hazırlanan oosit tüketim için, mikroskop altında yumurtanın açık kenarında bulabilirsiniz. Manipülatör kullanarak oosit yakın yama pipet hareket ettirin. Pipet seri direnç kaydedin. Ideal bir seri direnç yama pipet, pipet çözüm ile dolu ve banyo çözüm batmış M 1-1.5 arasında. </li><li> Direnci yaklaşık iki katına kadar oosit karşı pipet yavaşça itin. </li><li> Giga-ohm mühür elde edilinceye kadar pipet sahibine bağlı olan bir emme borusu yoluyla, ağız yoluyla membran nazik vakum uygulayın. Birkaç dakika için gerilim -30 mV tutarak yama sabitleyin. </li><li> Tersyüz olmuş bir yama, tüketim hızla oosit pipet içine daha fazla bastırıyor ve sonra yavaşça çekip yama elde etmek için. </li><li> Iç-dış yama şimdi sıkma için hazırdır. Iç-dış yama tutarak perfüzyon ucunun açılması uzaklıkta yaklaşık 100 mikron pipet hareket ettirin. </li><li> Elektronik atık toplamak için vanasını kapatın ve istenen perfüzyon çözümü için rezervuar valfi açık </li><li> Akımları karşısında yama kaydetmeye başlarsınız. Gerilim ve perfüzyon çözümleri istediğiniz gibi değiştirin. </li><li> Kayıt bittiğinde, takunya önlemek için deiyonize su ile iterek perfüzyon borulama, kalem ve bahşiş temizleyin. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Yama kelepçe için oosit hazırlanması sırasında, sıyırma çözüm 5-10 dakikalık tedavi vitellin vitellin membran sıyırma mümkün kılan plazma membranı, membran ayırma. Ideal bir seri direnç yama pipet, pipet çözüm ile dolu ve banyo çözüm batmış M 1-1.5 arasında. Aşağıda bir oosit membran yama yabani tip BK kanalları bir temsilci kayıt. 50 mV 50 mV artış ile 200 mV gerilim artar, ikinci adımda sol üst kare dalgalar, yama uygulanan gerilim gösterir. Aşağıda perfüzyon çözüm, nominal 0 Ca 2 + (ücretsiz [Ca 2 +] yaklaşık 0.5 nM) ilgili güncel izleri. IçindeBK kanalları açık olasılık geçerli genliği kırışıklık gerilimi ile arttığını gösterir. Sağ tarafta, aynı yama 1.0 mcM Ca 2 ile perfüze + aynı gerilim protokolü ile uygulanır. Geçerli genliği açık olasılık [Ca 2 +] ile arttığını belirterek, aynı gerilim altında daha fazla artar. <img src="/files/ftp_upload/2269/2269fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2">

