İyon Kanalları incelenmesi için yama Kelepçe ve Perfüzyon Teknikleri cinsinden ifade edilir Xenopus Oosit

Bu prosedürün genel amacı, hücre içi çözeltiyi kontrol ederken kontrollü voltaj altında BK kanal aktivasyonunu kaydetmektir. Bu, önce Xenopus Cytes'taki BK kanallarının BK kanalı mRNA'sı ile enjekte edilerek eksprese edilmesiyle gerçekleştirilir. İşlemin ikinci adımı perfüzyon sisteminin hazırlanmasıdır.

Prosedürün üçüncü adımı, oosit zarı ile yama pipeti arasında bir giga conta oluşturmaktır. Prosedürün son adımı, zar yamasını eksize etmektir. Sonuç olarak, bir profüzyon sistemi ile birleştirilmiş yama kelepçe teknolojisi kullanılarak elde edilen sonuçlar, BK kanallarının voltaj ve kalsiyum konsantrasyonundaki değişikliklerle aktive edildiğini göstermektedir.

Merhaba, ben Washington Üniversitesi'ndeki Dr.Jamie Zus laboratuvarından Jin Cho Young. Bu yöntem, iyon kanalı aktivasyonu için moleküler mekanizma ile ilgili sorular da dahil olmak üzere sinirbilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Öyleyse başlayalım.

Prosedürdeki ilk adım, yama klemplemesinden birkaç gün önce başlar ve in vitro olarak transkribe edilen BK kanal mRNA'sını kullanır. Xenopus Lavu Cytes aşaması beş ila altıncı hasat edildikten sonra, bir sirke 0.05 ila 50 nanogram BK kanal mRNA'sı enjekte edin. Bir nano enjeksiyon iki otomatik nanolitre enjektör kullanarak.

Enjeksiyonu takiben her mRNA için enjeksiyonu bir düzine oosit üzerinde tekrarlayın. Oositleri ND 96 solüsyonu kullanarak iki kez durulayın. Daha sonra oositleri bir kültür tabağına koyun ve oositlerin BK kanalını ifade etmesi için zaman tanımak için iki veya daha fazla gün boyunca 18 santigrat derecede inkübe edin.

İki ila beş günlük inkübasyonun ardından, oositler BK kanallarını eksprese etmelidir ve bu nedenle zaten yama klemplemesi içindir. Oositleri tutmadan önce, perfüzyon sisteminden başlayarak yama klemplemesi için ihtiyacınız olan her şeyi ayarlayın. Burada gösterilen sistem otomatik valf bağlantısıdır.

16 Füzyon sistemi basınçlı nitrojen, bolluk çözeltilerini çözelti rezervuarlarından füzyon tüplerinden ve bolluk kalemine ve ucuna iter. Her bir füzyon çözeltisi akışının akışı, bir rezervuar valfi ve bir elektronik valf tarafından kontrol edilir. Bu protokolde, rezervuarlardan biri basınçlandırılmaz ve bir atık toplayıcı olarak işlev görür, aynı zamanda bir basınç tahliye mekanizması olarak da işlev görür.

Deneylerden önce farklı konsantrasyonlarda kalsiyum veya magnezyum perfüzyon çözeltileri hazırlanabilir. Perfüzyon çözeltilerini rezervuarlara ekleyin ve her birini kalsiyum veya magnezyum konsantrasyonunu gösterecek şekilde etiketleyin. Önce füzyon sistemini kurmak için, tüpleri füzyon kalemine bağlayın.

Ardından elektronik valf kontrolörünü açın ve boruların ve püskürtme kaleminin tıkanıklık ve hava kabarcıkları içermediğinden emin olmak için elektronik valfleri açın. Deiyonize suyla doldurulmuş bir şırınga kullanarak deiyonize suyu her borudan itin. Bu noktada, boruları çözelti rezervuarlarına bağlayın ve nitrojene basınçlı uygulamak için gaz silindirinin valfini açın.

Boruyu rezervuar çözümlerinden biriyle doldurmak için bir rezervuar vanası açın. Gerekirse, çözeltideki kabarcıkları çıkarmak için rezervuar valfine tıklayın. Boru çözelti ile doldurulduktan sonra rezervuar vanasını kapatın, perfüzyon ucunu suyla doldurun ve perfüzyon kalemine vidalayın.

Herhangi bir baloncuk yakalamamaya dikkat edin. Ucu bağlarken, modelleme kili kullanarak perfüzyon kalemini banyo aşamasına sabitleyin, bol ucun banyo boşluğunda olduğundan emin olun. Bolluk sistemi şimdi kuruldu.

Bu noktada, banyoya deiyonize su ekleyin. Bolluk ucunun suya batırıldığından emin olun. Her perfüzyon solüsyonunun perfüzyon ucundan doğru şekilde çıktığını test edin.

Atık toplayıcının borusuna bağlı elektronik valfi kapatın ve bolluk çözeltilerinden biri için valfi açın. Mikroskop altında, perfüzyon ucundan çıkan füzyon sıvısı jetini gözlemleyin. Bu bol çözelti için valfi kapatın ve atık toplayıcı için valfi açın.

Bolluk jeti neredeyse yok olmalıdır. Perfüzyon solüsyonlarının her biri için aynı testi tekrarlayın. Tüm perfüzyon solüsyonlarının doğru şekilde aktığını doğruladığınızda, banyodaki deiyonize suyu istediğiniz banyo solüsyonu ile değiştirin.

Şimdi kayıt cihazını kurma zamanı. Her yama sıkıştırma seansından önce gümüş kayıt elektrodunu gümüş klorür ile yeniden kaplamanız gerekir. İlk olarak, elektrot telini pipet tutucusundan çıkarın ve elektrot telinin uç yarısını en az 15 dakika boyunca taze ağartıcı içeren bir şişeye batırın.

Bu, tel üzerinde bir gümüş klorür tabakası biriktirir. Elektrot telini deiyonize su ile durulayın ve kurulayın. Ardından gümüş gümüş klorür elektrodu pipet tutucusuna geri takın.

Şimdi bilgisayarınızı açın. Donanım anahtarını bilgisayarınızın yazıcı bağlantı noktasına takın. HEA pulse olan veri toplama yazılımını kullanabilmeniz için donanım anahtarının takılı olması gerekir.

Amplifikatörü açın ve veri toplama yazılımını başlatın. HEA nabzı. Protokol dosyasını yükleyin ve uyaran ölçeği gibi yapılandırma ayarlarını yapın.

Konfigürasyon ayarlarının yapılmasının amacı, test potansiyelinin komut potansiyeline tam olarak eşit olmasını sağlamaktır. Şimdi yumurtaları hazırlamaya hazırız. Oositleri inkübatörden alın.

Oositi beş ila 10 dakika sıyırma çözeltisine batırın. Sıyırma solüsyonu, viel zarını plazma zarından ayırır ve bu da vitel zarının sıyrılmasını mümkün kılar. Beş ila 10 dakika sonra, vitel zarını oositten nazikçe sıyırın.

İki forseps kullanarak. Bir divi OC sitesi son derece kırılgandır ve bu nedenle gerektiği kadar az taşınmalıdır. Devi oositinin havaya veya kabarcıklara maruz kalmasını önlemeye özen göstererek, oositi banyoya aktarmak için yeterli solüsyonla doldurulmuş bir cam pipet kullanın.

Oosit zarındaki kanallar artık açıkta ve yama pipeti için hazırdır. Mikro pipet çekicisine bir cam kılcal tüp yerleştirerek bir yama pipeti çekin. Uç şeklini ve açılma çapını belirlemek için pipetleri mikroskop altında gözlemleyin.

Kayıt sırasında kapasitif akımı azaltmak için açılma çapı iki ila dört mikrometre olmalı ve pürüzsüz bir uç sağlamak için ucu balmumu ile kaplayın ve ardından ateşleyin. Mikroskop altında cilalayın. Pipetin ucunu pipet çözeltisinin içine yerleştirerek ve pistonu çekerek pipet ucunu doldurun.