<ol><li>Methfessel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+measurements+on+Xenopus+laevis+oocytes%3A+currents+through+endogenous+channels+and+implanted+acetylcholine+receptor+and+sodium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Arch%22%5BJournal%5D)">Patch clamp measurements on Xenopus laevis oocytes: currents through endogenous channels and implanted acetylcholine receptor and sodium channels.</a> Pflügers Arch. 407, 577-588 (1986).</li>
<li>Toro, L., Wallner, M., Meera, P., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maxi-K+%28Ca%29%2C+Unique+Member+of+the+Voltage-Gated+K+Channel+Superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22News+Physiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Maxi-K (Ca), Unique Member of the Voltage-Gated K Channel Superfamily.</a> News Physiol. Sci. 13, 112-117 (1998).</li>
<li>Fettiplace, R., Fuchs, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+hair+cell+tuning%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of hair cell tuning.</a> Annu. Rev. Physiol. 61, 809-834 (1999).</li>
<li>Du, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-sensitive+potassium+channelopathy+in+human+epilepsy+and+paroxysmal+movement+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Calcium-sensitive potassium channelopathy in human epilepsy and paroxysmal movement disorder.</a> Nat. Genet. 37, 733-738 (2005).</li>
<li>Ledoux, J., Werner, M. E., Brayden, J. E., Nelson, M. T., T, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-activated+potassium+channels+and+the+regulation+of+vascular+tone%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Calcium-activated potassium channels and the regulation of vascular tone.</a> Physiology (Bethesda). 21, 69-78 (2006).</li>
<li>Salkoff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-conductance+potassium+channels+of+the+SLO+family%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">High-conductance potassium channels of the SLO family.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 921-931 (2006).</li>
<li>Shi, J., Cui, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Mg2%2B+enhances+the+function+of+BK-type+Ca2%2B-activated+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular Mg2+ enhances the function of BK-type Ca2+-activated K+ channels.</a> J. Gen. Physiol. 118, 589-606 (2001).</li>
<li>Magleby, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+mechanism+of+BK+%28Slo1%29+channels%3A+so+near%2C+yet+so+far%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gating mechanism of BK (Slo1) channels: so near, yet so far.</a> J. Gen. Physiol. 121, 81-96 (2003).</li>
<li>Latorre, R., Brauchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+conductance+Ca2%2B-activated+K%2B+%28BK%29+channel%3A+activation+by+Ca2%2B+and+voltage%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Res%22%5BJournal%5D)">Large conductance Ca2+-activated K+ (BK) channel: activation by Ca2+ and voltage.</a> Biol. Res. 39, 385-401 (2006).</li>
<li>Cox, D. H., Cui, J., Aldrich, R. W., W, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+gating+of+a+large+conductance+Ca-activated+K%2B+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Allosteric gating of a large conductance Ca-activated K+ channel.</a> J. Gen. Physiol. 110, 257-281 (1997).</li>
<li>Cui, J., Aldrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+linkage+between+voltage+and+Ca2%2B-dependent+activation+of+BK-type+mslo1%5BTitle%5D)+AND+%22K%2B+channels.+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Allosteric linkage between voltage and Ca2+-dependent activation of BK-type mslo1.</a> K+ channels. Biochemistry. 39, 15612-15619 (2000).</li>
<li>Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Slo1+BK+channels+by+Mg2%2B+coordinated+between+the+voltage+sensor+and+RCK1%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Activation of Slo1 BK channels by Mg2+ coordinated between the voltage sensor and RCK1.</a> 15, 1152-1159 (2008).</li>
<li>Lee, U. S., Cui, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%7Bbeta%7D+subunit-specific+modulations+of+BK+channel+function+by+a+mutation+associated+with+epilepsy+and+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">{beta} subunit-specific modulations of BK channel function by a mutation associated with epilepsy and dyskinesia.</a> J. Physiol. , 587-1481 (2009).</li>
</ol>

Oosit ifade sistemin endojen kanalları nispeten düşük arka nedeniyle voltaj bağımlı iyon kanallarının elektrofizyolojik karakterizasyonu için idealdir. Ayrıca, geçici bir ifade sistem olduğundan, bu kanalların mutagenez çalışma yerine etkili bir yöntem sağlar. Ancak, oosit ifade sistemi memeli hücrelerinde farklı olduğunu belirtmek gerekir, böylece farklı alt birimden post-translasyonel modifikasyonu ve dernek farklılıklar olabilir. Ayrıca, lipid konsantrasyonu kanalın fonksiyonel özelliklerini etkileyebilir iki hücre a...

<table><tbody><tr><td>Nanoject II Otomatik Nanolitre Enjektörü</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>P-97 Flaming/Brown Mikropipet Çekici</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Perfüzyon Sistemi ve Elektronik Kontrolör</td><td>AutoMate Scientific, Inc.</td><td>ValveLink 16</td><td>Perfüzyon ucunun iç çapı: 100 micron</td></tr><tr><td>Eversiyon Mikroskobu</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX31</td><td></td></tr><tr><td>Cam Pipetler</td><td>VWR international</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown Mikropipet Çekici</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Amplifikatör</td><td>Axon Instruments</td><td>AXOPATCH 200B</td><td></td></tr><tr><td>Bilgisayar Arayüzü</td><td>INSTRUTECH Corporation</td><td>ITC-18</td><td></td></tr><tr><td>Headstage</td><td>Axon Instruments</td><td>CV 203BU</td><td></td></tr></tbody></table>

İyon kanalları incelenmesi için yama kelepçe ve perfüzyon teknikleri cinsinden ifade edilir xenopus oosit

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Burada sunulan protokol büyük iletkenlik, voltaj ve Ca 2 + ile aktive olan K + (BK) kanalları aktivasyon çalışma için tasarlanmıştır. Protokol, aynı zamanda, diğer iyon kanalları ve nörotransmitter reseptörlerinin 1 için yapı-işlev ilişkisi çalışma için kullanılan olabilir. BK kanalları farklı dokularda yaygın olarak ifade edilir ve düz kas kasılması düzenlenmesi, iç saç hücrelerinin frekans ayarı ve nörotransmitter sürüm 2-6 düzenlenmesi de dahil olmak üzere birçok önemli fizyolojik fonksiyonları, suçlanmıştır . BK kanalları membran depolarizasyon ve hücre içi Ca 2 + ve Mg 2 + 6-9 tarafından aktive edilir. Bu nedenle, protokol, membran voltaj ve hücre içi bir çözüm kontrol etmek üzere tasarlanmıştır. Bu protokol, BK kanalları mesajcı RNA 2-5 gün inkübasyon 18 ° C 10-13 takip Xenopus laevis oosit (Evre V-VI) enjekte edilir. Tek veya birden fazla BK kanalları içeren Membran yamalar yama klemp teknikleri 10-13, iç-dış yapılandırma ile eksize. Yama intraselüler tarafı, farklı koşullar altında kanal aktivasyon incelenir, böylece kayıt sırasında istenen çözümleri ile perfüze. Özetlemek gerekirse, BK kanalları mRNA oosit zarı kanal proteinleri ifade Xenopus laevis oosit içine enjekte edilir; yama klemp teknikleri, kontrollü gerilim ve hücre içi çözümleri altında kanallar aracılığıyla akıntılar kaydetmek için kullanılır .

BK kanalları İyonik akım yama klemp teknikleri kullanılarak kaydedildi. BK kanalları ifade edilmiştir.<em&gt; Xenopus oositleri</em&gt; Mesajcı RNA enjekte edilerek. Yama kelepçe kayıtları sırasında hücre içi bir çözüm perfüzyon sistemi tarafından kontrol edilir.

İyon Kanalları incelenmesi için yama Kelepçe ve Perfüzyon Teknikleri cinsinden ifade edilir Xenopus Oosit

Burada sunulan protokol, yüksek iletkenlikli, voltaj ve Ca2+ ile aktive olan K+ (BK) kanallarının aktivasyonunu incelemek üzere tasarlanmıştır. Protokol ...