Bu, pipetin ucunu ıslatır. Ardından, bir şırınga kullanarak pipeti üçte bir oranında pipet solüsyonu ile doldurun. Ardından pipeti, içinde gümüş, gümüş klorür elektrot olacak şekilde pipet tutucusuna yerleştirin.

Tel elektrodun pipet çözeltisiyle temas halinde olduğundan emin olun. Bir sonraki adım, hazırlanan oositten içten dışa bir yama çıkarmaktır. İlk olarak, mikroskop altında oositin net kenarını bulun.

Manipülatörü kullanarak, yama pipetini oositin yakınına getirin ve suya batırıldığından emin olun. Banyo solüsyonunda, pipetin seri direncini kaydedin. Yama pipetinin ideal seri direnci, pipet çözeltisi ile doldurulduğunda ve banyo çözeltisine daldırıldığında bir ila 1,5 mili ohm arasındadır.

Şimdi pipeti, direnci yaklaşık iki katına çıkana kadar yavaşça oositin üzerine doğru itin. Pipet tutucuya bağlı bir emme borusu aracılığıyla ağızdan hafif emme uygulayarak bir giga ohm conta elde edin. Bir giga contasının oluştuğunu onayladıktan sonra, yamayı birkaç dakika eksi 30 milivoltta tutarak stabilize edin.

İçten dışa bir yama elde etmek için, pipeti hızlı bir şekilde OO bölgesine daha fazla iterek ve ardından yavaşça dışarı çekerek yamayı çıkarın. İçten dışa yama artık yama sıkıştırması için hazırdır. İç dış yamayı tutan pipeti, perfüzyon ucunun açıklığından yaklaşık 100 mikron uzağa hareket ettirin.

Atık toplama için elektronik valfi kapatın ve istenen bolluk çözeltisi için rezervuar valfini açın. Yama boyunca akımları kaydetmeye başlayın. Voltajı ve füzyon çözeltilerini istediğiniz gibi değiştirin.

Kaydı bitirdiğinizde, tıkanmaları önlemek için deiyonize sudan iterek bolluk tüplerinin kalemini ve ucunu temizleyin. Burada elde edilen yama klemp kayıtları, bir oosit zarı yaması üzerindeki vahşi tip BK kanallarının hem gerilime hem de kalsiyuma yanıt verdiğini göstermektedir. Bu şekil, perfüzyon çözeltisinde nominal sıfır kalsiyum içeren bir yama kaydını göstermektedir.

Akım izlerinin üzerindeki kare dalgalar, yamaya uygulanan voltajı gösterir. 50 milivoltluk artışlarla 50 milivolt ile 200 milivolt arasında değişen dört voltaj uygulandı. Maksimum akım, yaklaşık iki nano amper, maksimum 200 milivolt voltaj ile elde edildi.

Artan voltajla akım genliğindeki bu artış, BK kanallarının açılma olasılığının voltajla arttığını gösterdi. Bu şekil, içten dışa yamanın farklı voltajlara verdiği tepkiyi göstermektedir. Perfüzyon solüsyonunda bir mikromolar kalsiyum olduğunda, voltaj adımları uygulandı.

İlerleyen şekilde olduğu gibi, 200 milivolt voltaj adımına verilen yanıt, Perfu sekizinde kalsiyum olduğunda üst tepki, kalsiyum içermeyen iki nano ampere kıyasla yaklaşık üç nano ampere yükseldi. Bu, kalsiyum varlığında BK kanallarının açılma olasılığının arttığını gösterir. Özetle, bu yama sıkıştırma prosedürü BK kanallarının voltaj ve kalsiyuma bağımlı olduğunu gösterdi.

Bu videoyu izledikten sonra, profesyonel bir yakıt ikmal sistemi ile birleştirilmiş yama kelepçesi tekniği kullanarak Demir Kanal aktivasyonunu nasıl kaydedeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Şimdi. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneylerinizde iyi şanslar.