Bu prosedürün genel amacı, hücre içi çözeltiyi kontrol altında tutarken, kontrollü voltaj altında BK kanalı aktivasyonunu kaydetmektir. Bu işlem, öncelikle Xenopus hücrelerine BK kanalı mRNA'sı enjekte edilerek BK kanallarının eksprese edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise perfüzyon sisteminin hazırlanmasıdır.Prosedürün üçüncü adımı, oosit membranı ile patch pipet arasında bir giga sızdırmazlık (giga seal) oluşturmaktır. Prosedürün son adımı ise membran yamasının kesilip çıkarılmasıdır. Nihayetinde, bir perfüzyon sistemi ile birleştirilmiş patch clamp teknolojisi kullanılarak elde edilen sonuçlar, BK kanallarının voltaj ve kalsiyum konsantrasyonundaki değişikliklerle aktive olduğunu göstermektedir.Merhaba, ben Washington Üniversitesi'ndeki Dr. Jamie Zus laboratuvarından Jin Cho Young. Bu yöntem, iyon kanalı aktivasyonunun moleküler mekanizmasıyla ilgili sorular da dahil olmak üzere, nörobilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Öyleyse başlayalım.Prosedürün ilk adımı, patch clamping işleminden birkaç gün önce başlar ve in vitro olarak transkribe edilmiş BK kanalı mRNA'sını kullanır. Xenopus Lavu Cytes evre beş veya altı toplandıktan sonra, bir oocyte içine 0,05 ile 50 nanogram arasında BK kanalı mRNA'sı enjekte edin. Enjeksiyon için nano inject two auto nanoliter enjektör kullanın.Enjeksiyondan sonra, her bir mRNA için bir düzine oosit üzerinde enjeksiyon işlemini tekrarlayın. Oositleri ND 96 çözeltisi kullanarak iki kez durulayın. Ardından oositleri bir kültür plağına yerleştirin ve oositlerin BK kanalını eksprese etmeleri için iki veya daha fazla gün boyunca 18 degrees Celsius sıcaklıkta inkübe edin.İki ila beş günlük inkübasyonun ardından, oositlerin BK kanallarını eksprese etmesi beklenir ve böylece patch clamp işlemi için hazır hale gelirler. Oositlerle çalışmaya başlamadan önce, perfüzyon sistemiyle başlayarak patch clamp için ihtiyaç duyacağınız diğer tüm düzenekleri kurun. Burada gösterilen sistem automate valve link sistemidir.Basınçlı nitrojen, profüzyon çözeltilerini çözelti rezervuarlarından profüzyon tüplerine, oradan da profüzyon kalemine ve ucuna doğru iter. Her bir profüzyon çözeltisi akışının debisi, bir rezervuar valfi ve bir elektronik valf tarafından kontrol edilir. Bu protokolde, rezervuarlardan biri basınçlandırılmamıştır ve hem bir atık toplayıcı hem de bir basınç tahliye mekanizması olarak işlev görür.Deneylerden önce farklı kalsiyum veya magnezyum konsantrasyonlarına sahip perfüzyon çözeltileri hazırlanabilir. Perfüzyon çözeltilerini rezervuarlara ekleyin ve her birini kalsiyum veya magnezyum konsantrasyonunu belirtecek şekilde etiketleyin. Perfüzyon sistemini kurmak için öncelikle tüpleri perfüzyon kalemine bağlayın.Ardından, boruların ve profüzyon kaleminin tıkanıklıklardan ve hava kabarcıklarından arındırıldığından emin olmak için elektronik valf kontrolörünü açın ve elektronik valfleri açın. Deiyonize su ile doldurulmuş bir şırınga kullanarak her bir borudan deiyonize su itin. Bu aşamada, boruları çözelti rezervuarlarına bağlayın ve basınçlı azot uygulamak için gaz silindirinin valfini açın.Hortumu rezervuar çözeltilerinden biriyle doldurmak için rezervuar valflerinden birini açın. Gerekirse, çözeltideki kabarcıkları gidermek için rezervuar valfine tıklayın. Hortum çözeltiyle dolduktan sonra rezervuar valfini kapatın, perfüzyon ucunu suyla doldurun ve perfüzyon kaleminin üzerine vidalayın.Hava kabarcığı kalmamasına dikkat edin. Ucu bağlarken, perfüzyon kalemini modelleme kili kullanarak banyo tablasına sabitleyin ve perfüzyon ucunun banyo alanında olduğundan emin olun. Perfüzyon sistemi şu an kurulmuş durumdadır.Bu aşamada, banyoya deiyonize su ekleyin. Perfüzyon ucunun suyun içinde olduğundan emin olun. Her bir perfüzyon solüsyonunun perfüzyon ucundan doğru şekilde çıktığını test edin.Atık toplayıcının hortumuna bağlı elektronik vanayı kapatın ve perfüzyon solüsyonlarından birinin vanasını açın. Mikroskop altında, perfüzyon ucundan çıkan perfüzyon sıvısı jetini gözlemleyin. Söz konusu perfüzyon solüsyonunun vanasını kapatın ve atık toplayıcının vanasını açın.Perfüzyon jeti neredeyse kaybolmalıdır. Aynı testi her bir perfüzyon çözeltisi için tekrarlayın. Tüm perfüzyon çözeltilerinin doğru şekilde aktığını doğruladığınızda, banyodaki deiyonize suyu istenen banyo çözeltisiyle değiştirin.Şimdi kayıt düzeneğini kurma zamanı. Her patch clamping oturumundan önce gümüş kayıt elektrodunu gümüş klorür ile yeniden kaplamalısınız. İlk olarak, elektrot telini pipet tutucudan çıkarın ve elektrot telinin uç kısmını taze çamaşır suyu içeren bir şişeye en az 15 dakika boyunca daldırın.Bu işlem, tel üzerinde bir gümüş klorür tabakası oluşturur. Elektrot telini deiyonize su ile durulayın ve kurulayın. Ardından, gümüş gümüş klorür elektrodunu tekrar pipet tutucuya yerleştirin.Şimdi bilgisayarınızı açın. Donanım anahtarını bilgisayarınızın yazıcı portuna takın. HEA pulse adlı veri toplama yazılımını kullanabilmeniz için donanım anahtarının takılı olması gerekir.Amplifikatörü açın ve veri toplama yazılımını başlatın. HEA pulse. Protokol dosyasını yükleyin ve stimülasyon ölçeği gibi konfigürasyon ayarlarını düzenleyin.Yapılandırma ayarlarını düzenlemenin amacı, test potansiyelinin komut potansiyeline tam olarak eşit olmasını sağlamaktır. Artık oositleri hazırlamaya hazırız. Oositleri inkübatörden çıkarın.Oositi beş ila 10 dakika boyunca sıyırma solüsyonunda bekletin. Sıyırma solüsyonu, vitellin membranını plazma membranından ayırarak vitellin membranının sıyırılmasını mümkün kılar. Beş ila 10 dakika sonra, vitellin membranını oositten nazikçe sıyırın.İki adet pens kullanın. Divi oosit bölgesi son derece hassastır ve bu nedenle mümkün olduğunca az hareket ettirilmelidir. Divi oositin havaya veya kabarcıklara maruz kalmasını önlemeye dikkat ederek, oositi banyoya aktarmak için yeterli miktarda solüsyonla doldurulmuş bir cam pipet kullanın.Oosit membranındaki kanallar artık açık ve patch pipet için hazırdır. Bir cam kapiler tüpü mikro pipet çekiciye yerleştirerek bir patch pipet çekin. Uç şeklini ve açıklık çapını belirlemek için pipetleri mikroskop altında inceleyin.Kayıt sırasında kapasitif akımı azaltmak için açıklık çapı iki ila dört mikrometre olmalıdır; pürüzsüz bir uç elde etmek için ucu balmumu ile kaplayıp ardından ısıtın. Mikroskop altında cilalayın. Pipet ucunu, pipetin ucunu pipet solüsyonunun içine yerleştirip pistonu geri çekerek doldurun.Bu işlem pipet ucunu ıslatır. Ardından, pipetin üçte birini bir şırınga yardımıyla pipet çözeltisi ile doldurun. Sonra, içinde gümüş, gümüş klorür elektrot bulunan pipeti pipet tutucuya yerleştirin.Tel elektrodun pipet çözeltisiyle temas ettiğinden emin olun. Bir sonraki adım, hazırlanan oositinden ters yüz edilmiş (inside-out) bir yama kesip almaktır. Öncelikle, mikroskop altında oositin net kenarını bulun.Manipülatörü kullanarak, patch pipetini oositin yakınına getirin ve tamamen daldırıldığından emin olun. Banyo solüsyonu içerisinde, pipetin seri direncini kaydedin. Pipet solüsyonu ile doldurulmuş ve banyo solüsyonuna daldırılmış patch pipetinin ideal seri direnci 1 ile 1.5 milli ohm arasındadır.Şimdi, direnci yaklaşık iki katına çıkana kadar pipeti yavaşça oosit üzerine itin. Pipet tutucuya bağlı bir vakum tüpü aracılığıyla ağızla hafif vakum uygulayarak giga ohm sızdırmazlık sağlayın. Giga sızdırmazlığın oluştuğunu onayladıktan sonra, yamayı birkaç dakika boyunca minus 30 millivolt değerinde tutarak stabilize edin.Tersyüz edilmiş (inside-out) bir yama elde etmek için, pipeti hızlıca OO bölgesine doğru daha ileri itip ardından nazikçe geri çekerek yamayı kesin. Tersyüz edilmiş yama artık yama kenetleme (patch clamping) işlemi için hazırdır. Tersyüz edilmiş yamayı tutan pipeti, perfüzyon ucunun açıklığından yaklaşık 100 mikron uzağa taşıyın.Atık toplama için elektronik valfi kapatın ve istenen profüzyon çözeltisi için rezervuar valfini açın. Yama üzerindeki akımları kaydetmeye başlayın. Voltajı ve profüzyon çözeltilerini isteğe göre değiştirin.Kayıt işlemi tamamlandığında, tıkanmaları önlemek için deiyonize su geçirerek perfüzyon tüplerini ve ucunu temizleyin. Burada elde edilen patch clamp kayıtları, oosit membran patch'indeki vahşi tip BK kanallarının hem voltaja hem de kalsiyuma yanıt verdiğini göstermektedir. Bu şekil, perfüzyon solüsyonunda nominal sıfır kalsiyum içeren bir patch kaydını göstermektedir.Akım izlerinin üzerindeki kare dalgalar, patch'e uygulanan voltajı göstermektedir. 50 millivolt'tan 200 millivolt'a kadar, 50 millivolt'luk artışlarla dört farklı voltaj uygulanmıştır. Yaklaşık iki nano amp olan maksimum akım, 200 millivolt'luk maksimum voltaj ile elde edilmiştir.Gerilim artışıyla birlikte akım genliğinde meydana gelen bu artış, BK kanallarının açık olma olasılığının gerilimle birlikte arttığını göstermiştir. Bu şekil, içeri-dışarı (inside out) yamayı farklı gerilimlere karşı verdiği yanıtı göstermektedir. Perfüzyon solüsyonunda bir mikromolar kalsiyum varken, gerilim basamakları uygulanmıştır.Önceki şekilde olduğu gibi, 200 millivolt voltaj basamağına verilen yanıtta, Perfu sekiz içerisinde kalsiyum bulunduğunda üst yanıt, kalsiyum bulunmadığı durumdaki iki nano amps değerine kıyasla yaklaşık üç nano amps değerine yükselmiştir. Bu durum, BK kanallarının açık olma olasılığının kalsiyum varlığında arttığını göstermektedir. Özetle, bu patch clamping prosedürü, BK kanallarının voltaj ve kalsiyum bağımlı olduğunu ortaya koymuştur.Bu videoyu izledikten sonra, pro yakıt sistemi ile birleştirilmiş patch clamp tekniğini kullanarak Demir Kanalı aktivasyonunun nasıl kaydedileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.

patch-clamp-perfusion-techniques-for-studying-ion-channels-expressed

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu Xenopus laevis oosit kelepçe kayıt yama için bir giriş olarak tasarlanmıştır. Vitellin membran, bir gigaohm mühür (gigaseal) oluşumu ve dış topoloji yama isteğe bağlı dönüşüm kapsar.

Xenopus Oosit ifade İyon Kanalları Patch Kelepçe Kaydı

Biz nasıl bir iyon kanalı fonksiyonu tek bir nokta mutasyonu etkisinin araştırılması gösterecektir.

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

İfade ve HEK-293T Hücreler Rekombinant Gerilim Gated İyon Kanalları Elektrofizyolojik Kayıt için optimize edilmiş Transfeksiyon Strateji

Xenopus oositlerindeki enzimlerin heterolog ekspresyonu ve atomik absorpsiyon spektrofotometrisi ile tek tek hücrelere Rb+ veya Li+ alımını ölçerek K+-karşı taşıyıcı P-tipi ATPazların aktivitesini ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz. Yöntem, karmaşık kinetik çalışmaları kolaylaştıran radyoizotop akı deneylerine hassas ve güvenli bir alternatiftir.

Na, K ve H, K-ATPaz bölgesindeki tarafından Katyon Taşıma Ölçüm<em&gt; Xenopus</emAtomik Absorpsiyon Spektrofotometresi ile&gt; Oosit: Radyoizotop Tahliller Alternatif Bir

TRPV4 en incelemek için yaygın olarak kullanılan yöntemler tamamlamak için, iki yöntem tarif edilmiştir: Onun mechanosensitivity hipo-ozmotik tehdidi üzerine transgenik maya Ca 2 +-akorinden luminometri ele alınabilir. Ayrıca TRPV4-RNA incelenebilir on-hücre ya da kesilmiş modunda kelepçe bütün hücre iki elektrotlu voltaj kelepçe veya yama ile Xenopus oosit enjekte edilir.

Maya lüminometrik ve Xenopus Yumurta Elektrofizyolojik Sınavları

Kesik açık vazelin boşluk yaklaşım hızlı kanal kinetiği yüksek çözünürlüklü Xenopus oositlerde eksprese edilen voltaj-bağımlı iyon kanallarının iyonik ve yolluk akımlarının düşük ses kayıtları elde etmek için kullanılır. Küçük değişiklikler ile, voltaj kıskaç fluorometri kesme açık oosit protokolüne akuple edilebilir.

<em&gt; Xenopus</emFluorometri ile&gt; Yumurta Kes-açık Vazelin Gap Gerilim-kelepçe Tekniği

Burada tarif edilen hücre-bağlı patch-clamp tekniği ile, bir iyon kanalının güncel kayıt uzun uzanır elde edilmesi için bir işlemdir. Bu yöntem, gerçek zamanlı olarak, gözlemlemek için izin veren, biyolojik sinyali altında yer open-close kanal konformasyonlarının desen. Bu veriler rahatsız biyolojik membranların kanal özellikleri hakkında bilgilendirmek.

Tek kanallı bir hücre-bağlı Patch-clamp kayıt

Tek foliküllerin izolasyonu, sitoplazmik RNA mikroenjeksiyonları, çevre hücre tabakalarının çıkarılması ve Xenopus oositlerinde protein ekspresyonu için optimize edilmiş prosedürler anlatılmaktadır. Ek olarak, ligand kapılı iyon kanalları ile yapılan elektrofizyolojik deneylerde hızlı çözelti değişiklikleri için basit bir yöntem sunulmaktadır.

Xenopus Oositler: Mikroenjeksiyon için optimize Yöntemler, Foliküler Hücre Katmanlar çıkarılması ve Elektrofizyolojik Deneyler Hızlı Çözüm değişiklikler

Bu makale, iyon kanallarındaki yapısal yeniden düzenlenmeleri araştırmak için maleimid boyaları yerine Floresan Doğal olmayan Amino Asitlerin (fUAA) kullanıldığı klasik Voltaj-Kelepçe Florometrisinin (VCF) geliştirilmesini anlatıyor. Prosedür, Xenopus oosit DNA enjeksiyonu, RNA / fUAA koinjeksiyon ve eşzamanlı akım ve flüoresans ölçümlerini içerir.

Voltaj kelepçesi florometrisi<em&gt; Xenopus</emFloresan Doğal Olmayan Amino Asitler Kullanan Oositler

Burada, Xenopus oositlerinde boşluk bağlantı proteinlerini eksprese etmek ve yüksek yan akım ölçüm modunda çift oosit voltaj-kelepçe kayıtları için tasarlanmış ticari bir amplifikatör kullanarak iki appoze oosit arasındaki bağlantı akımını kaydetmek için bir protokol sunuyoruz.

Ksenopus Oositlerinden Boşluk Bağlantı Akımının Kaydedilmesi

Öğrenin BK kanallarının aktivasyonunu yama kelepçe ve perfüzyon teknikleriyle Xenopus oositlerinde nasıl kaydedilir. Bu yöntem iyon kanalı davranışlarını incelemek için kullanılabilir.

İyon Kanalları incelenmesi için yama Kelepçe ve Perfüzyon Teknikleri cinsinden ifade edilir Xenopus Oosit

Daha fazla video keşfet